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研究文章

结直肠癌和人类肠道微生物群:全基因组霰弹枪测序的可重复性

  • 艾米丽Vogtmann，

    emily.vogtmann@nih.gov

    从属关系美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症流行病学与遗传学部，美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症预防部

    ⨯
  • 兴,

    联系美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症流行病学与遗传学部

    ⨯
  • Georg西,

    联系结构与计算生物学单元，欧洲分子生物学实验室，海德堡，德国

    ⨯
  • Shinichi Sunagawa

    联系结构与计算生物学单元，欧洲分子生物学实验室，海德堡，德国

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  • 安妮塔y沃伊特,

    从属关系德国海德堡欧洲分子生物学实验室结构与计算生物学研究室，德国海德堡大学附属医院病理研究所应用肿瘤生物学研究室，德国海德堡大学附属医院应用肿瘤生物学临床合作单元，德国海德堡大学附属医院德国癌症研究中心(DKFZ)，德国海德堡大学附属医院和欧洲分子生物学实验室分子医学合作单元(MMPU)

    ⨯
  • 劳伊娜Hercog,

    联系基因组学核心设施，欧洲分子生物学实验室，海德堡，德国

    ⨯
  • 詹姆斯·j·Goedert

    联系美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症流行病学与遗传学部

    ⨯
  • 所施,

    联系美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症流行病学与遗传学部

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  • 同行博克,

    从属关系德国海德堡欧洲分子生物学实验室结构与计算生物学单元，德国海德堡大学医院分子医学合作伙伴单元(MMPU)，德国海德堡大学和欧洲分子生物学实验室，马克斯Delbrück德国柏林分子医学中心，德国柏林大学生物信息部生物中心Würzburg, Würzburg，德国

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  • Rashmi Sinha

    联系美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症流行病学与遗传学部

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摘要

越来越多的证据表明，肠道菌群影响结直肠癌的发展，但之前的研究在人群、技术方法和与癌症的关系方面存在差异。了解这些变化是需要进行比较和潜在的研究汇集。因此，我们对来自华盛顿特区的52例治疗前结直肠癌病例和52例匹配对照的粪便样本进行了全基因组鸟枪测序。我们将之前发表的16S rRNA研究结果与同一种群的宏基因组分类进行了比较。此外，将华盛顿特区病例和对照组的宏基因组预测基因、模块和途径与在法国招募的病例和对照组进行比较，这些病例和对照组的标本使用同一平台处理。粪便梭菌的存在，梭菌属,Porphyromonas而基于16S rRNA的肿瘤病例中梭状芽孢杆菌的相对丰度仅处于宏基因组学的边缘。这表明，在相同的样本集中，大多数但不是所有的分类关联都可以用两种方法看到。考虑到最近发表的法国宏基因组数据集中基因、模块和通路的相对丰度与癌症的显著关联，在华盛顿特区人群中检测到10个基因中的4个、9个模块中的3个和17个通路中的7个具有统计学意义的关联。总的来说，在华盛顿特区的研究中，结直肠癌的状况与法国研究中发现的39%的宏基因组预测基因、模块和途径相关。需要在人口内部和人口之间进行更多的比较，以确定变异的来源和尽管存在这些变异，但仍可重现的疾病关联。未来的研究应该有更大的样本量或跨研究的数据池，以有足够的能力检测出在多次试验校正后可重复和显著的关联。

引用:Vogtmann E, Hua X, Zeller G, Sunagawa S, Voigt AY, Hercog R，等(2016)结直肠癌与人类肠道微生物组:全基因组鸟枪测序的可重复性。科学通报11(5):e0155362。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155362

编辑器:约翰·帕金森，加拿大儿童医院

收到:2015年11月17日;接受:2016年4月27日;发表:2016年5月12日

这是一篇开放获取的文章，没有任何版权，任何人可以为任何合法目的自由复制、分发、传输、修改、构建或以其他方式使用。该作品可在Creative Commons CC0公共领域奉献。

数据可用性:霰弹枪宏基因组测序数据可在欧洲核苷酸档案数据库获得，登录号为PRJEB12449 (http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB12449)．由于隐私限制，完整的元数据可以通过联系Rashmi Sinha博士(sinhar@nih.gov)．

资助:该项目得到了美国国家癌症研究所内部研究计划的支持。GZ、SS、AYV、RH和PB通过CancerBiome项目(欧洲研究理事会项目参考文献268985)获得资助。

利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。

缩写:BMI，身体质量指数;CRC,结直肠癌;哥伦比亚特区;HMP，人类微生物组项目;宏基因组操作分类单位mOTU;操作分类单位;全基因组鸟枪测序

简介

人类微生物组是越来越多的研究领域的主题，因为它可能与人类健康和疾病有关。越来越多的证据表明，微生物组在结直肠癌(CRC)的发生或进展中发挥作用，可能通过炎症途径或致癌性微生物代谢物[1]，许多研究表明微生物与结直肠癌的关系[2- - - - - -9］．例如，通过对从粪便中提取的DNA中的通用细菌16S rRNA基因的下一代测序，我们的小组表明，与匹配的对照相比，CRC病例的群落多样性较低，梭状芽胞杆菌的相对丰度略低，而梭状芽胞杆菌的存在率较高梭菌属而且Porphyromonas［2］．在之前的微生物组和CRC研究中，一些使用了16S rRNA基因测序[2，4，5，7，9]，而其他人则使用全基因组霰弹枪测序/霰弹枪宏基因组学(WGSS;［3.，6，8])。WGSS不仅能获得细菌组成和多样性的概况，还能估计微生物组的功能潜力[10］．

我们对20世纪80年代在华盛顿进行的一项CRC病例对照研究的粪便样本进行了鸟枪宏基因组测序，该研究之前采用了16S rRNA基因测序[2］．通过将相同的样本采用不同的测序方法，我们能够将之前观察到的16S rRNA关联与霰弹枪宏基因组测序数据进行比较。此外，通过使用该技术，我们能够调查潜在的微生物基因水平与CRC的关联，这在16S rRNA基因测序数据中是不可能的，我们将基因水平的关联与之前法国一项病例对照研究中检测到的关联进行了比较，该研究应用了相同的宏基因组DNA提取和测序平台和生物信息学管道[8］．

材料和方法

主要研究人群

粪便样本是在一项CRC病例对照研究中收集的，该研究之前已详细描述过[11]，对各自16S rRNA基因测序研究的分析描述已在此前发表[2］．简单地说，1985年至1987年，在美国华盛顿招募了因非肿瘤和非胃肠道疾病等待手术的CRC病例和频率匹配的对照组。在手术或其他治疗前，参与者在两天内收集所有粪便，并将其储存在干冰上。在实验室，样本被冷冻干燥，池，并在-40°C持续保存。对于目前的霰弹枪宏基因组研究，我们从52例病例和52例对照组(WGSS DC人群)中选择了样本。病例和对照组的性别和体重指数(BMI;< 20公斤/米2≥20kg /m2)．将WGSS DC分析中的关联与之前16S rRNA基因测序研究(16S DC人群)中的关联进行比较，该研究包括来自同一父母研究的47例CRC病例和94例对照受试者。所有来自16S DC的47例CRC病例都包含在WGSS DC中，WGSS DC中的52例对照包含在16S DC的94例对照中。参与者提供了书面知情同意，该研究得到了美国国立卫生研究院人体受试者研究办公室的批准。

独立验证人口

我们将先前发表的一项研究(人群F)的数据作为独立验证集[8］．简而言之，从2004年到2006年，在法国巴黎招募了CRC病例和随机选择的对照组。在结肠镜检查前，收集新鲜粪便样本，并在收集后4小时内在-20°C冷冻。人群F包括53例CRC, 15例大腺瘤，27例小腺瘤，61例正常对照。由于来自华盛顿特区的对照可能也包括未诊断的小腺瘤，来自人群F的对照病例组包括53例CRC病例和88例对照组(即27例小腺瘤和61例正常对照组)，并排除了15例大腺瘤的数据。

我们还纳入了292名MetaHIT参与者公开的鸟枪宏基因组数据[12，13]及94名人类微生物组计划第一期参与者[14]以比较我们样本的整体多样性、丰富度和均匀度。

DNA提取和全基因组鸟枪测序

来自WGSS DC的冻干粪便样本被解冻，在磷酸盐缓冲盐水中重新悬浮，然后将一份标本用干冰运到位于德国海德堡的欧洲分子生物学实验室基因组学核心设施。详细描述了DNA提取、文库制备和全基因组霰弹枪测序的方法[8简单地说，从粪便样本中提取DNA使用GNOME DNA分离试剂盒(MP Biomedicals)进行了少量修改。使用Illumina HiSeq 2000/2500 (Illumina, San Diego, USA)对提取的DNA进行全基因组鸟枪测序。在位于德国海德堡的欧洲分子生物学实验室基因组学核心设施对这些样本的成对序列进行测序，其阅读长度为100 bp，目标测序深度为5 Gbp。

生物信息学

全基因组测序数据的生物信息学处理的一般策略先前已详细描述过[8]，在NCBI从种到门和宏基因组操作分类单位(mOTU)的分类级别中总结的分类学丰度剖面[15，16]是使用MOCAT创建的[17］．MOCAT还用于对从宏基因组集合中提取的基因进行功能注释到KEGG数据库(版本62)[18］．基于mOTU相对丰度计算生态指数(Shannon多样性、物种丰富度和群落均匀度)，并使用素食R软件包对2000个插入进行下采样[19］．由于阅读覆盖率较低，来自WGSS DC群体的一名参与者和来自F群体的四名参与者被排除在外。

统计分析

我们比较了WGSS DC群体、F群体、MetaHIT和HMP I期样本的Shannon多样性、丰富度和均匀性，并使用Kruskal Wallis检验检验WGSS DC群体和F群体的病例对照差异。然后，对于主要研究人群(WGSS DC人群:52例vs 52对照)和独立验证人群(F人群:53例vs 88对照)，我们测试了病例/对照状态与不同分类水平和基因类别(即基因、模块和途径)的相对丰度和存在/缺失之间的关联。采用了调整了年龄、性别和体重指数(BMI)的逻辑回归模型，根据Wald检验(S1表)．来自WGSS DC人群的3例CRC病例缺少BMI数据，因此我们使用性别特异性方法将这些值纳入CRC病例。为了与16S DC研究的可比性，我们还分别计算了特定类群存在/缺失和相对丰度的双侧Wald卡方检验和双侧非参数Wilcoxon检验的非调整逻辑回归模型。我们为所有分类水平和基因类别的WGSS DC和居群F生成log(观察的p值)与log(p值在正态分布下)的QQ图，以确定在多次比较校正后潜在的统计学显著关联。对于群体F中的基因类别数据，我们使用p值的Bonferroni校正来确定统计学意义(即p < 0.05/试验次数)，并认为p值< 0.05对WGSS DC的重复性分析具有统计学意义。所有的统计分析都使用R(3.0.0版本)进行。

结果

报告了52例CRC病例和52例对照组的特征表1．他们的性别和体重指数都很匹配。然而，CRC病例中非西班牙裔黑人的比例较高(病例中23.1%，对照组中5.8%)，受教育水平较低(15.4%的病例和3.8%的对照组中高中以下教育程度)，且吸烟者较多(病例中13.5%，对照组中3.8%)。在CRC病例中，28.8%的病例发生在右结肠，34.6%发生在左结肠。大多数CRCs是侵袭性的，没有已知的转移(40.4%)，但34.6%是转移。

缩略图
下载:
表1。1985-1987年，美国华盛顿结肠直肠癌病例和对照组(人口WGSS DC)的描述性特征。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155362.t001

WGSS组与16S组结直肠癌的相关性

在该人群(16S DC)之前的16S rRNA基因测序分析中，4个类群的存在和3个类群的相对丰度与CRC病例状态显著相关，错误发现率调整后的p值小于0.05。见表2，我们重现了梭菌门的存在与CRC病例状态之间的显著关联(p = 0.003)，特别是76.9%的病例和48.1%的对照组有可检测到的梭菌门。这再现了在16S DC分析中梭杆菌与病例状态的关联;尽管检出率较低(36.2%的病例和16.0%的对照组)，表2)．与16S DC相比，WGSS对其他类群也有较高的流行检出率，并再现了与梭菌属(p = 0.006)和Porphyromonas(p = 0.032)与CRC病例状态。之间的联系Atopobium和16S DC的CRC没有在WGSS中复制(表2)．见表3我们没有重现特定类群的相对丰度与CRC病例状态之间的关联，尽管在病例中梭状芽孢杆菌的相对丰度之间的关联趋于较低(p = 0.092)。值得注意的是，与16S DC研究相比，WGSS估计的病例和对照组梭状芽胞杆菌的相对丰度低两倍。在WGSS DC人群中，相对丰度最高的类群为拟杆菌门(Bacteroidia)，病例中相对丰度为53.2%，对照组为50.9% (S1表)．

缩略图
下载:
表2。16S rRNA基因测序数据与全基因组霰弹枪测序数据中检测到的重要类群的比较(存在/不存在类群)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155362.t002

缩略图
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表3。16S rRNA基因测序数据与全基因组霰弹枪测序数据中发现的类群显著相对丰度的比较。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155362.t003

WGSS DC与F人群中结直肠癌的相关性

在WGSS DC人群中，CRC病例与对照之间在Shannon多样性、丰富度或基于motu的均匀性方面没有显著差异，尽管总体上对照相比病例有略高的alpha多样性(图1)．WGSS DC群体、F群体和MetaHIT样本的Shannon多样性、丰富度和均匀度相似，而HMP样本的Shannon多样性、丰富度和均匀度略低。

缩略图
下载:
图1所示。比较人类微生物组项目(HMP)一期(N = 94)、MetaHIT (N = 292)粪便样本的Shannon多样性指数、物种丰富度和群落均匀性，以及WGSS DC和F人群的结直肠癌病例和对照。

采用Kruskal-Wallis检验检验结直肠癌病例与对照组之间的统计学差异。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155362.g001

人口F中的CRC病例状况[8与许多宏基因组衍生的KEGG基因、模块和通路的相对丰度密切相关(从45°线的强烈偏差中可以看出图2)，但这在WGSS DC人群中未见。对于KEGG基因、模块和通路的存在，在两个研究人群中几乎没有证据表明与CRC病例状态有任何关联(图2)．由于仅在F群体中检测到基因水平数据相对丰度的相关性，我们试图在F群体中通过Bonferroni校正与未进行多次比较校正的WGSS DC数据重现具有统计学意义的相关性。

缩略图
下载:
图2所示。从人群WGSS DC和人群F的粪便样本中，KEGG基因、模块和通路的相对丰度(上)和存在/缺失(下)与结直肠癌病例状态之间的关系的p值QQ图。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155362.g002

与全球评估相比(图2)，当我们考虑KEGG基因相对丰度(p < 0.05/8028)、模块(p < 0.05/485)和通路(p < 0.05/318)在群体F中的显著相关性时，在WGSS DC中对10个基因中的4个进行了癌症关联(p < 0.05):氨基甲基转移酶(K00605)、色氨酸酶(K01667)、肽甲硫胺亚基还原酶msrA/msrB (K12267)和假定的膜蛋白(K01421) (表4)．同样，WGSS DC重现了9个模块中的3个的癌症关联:亮氨酸降解，亮氨酸= >乙酰乙酸酯+乙酰辅酶a (M00036)，柠檬酸循环，第二碳氧化，2-氧戊二酸酯= >草酰乙酸酯(M00011)，和蛋氨酸生物合成，apartate = >高丝氨酸= >蛋氨酸(M00017) (表5)．在F人群中17个具有统计学意义的通路关联中，WGSS DC复制了7种通路关联:柠檬酸循环(ko00020)、硫辛酸代谢(ko00785)、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解(ko00280)、肌萎缩性侧索硬化症(ko05014)、赖氨酸生物合成(ko00300)、香叶醇降解(ko00281)和氮代谢(ko00910) (表6)．在WGSS DC中未发现与CRC的额外显著相关。

缩略图
下载:
表4。在Bonferroni校正后，F人群中基因的相对丰度与结直肠癌病例状态之间存在统计学意义上的相关性(p < 0.05/8028)，在WGSS DC人群中观察到的相关性。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155362.t004

缩略图
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表5所示。经过Bonferroni校正后，一个模块的相对丰度与人群F中的结直肠癌病例状态之间存在统计学意义上的相关性(p < 0.05/485)，在WGSS DC人群中观察到的相关性。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155362.t005

缩略图
下载:
表6所示。Bonferroni校正后，F人群中通路的相对丰度与结直肠癌病例状态之间存在统计学意义上的相关性(p < 0.05/318)， WGSS DC人群中已观察到的相关性。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155362.t006

讨论

本研究有两个主要目的:1)将之前观察到的16S rRNA基因关联与全基因组鸟枪宏基因组测序数据进行比较;2)研究不同人群中潜在的微生物基因水平与CRC的相关性。对于第一个目标，宏基因组学方法重现了先前在16S rRNA基因分析中观察到的一些关联，最值得注意的是，在梭杆菌门和梭杆菌门中发现类群的可能性更高梭菌属结直肠癌病例属。这两项研究之间的一个很大的区别是对类群的检测灵敏度。例如，在16S rRNA基因研究中，在36.2%的病例和16.0%的对照组中检测到梭菌门，但使用全基因组霰弹枪宏基因组学，在76.9%的病例和48.1%的对照组中检测到梭菌门。目前还不清楚是什么原因导致了16S rRNA和WGSS结果之间的差异，但可能是由于16S rRNA基因可变区测序、测序深度、分类学的生物信息学分配或技术差异。当将16S rRNA测序与全基因组鸟枪宏基因组研究进行比较时，这些在检测类群存在性和相对丰度方面的差异显示了一个重要的差异，应该在未来进行更详细的研究。

对于我们的第二个目标，WGSS DC确实重现了在CRC病例状态的人群F中检测到的一些特定的、具有统计学意义的基因、模块和通路[8］．在独立模型中确定了两个相关模块和路径:M00011(柠檬酸循环，第二碳氧化，2-氧酰戊二酸= >草酰乙酸)和ko00020(柠檬酸循环/TCA循环);和M00036(亮氨酸降解，亮氨酸= >乙酰乙酸+乙酰辅酶a)和ko00280(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解)。这些功能和其他功能可能与CRC有关，但还需要进一步的研究。基于全基因组霰弹枪宏基因组的Shannon多样性、丰富度和均匀度与WGSS DC中的CRC病例状态无关，但这些估计与MetaHIT和F人群中的相似。

我们从之前的一项研究中得到的统计上显著关联的再现性[8]提供了关于未来数据池的重要信息，因为这两组数据之间存在巨大差异。我们的样本是在20世纪80年代在美国收集的，而F群体的样本是在21世纪初在法国收集的。有证据表明，在低温下储存粪便样本可以维持微生物群落结构[20.，21然而，据我们所知，这一点在近30年的时间里都没有对储存的样本进行过测试。鉴于之前的研究表明，与2型糖尿病相关的微生物可能因人群而异[22，23]，尽管这些差异可能是由使用二甲双胍引起的[24)，令人鼓舞的是，美国和法国不同年份的人口之间的一些联系是强有力的。此外，在我们的研究中，我们在住院和治疗前收集了两天内所有肠道运动的粪便样本，然后冷冻干燥。这与F人群的方法形成对比，F人群的样本在结肠镜检查前2周到3天收集，但总是在肠道清洁之前收集，并来自一次肠道运动，在4小时内冻结。研究发现，粪便样本的冷冻干燥可能会影响婴儿粪便样本中不同类群的相对丰度[25]，因此在不同的存储方法之间重复一些发现是令人安心的。此外，与另一项霰弹枪宏基因组研究MetaHIT相比，WGSS样本似乎具有类似的多样性度量，MetaHIT也包含了不同的种群和集合。正如在人类全基因组关联研究中所看到的，需要大样本量来检测在多次测试中存活下来的关联。由于收集时间、种群和样本收集的这些差异，微生物分类和基因水平数据与CRC病例状态之间关联的相似性为跨异质性研究的数据汇集提供了一些支持。为评估未来收集粪便的理想收集方法，已进行了更多的工作[26- - - - - -30.]以及实验室处理程序和数据的生物信息处理的影响[31可以为下游数据池或元分析提供额外的信息。

此前的其他研究也调查了粪便微生物群与结直肠癌之间的关系[32］．与我们的研究结果类似，一些研究并没有发现CRC病例与对照组在社区多样性方面的总体差异[4，5，9］．然而，一项研究发现，与对照组相比，CRC病例的基因和属丰富度增加了[3.]，而另一项研究发现，与对照组相比，CRC患者的基因丰富度和基因α多样性降低，尽管在对结肠镜后粪便样本采集进行调整后，这种关联在统计学上不显著[6］．与我们的发现一致，大多数之前的研究发现CRC病例更有可能具有可检测或更高水平的梭菌属与对照组相比[3.，5- - - - - -7，9]，而只有一些研究检测到更高水平或检测到Porphyromonas与对照组比较[3.，5，7］．在之前的一项全基因组鸟枪宏基因组研究中，与对照组相比，发现模块M00036和KEGG通路ko00280和ko00910在CRC病例中显著富集[6与本研究中检测到的结果相似。在之前的另一项全基因组鸟枪宏基因组研究中，我们对KEGG通路ko00020、ko00280、ko00281、ko00300、ko00785的发现得到了证实，但KEGG通路ko00910的相关性与我们观察到的相反[3.］．综上所述，我们证实了在之前的研究中观察到的一些关联，但所有之前的研究(16S和全基因组霰弹枪测序)的功率都很低。此外，这些先前的研究可能无法充分调整潜在的混杂因素，这可以解释研究之间的一些差异。由于微生物组分析的多重比较，数据汇集将是克服这些分析能力有限的关键。

目前的研究并非没有局限性。首先，所有的粪便样本都是横断面收集的，因此不可能确定微生物变化是在癌症发生之前发生的，还是由于癌症的发生而发生的。此外，本研究的样本量相对较小，因此，在多次检验校正后，我们无法检测到许多具有统计学意义的关联。最后，我们的健康对照是等待择期手术的医院对照，可能不能代表当时的一般人群。然而，我们的研究也有优势。我们能够利用30多年前收集的现有样本资源，并从当前的一项研究中再现与CRC的关联。我们的粪便样本来自两天的收集，这可能更能代表典型的肠道微生物群。我们还能够利用其他现有的数据源进行比较。

在这项研究中，我们能够使用全基因组霰弹枪宏基因组测序重现在同一人群中使用16S rRNA基因测序评估的一些重要发现[2］．目前的研究还从之前法国患者的全基因组鸟枪宏基因组研究中再现了与CRC的一些显著的基因水平关联[8］．未来的研究将跨时间、人口和样本收集方法汇集数据，将有助于克服微生物组流行病学研究面临的一些统计能力问题，并将是识别可能涉及CRC检测或预防的重要关联的关键。此外，由于目前所有的研究都是横断面的，因此前瞻性队列研究必须包括粪便样本收集，以便研究人类肠道微生物组对不良健康结果的影响，如CRC。

支持信息

S1表。WGSS DC居群和F居群的分类分配(门、纲、目、科、属、种、种i、Motu)和基因类别(基因、模块和途径)的平均相对丰度或检测。

每个标签代表一个特定的分类级别或基因分配。给出了病例和对照组的平均相对丰度或平均检出(存在/缺失)，并提供了根据年龄、性别和体重指数(BMI)调整的Wald检验的p值。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155362.s001

(XLS)

致谢

该项目得到了美国国家癌症研究所内部研究计划的支持。部分数据分析正在使用美国国立卫生研究院HPC Biowulf集群的计算资源(http://hpc.nih.gov)．GZ、SS、AYV、RH和PB通过CancerBiome项目(欧洲研究理事会项目参考文献268985)获得资助。

作者的贡献

构思并设计了实验装置:GZ SS AYV RH JJG PB RS。分析数据:EV XH GZ JS。撰写论文:EV XH GZ SS AYV RH JJG JS PB RS。

参考文献

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