recast-jats-build ec6cccc6e1 gutjnl 肠道 肠道 肠道 肠道 肠道 0017 - 5749 1468 - 3288 英国医学杂志出版集团有限公司和英国消化病学会 gutjnl - 2020 - 323826 10.1136 / gutjnl - 2020 - 323826 33789966 / gutjnl 70/7/1253.atom 新型冠状病毒肺炎 开放获取 肠道 新型冠状病毒肺炎 特殊的集合 新型冠状病毒肺炎 特殊的集合 开放获取 COVID-19中人类口腔和肠道微生物群和脂质组学的变化 http://orcid.org/0000-0003-0798-3444 任 中国 1 2 王 海宇 1 2 崔 Guangying 1 2 陆 海丰 3. 王 凌 4 罗 在香港 5 程ydF4y2Ba 新华社 6 任 支 7 太阳 Ranran 1 2 刘 Wenli 8 http://orcid.org/0000-0002-3273-1268 刘 Xiaorui 9 刘 曹国伟 7 李 盎 1 2 王 Xuemei 1 2 饶 Benchen 1 2 元 的成语 5 张 华 3. http://orcid.org/0000-0002-3150-5269 太阳 Jiarui 7 程ydF4y2Ba 枭龙 1 2 李 冰结 10 胡 Chuansong 5 吴 Zhongwen 3. 余 Zujiang 1 2 http://orcid.org/0000-0002-2998-4918 菅直人 泉城 1 2 http://orcid.org/0000-0001-6945-0593 李 Lanjuan 3. 11 传染病科， 郑州大学第一附属医院， 郑州， 河南， 中国 河南省基因医院， 郑州大学第一附属医院， 郑州， 河南， 中国 传染病诊断与治疗国家重点实验室， 浙江大学医学院附属第一医院， 杭州， 浙江， 中国 临床化验科， 河南省胸科医院， 郑州， 河南， 中国 普通外科， 广山县人民医院， 信阳， 河南， 中国 肝胆胰外科“，， 浙江大学医学院附属第一医院， 杭州， 浙江， 中国 上海摩比欧生物医药科技有限公司， 上海， 上海， 中国 医学技术学院临床检验诊断学， 北华大学， 吉林， 吉林， 中国 国际和平妇幼保健医院， 上海交通大学医学院， 上海， 上海， 中国 肿瘤科， 郑州大学第一附属医院， 郑州， 河南， 中国 舒兰(杭州)医院， 浙江树人大学树兰国际医学院， 杭州， 浙江， 中国 任志刚博士，郑州大学第一附属医院感染科，河南郑州; fccrenzg@zzu.edu.cn；于祖江博士，郑州大学第一附属医院感染科，河南郑州; johnyuem@zzu.edu.cn；李兰娟教授，浙江大学医学院附属第一医院传染病诊疗国家重点实验室，浙江杭州; ljli@zju.edu.cn 7 2021 31 3. 2021 4 6 2021 30. 3. 2021 31 3. 2021 70 7 1253 1265 11 12 2020 04 02 2021 17 02 2021 ©作者(或其雇主)2021。CC BY-NC下允许重复使用。禁止商业再利用。请参见权限和权限。由英国医学杂志出版。 2021 http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ 这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/． 客观的

研究COVID-19活动性患者和康复患者的口腔微生物组、肠道微生物组和血脂谱;评估微生物组作为COVID-19非侵入性生物标志物的潜力;并探索微生物组和脂质特征之间的相关性。

 设计

我们收集了来自华中和华东地区的392份舌苔样本、172份粪便样本和155份血清样本并进行了测序。我们对微生物组和脂质分子进行了特征描述，构建了发现队列中的微生物分类器，并验证了其在华东地区74例确诊患者(CPs)和37例IgG阳性疑似患者(SPs)中的诊断潜力。

 结果

与健康对照(hc)相比，CPs的口腔和粪便微生物多样性显著降低。与hc相比，CPs在口腔中产生丁酸的细菌减少，产生脂多糖的细菌增加。基于8种最佳口腔微生物标志物(7种粪便微生物标志物)的分类器在不同队列中均有较好的诊断效果。重要的是，跨区域队列的诊断有效性达到87.24%。此外，该分类器将IgG抗体阳性的SPs成功诊断为CPs，诊断有效率达92.11%(对粪便微生物群的诊断为98.01%)。与CPs相比，鞘磷脂(SM)(d40:4)、SM(d38:5)、单甘油酯(33:5)等47个脂类分子被消耗，磷脂酰胆碱(36:4p)、磷脂酰乙醇胺(PE)(16:0p/20:5)、双甘油酯(20:1/18:2)等122个脂类分子被富集。

 结论

这项研究首次描述了COVID-19患者口腔微生物组的特征，以及康复患者口腔微生物组和脂质变化的特征，探讨了它们之间的相关性，并报告了COVID-19诊断模型的成功建立和验证。

 肠道微生物 脂质代谢 新型冠状病毒肺炎 http://dx.doi.org/10.13039/501100002858 中国博士后科学基金 2020年t130109zx 2020年t130609 国家重点研发计划项目 2018年yfc2000500 上海交通大学医学院国际和平妇幼保健院新冠肺炎防控项目 2020 - covid 19 - 01 国家科技重大专项 2018年zx10301201 http://dx.doi.org/10.13039/501100001809 国家自然科学基金 82070643 U1904164 U2004121 河南省科技攻关项目 202102310055 浙江大学医学院附属第一医院传染病诊疗国家重点实验室和传染病诊疗协同创新中心的开放基金 SKLID2019KF03 特色 解锁 特殊性质 contains-inline-supplementary-material has-earlier-version 是的 本研究的意义 关于这个问题我们已经知道了什么?

COVID-19已成为全球大流行，导致1亿多人感染，200多万人死亡。

然而，作为新冠肺炎诊断的金标准，RT-PCR核酸检测因病毒滴度低、采样误差和实验误差等多种因素造成的假阴性率至少达到20%，一直受到质疑。

口腔和粪便微生物群落作为特定疾病或病毒性疾病(包括肝细胞癌和类风湿性关节炎)的非侵入性诊断工具的概念已在许多研究中得到证实;然而，目前尚不清楚口腔微生物标志物能否诊断COVID-19。

微生物组和脂质可以影响特定疾病的进展;然而，它们在COVID-19患者中的特征和相关性尚不清楚。

 本研究的意义 新的发现是什么?

从健康对照(hc)到COVID-19患者，口腔和粪便微生物多样性下降，从疑似患者(SPs)到确诊患者(CPs)，微生物多样性相似。

与hc相比，COVID-19患者中产生丁酸的细菌减少，产生脂多糖的细菌增加。

在随机森林模型上进行五次交叉验证，筛选出最优的8个口腔微生物标志物(7个粪便微生物标志物)，构建基于最优微生物标志物的分类器，曲线下面积(AUC)为98.06%(粪便微生物组中为99.74%)。

重要的是，口腔微生物标志物实现了华中和华东地区COVID-19的跨区域验证。

口服和粪便微生物标志物成功诊断IgG抗体阳性的SPs为CPs, AUC为92.11%(粪便微生物组为98.01%)。

口腔微生物群、粪便微生物群和血脂分子之间的联系有助于CPs的恢复。

 在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

这是首次通过大队列MiSeq测序描述COVID-19患者口腔微生物群，并描述康复患者口腔微生物群和脂质的研究。

口腔和肠道微生物和脂质的改变可能参与了COVID-19的发展和恢复，这意味着对改变的微生物和脂质的干预可能有助于COVID-19的恢复。

这是首次在中国两个不同地区的三个队列中鉴定特异性微生物标志物并成功构建诊断模型的研究，取得了良好的诊断效果。同时，基于微生物特征的证据，我们首次提出并成功利用该模型将IgG阳性的SPs诊断为COVID-19阳性，提示微生物标志物可作为COVID-19无创诊断的辅助工具。

微生物组和脂质组之间的联系可能说明COVID-19的恢复机制。

 简介

COVID-19在全球迅速蔓延，已造成超过1亿人感染，200多万人死亡。 1然而，作为新冠肺炎诊断的金标准，逆转录- pcr (RT-PCR)核酸检测因假阴性率至少为20%而受到质疑。 2 3因此，迫切需要寻找一种新的诊断方法。

ACE2是SARS-CoV-2的靶标 4并在肺、肝、肾、脑和小肠上皮细胞中表达。SARS-CoV-2激活肠道ACE2受体，诱发炎症，引起胃肠道症状和微生物群失调。 5个6人体微生物组参与宿主免疫和代谢，与病毒性疾病密切相关。微生物组的改变有助于H7N9禽流感(H7N9)的发生和发展， 7艾滋病毒 8和乙肝病毒。 9日10先前的研究报告了COVID-19在住院期间和康复后的肠道或气道微生物特征。 11 - 15号然而，COVID-19和康复患者的口腔微生物区系尚未见报道。此外，微生物标志物作为一种非侵入性诊断工具已在许多疾病中建立起来。顾 等 16通过16S rRNA MiSeq测序，构建了基于5种肠道微生物标志物的分类器。该分类器诊断COVID-19的准确率较高，曲线下面积(AUC)高达0.89。然而，口腔微生物组对COVID-19的诊断潜力尚未得到评估。

代谢物的变化可以反映疾病的进展。 17短链脂肪酸(Short-chain fatty acids, SCFAs)是微生物组的脂质代谢产物，参与宿主细胞的基因表达、炎症、分化和凋亡。 18反过来，SCFAs可以为微生物群提供能量，维持其生存。之前的研究 19描述了COVID-19患者的蛋白质组学和代谢组学特征，并将非重症患者与重症患者区分开来。然而，尚未对COVID-19患者和康复患者的脂组学进行研究。

我们假设口腔和肠道微生物群参与了COVID-19的发展，并可以作为辅助诊断工具。此外，脂质组学和微生物组之间的相互作用可能有助于COVID-19的进展和恢复。为了验证这一假设，我们对392份舌苔样本、172份粪便样本和155份血清样本应用16S rRNA MiSeq测序和脂质组学技术，分析了COVID-19患者和康复患者的人体微生物组和脂质组学。

 方法 研究概要

本研究基于前瞻性标本采集和回顾性盲法评价设计原则进行。 20.

在华中和华东地区前瞻性采集了3种类型的957份样本，包括舌苔496份、粪便226份和血清235份( 图1)。经过严格的纳入和排除标准，719份样本被纳入进一步分析。其中，健康对照组(hc)样本采集于2019年10月前，隔离地区康复患者样本采集于出院前2天。舌膜标本和粪便标本进行16S rRNA MiSeq测序，血清标本进行超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)分析。收集和分析临床数据和参与者的人口统计数据( 表1)。的 在线补充方法展示了参与者的入组过程、纳入、排除以及详细的诊断标准。所有入组患者均按照中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的“诊疗方案试验V.5(或V.6)指南”的常规治疗进行标准治疗。 21日22

SP1 10.1136 / gutjnl - 2020 - 323826. - supp1

F1

研究设计和流程图。前瞻性收集华中和华东地区3种类型的957份样本，其中舌苔496份，粪便226份，血清235份。经过严格的纳入和排除标准，共纳入719份样本进行进一步分析，其中包括392份舌苔样本(72份CPs、37份SPs、22份CPRs、37份配对SPRs和150份来自河南的hcc和74份来自杭州的hcc)， 172份粪便样本(36份CPs、23份SPs、18份CPRs、23份SPRs和72份来自河南)和155份血清样本(73份CPs、30份SPs、22份CPRs和30份SPRs)。采用16S rRNA MiSeq对口腔和粪便样品进行测序，以表征微生物组并构建诊断模型;采用UPLC-MS检测血清样品，以表征脂质分子。hc，健康对照;CPs，确诊患者;SPs，疑似患者;CPRs，已康复的确诊患者;RFC，随机森林分类器;已康复的疑似患者; UPLC-MS, ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry.

 T1

口腔和粪便发现队列参与者的临床特征

临床指标 发现队列舌膜样本(n=148) P值 发现队列的粪便样本(n=72) P值
健康对照组(n=100) 确诊患者(48例) 健康对照组(n=48) 确诊患者(n=24)
年龄(年) 44.88±11.35 48.40±13.90 0.088 48.52±6.50 48.04±10.24 0.836
性别(女性/男性) 63/37 28/20 0.585 23/25 10/14 0.616
并发症 11 (22.9%) 4 (16.7%)
确诊患者或武汉暴露 38 (79.2%) 18 (75%)
入院时症状
发热 32 (66.7%) 21 (87.5%)
咳嗽 15 (31.25%) 8 (33.3%)
痰 5 (10.4%) 3 (12.5%)
头疼 3 (6.25%) 3 (12.5%)
乏力 6 (12.5%) 5 (20.8%)
实验室结果
白细胞 6.09±1.53 5.32±1.95 0.003 5.83±1.39 4.36±1.58 < 0.0001
中性粒细胞 3.56±1.17 4.26±2.04 0.088 3.32±1.05 3.68±2.03 0.962
淋巴细胞 1.95±0.47 1.77±2.03 < 0.0001 1.92±0.52 1.32±0.52 < 0.0001
血小板 234.26±49.33 191.42±75.22 < 0.0001 226.90±50.80 174.42±60.71 < 0.0001
血红蛋白 143.43±17.25 141.65±34.84 0.026 142.54±13.93 137.08±20.54 0.249
丙氨酸转氨酶 22.54±21.31 23.89±14.06 0.115 22.90±16.56 25.05±14.87 0.307
天冬氨酸转氨酶 22.57±11.23 25.29±10.47 0.010 21.67±7.83 26.50±10.46 0.009
总胆红素 12.70±5.59 13.14±8.45 0.400 11.53±5.02 10.47±6.35 0.120
血清肌酐 71.15±14.80 67.42±16.50 0.123 68.08±11.89 68.33±16.99 0.583

连续变量以均值(SD)或中位数(IQR)表示。分类变量以百分比表示。对COVID-19患者(n=48, n=24)和健康对照组(n=100, n=48)采用正态连续变量的Student’s t检验、非正态连续变量的Wilcoxon秩和检验和χ进行比较2分类变量的Fisher精确检验。统计学意义为p<0.05(双侧)。共病包括糖尿病、高血压、心血管疾病、慢性阻塞性肺疾病、恶性肿瘤和慢性肝病( 在线补充表S1)。

 SP2 10.1136 / gutjnl - 2020 - 323826. - supp2

SP9 10.1136 / gutjnl - 2020 - 323826. - supp9

标本采集、运输、储存、检测严格按照《新型冠状病毒肺炎疫情防控方案(第五版)》，按照II型高致病性微生物进行管理。 23

 粪便和舌苔样本采集和DNA提取

每个参与者在06:00-10:00提供新鲜的尾巴粪便样本。样品在70°C下灭活1小时，然后分成200 mg的三等份，并立即在−80°C保存。我们将室温>2小时的样品丢弃。

在采集舌苔样本之前，参与者用无菌水漱了两次嘴。舌苔的后中间到前中间区域由专业操作者用咽拭子刮拭。棉签立即放入冷冻管中，在56°C下灭活病毒30分钟，然后将样本转移到−80°C的冰柜中。DNA提取过程如前所述 24（ 在线补充方法)。

 PCR扩增、MiSeq测序及数据处理

按照标准方案进行PCR扩增和DNA文库构建，测序平台为Illumina MiSeq平台，由中国上海茂比欧生物医药科技有限公司提供。所有样本的原始Illumina读取数据保存在欧洲生物信息学研究所欧洲核苷酸档案数据库(PRJNA660302)。PCR扩增和序列数据处理的细节见 在线补充方法．

 操作分类法单元聚类和分类法注释

从所有样本中随机选择相同数量的读取，操作分类单元(OTUs)由usparse管道打包。 25收集所有样品在发现阶段、验证阶段和独立阶段的所有OTUs。我们将标识阈值设置为0.97。根据发展商的文件( http://rdp.cme.msu.edu/classifier/class_help.jsp%23conf)，使用RDP分类器V.2.626对序列进行标注。 26我们进一步分析了微生物多样性并进行了分类学分析(详情见 在线补充方法)。

 OTU生物标志物的鉴定和疾病概率的构建

分别将发现队列、验证队列和独立诊断队列的序列映射，生成发现OTU频率谱、验证频率谱和独立诊断频率谱。然后，我们使用Wilcoxon秩和检验来确定其显著性(p<0.05)，并选择口腔和粪便微生物群落中的OTU生物标志物进行进一步分析。我们在随机森林模型上通过五次交叉验证构建了诊断模型，并评估了疾病概率(POD)指数和受试者工作特征曲线。该过程是按照我们在以前的研究中所描述的进行的( 在线补充方法)。 24

 血清样本采集，脂组学检测及数据分析

所有采集的血液样品均采用3000转/分离心10分钟的方法制备，仔细收集上层取血清。通过添加乙醇灭活血清样品，大力摇晃，在生物安全罩中干燥，然后在−80°C保存。所有样品在4°C缓慢解冻。

采用标准试剂盒检测血清抗SARS-CoV-2 IgG，采用超高效液相色谱-质谱分析检测脂质组学，采用LipidSearch V.4.1和metaX ( 在线补充方法)。

 统计分析

正态连续变量采用Student 's t检验，非正态连续变量采用Wilcoxon秩和检验，χ进行比较2分类变量的Fisher精确检验。正态连续变量采用单因素方差分析，非正态连续变量采用Kruskal-Wallis检验。p值<0.05(双侧)的差异被认为有统计学意义。使用SPSS V.20.0 for Windows (SPSS，芝加哥，伊利诺伊州，美国)进行统计分析。

 结果 研究设计和流程图

排除后，719份样品被纳入进一步分析( 图1)，包括392份舌苔样本(72例确诊患者、37例疑似患者、22例康复患者、37例配对康复患者、150例河南hcc和74例杭州hcc)、172份粪便样本(36例CPs、23例SPs、18例CPRs、23例SPRs和72例河南hcc)和155份血清样本(73例CPs、30例SPs、22例CPRs和30例SPRs)。

CPs和hc的舌苔和粪便样本随机分为发现阶段和验证阶段。在发现阶段，我们对48个CPs和100个hc中的口腔微生物组(24个CPs和48个hc中的粪便微生物组)进行了特征分析，确定了关键的口腔或粪便微生物标志物，并通过五倍交叉验证随机森林模型构建了COVID-19分类器。在验证阶段，我们验证了基于24个CPs和50个hcc的口腔微生物组(12个CPs和24个hcc的粪便微生物组)的COVID-19分类器的诊断效果。利用杭州地区74份舌苔样本，验证了新型冠状病毒肺炎分类器的跨区域诊断效果。此外，利用37份IgG阳性的SPs舌苔样本(23份粪便样本)，测试COVID-19分类器是否可以诊断COVID-19阳性。最后，我们对COVID-19患者和康复患者的口腔和粪便微生物群和血脂分子进行了特征分析。此外，还分析了微生物组与脂质之间以及微生物组与临床参数之间的相关性。

 参与者特征

在发现队列中，CPs和hc的临床特征显示在 表1（ 在线补充表S1)。两组之间的性别和年龄相当。与hc相比，舌膜组和粪膜组的白细胞(WBCs) (p<0.01)、淋巴细胞(p<0.0001)和血小板(p<0.0001)降低，而天门冬氨酸转氨酶(p<0.05)升高。入院时最常见的体征或症状为发热和咳嗽。

 基于口腔微生物组的COVID-19无创诊断模型

发现队列的稀疏分析显示，每个组的OTU丰度接近饱和( 图2一个而且 在线补充图S1A)。根据Shannon指数和Simpson指数估计，CPs与hc相比，口腔微生物多样性显著降低(均p<0.001) ( 图2一个而且 在线补充图S1B， 在线补充表S2)。维恩图显示，2407个OTUs中有1392个是两组共同的，而685个OTUs是CPs所特有的( 在线补充图S1C)。主坐标分析(PCoA)显示样品之间的微生物群落空间，beta多样性结果显示两组之间的口腔微生物群落有显著差异( 图2 b而且 在线补充图S1D)。

SP3 10.1136 / gutjnl - 2020 - 323826. - supp3

SP10 10.1136 / gutjnl - 2020 - 323826. - supp10

F2

基于口腔微生物组的COVID-19无创诊断模型(A)样品数量与OTUs数量之间的稀疏性分析。随着样本量的增加，在CPs (n=48)和hc (n=100)中OTUs数量趋于饱和。与hc相比，CPs中OTUs数量减少。据Shannon指数估计，与hc相比，CPs的口腔微生物多样性显著降低。(B)基于OTU分布的PCoA显示两组间口腔分类组成存在显著差异。(C)与hc相比，CPs中有5个属显著富集，5个属显著减少。(D)属水平上两组细菌群落的平均组成和相对丰度。(E)两组中每个样品的差异OTUs相对丰度的热图。与hc相比，CPs的POD值显著升高，在发现队列(F和G)、验证队列(H和I)和独立队列(J和K)均取得较好的诊断效果，与hc相比，SPs的POD值显著升高(L)， AUC值为0.9211 (M). *P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001。 AUC, area under the curve; CPs, confirmed patients; HCs, healthy controls; OTUs, operational taxonomy units; PCoA, principal coordinate analysis; POD, probability of disease; SPs, suspected patients. Centerline, median; box limits, upper and lower quartiles; circle or square symbol, mean; error bars, 95% CI.

在属层面( 图2 d)、五种主要细菌、 普氏菌， 奈瑟氏菌属， 韦永氏球菌属， 链球菌而且 Porphyromonas，两组的平均比例均为60% ( 在线补充表S3)。口腔微生物群在属和门水平上的平均组成和相对丰度显示在 图2 d而且 在线补充图S1F．在门水平上提出了不同的分析 在线补充图S1E（ 在线补充表S4)。

与hc相比，五个属包括 Porphyromonas而且 梭菌属消耗殆尽，而包括 纤毛菌属而且 月形单胞菌属均增加(p均<0.05)( 图2 c） （ 在线补充表S4)。其中, Porphyromonas而且 梭菌属属于 产生丁酸盐的细菌家族， 27而 纤毛菌属而且 月形单胞菌属产生脂多糖。丁酸作为一种短链脂肪酸，具有重要的抗炎作用。 18此外，脂多糖可激活核因子κB (NF-κB)通路和toll样受体，促进促炎细胞因子，激活免疫反应。 28因此，产丁酸细菌的减少和产脂多糖细菌的增加可能参与了COVID-19患者的炎症反应。

热图显示3个OTUs富集于CPs, 45个OTUs富集于hc ( 图2 e， 在线补充表S5)。我们进一步进行了线性判别分析(LDA)效应量(LEfSe)分析，并基于LDA选择了与CPs密切相关的最具代表性的属( 在线补充图S1G和表S6)。

为了评估口腔微生物标志物对COVID-19的诊断价值，我们在100个hc和48个CPs之间构建了随机森林分类器模型。最初，在随机森林模型中通过五次交叉验证，选择了8个能够准确识别两组差异的OTUs作为最佳标记集( 在线补充图S1H,I)。然后，我们利用8-OTU集( 在线补充表S7-S10)。CPs的POD指数明显高于hc ( 图2 f)， AUC为98.06% (95% CI 96.31% ~ 99.82%， p<0.0001) ( 图2 g)。这些数据表明，口腔微生物标志物可以从HCs中特异性识别COVID-19患者。

同时，在验证队列中使用24个CPs和50个hc来验证微生物生物标志物对CPs的诊断效果。POD指数( 图2 h)明显高于hc，两组间AUC值为95.75% (95% CI 90.99%至100%)(p<0.0001) ( 图2我)。此外，我们还从杭州CPs采集了74份舌苔样本，作为独立诊断。POD指数( 图2 j)在74个杭州CPs中明显高于hc，两组间的AUC值为87.24% (95% CI 80.5%至93.98%)(p<0.0001) ( 图2 k)。上述结果表明，基于口腔微生物组的新冠肺炎分类器具有较强的诊断效果。

 CPs, SPs和hc的口腔微生物特征

RT-PCR核酸检测被公认为新冠肺炎的金标准。 3.但由于病毒滴度低、采样错误等多种因素导致假阴性率高，漏检了许多cp，从而增加了传播范围。因此，迫切需要寻找一种新型的无创诊断辅助工具。我们收集了79个SPs及其匹配的SPRs样本，在排除恢复期IgG抗体阴性的患者后，使用37个SPs及其匹配的SPRs样本来验证诊断价值。POD指数( 图2 l)明显高于hc, SPs和hc之间的AUC为92.11% (95% CI 86.15%至98.07%)(p<0.0001) ( 图2米)，提示该分类器可作为COVID-19无创诊断的辅助工具。此外，还测定了22个CPs、37个SPs和6个hc的血清IgG水平( 图3一)。与hc相比，CPs和SPs中的IgG明显升高(p<0.0001， 在线补充表S11)，高于正常检测上限。

F3

CPs, SPs和hc的口腔微生物特征。(A)康复期间CPs (n=22)、SPs (n=37)和hc (n=6)抗SARS-CoV-2抗体水平。试剂盒阳性判决值为10 U/mL(>值为10 U/mL为阳性，<10 U/mL为阴性)。图中抗体水平按log计算2(价值)。(B)样品数量与OTUs数量之间的稀疏性分析。随着样本量的增加，在CPs (n=72)、SPs(37)和hc (n=150)中OTUs数量趋于饱和。与hc相比，CPs和SPs中的OTUs数量减少。通过Shannon指数估算，CPs和sp的口腔微生物多样性相似，但与hc相比显著降低。(C)基于OTU分布的PCoA显示，CPs和sp的口腔微生物群落与hc的相似，但差异显著。(D)属水平上三组细菌群落的平均组成和相对丰度。(E)三组中每个样品的差异OTUs相对丰度的热图。PCoA显示，CPs与sp (F)、CPRs与SPRs (G)之间口腔微生物群分布无显著差异。(H)四组细菌群落在属水平上的平均组成和相对丰度。CPs，确诊患者; CPRs, confirmed patients who recovered; HCs, healthy controls; OTUs, operational taxonomic units; PCoA, principal coordinate analysis; SPs, suspected patients; SPRs suspected patients who recovered. Centerline, median; box limits or upper and lower lines, upper and lower quartiles; circle or square symbol, mean; error bars, 95% CI.

每种疾病都有其独特的口腔微生物特征。 24我们推测相同的微生物特征可能源于相同的疾病，并分析了CPs、SPs和hc之间的口腔微生物特征，以证明从微生物组的角度将IgG阳性的SPs鉴定为CPs的可行性。

CPs (n=72)和SPs (n=37)的口腔微生物多样性相似(p>0.05)，但与hc (n=150)相比显著降低(p<0.001) ( 图3 b而且 在线补充图S2A和表S12)。PCoA和热图显示，CPs和sp的口腔微生物群落与hc相似，但有差异( 图3 c, E而且 在线补充图S2B和表S14)。维恩图显示2184个OTUs中有1280个在CPs和sp之间共享( 在线补充图S2C)。微生物属和门的平均组成显示在 图3 d而且 在线补充图S2D（ 在线补充图表S13)。这些结果表明，sp的口腔微生物丰度和组成与CPs基本一致，而与hc存在差异。

SP4 10.1136 / gutjnl - 2020 - 323826. - supp4

PCoA结果显示，CPs与sp、CPRs与SPRs的口腔微生物群分布无显著差异( 图3 f, G)。此外，在属水平上( 图3 h， 在线补充表S15)， CPs和CPRs之间的口腔微生物组变异与SPs和SPRs之间的微生物组变异基本一致。这些数据表明，IgG阳性SPs的口腔微生物特征与CPs一致，通过口腔微生物组诊断IgG阳性SPs为COVID-19是可行的。

 口腔微生物修复与COVID-19患者康复

cpr的口腔微生物多样性与cp相似，但与hc相比显著降低(p<0.001) ( 图4一而且 在线补充图S2E和表S16)。PCoA显示，cpr与cp和hc的口腔微生物分布不同( 图4 b， 在线补充图S2F)。维恩图显示，CPRs的1012个OTUs中有985个与hc共享，953个与CPs共享( 在线补充图S2G)。

F4

口腔微生物修复与COVID-19患者康复(A)样品数量与OTUs数量之间的稀疏性分析。随着样本量的增加，在CPs (n=72)、cpr(22)和hc (n=150)中OTUs数量趋于饱和。与hc相比，CPs和CPRs中的OTUs数量减少。通过Shannon指数估算，cpr的口腔微生物多样性与CPs相似，但与hc相比显著降低。(B)基于OTU分布的PCoA显示，cpr与cp和hc的口腔微生物群落不同。(C)随着COVID-19的恢复，5个属的相对丰度逐渐增加，各组间差异显著，而5个属的相对丰度逐渐减少，各组间差异显著。(D)三组中每个样品的差异OTUs相对丰度的热图。红框从左到右表示OTUs丰度的逐渐增加，绿框从左到右表示OTUs丰度的逐渐减少。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001。 CPs, confirmed patients; CPRs, confirmed patients who recovered; HCs, healthy controls; OTUs, operational taxonomic units; PCoA, principal coordinate analysis. Centerline, median; box limits, upper and lower quartiles; circle or square symbol, mean; error bars, 95% CI.

口腔微生物组在门和属水平上的平均组成和相对丰度显示在 在线补充图S2H,J（ 在线补充表S17)。门和属水平的差异分析见 在线补充图S2I而且 图4 c（ 在线补充表S18)。随着新冠肺炎疫情的恢复，5个属如 Porphyromonas， 嗜血杆菌而且 Family_XIII_incertae_sedis持续增加(p<0.001)，而包括 纤毛菌，巨藻和硒单胞菌持续降低(p<0.01)。值得注意的是, Megasphaera随着龋齿的进展而增加。 29这些相似的结果表明，对这些细菌的干预可能会对患者的结果产生影响。热图还显示，CPRs的口腔微生物群落与CPs和hc不同，差异OTUs丰度在CPs和hc之间( 图4 d而且 在线补充表S19)。我们进行了LEfSe分析，并在LDA上选取了三组中最具代表性的属( 在线补充图S2K和表S20)。这些数据表明，口腔微生物组可能参与了COVID-19患者的康复。

 肠道微生物组作为COVID-19的无创诊断模型

除了口腔微生物组，肠道微生物组也与病毒性疾病密切相关，如乙肝病毒， 9丙肝病毒 30.和艾滋病毒。 31因此，我们对发现队列中的24个CPs和48个hc进行了测序。与hc相比，CPs的粪便微生物多样性显著降低(p<0.001， 图5一个而且 在线补充图S3A、B和表S21)。维恩图显示1704个OTUs中有1003个是CPs特有的( 在线补充图S3C)。PCoA和非度量多维尺度(NMDS)显示了粪便微生物群落的明显区别( 图5 b而且 在线补充图S3D)。

SP5 10.1136 / gutjnl - 2020 - 323826. - supp5

F5

肠道微生物组作为COVID-19的无创诊断模型。(A)样品数量与OTUs数量之间的稀疏性分析。随着样本量的增加，在CPs (n=24)和hc (n=48)中OTUs数量趋于饱和。与hc相比，CPs中OTUs数量减少。据Shannon指数估计，与hc相比，CPs的肠道微生物多样性显著降低。(B)基于OTU分布的PCoA显示两组间肠道分类组成存在显著差异。(C)属水平上两组细菌群落的平均组成和相对丰度。(D)与hc相比，CPs中有5个属显著富集，5个属显著减少。(E)两组中每个样品的差异OTUs相对丰度的热图。与hc相比，CPs的POD值显著升高，在发现队列(F和G)、验证队列(H和I)均具有较好的诊断效果，与hc相比，SPs的POD值显著升高(J)， AUC值为0.9801 (K)， **P<0.01， *** P< 0.001。 AUC, area under the curve; CPs, confirmed patients; HCs, healthy controls; OTUs, operational taxonomy units; PCoA, principal coordinate analysis; POD, probability of disease; SPs, suspected patients. Centerline, median; box limits, upper and lower quartiles; circle or square symbol, mean; error bars, 95% CI.

在属和门水平上，两组粪便微生物群的平均组成和相对丰度显示在 图5 d而且 在线补充图S3F（ 在线补充表S22)。在门和属水平上的差异分析在 在线补充图S3E而且 图5 c（ 在线补充表S23)。与hc相比，cp减少5个属，增加5个属(p<0.05)。热图显示7个OTUs富集于CPs, 27个OTUs富集于hc ( 图5 e而且 在线补充表S24)。基于LEfSe分析，我们进一步筛选出了与CPs相关的最具代表性的属( 在线补充图S3G和表S25)。

为了评估粪便微生物标志物对COVID-19的诊断价值，我们基于7个最优标记集，在48个hc和14个CPs之间构建随机森林分类器模型( 在线补充图S3H,I和表S26-S28)。然后，我们计算了发现和验证队列的POD指数。CPs的POD指数明显高于hc ( 图5 f)， AUC为99.74% (95% CI 99.16%至100%，p<0.0001) ( 图5克)。在验证阶段，POD索引( 图5 h) CPs (n=12)明显高于hc (n=24)， AUC为99.31% (95% CI 97.66%至100%，p<0.0001) ( 图5我)。这些结果表明，该分类器对COVID-19有很大的诊断潜力。

 不同组的肠道微生物变化

接下来，我们收集了23个SPs的样本并进行测序，并对恢复过程中IgG阳性的SPRs进行配对。POD指数( 图5 j)的AUC为98.01% (95% CI 95.11%至100%，p<0.0001， 图5 k)，表明该分类器也可以作为COVID-19无创诊断的辅助工具。测定18例CPs、23例SPs和6例hc的血清IgG水平( 图6)。恢复期间，CPs和SPs的IgG水平明显高于hc (p<0.0001， 在线补充表S18)。

F6

CPs、SPs和hc之间的肠道微生物改变。(A)康复期间CPs (n=18)、SPs (n=23)和hc (n=6)抗SARS-CoV-2抗体水平。试剂盒阳性判决值为10 U/mL(>为10 U/mL为阳性，<10 U/mL为阴性)。图中抗体水平按log计算2(价值)。(B)样品数量与OTUs数量之间的稀疏性分析。随着样本量的增加，在CPs (n=36)、SPs (n=23)和hc (n=72)中OTUs数量趋于饱和。与hc相比，CPs和SPs中的OTUs数量减少。通过Shannon指数估算，CPs和SPs的粪便微生物多样性相似，但与hc相比显著降低。(C)基于OTU分布的PCoA显示，CPs和sp的肠道微生物群落与hc相似，但差异显著。(D)属水平上三组细菌群落的平均组成和相对丰度。(E)三组中每个样品的差异OTUs相对丰度的热图。PCoA显示，CPs与sp (F)、CPRs与SPRs (G)的粪便微生物群分布无显著差异。(H)四组细菌群落在属水平上的平均组成和相对丰度。hc，健康对照; CPs, confirmed patients; SPs, suspected patients; OTUs, operational taxonomy units; PCoA, principal coordinate analysis; CPRs, confirmed patients who recovered; SPRs, suspected patients who recovered. Centerline, median; box limits or upper and lower lines, upper and lower quartiles; circle or square symbol, mean; error bars, 95% CI.

相似的肠道菌群特征可能源于相同的疾病。因此，我们分析了CPs (n=36)、SPs (n=23)和hc (n=72)的粪便微生物特征。CPs和SPs的粪便微生物多样性相似，但与hc相比显著降低(p<0.001， 图6 b而且 在线补充图S4A和表S29)。PCoA和NMDS ( 图6 c而且 在线补充图S4B)显示cp和SPs的粪便微生物群相似，但与hc不同。维恩图显示1421个OTUs中有722个在CPs和sp之间共享( 在线补充图S4C)。粪便微生物群在属和门水平的平均组成显示在 图6 d而且 在线补充图S4D（ 在线补充表S30)。热图( 图6 e， 在线补充表S31)显示，在CPs和SPs与hc中，18个OTUs富集，30个OTUs枯竭。PCoA结果显示，CPs与sp、cpr与SPs的粪便微生物群分布无显著差异( 图6 f, G)。此外，在属水平上( 图6 h， 在线补充表S32)， CPs和CPRs之间的粪便微生物变化与SPs和spr之间的粪便微生物变化基本一致。这些结果表明，来自SPs的粪便微生物特征与来自CPs的基本一致。

SP6 10.1136 / gutjnl - 2020 - 323826. - supp6

与CPs (n=36)相比，cpr (n=18)的粪便微生物多样性增加(Shannon指数，p<0.05)，但与hc (n=72)相比，显著降低(p<0.001) ( 图7而且 在线补充图S4E和表S33)。PCoA和NMDS ( 图7 b而且 在线补充图S4F)的结果显示，cpr的粪便微生物群落与CPs和hc的粪便微生物群落不同。维恩图显示，CPRs的816个OTUs中有769个与hc共享，615个与CPs共享( 在线补充图S4G)。

F7

肠道微生物恢复与COVID-19患者康复(A)样品数量与OTUs数量之间的稀疏性分析。随着样本量的增加，在CPs (n=36)、CPRs (n=18)和hc (n=72)中OTUs数量趋于饱和。与hc相比，CPs和CPRs中的OTUs数量减少。根据Shannon指数估计，cpr的粪便微生物多样性比CPs增加，但比hc显著降低。(B)基于OTU分布的PCoA显示，cpr与CPs和hc的粪便微生物群落不同。(C)随着COVID-19的恢复，5个属的相对丰度逐渐增加，各组间差异显著，而5个属的相对丰度逐渐减少，各组间差异显著。(D)三组中每个样品的差异OTUs相对丰度的热图。红框从左到右表示OTUs丰度的逐渐增加，绿框从左到右表示OTUs丰度的逐渐减少。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001。 HCs, healthy controls; CPs, confirmed patients; OTUs, operational taxonomy units; PCoA, principal coordinate analysis; CPRs, confirmed patients who recovered. Centerline, median; box limits, upper and lower quartiles; circle or square symbol, mean; error bars, 95% CI.

在门和属水平上，三组粪便微生物群的平均组成和丰度显示在 在线补充图S4H,J（ 在线补充表S34)。在门和属水平上的差异分析在 在线补充图S4I而且 图7 c（ 在线补充表S35)。随着COVID-19的恢复，5个属持续升高(p<0.05)， 5个属持续下降(p<0.01)。其中, 毛螺菌属可以通过发酵纤维产生短链脂肪酸， 32而且 Faecalibacterium通过抑制NF-κB和干扰素γ具有抗炎特性，已被认为是人类健康的潜在生物标志物。 33因此，这些细菌可能通过减少炎症细胞因子风暴和促进免疫系统改善来促进患者康复。 34

热图显示，CPRs的粪便微生物群落与CPs和hc不同，差异OTUs丰度在CPs和hc之间( 图7 d， 在线补充表S36)。我们进行了LEfSe分析，并在LDA上选取了三组中最具代表性的属( 在线补充图S4K和表S37)。

 微生物组和脂质组之间的联系有助于CPs的恢复

代谢物在COVID-19的进展中发挥重要作用。 17然而，COVID-19和康复患者的脂质组学特征尚未见报道，其在康复过程中的作用也未见报道。因此，我们使用UPLC-MS非靶向脂质组学方法检测了155个样本，包括73个CPs, 30个sp, 22个cpr和30个spr。我们获得了高质量的数据( 在线补充图S5A-D)。共鉴定和定量了808个脂质分子( 在线补充表S38)。在亚类水平上，四组中磷脂酰胆碱(PC)、甘油三酯(TG)和鞘磷脂(SM)平均占80% ( 图8， 在线补充图S5E和表S39)。

SP7 10.1136 / gutjnl - 2020 - 323826. - supp7

F8

微生物组和脂质组之间的联系有助于CPs的恢复。(A)在子类水平上，CPs (n=73)和CPRs (n=22)中脂类的平均组成和相对丰度。(B)主成分分析显示，脂质在CPRs (n=22)和CPs (n=73)中的分布不同。(C)基于KEGG确定了CPs (n=73)和cpr (n=22)之间差异最大的20条富集通路。点的大小代表代谢物的数量。(D)热图显示了CPs (n=11)和hc (n=18)之间28个不同的口腔OTUs和28个不同的肠道OTUs之间的部分Spearman相关系数。红色代表正相关，绿色代表负相关。(E) 22种辨别性口腔微生物OTUs、4种辨别性粪便微生物OTUs和CPs (n=36)和cpr (n=18)中10种辨别性脂分子之间的关系。点的颜色表示该属的不同门。每个属的点的大小表示平均相对丰度。 The circle points represent the faecal microbiome, square points represent the lipid molecule and diamond points represent the tongue-coating microbiome. The transparency of the lines represents the negative logarithm (base 10) of the p value of correlation (Spearman’s), red lines represent negative correlations, blue lines represent positive correlations and the width of the lines represents the size of the correlation (Spearman’s). HCs, healthy controls; CPs, confirmed patients; OTUs, operational taxonomy units; CPRs, confirmed patients who recovered.

主成分分析及热图( 图8 b而且 在线补充图S6A和表S40)显示，CPs与CPRs之间存在明显差异，其中SM(d40:4)、SM(d38:4)、单甘油酯(33:5)等47个脂质分子被消耗，PC(36:4p)、PE(16:0p/20:5)、双甘油酯(20:1/18:2)等122个脂质分子被富集。此外，在CPs和CPRs之间发现了20种差异最大的富集通路( 图8 c)，包括产热和坏死。SPs和SPRs的结果载于 在线补充图S5F-G和S6B．

SP8 10.1136 / gutjnl - 2020 - 323826. - supp8

我们分析了28种口腔和28种粪便特有微生物OTUs在CPs和hc之间的相关性。其中11个口腔微生物群，如OTU2284 ( Porphyromonas),OTU1642 (嗜血杆菌)和OTU1868 (普氏菌)与富集hc的OTU1153呈正相关( Roseburia)，但与富含cp的OTU1741负相关( Halomonas)(p < 0.05) ( 图8 d， 在线补充表S41)。

人体微生物组通过向血液中分泌代谢物参与疾病的发生和发展。 35 36因此，在CPs和CPRs中分析了口腔和粪便微生物群与脂质组学之间的相关性。Spearman相关分析显示，4种粪便微生物OTUs、22种口腔微生物OTUs与10种脂质分子( 图8 e)。cpr富集tg(26:0/18:1/18:2)与4种cp富集粪便OTUs呈负相关，包括OTU953 ( 链球菌)， otu920 ( 罗思氏菌属)及OTU624 ( Halomonas) (p<0.05)，且与crp富集的口服OTU1801呈正相关( 梭菌属) (p < 0.05)。有趣的是，cpr富集的OTU1801 ( 梭菌属)与10个富含cpr的脂质分子呈正相关，与OTU624呈负相关( Halomonas)， otu920 ( 罗思氏菌属)及OTU953 ( 链球菌)，在CPs的粪便样本中富集。

此外，我们进行了Spearman相关分析( 在线补充图S5H)，发现wbc与25个OTUs呈正相关，包括OTU2628 ( Porphyromonas)及OTU2247 ( 奈瑟氏菌属)(p<0.05)，与5个OTUs呈负相关，其中OTU1135 ( 韦永氏球菌属)及OTU186 ( 纤毛菌属) (p < 0.05)。淋巴细胞与37个OTUs呈正相关，包括OTU1891 ( 奈瑟氏菌属)及OTU2628 ( Porphyromonas) (p<0.05)，与4个OTUs呈负相关，其中OTU1135 ( 韦永氏球菌属)及OTU390 ( Megasphaera) (p < 0.05)。粪便微生物群与临床指标之间的相关性在 在线补充图S5I．总之，这些结果表明，独特的脂质分子与口腔和肠道微生物组的变化密切相关，而独特的脂质和微生物组与COVID-19的恢复密切相关。

 讨论

我们的研究首先发现了与covid -19相关的口腔微生物群的组成和功能改变，确定了特定的微生物标志物并构建了诊断模型，在中国两个不同地区的三个队列中取得了良好的诊断效果。令人信服的研究表明，口腔微生物组与病毒性疾病密切相关，可以作为特定疾病或病毒性疾病的非侵入性诊断工具。张 等 37提出一种口腔微生物诊断模型，并验证其对类风湿关节炎(RA)的诊断效果。Flemer 等 38研究结直肠癌口腔微生物组改变，建立基于16种口腔微生物标志物的诊断模型，取得较好的诊断效果。因此，我们首次提出口腔微生物标志物可能是一种潜在的COVID-19非侵入性诊断工具。同时，我们首次提出并成功地将IgG阳性的SPs诊断为COVID-19患者。

每种疾病都有其独特的口腔和肠道微生物变化。 24类风湿性关节炎患者口腔菌群失调表现为 唾液乳杆菌和消耗 嗜血杆菌spp。 37 Porphyromonas， Tannerella而且 梭菌属牙周炎丰富。 39在我们的研究中，我们发现IgG阳性的SPs中的微生物改变与CPs是一致的，这支持了我们从微生物组的角度使用微生物模型诊断SPs为CPs的想法。微生物标志物联合RT-PCR可进一步提高人群中对潜在COVID-19患者的检测效果，减少传染源和传播范围。

微生物组与疾病恢复密切相关。类风湿性关节炎和牙周炎患者的口腔微生物失调在治疗后部分恢复正常， 37个40这表明微生物群在恢复中起着重要作用。我们首次报道了COVID-19恢复期患者口腔微生物群和脂质组学的特征，并发现了可能与COVID-19的发展和预后有关的关键细菌和脂质分子。微生物群可能通过将脂质分子分泌到血液中来影响COVID-19的进展。我们的工作报告了微生物组和脂类之间的相关性。口腔和肠道微生物群分别与白细胞、淋巴细胞等临床指标相关。随着微生物组影响疾病的可能机制的进一步研究，微生物辅助诊断、治疗和预后在COVID-19的应用前景广阔。

作者要感谢所有参与这项研究的志愿者。感谢中国广山县人民医院和郑州大学第一附属医院所有参与抗击COVID-19的临床医生。

ZR、HW、GC、HL和LW贡献相同。

这篇文章在Online First发表后已被更正。平等供款表已更新。

ZR, LL和ZY设计了研究。收集临床标本ZR、HL、LW、HL、XW、BR、HZ、XL、HC、CY、XC。HR和JS提取细菌DNA。HL和XL进行MiSeq测序。GC、XC、WL、ZW完成脂组学检测分析。HW、GC、CL、RS、AL、CY和QK对数据进行了分析。HW, ZR和BL撰写了手稿。所有作者审阅并批准了手稿。

本研究由国家科技重大专项(2018ZX10301201)、中国博士后科学基金(2020T130609、2020T130109ZX)、国家重点研发计划(2018YFC2000500)、国家自然科学基金(U2004121、82070643、U1904164)、河南省科技计划(202102310055)、国际和平妇幼保健院新冠肺炎疫情防控项目资助。上海交通大学医学院(2020-COVID-19-01)和浙江大学医学院第一附属医院传染病诊疗国家重点实验室和传染病诊疗协同创新中心开放基金(SKLID2019KF03)。

没有宣布。

不是委托;外部同行评审。

此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。

 数据可用性声明

数据可以在一个公共的、开放访问的存储库中获得。所有样本的原始Illumina读取数据保存在欧洲生物信息研究所欧洲核苷酸档案数据库(PRJNA660302)中。

 伦理语句 患者发表同意书

不是必需的。

 伦理批准

本研究由郑州大学第一附属医院(2020-KY-055)和广山县人民医院(2020-001)机构审查委员会批准。该研究是根据赫尔辛基宣言和良好临床实践规则进行的。在研究方案得到充分解释后，所有参与者都签署了书面知情同意书。

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