在临床前模型中，肠道菌群促进胰腺癌的发生

摘要

胰腺导管腺癌(PDAC)是美国癌症死亡的第三大原因，但关于影响胰腺癌发生的宿主因素的数据很少。越来越多的证据支持宿主菌群在癌变中的作用，但其在PDAC中的作用尚未得到很好的确立。在此，我们报道抗生素介导的Kras微生物耗竭^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}与微生物群完整的Kras相比，小鼠表现出低分化肿瘤的比例下降^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}老鼠。随后的16S rRNA PCR结果显示~50%的Kras^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}携带PDAC的小鼠存在胰腺内细菌。为了确定人类中类似的观察结果是否与PDAC的存在相关，良性和恶性的人类胰腺手术标本通过16S细菌测序和培养证实了微生物群。然而，微生物组成并不能区分PDAC和非PDAC组织。此外，小鼠胰腺并没有自然获得胰腺微生物群，因为无菌小鼠转移到特定的无病原体的住所后，随着时间的推移无法获得胰腺内细菌，这并没有通过结肠炎小鼠模型得到增强。最后，与微生物群完整的Nod-SCID小鼠相比，抗生素介导的微生物消耗显示出PDAC异种移植形成的时间增加，肿瘤变小，生长减弱。有趣的是，通过16S rRNA PCR，两个异种移植组都没有瘤内细菌，这表明胰腺内/瘤内微生物群并不是PDAC加速的唯一驱动因素。来自微生物群完整小鼠的异种移植通过免疫组化表现出先天免疫抑制，通过RNA测序确定其对致癌途径的差异调节。我们的工作支持了肠道微生物群在PDAC进展中的远程作用，并为胰腺癌的发生开辟了新的研究途径。

介绍

尽管在确定胰腺癌发生的基因突变的时间关系方面取得了进展(1 - 3)，胰腺导管腺癌有明显的病理组织学证据(4，5)，以及潜在的免疫介质(6，7)，对于这种致命疾病的可改变的宿主因素知之甚少，它现在是美国第三大最常见的癌症死亡原因(8)．虽然PDAC发展的危险因素与各种促炎状态有关，包括吸烟(9)、胰腺炎(10)和肥胖(11)，以及个人的遗传倾向(12，13)，大部份个案是散发的，并无明确的危险因素。因此，需要积极的和范式转变的方法，以确定胰腺癌发生的因素，可能允许早期发现和风险调整。

宿主微生物群由数以万亿计的细胞组成，这些细胞组成了共享每个个体身体空间的共生、共生和致病微生物环境。微生物-宿主网络的中断与许多人类病理状况有关，包括癌症(14 - 16)．先前的观察表明，与没有胰腺癌的患者相比，患有PDAC的患者可能具有不同的口腔和粪便微生物组(17日至19日)．具体来说，最近的报告证明了与存在的联系Porphyromonas gingivalis及患上PDAC的风险(17，18)．此外，在梭杆菌门及其属丰度增加的患者中，注意到PDAC发展的浓度依赖风险降低纤毛菌属（18)．对共生口腔细菌血清抗体滴度较高的患者同样可见保护作用(优势比0.55,95%可信区间0.36-0.83)(17)．最后，与健康对照相比，PDAC病例的肠道菌群可能允许疾病区分，微生物门多样性减少，拟杆菌门增加，厚壁菌门和变形菌门减少(19)．然而，这些微生物差异对胰腺癌的功能影响目前尚不清楚，仅代表与疾病状态有关。

在本研究中，我们研究了宿主菌群对胰腺癌发生的影响，并试图确定它是由局部作用还是远处作用介导的。在此，我们报告了人类胰腺中存在的微生物群，在癌症和非pdac组织之间没有明确的“疾病相关特征”。重要的是，利用PDAC异种移植和PDAC基因工程小鼠模型(GEMM)的实验支持肠道细菌对胰腺癌发生的远距离影响的概念，这可能是由先天免疫抑制和肿瘤内致癌途径的失调介导的。

材料与方法

人体组织获取

人体数据和组织采集和使用的所有方面都得到了佛罗里达大学机构审查委员会(IRB)的批准(议定书# IRB201600873)。从计划接受良性和恶性外科疾病胰腺切除术的患者获得书面知情同意，以分配部分切除组织用于研究目的。手术切除后，从手术标本中无菌收集胰腺组织的内部部分，放入无菌低温管中，在液氮中快速冷冻，随后在- 80°C保存，直到使用。对用于培养和测序的组织切片进行单独分析，以确认其病理。标记为“正常”的组织代表组织学上正常的组织，作为胰腺切除术中确定手术边缘状态的一部分或出于非恶性目的(如良性胰腺囊肿)而切除的组织。标记为“癌”的组织代表组织学证实的PDAC。

组织处理及组织学分析

肿瘤细胞系异种移植或Kras胰腺^{G12D / +}/ PTEN^{液态氧/ +}/Pdx1-Cre小鼠(在此简称为“Kras^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}’)在切除前，用2% w/v葡萄糖酸洗必泰在70% v/v异丙醇中消毒侧腹或腹部。每个异种移植物和Kras的代表部分^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}小鼠胰腺用福尔马林固定，石蜡包埋。切片以5 μm厚度切割，用苏木精和伊红染色，使用常规方法进行病理分析和肿瘤分级(仅用于胰腺)。由一名致盲动物病理学家对胰腺切片进行胰腺上皮内瘤变(PanIN)和癌级评分。每个胰腺共评估了50个胰腺小叶，并根据最恶性的病变进行评分(即，如果一个小叶具有PanIN 2和PDAC，则将其评分为PDAC)。无菌瑞士卷结肠样品(GF)Il10^−−/实验(见“微生物培养及操作’)按描述进行福尔马林固定和石蜡包埋，并对结肠炎进行苏木精和伊红染色。结肠炎程度评分采用盲法，如前所述(20.)．

对未染色的异种移植物玻片进行免疫组织化学检测免疫细胞标记CD45。组织切片在二甲苯中脱蜡，用分级乙醇系列脱水。为了获取抗原，载玻片在0.01 M柠檬酸钠缓冲液(pH 6)中煮沸20分钟。正常山羊血清(Vector Laboratories, Burlingame, CA)在室温下阻断非特异性结合30分钟。在tris缓冲盐水中，3% (v/v)过氧化氢可以抑制内源性过氧化物酶活性。一抗兔抗cd45 (Abcam, Cambridge, MA)在阻断缓冲液(Vector Laboratories)中稀释(1:200)，应用于标本，在4°C下孵育过夜。将组织切片与山羊抗兔二抗(Vector Laboratories)在室温下孵育20分钟。用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories)中的ABC试剂孵育载玻片30分钟，然后用DAB反应检测信号。玻片反染色，二甲苯脱水，乙醇脱水，永久固定。对10个随机高功率场(40倍)进行盲法评分。使用徕卡DM5500 B显微镜系统(徕卡微系统公司，布法罗格罗夫，伊利诺伊州)，运行LAS X采集软件(版本3.3.3)，在5倍和40倍放大倍率下拍摄显微照片。

细菌DNA提取及16S rRNA测序

从收集的粪便或组织样本中提取细菌全基因组DNA，使用DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit (Qiagen)根据制造商规格进行提取。根据人类微生物组项目(协议#07-001)制定的指导方针，使用PowerMag微生物组RNA/DNA分离试剂盒从约50 mg胰腺标本中提取人类胰腺组织DNA。16S rRNA基因V1-V3区高变区使用引物对27F (5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ')和534R (5 ' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ')扩增。正向引物和反向引物都包含通用的Illumina配对端适配器序列，以及PCR引物序列和Illumina适配器序列之间唯一的4-6个核苷酸条形码，以允许多重测序。PCR产物在琼脂糖凝胶上显示，然后使用agcourt AMPure XP试剂盒(Beckman Coulter, Brea, CA)纯化样品，并使用KAPA文库定量试剂盒(KK4824, KAPA生物系统)进行qPCR定量。然后将等量的样品汇集并使用Illumina MiSeq (Illumina, Inc;San Diego, CA)成对端，300个碱基长，每端产生16 797 256个读取。参见补充方法致癌作用在线，进行16S rRNA的描述测序分析。

组织培养与维护

所有人胰腺癌细胞系BxPC3 (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA)和L3.6pl均被使用在活的有机体内为了利用原发和转移细胞系，分别拥有野生型(BxPC3)和突变型(L3.6pl)的异种移植动物研究喀斯特致癌基因。L3.6pl细胞系最初来源于肝转移，如前所述，在原位注射COLO-357人胰腺癌细胞系的裸鼠中发生肝转移(21)．ATCC利用他们的STR分析单元验证服务确认了细胞系的验证。细胞系在添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI (BxPC3)或Dulbecco 's Modified Eagle Medium (L3.6pl)中培养。细胞保存在37°C和5% CO的加湿培养箱中₂直到准备好用于皮下异种移植研究。

胰腺癌基因工程小鼠模型的生成与利用

佛罗里达大学的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准了所有描述的动物实验的动物护理和使用的所有方面，并遵循了国家动物护理和使用指南。克拉斯的繁殖^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}在整个实验过程中，研究人员将小鼠和动物安置在特定的无病原体(SPF)条件下。通过将链霉素(2 g/l)、庆大霉素(0.5 g/l)、杆菌肽(1 g/l)和环丙沙星(0.125 g/l)在高压水中重组而成的抗生素(Abx)鸡尾酒可消耗肠道微生物群，并可自由提供给动物。在负压罩中定期收集粪便，并快速冷冻，进行常规有氧和厌氧培养，以确认肠道菌群的消耗(补充图1A，可于致癌作用在线)。看到补充的方法，可于致癌作用在线，和数据的生成和使用Kras的描述^{G12D / +}/ PTEN^{液态氧/ +}/Pdx1-Cre小鼠。

动物胰腺癌异种移植研究

这些实验中动物护理和使用的所有方面都得到了佛罗里达大学(UF) IACUC的批准，并遵循了国家动物护理和使用指南。4-6周龄雌性NOD在UF的SPF窝中环境驯化1周后，肠道菌群进行了检测。CB17 -Prkdc^scid/J (' Nod-SCID ')小鼠(杰克逊实验室，Bar Harbor, ME)被上述相同的广谱抗生素鸡尾酒耗尽。选择性别特定的小鼠，其次是现有的数据，表明小鼠肠道菌群可以受到性激素的影响(22)．因此，我们选择在雌性小鼠中进行异种移植研究，因为研究中使用的细胞系最初都来自女性患者。此外，先前对人类微生物组项目的分析和其他研究表明，性别不是微生物组成和栖息地位置的主要驱动因素(23，24)．在使用小鼠进行异种移植研究之前，已证实肠道菌群的耗竭(补充图1B，可于致癌作用在线)。看到补充的方法，可于致癌作用在线，对PDAC异位异种移植的生成的描述。

肠道炎症，渗透性试验和细菌易位

屏障功能实验选用10 - 12周龄GFIl10^−−/(129SvEv)小鼠从无菌隔离器转移至SPF罩内，按1 × 10灌胃1次⁸cfu空肠弯曲杆菌(strain 81-176)，如前所述(25)．感染后12天，根据动物护理指南对这些小鼠实施安乐死。安乐死前4小时，给予fitc -右旋糖酐0.6 mg/g (Sigma)口服灌胃。血液通过心脏末梢出血收集到EDTA真空管中，并在室温下凝血。试管在3000转/分(4℃下10分钟)下离心，收集血清并在−80℃下储存。随后用Synergy HTX酶标仪(Biotek, Winooski, VT)在激发/发射波长485/528nm下测量血清FITC浓度。此外，结肠和胰腺通过无菌技术收集，如前所述，在负压罩中。如上所述，对结肠瑞士卷进行福尔马林固定和石蜡包埋进行组织学分析。胰腺的纵向部分(包括头部、身体和尾部)被快速冷冻，随后用于细菌培养，而其余部分被快速冷冻，如所述用于16S细菌PCR分析。每个小鼠胰腺称重和均质在厌氧条件下使用电动杵无菌PBS。 Routine bacterial cultures were subsequently performed under both aerobic and anaerobic conditions.

对于粪便样本的培养，将收集的小鼠粪便的新鲜或冷冻部分称重，在厌氧条件下解冻，并使用电动杵在无菌PBS中均质。然后在脑心输注(BHI)或布鲁氏菌(BRU)琼脂(厌氧菌系统，Morgan Hill, CA)上重复镀样品。一半的培养皿在厌氧条件下孵育长达72小时，另一半培养皿在好氧条件下孵育。

统计分析

所有非序列相关的统计分析(即肿瘤生长特征等)均使用GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA)进行。利用Shapiro-Wilk检验来确定连续数据集内的正态性，并与Student的数据集进行比较t-test或Mann-Whitney。在适当的情况下，分类变量与皮尔逊卡方检验或费雪精确检验进行比较。所有统计分析均采用双侧显著性水平0.05和95%置信区间。细菌DNA提取、16S rRNA基因序列和RNA序列分析的分析方法见补充方法，可在致癌作用网上。所有测序结果已存入NCBI BioProject ID: PRJNA427203。

结果

肠道微生物群加速Kras中胰腺癌的发生^G12D/ PTEN^−/+胰腺癌小鼠模型

口腔和肠道菌群以前与胰腺癌有关，但没有确定直接关系(17日至19日)．为了弥补这一知识鸿沟，我们首先试图确定肠道微生物群在胰腺癌发生中的作用，以及它是否可以使用Kras从远处影响其进展^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}胰腺癌小鼠模型。该PDAC小鼠模型基于组成性激活的Kras癌基因(G12D转变突变)的存在而发生腺癌，同时小鼠胰腺内PTEN肿瘤抑制部分丧失(26)．断奶后，1月龄小鼠肠道菌群(n= 7)用Abx鸡尾酒排出，常规大便培养证实(补充图1A，可于致癌作用在线)。这些小鼠和完整的微生物群对照组(n= 7)于3个月大时处死，胰腺无菌采集，病理评分如下所示(图1一个B).与缺乏菌群的小鼠相比，菌群的存在导致各组间病理分级差异有统计学意义。具体来说，与微生物群完整的小鼠(86个病灶)相比，微生物群完整的小鼠(223个恶性小叶)有更多的PanIN病变(147个病灶)，与缺乏微生物群的小鼠(161个恶性小叶;图1 c；P< 0.0001)。对各组间恶性小叶的比较进一步显示，在微生物群完整的队列中，3级(即低分化)PDAC的比例高于微生物群缺失的队列(分别为89.7比34.8%;图1 d；P< 0.0001)。在第二个独立队列中观察到类似的癌变进展降低率，该队列显示在微生物群完整的小鼠中正常、PanIN和腺癌的平均发病率(n= 3)，分别为25、41和33%，而微生物群枯竭的Kras为22、79和0%^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}老鼠(n= 4) 3个月大时(P< 0.0001)。接下来我们检测了Kras胰腺中细菌的存在^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}老鼠。使用采集胰腺的通用16S rRNA细菌引物进行PCR分析，结果表明，与abx处理组相比，一组代表性对照样本的细菌PCR拷贝数增加了2对数(图1 e；P= 0.004)。在厌氧和好氧条件下进行的验证性微生物培养表明，控制Kras的胰腺中存在细菌^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}小鼠[253887和8786菌落形成单位(cfu)/克胰腺组织]。

人的胰腺含有微生物群

扩展我们对克拉斯胰腺中的细菌的观察^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}在小鼠中，我们对无菌的、手术切除的、病理证实为正常的人类胰腺样本中分离出来的细菌基因组DNA进行了16S rRNA基因测序(n= 7)、胰腺炎(n= 4)或PDAC (n= 16)。这些患者的临床病理因素详细见表1．只有读数超过500的样本被纳入进一步分析和展示，这解释了样本数量的差异(见补充方法，可在致癌作用在线)。基因组分析表明，这些胰腺，包括非pdac标本，含有微生物群(图2 a - c)，而不是来自外部污染(见补充的方法和图2，可于致癌作用在线)。然而，基于原理坐标分析，在属水平上，健康胰腺、胰腺炎和PDAC标本之间没有微生物种群的聚类。PDAC病理阶段与β多样性或细菌类群(使用线性判别分析效应量[LEfSe])之间没有发现关联(P> 0.05，数据未显示)。虽然正常和胰腺癌之间似乎存在微生物差异(图2一个)，在对前五个原则坐标分析轴进行错误发现率(FDR)校正(FDR = 0.06)后，这是不显著的。此外，Chao1指数和Shannon指数在属丰富度和多样性上均无显著差异(图2 d和E,补充表1和表2)．而几个不同的属，如不动杆菌（P= 0.03),Afipia（P= 0.07),肠杆菌属（P= 0.07)和假单胞菌（P= 0.06)。图2 f)，在FDR校正后，没有发现特定属(科、目、纲或门)与疾病状态(正常与PDAC)之间的统计联系(补充表3-7，可于致癌作用在线)。为了证实细菌在人胰腺定植，从独立的恶性胰腺标本中提取新的裂解液，在好氧和厌氧条件下培养，证实了人胰腺中存在可培养的细菌，平均为~1 × 10⁵(有氧)和~1 × 10⁵(厌氧)培养48小时后组织cfu/g。随后对这些菌落进行16S rRNA基因测序和交叉参照分类法，证实了PDAC组织16S测序最初检测到的属的存在(补充表8，可于致癌作用在线)。值得注意的是属棒状杆菌属，肠杆菌属，埃希氏杆菌属，丙酸菌属，葡萄球菌和链球菌在测序组之间普遍存在，占总检测属的35%。使用100%相似度下生成的QIIME闭参考OTUs进行类似分析，结果显示两组OTUs中有23%是相同的。总之，人类胰腺含有一种微生物群，其群落组成不能区分正常和疾病状态。

胰腺菌群的获得不是一个生理过程

为了确定胰腺微生物获得的时间关系，将一组GF 129SvEv小鼠转移到SPF条件下，并灌胃1 × 10⁵并放置1、2、4和8周。采集每个胰腺，通过16S rRNA PCR扩增细菌定植量。而在常规来源小鼠的粪便中，通过通用细菌PCR检测到细菌(图3一)，在这些小鼠的胰腺内未观察到定殖的证据(图3 b)．鉴于肠道通透性缺陷与细菌转移至周围器官有关(27)，我们接下来使用Il10^−−/小鼠肠通透性缺陷模型(28)并通过口腔感染空肠弯曲杆菌(应变81-176)来加速这种缺陷的渗透性(29)，以确定肠道微生物迁移到胰腺的能力。的c .空肠受感染的Il10^−−/与未感染的对照组相比，小鼠出现了严重的结肠炎(得分:3.66)Il10^−−/小鼠(得分:0.288，P< 0.001;图3 c和D)．此外,c .空肠受感染的Il10^−−/与对照组相比，血清fitc -右旋糖酐检测显示小鼠肠道通透性增加(血清中位浓度分别为1283和167.7 ng/ml;P= 0.003;图3 e)．有趣的是，16S rRNA PCR分析和培养试验均未检测到两组细菌定植的证据(数据未显示)。这些数据表明，即使在肠道炎症的情况下，胰腺细菌的获得也不是一个生理过程。

非局部效应在微生物群介导的胰腺癌发生中很重要

胰腺肿瘤的进展可能受到胰腺微环境中细菌的存在和肠道菌群施加长期影响的影响。为了分析这些贡献，我们使用了PDAC的皮下异种移植模型，以避免胰腺内细菌在胰腺癌发生中的任何潜在作用，而是专注于胰腺外细菌的影响。口服广谱Abx鸡尾酒后Nod-SCID小鼠肠道菌群减少，常规粪便培养证实(补充图1B，可于致癌作用在线)。随后，将胰腺癌细胞株BxPC3和L3.6pl异位注射到这些小鼠的侧翼。的在体外这些细胞的增殖与暴露于Abx鸡尾酒无关，因为通过降低Alamar Blue (补充的方法和补充图3，可于致癌作用在线)。肠道菌群的存在加速了胰腺癌的发生，与缺乏菌群的队列相比，BxPC3细胞系的成功异种移植物植入率增加(分别为100 vs 67%;P= 0.05;图4一)．在微生物群完整组和微生物群缺失组之间，L3.6pl异种移植的植入率没有差异(分别为71.4 vs 88.9%;P= 0.3;图4一)．比较成功生长的异种移植，完整的微生物群导致平均检测潜伏期在统计学上显著降低[(BxPC3: 28.1天vs . 50.8天;P< 0.0001);L3.6pl: 21.2天vs 42.9天;P分别< 0.0001;图4 b]，肿瘤体积随时间增加(BxPC3 .P= 0.01 - -0.05;L3.6plP= 0.01 - -0.03;图4 c)和增加的增长率(BxPC3 .P= 0.01 - -0.05;L3.6plP= 0.04;图4 d)．为了证实异种移植物没有细菌，这可能解释这些表型差异，我们对小鼠肿瘤样本进行了细菌培养和16S rRNA PCR分析。而在收获的克拉斯中检测到细菌的存在^G12D/ PTEN^−/+胰培养及PCR (图1 e)，对Abx处理敏感(补充图1A，可于致癌作用在线)，在异种移植中未检测到信号(图4 e)．这表明，在这些模型中，PDAC发育的加速是肠道菌群影响的次要因素。

总之，这些数据表明，肠道微生物有能力以肠外、远距离的方式影响胰腺癌的发生，而不依赖于胰腺微生物群或胰腺间质微环境。

肠道菌群影响人类和小鼠胰腺癌异种移植的转录组变化

为了确定响应微生物群而发生的瘤内转录组变化，对无菌收获的BxPC3异种移植进行了Illumina HiSeq 3000 RNA测序(RNAseq)。为了同时查询人类肿瘤成分(来自BxPC3细胞)和小鼠成分(来自肿瘤浸润的小鼠细胞)，将修剪和过滤的reads与独立的人类和小鼠参考序列对齐(见补充的方法，可于致癌作用在线)。这表明在人类和小鼠亚群中有许多差异表达的基因，已知这些基因参与致癌，这取决于肠道微生物群的状态补充图4，可于致癌作用在线)。例如，肠道微生物群的存在导致了人类致癌基因的上调，如TNC (6.9 log2倍，P= 0.008)， PLXNA4 (3.4 log2 fold，P= 0.008)， CXCL10 (2.5 log2 fold，P= 0.008)。相反，微生物群减少导致许多与患者生存和肿瘤抑制相关的通路上调，如DAPK2 (2.35 log2倍，P= 0.008)， KLF9 (2.32 log2 fold，P= 0.008)和LUM (log2乘以1.8，P= 0.008)。在存在微生物群的情况下，差异表达的小鼠基因包括参与进展和免疫监测的前致癌基因的上调，如ST14 (2.35 log2倍，P= 0.04)， CCR2 (1.8 log2 fold，P= 0.004)和FABP4 (1.6 log2 fold，P= 0.04)。相反，微生物群的减少导致许多抗癌途径的上调，如WIF1 (3 log2倍，P= 0.004)， SCARA5 (2.6 log2 fold，P= 0.004)和CDKN1C (1.8 log2倍，P= 0.03)。虽然可能有人认为抗生素的施用可能会改变肿瘤转录组，但我们将我们的reads与先前发表的抗生素诱导基因测序数据库进行了比较(30.)，并确定我们数据集中的差异表达基因不是抗生素直接诱导的(数据未显示)。

先天免疫细胞浸润胰腺癌异种移植在微生物群减少小鼠

鉴于我们免疫能力强的克拉斯之间有相似的表型^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}小鼠模型和免疫缺陷Nod-SCID异种移植物模型，以及我们的RNAseq数据和先前涉及免疫细胞在肿瘤监测中的文献(31)，如果免疫细胞在观察到的表型中发挥作用，我们假设它将通过先天系统发挥作用。因此，我们试图评估PDAC异种移植物中先天免疫细胞浸润的存在。使用CD45免疫组化，我们的数据显示，在微生物群减少的小鼠PDAC异种移植中，CD45阳性细胞有统计学意义上的增加(P= 0.009;图5)．这表明观察到的表型与微生物群介导的先天免疫系统抑制有关。

讨论

胰导管腺癌是一种致命的疾病，死亡率几十年来一直保持稳定(8)．范式转换的研究是必要的，以加速预防，检测和治疗这种侵袭性恶性肿瘤。在这项研究中，我们发现了Kras中PanIN向PDAC的自然进展的加速^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}PDAC小鼠模型;当存在微生物群时，癌症形成的发生率更高，特别是低分化的癌症。我们对完整克拉斯菌群胰腺内细菌的观察^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}小鼠的研究扩展到人类样本，其中注意到人类胰腺具有微生物群，但在FDR矫正后，它似乎无法区分正常和胰腺癌。利用无菌小鼠，这种胰腺微生物群在正常生理条件下似乎不会形成，即使存在有缺陷的肠膜功能。最后，我们发现肠道菌群是胰腺癌进展的重要中介因素，因为与微生物群减少的小鼠相比，在微生物群完整的小鼠中观察到PDAC异种移植物致瘤性增加，这可能是继发于微生物群对瘤内癌症通路的调节或先天免疫抑制。

而其他非肠道组织部位，如乳房(32)、呼吸道(33)和皮肤(34)已被证明具有与组织特异性恶性肿瘤相关的微生物群，与最近的一份报告(35)．然而，需要使用更大的队列进行微生物群分析，以得出关于细菌与胰腺致癌之间关系的明确结论。尽管在我们的数据集中与PDAC缺乏相关性，但PDAC患者中胰腺微生物群的存在与最近两份显示胰腺癌患者中存在细菌的报告很好地吻合(35，36)．有趣的是，盖勒及其同事的报告显示，通过qPCR 16S PCR检测到的器官捐赠者的正常胰腺标本中细菌含量很低。这与我们的数据形成对比，在我们的数据中，所有测试样本(正常，胰腺炎和PDAC)都通过细菌测序检测到胰腺微生物群，但与Pushalkar及其同事在PDAC和正常样本中检测到细菌相似(35)．然而，虽然我们没有注意到基于胰腺状态的样本集之间的区别，但Pushalkar的报告确定了正常和PDAC样本之间的微生物差异，但没有包括FDR校正，也没有提供关于正常胰腺样本来源的信息。研究之间差异的原因尚不清楚，但可能与FDR校正、技术(qPCR与16S rRNA测序)或组织来源有关，因为我们使用的非pdac患者样本与来自健康器官捐赠者的组织相比，可能存在允许特定微生物进入的“区域缺陷”。然而，我们的研究与Geller和Pushalkar (35，36)．即细菌属不动杆菌，肠杆菌属，假单胞菌，Delftia，肠球菌，链球菌，棒状杆菌属，丙酸菌属，克雷伯氏菌，Sphingomonas和葡萄球菌在我们的研究和盖勒的研究中观察到克雷伯氏菌在癌症和正常样本中比例过高。根据Pushalkar最近的报告，他们在人类PDAC样本中丰度最高的门是Proteobacteria (45%)， Bacteroidetes(31%)和Firmicutes(22%)，这与我们观察到的Proteobacteria(45%)和Firmicutes(33%)相似，而Bacteroidetes在我们的PDAC样本中只有3%的丰度。变形菌门和厚壁菌门研究之间的一致性提出了一个潜在的未来研究领域。

细菌在人体胰腺内的影响以及它们如何在这个器官中建立，目前尚不清楚。由于胰腺通过胰管直接进入上胃肠道，可以合理推测定植是由十二指肠或胆道树的细菌回流造成的，正如Pushalkar最近的研究所述等．（35)．然而，口腔微生物群是PDAC发展中潜在作用的负责菌群的论点未能考虑到各种研究，这些研究表明正常和恶性胰腺之间的粪便微生物群差异及其潜在影响(19，35，37)．虽然Pushalkar涉及口腔微生物群，但它在胰腺中的存在仅限于需要高浓度的口服灌胃粪肠球菌和大肠杆菌此外，根据我们的无菌数据，通过上或下胃肠道的胰腺定植可能不是该器官的“默认设置”，因为转移到SPF收容的ex-GF小鼠的胰腺中没有检测到细菌，也没有检测到小鼠的胰腺Il10^−−/肠通透性受损的小鼠。然而，在克拉斯的胰腺中发现了细菌^G12D/ PTEN^{液态氧/ +}Pushalkar也报道了这种现象et al。（35)使用PDAC的类似GEMM。可以假设，胰腺病理(胰腺炎、PanIN形成或PDAC)与细菌易位增加(口腔、肠道)相结合，是胰腺内细菌定植的关键条件。此外，胰腺来源的抗菌肽与肠道菌群组成和功能之间的远距离联系此前已被报道(38)．人们可以推测，胰腺和肠道之间发生了影响微生物播种的双边通信。目前，尚无研究表明口腔微生物群的功能变化对PDAC发育的影响，该领域仅限于潜在的细菌标志物。因此，需要进一步的研究来破译胰腺细菌定植的机制，以及它是来自口腔还是肠道来源。

尽管我们记录了胰腺微生物群，但我们的研究清楚地确定了GEMM和胰腺癌皮下异种移植模型中肠道生物群对胰腺癌进展的远距离调节。在异种移植模型中，肿瘤内细菌的缺乏，但抗生素介导的微生物耗竭对肿瘤生长的显著影响，清楚地表明肠道菌群是致癌的关键调节剂。这可能与微生物群通过上调已知致癌基因(如腱蛋白C)来改变致癌途径的能力有关。39)，丛A4 (40)及CXCL10 (41)与肿瘤抑制基因如DAPK2的上调(42)， lumican (43)及Wif1 (44)，如RNAseq所示。此外，在缺乏微生物群的Nod-SCID小鼠中，CD45肿瘤内免疫细胞浸润减少，这表明微生物群与其他癌症一样抑制了先天性免疫细胞浸润(31)，与Pushalkar的研究结果一致等．（35)．然而，最近的一份报告表明，微生物群介导的肿瘤反应是继发于适应性免疫系统调节(45)．这些研究强调了迫切需要探究这些免疫途径及其与微生物群和胰腺癌发生的相互作用。BxPC3突变负担差异(喀斯特与L3.6pl (喀斯特突变体)可能解释了不同细胞系之间的植入率差异，而不考虑肠道菌群状态。此外，最近的数据(35)证实了我们的发现，微生物群的影响似乎是独立的喀斯特突变状态。然而，鉴于我们的异种移植和基因工程小鼠都不是癌症启动的模型，因为它们都具有已知导致PDAC的必要基因突变，我们在微生物群存在的情况下确定的胰腺癌发生的加速，以及基于16S测序的人类标本中缺乏分化，表明肠道微生物群的元素或其代谢产物以远程方式加速胰腺癌的发生。例如，肠道菌群已被证明远程影响其他过程，包括动脉粥样硬化的发展和骨髓免疫功能(46-48)．此外，肠道菌群以远距离方式影响癌症发展的先例已经确立(49，50)，我们的数据进一步支持了宿主微生物群与癌症加速之间的相互作用。宿主菌群是否能诱导导致PDAC起始的遗传畸变是一个有待探索的领域。鉴于我们的模型呈现了完整和衰竭的肠道微生物群系统，两者之间具有不同的表型，进一步的研究必须旨在通过更具体的微生物操作来破译导致所观察到的表型的直接因果物种。

我们的研究开始阐明微生物群在胰腺癌进展中的直接作用，而不仅仅是微生物和疾病存在的简单联系。我们报道，正常和恶性胰腺组织都含有微生物群，但这种微生物群不能区分疾病状态，肠道微生物的存在加速了PDAC的进展，利用转基因和异种移植的胰腺癌小鼠模型。这表明宿主菌群可以从远处(即非胰腺)而不是胰腺内影响胰腺癌的发生，如最近的一项研究所示(35)．此外，与最近的研究相反，我们在GEMM和PDAC异位小鼠模型(与原位胰腺模型相反)中都维持了观察结果。此外，即使在微生物群完整的小鼠中，PDAC异种移植体内也缺乏细菌，这支持了微生物群对胰腺癌发生的远距离影响。因此，胰腺内细菌可能与治疗反应比癌症进展更相关(36)．这些数据为胰腺癌发生机制的研究开辟了新的领域。鉴定和确认特定的微生物及其潜在的代谢物，不仅可以加速PDAC的发展，还可以促进它们转位到胰腺，这将为胰腺癌研究领域开辟新的途径。

资金

这项研究得到了美国癌症协会- Norma and Rich DiMarco指导研究学者Grant (MRSG-17-228-01-TBG;RT)、佛罗里达大学外科(RT)和佛罗里达大学健康癌症中心试点项目赠款(RT、RZG和CJ)、通过由佛罗里达大学医学系(MZK和CJ)和佛罗里达大学健康癌症中心(RZG)分发的基金的佳得乐信托。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

利益冲突声明:没有宣布。

缩写

• GEMM

  基因工程小鼠模型

• PDAC

  胰导管腺癌

• PanIN

  胰腺上皮内瘤变

• 防晒系数

  特定的无菌

参考文献