GPR41 / FFAR3和GPR43 / FFAR2 Enteroendocrine细胞为短链脂肪酸Cosensors vs FFAR3在肠肠神经元和FFAR2白细胞

短链脂肪酸受体的表达GPR41 / FFAR3和GPR43 /游离脂肪酸受体2 (FFAR2)是胃肠道的转基因研究单体的红色荧光蛋白(mRFP)记者老鼠。在胃里游离脂肪酸受体3 (FFAR3) -mRFP表示分组人口胃促生长素和胃泌激素的细胞。相比之下,强烈的表达FFAR3-mRFP观察缩胆囊素,glucose-dependent insulinotropic肽(GIP)和近端小肠的分泌素细胞在所有glucagon-like peptide-1 (GLP-1),肽YY,神经降压素细胞远端小肠。整个结肠和直肠,FFAR3-mRFP强烈表达肽YY的庞大的人口和glp - 1在神经降压素细胞的细胞和近端结肠。的梯度表达式FFAR3-mRFP生长抑素细胞中可观察到不到5%在胃里95%以上的直肠。物质P-containing肠嗜铬细胞的细胞显示类似的梯度FFAR3-mRFP表达整个小肠。令人惊讶的是,FFAR3-mRFP也表达了黏膜下和肠肌神经节的神经元细胞。定量PCR分析fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)纯化FFAR3-mRFP阳性细胞证实了coexpression与各种肽激素以及关键神经元标记蛋白质。FFAR2-mRFP记者强烈表达大量的白细胞特别是小肠固有层的但令人吃惊的是只有弱的分组人口enteroendocrine细胞。然而,合成配体特定FFAR3或FFAR2每个发布GLP-1从FFAR2受体激动剂结肠隐窝文化和细胞内钙动员^{2 +}在FFAR2积极enteroendocrine细胞。得出FFAR3-mRFP作为一个有用的标记对于大多数enteroendocrine小和大肠细胞FFAR3和FFAR2作为传感器的短链脂肪酸enteroendocrine细胞,而FFAR3显然这个角色在肠肠神经元和FFAR2白细胞。

enteroendocrine系统最大和最多样化的身体的内分泌器官的许多不同类型的激素产生细胞分散在肠上皮细胞沿整个胃肠道(GI)呼吸道上皮细胞(1)。Enteroendocrine细胞通常瓶形状的顶端,microvillus-decorated感官延伸到达肠道流明和猴的细胞分泌颗粒底部肠肽激素的释放(2,3)。通常enteroendocrine基底细胞扩展,既可以感觉和有针对性的,旁分泌分泌功能(4,5)。盛行的教条是,每个大约15个不同enteroendocrine细胞表达和释放肽只从单一前体肽激素,即除了glucagon-like peptide-1 (GLP-1) /肽YY (PYY组)的远端小肠和结肠细胞和胃促生长素/近端小肠的蠕动素细胞(1,6,7)。然而,最近很明显,细胞表达功能上相关的肽,缩胆囊素(CCK)分泌素,glucose-dependent insulinotropic肽(GIP) GLP-1, PYY组,和神经降压素,比通常更密切相关的赞赏,他们每个人都有能力来表达其他肽激素这组肽(8,9)。这个相对广泛的肽的功能性结果coexpression尚不清楚。然而,连同这一事实enteroendocrine细胞重新大约每个星期,它表明enteroendocrine系统可能受到更大程度的可塑性,可能可以针对肥胖和2型糖尿病的治疗(9)。

个人enteroendocrine细胞必不可少的功能是肠道的腔的内容和报告在中枢神经系统和身体其他内分泌和代谢器官通过神经、内分泌、旁分泌途径,激活肽激素(3,6)。除了葡萄糖外,大多数营养或食物组件是感觉到通过其代谢产物化学传感器,即专用seven-transmembrane (tm) 7 G protein-coupled位于细胞膜受体(3)。例如,甘油三酯由胰脂肪酶和代谢物,退化和长链游离脂肪酸和monoacyl-glycerol,都感觉到GPR40 / GPR120 GPR119,分别为(10)。

短链脂肪酸(SCFAs),即主要是乙酸、丁酸、丙酸,通过消化肠道微生物群生成复杂的碳水化合物,即主要膳食纤维(11,12)。SCFAs,浓度可以达到约100毫米腔的冒号,很容易吸收,构成我们日常能量需求(6% - -9%的13)。吸收SCFAs也容易被肝脏,并在周围等离子体浓度因此通常与肠道流明低但仍大约10⁻⁵米(14)。然而,SCFAs不仅作为一个重要的能量来源,但他们也作为化学信使或信号分子。在小肠SCFAs已知的影响,例如,平滑肌收缩,电解质的分泌和细胞生长(15- - - - - -17)。最近SCFAs已被证明增加proglucagon和pro-PYY基因表达和增加等离子体水平GLP-1 PYY组和抑制胃促生长素分泌(18)。此外,复合碳水化合物的摄入,如oligofructose和菊粉已经报告给调控GLP-1和PYY组(17,19)。SCFAs也众所周知影响白细胞功能(20.- - - - - -23),最近发现的受体SCFAs至关重要的招募中性粒细胞在肠道炎症和炎症反应的调节肠道微生物群是通过SCFA受体介导的(24,25)

2003年几组报道,2密切相关,孤儿seven-transmembrane或G蛋白耦合的受体,FFAR3 (GPR41)和游离脂肪酸受体2 (FFAR2;SCFAs GPR43)受体(26- - - - - -28)。2 SCFA受体亚型在串联在一个染色体位点编码,和他们的选择性SCFAs很相似,因为他们都是主导SCFAs激活2,丙酸和丁酸,EC₅₀值大约10⁻⁵m .然而,而乙酸也有类似的效力FFAR2丙酸和丁酸盐是强100倍少的游离脂肪酸受体2 (FFAR3),至少在男人(26)。β-hydroxybutyrate相比之下,酮体,由肝脏产生饥荒期间,据报道FFAR3采取行动而不是FFAR2表明FFAR3可能发挥更重要作用的集成外部和内部代谢信号(29日)。FFAR2和FFAR3夫妇通过Gi / o通路和受体抑制营地生产,而FFAR2而不是FFAR3夫妇也有效地通过《Gq》(26)。有一些困惑关于FFAR2和FFAR3的表达模式。然而,人们普遍同意,FFAR2高度表达在白细胞,这是这一事实突显出,FFAR2 recloned在鼠标纯粹基于其特定7 tm作为白细胞受体(26- - - - - -28,30.)。重要的是,它最近变得越来越明显,FFAR2和FFAR3表达enteroendocrine细胞(5,18,31日- - - - - -36)。

在目前的研究中,我们使用转基因老鼠记者表达单体的红色荧光蛋白(mRFP) (37)启动子的控制下元素FFAR2 FFAR3,分别确定SCFA receptor-expressing胃肠道细胞。的表达FFAR3-mRFP enteroendocrine细胞广泛和强烈的整个消化道,详细描述fluorescence-activated细胞的免疫组织化学costaining和分析排序(流式细胞仪)纯化细胞。令人惊讶的是,FFAR3-mRFP被发现也表达了肠神经元,即在黏膜下和肠肌神经节。FFAR2-mRFP特别强烈的表达在白细胞的固有层但enteroendocrine细胞,但也发现了更多的零星。我们的功能研究表明FFAR2和FFAR3 enteroendocrine激素释放的细胞很重要。

材料和方法

动物

生成FFAR2 FFAR3记者老鼠,我们使用细菌人工染色体的编码序列FFAR3或FFAR2取代组成的盒式mRFP后跟一个聚腺苷酸化信号从牛GH和选择基因(β-lactamase)两侧flippase (FLP)重组酶使用衰退/矩形复合目标站点,如前所述(38,39)。验证和片段长度polymorphism-mediated切除后β-lactamase基因,转基因创始人线生成通过原核注入FvB / N卵母细胞。至少有3种不同的创始人被用于生成FFAR2 FFAR3记者行,所有显示mRFP一致的表达模式。动物被保存在C57BL / 6背景。完整的描述一代FFAR3-mRFP FFAR2-mRFP转基因小鼠和描述他们的表达模式的记者在其他组织如脂肪组织将在其他地方出版。

只使用雄性老鼠在这项研究中,他们被安置与随意获得常规食物和水在12小时光,12小时黑暗周期。动物年龄在8 - 10周被颈椎错位使用安乐死。动物程序按照丹麦进行动物研究部门(个人动物许可证颁发的2012-15-2934-00221丹麦动物研究委员会)。

化合物

丙酸钠从西格玛奥德里奇购买。FFAR2选择性受体激动剂(S) 2 - 3 (4-chlorophenyl), 3-dimethyl-N——(5-phenylthiazol-2-yl) butamide (CFMB)从Calbiochem购买。FFAR3选择性受体激动剂N - (2, 5-dichlorophenyl) 4 (furan-2-yl) 2-methyl-5-oxo-1, 4, 5, 6, 7, 8-hexahydro-quinoline-3-carboxamide (AR420626)是合成其他地方描述(40)。

免疫组织化学

组织样本在PBS冲洗,在冰冷的刚做好的4%多聚甲醛固定24小时后跟cryoprotection(20%蔗糖,PBS)在4°C 48小时,在寒冷的PBS和冲洗在嵌入之前,冻结在最佳切削温度复合(Tissue-Tek;樱花)。部分,8μm被削减(CM3050低温恒温器;徕卡),在室温下干燥1小时,洗(3×5分钟)在寒冷的PBS和孵化阻断缓冲区(2% BSA在PBS)在室温下在孵化前一夜之间在4°C主要抗体(补充表1发表在内分泌学会期刊的在线网站http://endo.endojournals.org)稀释阻断缓冲区。部分洗(3×5分钟)在PBS孵化前1小时在室温下与二次抗体稀释1:200和洗PBS(3×5分钟)。组织部分与荧光安装介质(盖玻片S3023;Dako)。组织部分肠神经评估被安装在介质包含4′,6′-diamino-2-phenylindole (DAPI,延长黄金试剂;分子探针)。部分分析了IX70奥林巴斯显微镜和XM10奥林巴斯相机(奥林巴斯)。伪彩色应用程序和图片合并是由Adobe Photoshop。

单细胞悬液和流式细胞仪净化

远端小肠的10厘米(回肠)收获和汇集从3转基因动物。段被倒置,膨胀,消化了20分钟0.13温斯迟单位Liberase(罗氏)1885年DMEM而被慢慢动摇37°C。每五分钟,组织大力动摇了5秒钟。这个过程重复3次。在排序之前,细胞慢慢动摇第二段20分钟在37°C,通过70 -μm孔径细胞过滤器,在1500转5分钟颗粒状,resuspended与10%胎牛血清的DMEM 1885。红色荧光蛋白(RFP)阳性细胞纯化的流式细胞仪使用MoFlo XDP(贝克曼库尔特)和存储在80°C (−9)。

定量rt - pcr分析

细胞总RNA提取使用NucleoSpin RNA x工具包(Macherey-Nagel)和rt - pcr进行使用上标三世逆转录酶(表达载体)。专门设计的StellARray定量PCR (qPCR)数组(Lonza)占地93选肽激素和神经肽是根据制造商的指示使用SYBR预混料Taq交货(豆类)。在单一外显子引物设计;因此,DNA样本函数可以作为校准器。定量rt - pcr进行使用LightCycler480(罗氏)。相对每个基因拷贝数计算使用基因组DNA作为参考基因校准器,进一步规范化YWHAZ描述(41)。

GLP-1分泌物主要结肠隐窝的文化

结肠隐窝是由雄性C57BL / 6小鼠胶原酶消化被Reimann et al (42)和播种到24-well板涂层与基底膜基质(BD生物科学)。第二天,细胞被清洗和孵化与配体3小时(一式四份)标准溶液(42)含0.1%脂肪无酸的BSA (Sigma-Aldrich)和10毫米葡萄糖。总GLP-1 GLP-1测量根据协议版本2从规模内消旋发现(型号K150JVC-1)。

Ca^{2 +}FFAR2-mRFP-positive细胞成像

从FFAR2-mRFP记者隐窝老鼠准备如上所述,镀在matrigel-coated玻璃盖玻片(热科学)在生长介质[DMEM-F12 10%胎牛血清,30 ng / L小鼠表皮生长因子,0.1 mg / L庆大霉素(Sigma-Aldrich), 2毫米谷酰胺、青霉素、链霉素)。Ca^{2 +}成像实验3 - 8天后细胞被加载时45分钟37°C 4μM fluo-4(表达载体),2.5更易probenicid(表达载体),300年μM毒扁豆碱(Sigma-Aldrich)和10μL电力负荷(英杰公司)在生长介质。赫斯特33342(热科学)添加了最后5分钟,和盖玻片细胞被放置在标准溶液(42)与10毫米葡萄糖。活细胞成像进行了使用蔡司倒LSM 780显微镜×40水浸客观的孵化室在37°C。Fluo-4很兴奋在488 nm,赫斯特33342年在405海里,用一个氩和mRFP 543海里,二极管,HeNe激光,分别由禅宗控制软件。FFAR2受体激动剂CFMB添加在最后一集中1μM和fluo-4荧光测量记录每1.5秒。

通过磷酸肌醇积累FFAR3信号

受体cdna克隆到pCMV-Tag (2 b) (Stratagene)。COS-7细胞生长与10%胎牛血清的dmem - 1885, 2毫米谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素和链霉素100μg /毫升。细胞被cotransfected通过磷酸钙沉淀与受体嵌合G蛋白质,Gα_qi4myr,使Gα_我通过Gα耦合信号来衡量_问通路(43)。The cells were incubated with various concentrations of propionate (SUPELCO) and AR420626, followed by inositol phosphate turnover measurements (44)。

结果

在转基因表达mRFP FFAR3启动子的控制下(FFAR3-mRFP),红色荧光观察enteroendocrine-like细胞在整个消化道,即从胃到直肠。然而,在以下的表达mRFP使用RFP的抗体通过免疫组织化学方法检测。

在胃粘膜,FFAR3-mRFP胃泌激素和ghrelin-positive细胞中表达

FFAR3-mRFP-expressing细胞相对稀缺的胃粘膜的身体但被发现在一个相对狭窄的区间在胃底腺腔(图1)。免疫组织化学分析表明,超过90%的胃泌激素免疫反应性的细胞腔表示FFAR3-mRFP (图1一个和表1)。此外,大约50%的饥饿激素细胞显然是FFAR3-mRFP正面的(表1)。然而,相对较大的部分剩余的胃促生长素细胞似乎也表达FFAR3-mRFP但只有弱。相比之下,somatostatin-immunoreactive细胞,均匀分散在整个胃粘膜,很少(< 5%)表示FFAR3-mRFP (图1C和表1)。

在小肠,FFAR3-mRFP表达主要enteroendocrine CCK-secretin-GIP-GLP-1-PYY-neurotensin谱系的细胞

整个小肠的FFAR3-mRFP-positive enteroendocrine-like细胞丰富的均匀分散,而沿着crypt-villus轴(图2a - c)。

CCK免疫反应性的细胞,主要被发现在近端小肠的一部分,基本上都为十二指肠CCK细胞表达FFAR3-mRFP如图所示图2Ab。同样的,所有的免疫反应性的分泌素细胞,这几乎完全被发现在十二指肠,表示FFAR3-mRFP (图2Aa)。GIP-immunoreactive细胞相对丰富的十二指肠空肠但也发现,就像2其他近端小肠的主要激素,CCK和分泌素GIP细胞表达FFAR3-mRFP jejeunal GIP细胞(如图所示图2Ba)。

在远端小肠的一部分,基本上所有enteroendocrine GLP-1免疫反应性的细胞,主要是位于隐窝和绒毛的下部,表示FFAR3-mRFP (图2Ca和表1)。这也是PYY-immunoreactive的细胞,这是位于整个crypt-villus轴(图2世邦魏理仕(Cb)和neurotensin-immunoreactive细胞,主要是位于绒毛(图2Cc;GLP-1, PYY组和神经降压素通常是表示位于相同的单元中2和2或3在一起;然而,这个问题不是本研究进一步解决因为基本上所有的细胞表达一个或更多的荷尔蒙也表达了FFAR3-mRFP)。很少一个GLP-1或PYY组细胞不表达FFAR3-mRFP,和在所有情况下,这些细胞位于非常隐窝的底部。

Enteroendocrine细胞含P物质免疫反应性是完全位于整个小肠隐窝,发现。一部分物质P-positive细胞表达FFAR3-mRFP增加向远端小肠的一部分(表1)。因此,只有大约30%的物质P-positive细胞表达的十二指肠FFAR3-mRFP (图2交流);然而,这部分增加到大约50%在空肠(图2回肠(Bc)和大约90%表1)。

Enteroendocrine生长抑素细胞被发现与一个相对平等的密度在小肠中,但与物质P-positive细胞,生长抑素细胞分散在整个crypt-villus轴。在胃里,只有一小部分(-10%∼5%)的生长抑素细胞表达的十二指肠和空肠FFAR3-mRFP,,然而,增加到大约50%的回肠(图2Cb和表1)。

总之,在小肠,FFAR3-mRFP表达基本上所有enteroendocrine细胞来源于CCK-secretin-GIP-GLP-1-PYY-neurotensin血统(9),但只在一小部分的P物质和生长抑素细胞,分别。然而,这个分数增加向远端小肠的一部分。

密度表达式的FFAR3-mRFP enteroendocrine结肠细胞

FFAR3-mRFP-expressing粘膜细胞的数量和密度,尤其是近端结肠,显著(图3)。红色荧光enteroendocrine细胞被发现人口分散从底部到顶部的隐窝以及上皮隐窝。

PYY组细胞,这显然构成了控制人口enteroendocrine近端结肠细胞,被发现在整个表面上皮隐窝深度和,和所有PYY组细胞表达FFAR3-mRFP (图3Ab和表1)。同样,所有GLP-1细胞,主要被发现在隐窝内,FFAR3-mRFP表示。在近端结肠,神经降压素免疫反应性检测enteroendocrine人口的细胞,被发现在隐窝的上方,特别是在隐窝上皮。这些神经降压素细胞也表达了FFAR3-mRFP (图3交流和表1)。

在近端结肠,生长抑素免疫反应性被发现在一个相对较小的人口enteroendocrine细胞也在一个相当富裕的somatostatin-immunoreactive网络神经纤维位于上皮下方。尽管somatostatin-positive细胞的数量减少了小肠结肠,越来越分数的这些显示FFAR3-mRFP表达式,即大约80% (表1)。

在结肠癌、FFAR3-mRFP细胞的密度较低而近端结肠(图3,A和B),中间的红色荧光细胞主要是发现和更低的隐窝的一部分,尤其是稀缺或在许多地方,甚至完全缺席之间的上皮隐窝(图3B)。在近端结肠,基本上所有glp - 1在中间和PYY组细胞表达FFAR3-mRFP冒号(图3英航和Bb)。令人惊讶的是,神经降压素细胞,这在近端结肠之间被发现主要在上皮隐窝,通常很少或完全缺失中间结肠的一部分。

Somatostatin-immunoreactive细胞一样稀缺中间结肠近端结肠;然而,这些表达的分数FFAR3-mRFP进一步增加大约90% (图3Bc和表1)。

在直肠,FFAR3-mRFP-positive细胞的发生相当类似于结肠,这里所有的GLP-1和PYY组免疫反应性的细胞也表达了FFAR3-mRFP。直肠中几乎所有的生长抑素细胞也表达了FFAR3-mRFP (表1)。

短链脂肪酸诱导激素释放

鉴于FFAR3-mRFP-positive结肠细胞的丰富,我们研究了丙酸被SCFA对GLP-1释放的影响小鼠结肠隐窝的文化。丙酸(1到10毫米)增加GLP-1分泌一样有效neuromedin C (NMC),即1.47±0.08,1.55±0.14倍(平均±SEM),分别为NMC vs 1.63±0.11倍。AR420626,这是一个小说,合成选择性FFAR3受体激动剂有2.7×10的力量⁻⁷在转染COS-7细胞(图3Cc),也刺激GLP-1释放结肠隐窝的文化,虽然只有1.26±0.06倍,以应对10μM AR420626 (图3世邦魏理仕(Cb)。GLP-1分泌也增加了选择性配位体CFMB FFAR2,尽管这没有达到统计学意义(图3世邦魏理仕(Cb)。

纯化FFAR3-mRFP细胞表达的肽成绩单

FFAR3-mRFP-positive细胞从回肠粘膜酶消化分离,纯化和流式细胞仪的分析qPCR肽表达的使者和战车(图4)。所有预期的记录对应所寻找到的肽激素的前体FFAR3-mRFP细胞免疫组织化学分析发现最高度FACS-purified细胞基因表达和高纯度。其中,nt(proneurotensin)和蛇口集装箱码头(prosecretin)是最高度表达肽前体在RNA水平,紧随其后吉普赛人(pro-GIP),Pyy组(pro-PYY),Gcg(proglucagon GLP-1)风场(prosomatostatin)和Tac1 (prosubstance P)的检出限(图4B)。chromogranin A和B的成绩单也高度表达和丰富FFAR3-mRFP-positive细胞(图4B)。

令人惊讶的是,神经生长因子诱导的成绩单(VGF),这是一个为TLQP-21肽前体,也是高度表达和丰富FFAR3-mRFP-positive细胞(图4B)。因为VGF通常表达的神经组织,它的存在在FFAR3-mRFP-positive细胞可以因此表明FFAR3-mRFP表达在神经组织在肠道粘膜或VGF表达一些enteroendocrine FFAR3-mRFP也表达的细胞。然而,其他一些神经肽等前兆GalP (progalanin) Npw (proneuropeptide W), Nmu (proneuromedin U)和NPY (proneuropeptide Y)都在FFAR3-mRFP-positive细胞中还表示,尽管水平相对较低,但支持认为FFAR3可能在神经细胞表达。

FFAR3-mRFP黏膜下和肠肌ganglial细胞中表达

当关注的小肠黏膜下层和肌肉层FFAR3-mRFP记者老鼠,相对较弱的红色荧光检测在黏膜下神经节细胞体内。然而,使用anti-mRFP抗体免疫组织化学分析明确指出FFAR3-mRFP黏膜下神经节细胞体内(图5)。对比染色与抗体的神经肽——血管活性肠多肽(VIP)证明colocalization VIP和FFAR3-mRFP (图5)。然而,许多FFAR3-mRFP-positive神经节细胞没有显示VIP免疫反应性,表明FFAR3-mRFP表达在黏膜下神经节神经元的一个更广泛的人口比VIP-expressing secretomotor神经元。FFAR3-mRFP只能识别soma的神经节细胞和神经纤维不能检测到黏膜下层,甚至用mRFP抗体(数据未显示)。

FFAR3-mRFP也表达在细胞的肠肌间神经节位于圆周和纵向肌肉神经标记PGP9.5(可视化的45)。然而,FFAR3-mRFP-positive肠肌神经节细胞数量较少,也较弱的荧光比观察黏膜下神经节(图5B)。

FFAR2-mRFP表达在白细胞在固有层和enteroendocrine小肠细胞

最初的组织学特征的胃肠道FFAR2-mRFP老鼠证明了FFAR2-mRFP强烈表达在白细胞在固有层以及分散enteroendocrine细胞(图6A)。FFAR2此前报道被表达在白细胞和巨噬细胞(26- - - - - -28);然而,FFAR2-mRFP细胞的数量和密度的小肠固有层FFAR2-mRFP老鼠是惊人的,如图所示的回肠图6。

在目前FFAR2-mRFP记者的老鼠,只有一小部分表达的mRFP是enteroendocrine细胞,和表达远远弱于固有层的免疫细胞。因此,大约40%的PYY组GLP-1cells和大约20%的神经降压素细胞表达FFAR2-mRFP (图6)。FFAR2-mRFP只有弱的事实,显然部分enteroendocrine细胞表达,此前已报告表达FFAR2相当强烈(5,31日,36),我们没有在这里描述的enteroendocrine表达FFAR2-mRFP进一步的老鼠。

FFAR2 agonist-induced FFAR2-mRFP-positive细胞钙反应

由于FFAR2受体Gq耦合,我们从FFAR2-mRFP小鼠结肠隐窝加载文化Fluo-4中描述材料和方法和确定FFAR2-mRFP-positive细胞接受Fluo-4并记录在这些配体。所示图6,虽然enteroendocrine细胞只表达了FFAR2-mRFP有气无力地(图6Aa-c) FFAR2选择性受体激动剂CFMB FFAR-mRFP-positive中引发了强烈的钙反应细胞(图6B)。

讨论

在目前的研究中,mRFP的表达作为一个记者为SCFAs 2受体的表达,FFAR2 FFAR3, enteroendocrine细胞,肠内白细胞,并在整个胃肠道肠神经(图7)。这项研究提供了一个小说,比预期的更广泛的图片主机怎么没感觉的代谢物,从膳食碳水化合物生成(纤维)的肠道微生物群。但研究也提出了一些方法论的问题。

mRFP表达式的努力反映表达FFAR3 FFAR2 ?

GFP的表达或RFP类似物由转录控制元素被广泛使用作为一种工具来识别感兴趣的细胞表达蛋白质特别是在中枢神经系统(www.gensat.org)(46)。虽然积极的结果,即荧光记者的表达蛋白质,通常被认为是一个值得信赖的迹象的感兴趣的蛋白质的表达,负面的结果,即缺乏GFP的表达或RFP,更多的问题。例如,使用一个类似的构造针对胃促生长素细胞人性化renilla reniformis绿色荧光蛋白表达基本上所有饥饿激素细胞的胃里只有很少的胃促生长素细胞小肠(47)。因此,尽管enteroendocrine胃和小肠细胞表达相同的proghrelin前体蛋白从相同的基因,细菌人工染色体结构组成的一个非常大的DNA片段周围的胃促生长素基因指导表达GFP的记者只在胃生长素细胞蛋白质。

FFAR3-mRFP鼠标的应变在目前的研究中,使用mRFP表达式的基本上都enteroendocrine小肠细胞但没有检测到周围的粘膜细胞,即使使用mRFP抗体。然而qPCR分析,例如,FACS-purified GFP-CCK细胞表明尽管FFAR3 enteroendocrine CCK细胞中高度表达,它也表达了在邻近,GFP-negative孤立于粘膜细胞。依照这个qPCR分析FACS-purified FFAR3-mRFP细胞在目前研究显示只有相当有限,7倍浓缩的FFAR3 RNA转录(数据没有显示)。然而,此前据报道,FFAR3 RNA纯度大约50 - 100倍enteroendocrine小肠细胞(32,34,36)。

重要的是,选择性的表达FFAR3-mRFP记者enteroendocrine肠粘膜细胞标记这些细胞是非常有用的。基本上所有CCK FFAR3-mRFP表达,分泌素,和GIP近端小肠细胞和GLP-1, PYY组,神经降压素细胞远端小肠。最近我们描述CCK,分泌素,GIP, GLP-1, PYY组,和神经降压素细胞构成的共同血统enteroendocrine细胞不同,例如,生长激素抑制素和P物质细胞(9)。因此,即使这个家族有能力的成熟细胞表达的肽作为证明,例如,细胞消融研究基于白喉毒素受体的表达启动子驱动proglucagon (9)。此外,单细胞qPCR排序的流式细胞仪分析CCK-GFP-positive细胞表明,大约一半的细胞表达二肽和大约15%的表达三肽激素(9)。有趣的是,FFAR3-mRFP表达enteroendocrine基本上所有的细胞谱系。事实上,在小肠,FFAR3-mRFP enteroendocrine来说是一个更可靠的标记细胞比chromogranin加强绿色荧光蛋白鼠标我们生成高分辨率的绿色荧光蛋白的表达,例如,在所有的肾上腺髓质细胞和内分泌胰腺只有相对较小的一部分enteroendocrine小肠细胞(数据没有显示)。

关于FFAR2-mRFP记者,我们发现它是强烈表示在肠白细胞赞同这一事实FFAR2先前已被证明是表达在白细胞(26- - - - - -28)。然而,尽管FFAR2古典免疫组织化学和qPCR流式细胞仪分析纯化细胞表达和丰富,例如,GLP-1细胞(5,31日,36),FFAR2-mRFP记者表示只有相当弱,只有在enteroendocrine细胞的一小部分。然而,细胞,只有弱表达报告基因FFAR2-mRFP做表达功能FFAR2受体作为证明了引发的强烈的胞内钙反应选择性FFAR2 FFAR2-mRFP-positive细胞受体激动剂(图6B)。

因此,得出的结论是,在鼠标的当前研究中,FFAR3-mRFP是一个优秀的记者FFAR3 enteroendocrine细胞和肠神经细胞中表达。同样,FFAR2-mRFP尤其适合FFAR2表达式的检测肠白细胞但显然只有有限的价值作为一个记者enteroendocrine FFAR2表达的细胞。

Coexpression FFAR3功能和FFAR2 enteroendocrine细胞

之前就有报道称,FFAR2表示,例如,GLP-1细胞SCFAs刺激GLP-1分泌的小肠和结肠隐窝文化(36,48)。有趣的是,Tolhurst et al (36)发现删除FFAR3或FFAR2宁愿类似影响SCFA-induced glp - 1在体外和体内分泌设置,删除每个2受体的葡萄糖耐量受损几乎相同的程度。然而,基于这样的观察:删除FFAR2的影响略大于删除FFAR3事实上只有FFAR2信号通过《Gq》,他们不认为FFAR2和FFAR3是主要的传感器从enteroendocrine SCFAs调节激素分泌细胞(36)。林等(18)达到一个类似的结论通过分析FFAR3-deficient老鼠,因为他们发现,尽管丁酸和丙酸防止食源性肥胖和刺激的肠道激素的分泌,这些影响是显然不是通过FFAR3介导。FFAR3和FFAR2-deficient老鼠,有趣的是,观察其他SCFA受体的表达下降而不是补充上调(36)。因此,似乎有一个紧耦合和潜在合作2 SCFA受体中coexpressed enteroendocrine细胞。特别是,高度的生理作用表达FFAR3仍相当清楚。然而,我们发现,选择性FFAR3受体激动剂作为FFAR2至少有效触发GLP-1分泌选择性受体激动剂(图3C)。

SCFA配体可用性

SCFA配体是由肠道微生物群在大量生产,特别是在结肠中浓度腔可以在100毫米的顺序(5,13)。这是几个数量级高于欧盟₅₀FFAR3和FFAR2,这意味着这些受体可能不能作为传感器的腔的SCFAs。然而,很可能一般营养受体表达不仅在顶端,腔的小费enteroendocrine细胞在基底膜也被描述,至少对于FFAR2 (3,5)。因此,可以认为enteroendocrine细胞,至少在结肠,可能感觉或监控SCFAs在细胞内的浓度要低得多的粘膜细胞和基底膜之间的空间。

在小肠的功能FFAR3 FFAR2 enteroendocrine细胞,然而,更加不明朗。然而,FFAR3 FFAR2 enteroendocrine细胞基底膜的小肠可能只是感应等离子体吸收SCFAs。此外,虽然一般不欣赏,但实际上是一个相当大的和多样化的微生物群还在小肠(12)。因此,SCFA enteroendocrine细胞受体在小肠也可以监控SCFA由细菌产生的流明小肠(图7)。

在FFAR3-expressing胃胃泌激素和激素细胞,有可能相当有限的地方,腔的SCFAs的生产,例如,在人。然而,在反刍动物这些enteroendocrine细胞将会接触到大量的SCFAs瘤胃中产生,这是位于普通胃更多的检查。

FFAR3表达肠神经元

FFAR3-mRFP惊讶地发现是表示对肠神经,也即在神经节细胞黏膜下和肠肌神经节(图7)。粘膜下神经节,这些细胞costain VIP,表明SCFAs FFAR3 secretomotor神经元,感觉到的是参与的控制从肠上皮细胞分泌的水和盐。然而,FFAR3-mRFP还发现在非vip神经元,这需要进一步的特点。此前有报道称FFAR3交感神经节表示,这是表明SCFAs可以刺激交感神经元活动率(49)。因此,看来FFAR3函数SCFA传感器在各种身体的神经元。

一些结论

在目前的研究中,我们发现FFAR3-mRFP记者强烈表达了在主,人口众多enteroendocrine细胞在整个消化道,但令人惊讶的是还在黏膜下和肠肌神经节神经元。相比之下,FFAR2-mRFP表示只有在enteroendocrine细胞,但强烈的族群人口众多的白细胞在小肠固有层。因此,显然FFAR2和FFAR3余函数作为短链脂肪酸的传感器信号在enteroendocrine细胞,而FFAR3独自负责直接神经传感和FFAR2白细胞传感SCFAs复合碳水化合物产生的肠道微生物群(图7)。从而我们的研究提供了一个小说,更复杂和精致的肠道微生物群的代谢是由主机通过SCFA代谢物和记录可以想象如何微生物群从而控制主机通过SCFA代谢物的代谢被感觉到不仅通过enteroendocrine而且神经和免疫路线。然而,我们需要理解的复杂生理相互作用FFAR2和FFAR3 enteroendocrine细胞在分子和细胞生物学水平更好的利用这个系统进行药物治疗。然而,FFAR3-mRFP记者作为小说,在这项研究中引入方便enteroendocrine细胞的主要人口的生物标志。

确认

我们感激抗体的慷慨礼物教授Jan Fahrenkrug Jens f . Rehfeld每Schaffalitzky de Muckadell和专家技术援助的丽丝奇怪和海蒂·m·保尔森。我们感谢弗雷德里克·Backhed建设性的讨论和批判阅读手稿。

这项工作是由诺和诺德基金会支持基础代谢研究中心(www.metabol.ku.dk)是由无条件拨款支持哥本哈根大学的诺和诺德公司的基础。项目也是唯一支持的项目对食物、健身和制药公司(http://www.foodfitnesspharma.ku.dk)从丹麦科学、技术和创新。实验室进一步支持由Lundbeck公司基金会(K.L.E. T.W.S.)和它是一家从丹麦医学研究理事会(K.L.E.和t。w。)。

A.G.当前地址:C年代ll我mited, 45 Poplar Road, 3052 Parkville, Australia.

披露概要:萨达姆政权和R.M.J.受雇于竞技场制药、开发复合AR420626用于这项研究。其余作者没有披露。

缩写

• AR420626

  N - (2, 5-dichlorophenyl) 4 - (furan-2-yl) 2-methyl-5-oxo-1, 4, 5, 6, 7, 8-hexahydroquinoline-3-carboxamide

• CCK

  缩胆囊素

• CFMB

  (S) 2 - 3 (4-chlorophenyl), 3-dimethyl-N——butamide (5-phenylthiazol-2-yl)

• 流式细胞仪

  fluorescence-activated细胞分类

• FFAR2

  游离脂肪酸受体2 (GPR43)

• FFAR3

  游离脂肪酸受体3 (GPR41)

• 胃肠道

  胃肠

• 吉普赛人

  glucose-dependent insulinotropic肽

• GLP-1

  glucagon-like肽1

• mRFP

  单体的招标书

• NMC

  neuromedin C

• PYY组

  肽YY

• qPCR

  定量聚合酶链反应

• 招标书

  红色荧光蛋白

• 短链脂肪酸

  短链脂肪酸

• VGF

  神经生长因子诱导

• 贵宾

  ——血管活性肠多肽。

引用