主要gydF4y2Ba

为了更好地了解对SARS-CoV-2的免疫反应生物学，我们将COVID-19患者(即SARS-CoV-2病毒检测呈阳性的患者)与出现类似呼吸道症状但未感染SARS-CoV-2的患者进行了比较。我们招募了21名SARS-CoV-2阳性的住院患者;临床表现相似，符合急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征，新冠病毒阴性(即由其他感染引起或原因不明)的住院患者11例;和14个健康的对照组。我们进一步根据其疾病的全部临床病程将这些患者分为“轻度-中度”疾病(需要短期住院，不需要机械通气和重症监护)或“重度”疾病(需要插管和重症监护)(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．因此，我们的研究包括轻度-中度COVID-19患者(gydF4y2BangydF4y2Ba= 11)，严重COVID-19患者(gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)，以及轻度-中度(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6)或严重(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)与COVID-19无关的急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征。除1例患者外，所有表现为轻中度疾病的患者在住院期间均保持轻中度(扩展数据图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，表明在该队列中，轻度-中度和重度是稳定状态，而不是疾病的短暂阶段。gydF4y2Ba

图1:严重COVID-19疾病的特征是缺乏干扰素反应性中性粒细胞。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，左，患者和健康对照个体的性别、SARS-CoV-2状态和疾病严重程度，右，研究设计说明。Ab抗体。gydF4y2BabgydF4y2Ba，左，统一流形近似和投影(UMAP)可视化116,517个细胞合并从整个队列与特定群体的细胞覆盖。右，这些细胞群在健康对照个体(Ctrl)、轻中度疾病患者(M/M)和严重疾病患者中的频率。gydF4y2BacgydF4y2Ba，中性粒细胞亚群UMAP显示。这些子集是根据它们的基因表达来命名的;日博。，enr我ched我nribosomal proteins.dgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba， SARS-CoV-2状态和疾病严重程度分别对中性粒细胞UMAP的覆盖。gydF4y2BafgydF4y2Ba， ISG频率gydF4y2Ba+gydF4y2Ba根据SARS-CoV-2状态(阳性或阴性)和疾病严重程度(对照，gydF4y2BangydF4y2Ba= 14;SARS-CoV-2-negative M / M,gydF4y2BangydF4y2Ba= 6;SARS-CoV-2-negative严重,gydF4y2BangydF4y2Ba= 5;SARS-CoV-2-positive M / M,gydF4y2BangydF4y2Ba= 11, sars - cov -2阳性严重gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)。gydF4y2BaggydF4y2Ba在SARS-CoV-2阳性患者中，中性粒细胞亚型和疾病严重程度的ISG-signature评分。采用双向方差分析(ANOVA)和多重比较(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba)或双面Wilcoxon检验(gydF4y2BafgydF4y2Ba)．＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01， ****gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001。对于箱形图gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba:中线，中间;盒子限制，第25和75百分位;胡须，最小值和最大值。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

由于大多数COVID-19死亡发生在急性呼吸窘迫综合征患者中，其特征是强烈的免疫反应，其中中性粒细胞、单核细胞和血小板的作用突出，因此我们重点收集了这些细胞和其他主要种群。因此，我们对所有个体的红细胞耗尽的血液样本进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。经过合并、批量校正和去除孪晶后，我们的数据包含116,517个细胞(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)，其中我们鉴定出中性粒细胞、血小板、单核吞噬细胞、T细胞、自然杀伤细胞(NK)、B细胞、浆细胞和嗜酸性粒细胞(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．我们证实中性粒细胞频率与疾病严重程度呈正相关，而淋巴细胞种群呈负相关gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．在这个分辨率水平上，SARS-CoV-2病毒呈阴性和阳性的个体之间的结果相似(扩展数据图)。gydF4y2Ba1 f-egydF4y2Ba）gydF4y2Ba

在中性粒细胞中，我们鉴定出7个亚型(图2)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，与之前的研究一致gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba．一种表达强烈干扰素刺激基因(ISG)签名的人群(以下称为ISG中性粒细胞)在COVID-19患者中高度富集，但在病情严重的患者中没有(图2)。gydF4y2Ba1 d, egydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．独立伪时间分析(扩展数据图。gydF4y2Ba2 dgydF4y2Ba)将ISG亚型置于分化晚期，并表明这是唯一在轻中度疾病患者和重度疾病患者之间发生显著变化的状态(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)，特别是在SARS-CoV-2阳性的个体中(图2)。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．isg特征基因包括主要抗病毒调节因子，如gydF4y2BaISG15gydF4y2Ba而且gydF4y2BaIFITM3gydF4y2Ba后者编码干扰素诱导的跨膜蛋白3，限制病毒进入细胞质gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

我们还分析了所有中性粒细胞中SARS-CoV-2阳性和阴性患者的差异表达基因(deg)，以及轻中度疾病患者和重度疾病患者的差异表达基因。与sars - cov -2阳性的重症患者相比，isg标记基因在所有中性粒细胞亚群中均表现出较高的相对表达水平，特别是在轻-中度疾病患者中。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba2 h ngydF4y2Ba)．相比之下，与轻中度疾病患者相比，无论COVID-19状态如何，重症患者的中性粒细胞中单独的中性粒细胞脱颗粒基因程序上调(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 o-pgydF4y2Ba)．这表明，无论病原是什么，在所有呼吸道感染中都存在一个共同的脱颗粒增强程序，并且在轻度-中度COVID-19患者的所有中性粒细胞中都发生了ISG程序的全面诱导，而在重度COVID-19患者中没有这种诱导gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

对单核吞噬细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和浆细胞样树突状细胞)的评估得出了7组转录上不同的细胞亚群，这些亚群在我们的队列中均匀分布(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．我们发现，在COVID-19患者中，特别是在轻中度疾病患者中，经典单核细胞的isg表达簇富集，与中性粒细胞相似(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba4得了gydF4y2Ba)．表达isg的单核细胞也表达与糖酵解相关的基因;相比之下，表达S100钙结合蛋白A12 (S100A12)的单核细胞亚群富集了与氧化磷酸化相关的基因，这与先前关于细菌性败血症的报道一致gydF4y2Ba6gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．对deg的分析表明，当整个单核吞噬细胞池被评估时，isg是与轻度-中度表型相关的显性基因(扩展数据图)。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

图2:严重COVID-19疾病的定义是外周血免疫细胞缺乏一致的干扰素反应。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba轻-中度疾病患者(sars - cov -2阴性，gydF4y2BangydF4y2Ba= 6;SARS-CoV-2-positive,gydF4y2BangydF4y2Ba= 11)和严重疾病(sars - cov -2阴性，gydF4y2BangydF4y2Ba= 5;SARS-CoV-2-positive,gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)。树突状细胞;pDCs，浆细胞样树突状细胞。中线，中间;盒子限制，第25和75百分位;胡须，最小值和最大值。gydF4y2BabgydF4y2Ba，散点图显示ISG之间的相关性gydF4y2Ba+gydF4y2Ba中性粒细胞和ISGgydF4y2Ba+gydF4y2Ba指示组患者的单核细胞亚群。gydF4y2BaPgydF4y2Ba值与斯皮尔曼秩相关系数(gydF4y2BaρgydF4y2Ba)显示(M/M，gydF4y2BangydF4y2Ba= 11;严重,gydF4y2BangydF4y2Ba= 10;SARS-CoV-2-negative,gydF4y2BangydF4y2Ba= 11)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，根据SARS-CoV-2状态和疾病严重程度，所有T细胞(上)和所有B细胞和浆细胞(下)中ISG-signature评分的小提琴图。采用双侧Wilcoxon检验评估统计学意义。gydF4y2BadgydF4y2Ba，使用与ISG相关最多和最少的细胞子集之间的斯皮尔曼秩相关的相关矩阵gydF4y2Ba+gydF4y2Ba中性粒细胞(数据包括所有SARS-CoV-2阴性和阳性患者)。Mon.，单核细胞，ne。中性粒细胞。gydF4y2BaegydF4y2Ba，所有血小板的isg特征评分，根据SARS-CoV-2状态和疾病严重程度。gydF4y2BafgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BahgydF4y2Ba，所有患者的三维PhEMD嵌入，以新生患者簇A-H着色(gydF4y2BafgydF4y2Ba)、SARS-CoV-2状态(gydF4y2BaggydF4y2Ba)和疾病严重程度(gydF4y2BahgydF4y2Ba)．基于亲和的过渡包埋热扩散势。采用双尾Spearman秩相关检验(gydF4y2BabgydF4y2Ba)、多重比较的Kruskal-Wallis检验(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)或双面Wilcoxon检验(gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba)．＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05， ****gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

表达ISG的频率(ISGgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)单核细胞和ISGgydF4y2Ba+gydF4y2Ba在轻-中度COVID-19患者中，中性粒细胞之间的相关性很强(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．T细胞和B细胞频率的综合分析(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)显示，这两种细胞类型的ISG特征也显著富集，特别是在轻-中度COVID-19患者中(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．ISG的频率gydF4y2Ba+gydF4y2Ba一个区室中的细胞与另一个区室中的细胞相互关联，例如ISGgydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞和ISGgydF4y2Ba+gydF4y2Ba中性粒细胞-仅存在于轻中度疾病患者(扩展数据图)。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)．因此，所有患者的多种细胞类型的Spearman相关分析显示了相关的ISG集合gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞群和其他细胞群的第二个抗相关块，特别是那些表达S100A12的细胞群(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们的scRNA-seq全血数据集也允许我们识别血小板，并根据已建立的血小板特征基因将其分类为亚群(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．对这些基因的分析发现了6个基因簇，其中3个(命名为“H3F3B”，“HIST1H2AC”和“RGS18”)仍然携带从亲本细胞(巨核细胞)获得的转录本。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba)．在严重的COVID-19患者中，HIST1H2AC亚群仅少量耗尽，表明偏离了“年轻”细胞(扩展数据图)。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)．为了进一步研究这一发现，我们覆盖了的表达式gydF4y2BaBCL2L1gydF4y2Ba，它已被确定为血小板寿命的“分子钟”，并添加到我们的数据集中gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．这表明富含组蛋白的H3F3B簇代表“年轻”血小板(扩展数据图。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba)——这一结果得到了年轻的网状血小板转录本的第二个签名的支持gydF4y2Ba9gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)．基于H3F3B聚类的伪时间分析(扩展数据图。gydF4y2Ba6 f, ggydF4y2Ba)再次表明，在轨迹终点，来自所有疾病患者的血小板普遍过量(扩展数据图。gydF4y2Ba6小时gydF4y2Ba)．虽然我们没有明确的ISGgydF4y2Ba+gydF4y2Ba集群(扩展数据图。gydF4y2Ba6我gydF4y2Ba)，类似于髓样细胞和淋巴样细胞，轻中度疾病患者血小板中的isg标记值相对于严重疾病患者有所增加，特别是对于COVID-19患者(图2)。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

血小板scRNA-seq还允许使用“血小板优先”方法鉴定血小板和非血小板之间的异型聚集物(扩展数据图)。gydF4y2Ba7得了gydF4y2Ba)．这种方法揭示了与细胞相关的血小板转录物的存在，这些细胞也具有其他主要血细胞类型的特征(扩展数据图)。gydF4y2Ba7得了gydF4y2Ba)．与原始数据集相比，我们发现在这个“血小板优先”对象中细胞类型的频率没有显著差异(扩展数据图。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba)．这表明，至少在循环血液中，血小板与不同的其他细胞类型不加区别地聚集在一起，而不会偏向于某一种细胞类型。gydF4y2Ba

重症COVID-19整体评估gydF4y2Ba

在观察到在轻中度疾病患者中每种细胞类型的ISG表达谱都有所增加，但在重度疾病患者中整体减少后，我们转向了疾病状态的整体观点。PhEMD(“表型地球移动者的距离”)gydF4y2Ba10克ydF4y2Ba根据患者的细胞亚型频率对其进行包埋，结果显示有8组不同的患者。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)，其中从A到H的进展代表中性粒细胞相对频率普遍增加的患者。C、D、G、H组为单核细胞相对富集的患者。E组为ISG富集的患者gydF4y2Ba+gydF4y2Ba中性粒细胞，主要由sars - cov -2阳性的轻中度疾病患者组成(图。gydF4y2Ba2 g hgydF4y2Ba)．相比之下，G组是患者的另一种“严重”命运，中性粒细胞高度富集，S100A12占优势gydF4y2Ba+gydF4y2Ba而不是ISGgydF4y2Ba+gydF4y2Ba中性粒细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

血清干扰素α (IFNα)检测不能解释ISG的丢失gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在重症患者中观察到大量的IFNα产生(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．然而,研究小组gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞群与较轻的COVID-19疾病严重程度密切相关，表现出较高的血清IFNα浓度和较低的血浆表面活性蛋白D (SP-D)水平(表明肺泡上皮损伤)(扩展数据图)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．当与高维血浆蛋白水平面板进行比较时(扩展数据图。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)，大多数ISGgydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞亚型聚集在一起，并与指示强烈的ISG和T辅助性1 (TgydF4y2BaHgydF4y2Ba1)响应(CXCL1, CXCL6, CXCL10, CXCL11, TNFB, IL-12B, MCP2和MCP4)。ISG状态的一个意想不到的反相关是针对SARS-CoV-2刺突和核衣壳蛋白的血清抗体浓度(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

图3:重症COVID-19患者抗体对ISG诱导的中和作用。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba、轻中度疾病患者血清IFNα浓度(gydF4y2BangydF4y2Ba= 17)或严重疾病(gydF4y2BangydF4y2Ba= 15)，这些人的SARS-CoV-2呈阴性或阳性(通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定)。患者1055和1060用红色突出显示，以及他们的ISG频率gydF4y2Ba+gydF4y2Ba单核细胞(图;gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)，轻中度COVID-19患者的中位数频率也是如此。中线，中间;盒子限制，第25和75百分位;胡须，1.5 ×四分位范围。gydF4y2BabgydF4y2Ba， Luminex法检测患者血清中抗sars - cov -2抗体(抗刺突蛋白和核衣壳蛋白)水平。gydF4y2BacgydF4y2Ba，显示SARS-CoV-2阳性患者的病毒载量与结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白的抗体水平的散点图，疾病严重程度重叠。抗体水平(抗SARS-CoV-2刺突蛋白的全抗体滴度)显示为Luminex测定的任意单位中位数荧光强度(MFI);病毒载量用倒数表示gydF4y2BaCgydF4y2BatgydF4y2Ba以SARS-CoV-2核衣壳序列为靶点扩增的定量PCR反转录(qRT-PCR)编号。采用Spearman方法计算相关系数和显著性。无法获得数据的患者被排除在外(M/M，gydF4y2BangydF4y2Ba= 9;严重,gydF4y2BangydF4y2Ba= 7)。gydF4y2BadgydF4y2Ba，显示针对SARS-CoV-2刺突蛋白的完整抗体滴度相对于症状出现后几天的散点图。无法获得数据的患者被排除在外(M/M，gydF4y2BangydF4y2Ba= 14;严重,gydF4y2BangydF4y2Ba= 8)。gydF4y2BaegydF4y2Ba用IFNα和健康供体或轻中度或重度COVID-19患者血清培养健康pmcs后，单核细胞CD14和IFITM3表达等高线图和直方图。患者标识符(1005、1006等)显示在顶部。gydF4y2BafgydF4y2Ba，用蛋白A/G珠预处理轻度-中度(浅黄色)或重度(粉红色)COVID-19患者血清后，在与pbmc培养前，单核细胞CD14和IFITM3表达的等高线图和直方图，以耗尽IgG水平。gydF4y2BaggydF4y2Ba，左，IFITM3在CD14中表达的Fold变化gydF4y2Ba+gydF4y2Ba单核细胞(控制,gydF4y2BangydF4y2Ba= 5;M / M,gydF4y2BangydF4y2Ba= 21;严重,gydF4y2BangydF4y2Ba= 14;M / M耗尽,gydF4y2BangydF4y2Ba= 11;严重的枯竭,gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)。对，经典单核细胞与中间单核细胞的比例(对照，gydF4y2BangydF4y2Ba= 4;M / M,gydF4y2BangydF4y2Ba= 24;严重,gydF4y2BangydF4y2Ba= 7;M / M耗尽,gydF4y2BangydF4y2Ba= 11;严重的枯竭,gydF4y2BangydF4y2Ba= 7)，来自两个不同的实验和两个不同的健康捐赠者。gydF4y2BahgydF4y2Ba，左为合并CD3后IFITM3表达的等高线图和直方图gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba+gydF4y2Ba用IFNα和健康供体或SARS-CoV-2阳性患者的血清培养健康pmcs和淋巴细胞。对，IFITM3在淋巴细胞中的诱导。统计意义gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba采用双因素方差分析和多重比较进行评估。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01， ***gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001， ****gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001。对于箱形图gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba:中线，中间;盒子限制，第25和75百分位;胡须，最小值和最大值。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

这种反相关性是明显的，并且在严重COVID-19患者血清中较高水平的IgG抗体或免疫复合物中没有强烈反映(扩展数据图)。gydF4y2Ba8 d-fgydF4y2Ba)．我们认为严重COVID-19患者具有更高水平的潜在中和抗体是一个悖论。这一发现似乎与之前的报告相矛盾，这些报告显示病毒载量与COVID-19的严重程度和死亡率有关gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba-这种差异可以解释为这些研究检查了高死亡率的患者，这在我们的队列中是非常罕见的事件(补充表)gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．入院当天，两种抗体(即针对SARS-CoV-2刺突和核衣壳蛋白)的特异性与从鼻拭子评估的病毒载量呈反相关(图2)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)，与这些中和抗体相一致(尽管没有确切的证据)。据报道，抗体滴度增加和病毒载量下降是疾病后期的一个特征gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，我们考虑了我们观察到的轻中度疾病只是先于严重疾病的假设。然而，我们发现，随着时间的推移，与轻中度疾病患者相比，重症COVID-19患者的抗体滴度始终较高——甚至在症状出现两周后(图2)。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba) -在我们的21例轻中度疾病患者中，只有1例继续发展为严重疾病(扩展数据图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．最后，我们观察到症状发作日期与ISG的存在之间没有统计学相关性gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞群(扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．这些因素似乎反对轻度-中度和重度状态之间的简单时间关系，并引导我们研究血清中这种状态分裂的系统病因。gydF4y2Ba

抗体拮抗ISG反应gydF4y2Ba

考虑到这种抗体的增强，我们首先询问了重症COVID-19患者的血清是否也含有抗ISG抗体gydF4y2Ba+gydF4y2Ba通过将血清直接应用于健康个体的外周血单个核细胞(pmcs)，与IFNα和不含IFNα培养(扩展数据图)。gydF4y2Ba9模拟gydF4y2Ba)．我们在两名轻中度COVID-19患者和两名重度COVID-19患者的血清中检测到结合ifn处理细胞的抗体(扩展数据图)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．然而，不同细胞类型的染色差异很大(扩展数据图。gydF4y2Ba9 cgydF4y2Ba)，无论有无IFNα刺激，这表明每个患者可能都有独特的特异性组合。例如，虽然1050号患者的血清没有染色ISGgydF4y2Ba+gydF4y2Ba我们在该患者中发现了抗IFNα抗体的证据(图2)。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)——这与最近的一项研究一致gydF4y2Ba14gydF4y2Ba该研究还发现，大约12%的COVID-19患者体内存在抗ifn α抗体。该患者在我们的队列中是独一无二的，IFNα反应不能解释缺乏ISGgydF4y2Ba+gydF4y2Ba大多数严重COVID-19患者的细胞。gydF4y2Ba

我们以IFITM3为标记物，分别检测了重症COVID-19患者血清中的因子是否影响IFNα对isg标记基因的诱导。因此，我们将5%的患者血清添加到IFNα刺激的健康pmcs样本中，发现来自健康对照个体或来自轻-中度COVID-19患者的血清对分化没有影响(通过IFITM3水平或CD14频率测量)gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)，所有来自严重COVID-19患者的检测血清均有显著影响，从完全阻断到部分抑制IFNα反应(图2)。gydF4y2Ba3 e, ggydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba9 d, egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了测试重症COVID-19患者血清中的抗体是否与IFNα反应的抑制有关，我们用蛋白A和蛋白G(蛋白A/G)珠预先吸附患者血清，以消耗血清中的抗体。这缓解了IFITM3诱导的阻塞，并恢复了干扰素刺激的单核细胞的总产量(图。gydF4y2Ba3 f, ggydF4y2Ba)．在包括淋巴细胞在内的其他人群中，ifn α依赖的ISG签名生成也观察到类似的抗体吸收阻断和释放(图2)。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba9 fgydF4y2Ba)．这是有可能的，因为稳健的IFN反应依赖于初始干扰素-α受体(IFNAR)信号传递的正反馈环gydF4y2Ba15gydF4y2Ba淋巴细胞中的IFN反应受益于单核细胞中IFNAR信号的扩增。我们还证实了对ISG生成的抑制作用gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在第二个验证队列中，由8名轻中度COVID-19患者和6名重度COVID-19患者组成(扩展数据图)。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

IFNAR信号通路FCγRIIb的拮抗作用gydF4y2Ba

在探索这一结果的机制时，我们发现，在IFNα和患者血清培养期间，用Fc受体阻断抗体(CD16、CD64和CD32)处理pmcs，可以恢复用重症COVID-19患者血清培养的细胞中IFITM3的诱导(图2)。gydF4y2Ba4 a, egydF4y2Ba)和验证(扩展数据图。gydF4y2Ba10 bgydF4y2Ba)军团。阻断Fc受体不仅可以恢复IFITM3的诱导，还可以恢复其他isg的诱导，如IFI27、ISG15和MX1(扩展数据图)。gydF4y2Ba10 cgydF4y2Ba)．这些结果，以及与严重COVID-19患者血清培养的pmcs细胞死亡没有增加(扩展数据图)。gydF4y2Ba10 dgydF4y2Ba)，提示严重疾病患者血清中存在的抗体触发Fc受体信号，抑制IFNAR参与后的转录反应。gydF4y2Ba

图4:重症COVID-19患者血清中igg介导的ISG诱导中和是通过患者抗体Fc结构域与CD32结合而发生的。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba在存在或不存在抗cd16、抗cd64和抗cd32抗体(抗cd16 /64/32)以阻断Fc受体(FcRs)的情况下，用IFNα和健康供体或轻-中度或重度COVID-19患者的血清培养健康pmcs后，单核细胞CD14和IFITM3表达的等高线图和直方图。患者标识符显示在顶部。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba， CD14和IFITM3表达等高线图和直方图(gydF4y2BabgydF4y2Ba)和IFITM3表达的折叠变化(gydF4y2BacgydF4y2Ba)在CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaIFNα加或不加5 μg、10 μg ml、不加或不加IFNα的健康pmcs培养后的单核细胞gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba抗cd16、抗cd32或抗cd64抗体单独或联合交联并激活Fc受体。结果gydF4y2BacgydF4y2Ba来自两个独立的实验和两个不同的细胞供体，包括其中一个供体的两个抗体数量(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3次实验)。数据为均数±标准差。gydF4y2BadgydF4y2Ba中所述的中和试验gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，但只添加了抗cd32抗体。gydF4y2BaegydF4y2Ba，实验中IFITM3表达的变化gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba(左)(五个独立的实验和三个不同的捐赠者)和gydF4y2BadgydF4y2Ba(右)(一个实验和两个不同的捐赠者)。中线，中间;盒子限制，第25和75百分位;胡须，最小值和最大值。统计意义gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba采用双向方差分析和多重比较进行评估。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01， ****gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

我们认为这种机制可能是抗体生成下调干扰素级联的基本途径，因此我们测试了通过交联激活Fc受体是否能拮抗IFNα对IFITM3的诱导。与CD16和CD64单独交联的PBMCs相比，CD32单独交联的PBMCs对IFITM3的诱导明显减少(图2)。gydF4y2Ba4 b, cgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba10 egydF4y2Ba)，而所有三种Fc受体的交联一起诱导促炎细胞因子的产生(扩展数据图。gydF4y2Ba10 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

回到对重症COVID-19患者血清的影响，我们发现，在重症COVID-19患者血清存在的情况下，单独阻断CD32可以恢复用IFNα培养的pmcs中IFITM3的诱导。gydF4y2Ba4 d, egydF4y2Ba)．先前的研究表明，Fcγ受体IIb的阻断(Fcγ riib;也被称为CD32B)阻断导致树突状细胞和单核细胞的干扰素样反应gydF4y2Ba16gydF4y2Ba而激活Fc受体Fcγ riia (CD32A)的结合则引发病毒免疫gydF4y2Ba17gydF4y2Ba．与之前的研究一致，我们发现阻断FCγRIIb，而非FCγRIIa，可以挽救重症COVID-19患者血清培养的单核细胞中IFITM3的诱导(扩展数据图)。gydF4y2Ba10克gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

总之，我们的研究结果表明，在严重COVID-19患者中，抑制表达isg的免疫细胞群体的表型与他们的抗体通过FCγRIIb信号拮抗IFNAR信号相对应。在我们的队列中，这种一般抗体介导的作用几乎体现在所有严重疾病患者中，而对抗细胞因子IFNα本身的抗体仅在七分之一的患者中看到，这些抗体阻断了ISG功能，但不通过Fc受体(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在特异性方面，值得注意的是，最近的研究强调，COVID-19患者的自身抗体与磷脂等多种靶标结合gydF4y2Ba18gydF4y2Ba还有内皮蛋白gydF4y2Ba19gydF4y2Ba但并不是所有患者都出现了每种特异性。我们的工作同样发现，抗体与各种免疫细胞结合，在某些感染过程中，B细胞室的不完全耐受性可能包括对许多宿主蛋白质的识别，包括免疫细胞上的蛋白质。尽管研究COVID-19中抗体特异性的可能多样性很重要，但抗体的集中修饰(它改变了抗体对Fc受体亚型的选择性)和IgG亚型的差异选择性也正在成为COVID-19严重程度的显著特征gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba．我们推测，血清中这些IgG亚类的不同水平，加上不同Fc受体的不同亲和力，可能导致通过抑制Fc γ riib产生更强的信号。需要进一步的工作来描述这些IgG亚类的相对贡献及其特异性。无论如何，我们的研究表明，在严重COVID-19患者中，这种全球性的ISG原型靶向可能可以通过利妥昔单抗等药物来减少B细胞反应gydF4y2Ba21gydF4y2Ba-可能在恢复期个体血清存在的情况下，通过静脉注射IgG (IVIG)与血清抗体竞争Fc受体接合gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，或快速发展临床上阻断FCγRIIb的抗体。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

数据报告gydF4y2Ba

没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估期间没有对分配盲目。gydF4y2Ba

患者、参与者、严重程度评分和临床数据收集gydF4y2Ba

加州大学医院收治的已知或推定患有COVID-19的患者在住院3天内接受了筛查。患者或指定的代理人提供了参与研究的知情同意。本研究包括2020年4月8日至5月1日在COMET (COVID-19有效治疗的多免疫分型项目;gydF4y2Bahttps://www.comet-study.org/gydF4y2Ba)就读于加州大学旧金山分校(UCSF)。COMET是一项前瞻性研究，旨在描述住院患者特定免疫评估与COVID-19临床病程之间的关系。健康捐赠者(对照组)为成年人，既往无COVID-19诊断或近期无与COVID-19一致的症状。该分析包括直接、通过代孕或按照区域伦理研究委员会和《赫尔辛基宣言》批准的方案提供知情同意的参与者的样本。对于住院患者，临床数据从电子病历中提取为标准化的病例报告表格。我们在取样时和住院结束时都使用了严重程度评分(扩展数据图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．在这两种情况下，严重程度评估基于三个主要参数:护理水平、机械通气需求和机械通气时间。轻、中度疾病患者是指住院期间不需要机械通气且ICU住院时间不超过1天的标准病房或重症监护病房患者。重症患者是指需要重症监护和机械通气(一般5天或以上)的患者。因此，我们的验证队列由21例COVID-19患者组成(11例轻-中度和10例重度);11例临床表现相似但未感染COVID-19的患者(6例轻-中度，5例重度);和14个健康的对照组。我们还收集并使用了由14名SARS-CoV-2阳性患者组成的验证队列的血清。收集样本，评估严重程度，如前所述的初始队列。该发现队列由8例轻中度COVID-19患者和6例重度COVID-19患者组成。 Information on age, sex, type of infection, day of onset, viral load and complete blood cell count is listed in Supplementary Table1克ydF4y2Ba．该研究由UCSF机构审查委员会批准:IRB 20-30497。gydF4y2Ba

血液细胞的分离和scRNA-seq处理gydF4y2Ba

对新鲜全血进行scRNA-seq以保存粒细胞。简而言之，外周血采集到EDTA管(BD, 366643)。全血经500 μl的外周血经RBC裂解缓冲液(Roche, 11-814-389-001)处理后制成。然后对细胞进行计数，每个个体直接将15,000个细胞装入Chromium Controller中，按照制造商的说明将单个细胞划分为纳升级别的凝胶乳剂珠(GEMs)。在GEM划分之前，一些样本被聚集在一起(每个样本15,000个细胞)。使用Chromium Single Cell 5’Reagent Kit (v.5.1) (10X Genomics)进行反转录、cDNA扩增和基因表达文库构建(遵循10X Genomics提供的详细方案)。文库在Illumina NovaSeq6000上测序，R1使用28个周期，R2使用98个周期。所有样本均被囊化，抽血后6 h内生成cDNA。gydF4y2Ba

PBMC与患者血清共培养实验及流式细胞仪分析gydF4y2Ba

使用polymorphism prep (Alere Technologies)从健康献血者的edta抗凝全血中分离出pmcs，并重新悬浮在培养基中(RPMI 1640 + 10% FBS)。为了检测干扰素刺激的中和作用，将自体血清或临床研究参与者的血清(10 μl)镀上IFNα (Stemcell IFNα- 2a;终浓度1 pg μlgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)，总体积为200 μl，再加入2.5 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2BaPBMCs。孵育24 h后，流式细胞术检测pmcs中ifn α诱导的IFITM3的上调以及CD14和CD16的水平和组分。在表面染色和添加固定活/死紫染料(赛默飞世尔科学，L34955)后，按照制造商的说明，使用eBioscience Foxp3/转录因子染色缓冲组(赛默飞世尔科学，00-5523-00)进行细胞内IFITM3检测。Fc受体阻断实验中，Fc受体被未偶联的抗cd16阻断(克隆3G8;生物基因，302002)，anti-CD32(克隆FUN-2;bilegend, 303202)， anti-CD64(克隆10.1;BioLegend, 305002)， anti-CD32A(克隆IV.4;BioXcell)和抗cd32b /C(克隆S18005H;生物传说)，每个抗体0.5 μg。IFNα (1 pg μl)孵育24 hgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)，流式细胞术检测外周血单核细胞ifn α诱导的IFITM3的上调，CD14和CD16的水平和分数。用于血清染色测定，pmcs用培养基或1-100 pg ml培养gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba收集样品，用未偶联的抗cd16阻断Fc受体(克隆3G8;生物基因，302002)，anti-CD32(克隆FUN-2;bilegend, 303202)和anti-CD64(克隆10.1;BioLegend, 305002)抗体在冰上放置20分钟。在用荧光激活细胞分选(FACS)缓冲液(2%胎牛血清，1mm EDTA, PBS)洗涤一步后，用未结合的AffiniPure驴抗人IgG (Jackson Immunoresearch;709-005-149)在室温下放置15分钟。用FACS缓冲液洗涤后，将pmcs在冰上进行表面标记染色30分钟。染色孵育后，用FACS缓冲液(1500 rpm, 5 min, 4℃)洗涤细胞3次，用5 μl自体血清或临床研究参与者血清在冰上孵育30 min。用FACS缓冲液清洗细胞后，使用AffiniPure驴抗人IgG-Alexa Fluor 647抗体(Jackson Immunoresearch, 709-605-149)检测细胞结合抗体，该抗体与细胞一起在冰上孵育30分钟。再次清洗细胞，在1 μg ml中重悬gydF4y2Ba−1gydF4y2BaDAPI解决方案的活/死区分。使用以下抗体进行流式细胞分析:抗人CD3-BB700(克隆SK7;BD Biosciences, 566575)，抗人CD14-BV711(克隆MSE2;生物传奇，301838)，抗人CD15-BV786(克隆W6D3;BD生物科学，741013)，抗人CD16-BV605(克隆3G8;bilegend, 302040)，抗人CD19-BV785(克隆HIB19;生物基因，302240)，抗人CD45-APCeFluor780(克隆HI30;赛默飞世尔科技公司，47-0459-42)，抗人类IFITM3-AlexaFluor 647(克隆EPR5242;Abcam ab198573)。gydF4y2Ba

外周血单核细胞fc受体交联实验gydF4y2Ba

平底聚苯乙烯板(96孔)在4°C下涂上10或5 ug ml过夜gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba抗cd16的组合(克隆3G8;生物基因，302002)，anti-CD32(克隆FUN-2;bilegend, 303202)和anti-CD64(克隆10.1;BioLegend, 305002)在PBS中稀释。在PBMC电镀前，用PBS洗板三次，电镀过程如上所述。每孔总共25万个pmcs被短暂旋转，并在37°C下孵育15分钟，以允许包被抗体接合。然后将IFNα加入孔中，在37℃下孵育24 h，然后按上述方法进行流式细胞术。gydF4y2Ba

统计分析和数据可视化gydF4y2Ba

使用GraphPad Prism或R软件包进行统计分析。使用非参数Mann-Whitney检验来检验两组之间的零假设，以解释数据的非正态分布。同样，多组比较采用双因素方差分析或非参数Kruskal-Wallis检验，再进行多组比较。在每个图形图例中还指出了具体的统计检验及其产生的显著性水平。使用R包Seurat和ggplot2 (v.3.1.0)， GraphPad Prism和Adobe Illustrator生成图形。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba