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Mol. Cells 2016;39 (7): 536 - 542

2016年7月31日在线发布

https://doi.org/10.14348/molcells.2016.0048

©韩国分子与细胞生物学学会

IL-17A膜结合形式促进结肠癌细胞生长和致瘤性

Van Anh Do Thi1、3、朴桑民1、3， Hayyoung Lee2, *和金永相(Young Sang Kim)1, *

作者信息。+

1忠南大学自然科学学院生物化学系，大田305-764;2忠南大学生物技术研究所，大田305-764;3.这些作者对这项工作做出了同样的贡献。

通信:＊对应：young@cnu.ac.kr(YSK);hlee@cnu.ac.kr(HL)

收到了2016年2月23日;修改后的: 2016年5月17日;接受: 2016年5月27日

摘要

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白细胞介素- 17a是IL-17家族的一员，在老鼠体内被称为CTLA8。它由T淋巴细胞和NK细胞产生，具有促炎作用，诱导细胞因子和趋化因子的产生。然而，它在肿瘤生物学中的作用仍有争议。我们通过将编码IL-17A的基因以分泌或膜结合的形式转移到CT26结肠癌细胞中，研究了局部产生的IL-17A的作用。CT26细胞的膜结合形式的表达显著增强了它们的增殖 在体外．增强的生长被证明是由于细胞周期进展速度的增加:在同步细胞后，加入和退出秋水胺，表达IL-17A膜结合形式的细胞的细胞周期进展速度远远快于对照细胞。分泌型和膜结合型IL-17A均可诱导癌细胞中Sca-1的表达。当肿瘤克隆被移植到同基因BALB/c小鼠中，表达IL-17A膜结合形式的肿瘤克隆迅速生长;表达分泌型的细胞也比野生型CT26细胞生长得快，但比表达膜结合型的克隆生长得慢。这些结果表明IL-17A通过增强细胞周期进程促进肿瘤的致瘤性。在治疗肿瘤和免疫相关疾病时应考虑这一发现。

关键字结肠癌，白介素17A，膜结合细胞因子，促肿瘤因子，sca-1

介绍

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Th17淋巴细胞是最近发现的CD4+ T淋巴细胞的一个子集，它在IL-6、TGF-β和IL-23的作用下发育。它们的典型特征是分泌细胞因子IL-17 (韦弗等人，2006；2007)．IL-17最早被克隆并称为细胞毒性T淋巴细胞抗原8 (CTLA-8)，以IL-17A-F亚型的形式存在(Rouvier等人，1993；Yao等，1996)．其中IL-17A和IL-17F同源性最高，主要由活化的T淋巴细胞产生(Moseley等人，2003年)．IL-17是一种促炎细胞因子，通过NF-κB、ERK、JNK和p38 MAPK细胞内信号通路，促进巨噬细胞和成纤维细胞分泌IL-6、IL-1β和趋化因子。它还可以通过诱导过度的炎症反应引起自身免疫性疾病。由于IL-17受体在免疫细胞和各种上皮组织中广泛表达(Moseley等人，2003年)， IL-17信号通路可能影响免疫系统以外的细胞内稳态。

细胞因子在调节致瘤性的免疫应答中起着重要作用。IL-17的功能作用在肿瘤生物学中也有研究。简而言之，一些肿瘤如前列腺肿瘤和卵巢肿瘤已被发现可产生Th17细胞(Miyahara等，2008；Sfanos等人，2008年)．然而，在大多数类型的癌症中，IL-17的分泌形式的异位表达对其没有显著影响 在体外增长(Hirahara等人，2001；Numasaki等，2003；Tartour等人，1999年)．将产生il -17的肿瘤移植到具有免疫功能的同基因小鼠中得到了相反的结果;IL-17在某些造血癌细胞和纤维肉瘤中的异位表达抑制了其移植后的生长(Benchetrit等人，2002年；Hirahara等人，2001)，而其他一些癌症的生长则受到刺激(Numasaki等，2003；Tartour等人，1999年)．阻断内源性IL-17表达也会增加或减少肿瘤生长，这取决于癌症类型和系统(Hyun等人，2012；Kryczek等，2009；王等，2009；2010)．

尽管某些细胞因子具有强大的抗肿瘤作用，但全身给药的细胞因子具有显著的毒性，这限制了它们的临床应用(阿特金斯等人，1997；Car等人，1999；莱纳德等人，1997年)．为了避免这一问题，人们尝试了实现细胞因子本地化生产的基因转移策略。在许多情况下，以膜结合形式表达的细胞因子比以分泌形式表达的细胞因子更能提高肿瘤细胞的免疫原性，并能更有效地刺激抗肿瘤免疫(Ji等，2002；Kim等人，2000年；Marr等人，1997年；Hoo Soo等，1999)．先前我们发现，表达膜结合IL-12p35的肿瘤细胞可降低致瘤性，并导致CD8+甲沙细胞的T细胞依赖性抗肿瘤免疫(Lim等人，2010)．在本研究中，我们研究了IL-17A膜结合形式在CT26结肠癌细胞上的表达是否促进或抑制其肿瘤生长，首次发现膜结合形式的IL-17A大大增加了其增殖和致瘤性 在体外而且 体内。

材料与方法

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小鼠和肿瘤细胞系

雌性BALB/c小鼠6 ~ 8周龄，来自韩国化学技术研究院(Korea Research Institute of Chemical Technology, Korea)。所有的动物程序都得到了忠南大学实验动物保护委员会的批准和指导。以BALB/c小鼠为来源的小鼠结肠肿瘤细胞系CT26在添加10%热灭活胎牛血清(FBS;GIBCO-BRL)， 2 mM l -谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素(Sigma St, Louis, MO)在37°C湿度5% CO2中。以G-418 (Santa Cruz, US) 0.2 μg/ml作为转染的选择剂。细胞孵育24小时，然后暴露于含有秋水胺或IL-17A的培养基中。

抗体和试剂

抗il - 17a多克隆抗体(ab79056)和fitc偶联抗mhc Class 1 (ab25056)购自Abcam(美国)。抗sca1抗体由Alfred L. M. Bothwell博士(美国耶鲁大学)提供。fitc偶联山羊抗小鼠IgG和cy3偶联驴抗兔IgG(711-165-152)购自美国Sigma公司。山羊抗小鼠(sc-2005)和山羊抗兔(sc-1004) HRP偶联二抗体来自Santa Cruz Biotechnology(美国)。

质粒的构建和转染

以小鼠脾细胞cDNA为模板扩增S-IL-17A和mb-IL-17 cDNA。小鼠TNF-α cDNA由Sang Young Chun博士(全南国立大学，韩国)提供。为了构建pcDNA3.1/S-IL-17A和嵌合的pcDNA3.1/ pb - il - 17asplasmidas，我们使用针对S-IL-17A的引物(Forward 5 ' TCA GGATCCGCAAACATGAGTCCAGGG 3 '、Reverse 5 ' GGTCTCGAGTTAGGCTGCCTGGCGGAC 3 ')、pb - il - 17a (Forward 5 ' AGTGGATCCAAGCAGCGATCATCC CTC 3 '、Reverse 5 ' ggtctcttaggctgcctggcggac 3 ')和TNF-α (Forward 5 ' TCAAGCTTATGAGCACAGAAAGC 3 '、Reverse 5 ' ATTGGATCCCTCCGGCCA TAGA 3 ')分别扩增各自的cDNA片段。对S-IL-17A (501bps)和Mb-IL-17A (410 bps) PCR片段进行酶切 Bam你好/ XhoI.用酶切法消化一个240 bp的TNF-α cDNA片段，编码跨膜区(79 ~ 45)、细胞质区(44 ~ 24)和细胞外区(23 ~ 5) 欣dIII / BamHI和连接到Mb-IL-17A表达质粒。然后将嵌合cdna亚克隆到pcDNA3.1(+)表达载体中。通过DNA测序(Genotech，韩国)确认构建。使用BioT转染试剂(Morganville Scientific, USA)将这些构建物或空载体转染CT26结肠癌细胞。48 h后，将细胞置于含G418 (1mg /ml)的培养基中。耐药菌落通常可见。转染后3周。

rt - pcr

为了检测S-IL-17A和Mb-IL-17A mrna的表达，使用Hybrid-R试剂盒(GeneAll，韩国)提取总RNA。用低聚(dT)引物和M-MLV逆转录酶(Affymetrix, USA)在42°C下逆转录2 μg总RNA 1 h。在DNA热循环器(Biorad;美国)。

IL-17A ELISA

采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养上清中IL-17A的浓度。1 × 106细胞在24孔培养板中1 ml培养基中37°C培养24 h。用酶扩增敏感免疫分析试剂盒(KOMA Biotech Inc.，韩国)测定上清中的IL-17A。

流式细胞术分析

用染色缓冲液(1×含0.02%叠氮化钠和2%胎牛血清的PBS)稀释一抗，4℃孵育1 h。用染色缓冲液洗去未结合抗体后，用合适的二抗在4°C黑暗下染色45分钟。进一步清洗后，用流式细胞仪(FACSCalibur, Becton Dickinson, USA)分析。BrdU染色用50 μM BrdU孵育最后12 h。采收后，将其固定在70%乙醇中，用2 M HCl渗透。用抗BrdU (Santa Cruz)和fitc标记的抗小鼠IgG抗体染色后，用流式细胞术检测BrdU的掺入。

在体外细胞增殖试验

1 × 104细胞被镀在96孔板上。培养72h，采用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)法检测细胞增殖情况。

肿瘤的挑战

5只同基因BALB/c小鼠分别用CT26克隆进行挑战。肿瘤细胞用PBS洗涤两次，并在PBS中悬浮。1 × 106用1 ml一次性注射器将肿瘤细胞PBS 100 μl皮下注射到小鼠左后下象限。用卡尺连续测量肿瘤大小，计算公式为:0.52 × S2× L，其中L为肿瘤长度，S为肿瘤宽度。作为对照，5只BALB/c小鼠分别被CT26野生型或模拟转染的CT26细胞挑战。实验结束时，动物被CO杀死2-含腔，收集肿瘤。

细胞周期进展率分析

稳态动力学方法是一种中期酶抑制技术，提供有丝分裂的进入率或细胞出生率(帕克和斯蒂芬，1963年)．在这项研究中，激素动力剂，秋水胺，被用来分析细胞增殖。用0.5 μg/ml秋水仙苷(Gibco)培养细胞20 h，去除秋水仙苷后定期采集样品。样品用70%冰冷乙醇固定，用FACSCalibur (Becton Dickinson, USA)分析DNA含量。用RNAase消化细胞RNA后，用50 μg/ml碘化丙啶染色核DNA。

统计分析

所有数据以平均数±标准差(误差条)表示。单向或双向方差分析(ANOVA)和学生的 t-tests用于分析组之间的差异，如图图例所示。一个 P-value小于0.05被认为是显著的。

结果

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CT26结肠癌细胞中分泌型和膜结合型IL-17A的表达

为了确定IL-17A在癌细胞中的作用，我们使用了来自BALB/c小鼠的小鼠CT26结直肠癌细胞。细胞转染控制载体(pcDNA3.1+)或分泌型IL-17A (S-IL-17A, 1?158 a.a.的IL-17A)或膜结合的IL-17A (Mb-IL-17A)。Mb-IL-17A是TNF-α和26?158 a.a.的IL-17A (图1一个)．排除TNF-α-转换酶(TACE)的细胞质区切割位点，以形成稳定的膜结合形式的嵌合蛋白(Horiuchi等，2010)．野生型CT26细胞不表达内源性IL-17A (图1 b)．用G418选择转染稳定的细胞系，RT-PCR检测S-IL-17A和Mb-IL-17A mrna的表达(图1 c)．选择两个表达S-IL-17A-和mb - il - 17a的细胞克隆进行进一步实验，分别命名为S11/S15和Mb6/Mb10。ELISA法检测CT26亚系培养上清中IL-17A蛋白含量。在S-IL-17A转染物S11和S15的培养上清中检测到，而在Mb-IL-17A转染物(图1 d)．流式细胞术分析IL-17A的表面表达，在重复实验中检测到Mb-IL-17A克隆与野生型CT26细胞(P)和模拟转染细胞(M)的基础水平相比，表达明显增加(图1 e)．

结肠癌细胞表达Mb-IL-17A促进肿瘤细胞生长

将S-IL-17A和Mb-IL-17A克隆转染物在常规培养基中培养，用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)法分析其增殖情况。48小时后，Mb-IL-17A克隆的细胞数量比野生型或模拟转染细胞的细胞数量高出约2.3倍，而S-IL-17A转染细胞的生长与对照CT26细胞相似(图2一个)．

看是否有差异 在体外将IL-17A表达细胞和对照CT26细胞皮下植入同基因BALB/c小鼠体内。每组5只，每只取1 × 106观察肿瘤生长1个月，IL-17A表达和对照的CT26细胞均形成实体瘤。S11和S15的生长速度快于对照组，但慢于Mb6和Mb10 (图2 b)．在第18天，S11和S15转染物形成的肿瘤体积比模拟转染细胞形成的肿瘤体积(1030 mm)大1.5倍3.1034毫米3. vs。675毫米3.) (图2 c)．在第18天，Mb6和Mb10形成的肿瘤体积分别是对照组的3.9倍和2.6倍(2754 mm)3.1742毫米3. vs。675毫米3.)．在第25天拍摄的肿瘤照片证实了这一结果(图2 d)．这一发现表明，IL-17A的异位表达增加了CT26细胞的致瘤性，特别是表达IL-17A膜结合形式的细胞。

Mb-IL-17A在癌细胞上的表达促进细胞周期的进展

分析Mb-IL-17A的表达对细胞增殖的影响 在体外我们使用了秋水胺，一种在中期诱导细胞周期停止的试剂(Kung等人，1990；里德和帕拉佐，1992年)．我们假设，如果两种不同的细胞群有不同的细胞循环率，在给定的时间内，在中期被秋水胺捕获的细胞比例将是不同的。因此，用碘化丙啶对模拟对照和表达il - 17a的CT26肿瘤克隆进行分析，并测量各期细胞的比例。在没有秋水胺处理的情况下，转染物在每个阶段的细胞比例没有差异(图3)．0.1 μg/ml的秋水酸处理后，每隔2小时收集样品，用碘化丙啶染色，发现Mb6和Mb10在G2/M期的积累比其他细胞系更快(图3 b)．在Mb6和Mb10中，超过60%的细胞在8 h时已经进入G2/M期，而S11和S15在G2/M期积累较慢，细胞积累的最大比例不超过50%。这些数据表明，Mb6和Mb10细胞的细胞周期进展比S11和S15细胞或对照细胞更快。

已知，当colcemid同步的4N细胞群从抑制中释放时，一部分细胞产生2N或8N细胞，其余细胞通过凋亡和衰老死亡(Rieder和Maiato, 2004年)．我们假设如果两种不同的细胞群以不同的速度循环，它们从中期阻滞释放后的细胞周期进展将是不同的。因此，将colcemid从细胞培养物中去除，观察肿瘤克隆从4N到8N的加倍时间为80 h。在模拟转染克隆以及S11和S15细胞中，8N DNA含量在32 h时达到峰值，然后下降(图4)．而在Mb6和Mb10中，8N细胞在24 h时达到第一个峰值，在47 h时形成第二个峰值，表明Mb6和Mb10中4N细胞的倍增时间远短于对照和S-IL-17A转染物(图4 b)．在去除秋水胺72小时后用光学显微镜观察细胞，表达mb - il - 17a的克隆都比其他细胞系形成了更多的细胞(图4摄氏度)．此外，在BrdU存在12小时的转染物中，与mock和S-IL-17A转染物相比，表达mb - il - 17a的克隆中BrdU融入复制DNA的数量显著增加(图4 d)．这些数据表明，表达膜结合IL-17A的肿瘤细胞增殖越快是细胞周期进展越快的结果。进一步研究IL-17A膜结合形式诱导的下游信号通路，将有助于深入剖析IL-17调控肿瘤细胞生长的机制。

IL-17A刺激CT26癌细胞中Sca-1的表达

为了评估MHC I类分子的表达，野生型CT26和il - 17a转染的克隆用抗MHC I- l类进行染色d单克隆抗体。表达mb - il - 17a的克隆上MHC I类分子的表面表达高于野生型CT26或模拟载体转染的细胞，但S-IL-17A克隆上MHC I类分子的表达没有增强(图5)．通过阻断gdf10依赖的TGF-β信号，干细胞抗原(Sca-1)，一种甘油磷脂酰肌醇连接的表面蛋白，已被证明可以增强致瘤性(巴茨等人，2011年；Upadhyay等，2011；Xin等，2005)．由于IL-17A是一种重要的TGF-β驱动细胞因子，因此我们检测了IL-17A与Sca-1表达的关系。表达S-IL-17A-和mb - il - 17a的克隆与野生型CT26细胞或模拟载体转染的克隆相比，细胞表面Sca-1抗原的表达增加(图6)．Sca-1在mock、S11、S15、Mb6和Mb10细胞中表达峰值的平均值分别为9.49、22.7、14.62、27.78和43.53，与各同型对照的峰值相减。在进一步的分析中，野生型CT26细胞与模拟对照细胞和S11细胞培养上清液处理72 h (图6 b)．S11上清液明显增加了CT26细胞上Sca-1的表达，说明IL-17A诱导了癌细胞中Sca-1的表达。

讨论

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许多细胞因子在促进或抑制肿瘤免疫方面的作用已被广泛研究，但仍有几种细胞因子的作用尚未明确。在本研究中，我们研究了CT26结肠癌细胞上表达的IL-17A膜结合形式是否促进或抑制肿瘤生长，我们首次发现它大大增加了细胞生长和致瘤性 在体外而且 在活的有机体内．我们的发现是根据几次观察得出的。首先，在常规培养基中培养的Mb-IL-17A克隆转染物显示细胞增殖显著增强(图2一个)．第二，将Mb-IL-17A异位表达植入同基因BALB/c小鼠皮下，显著增加CT26的致瘤性(无花果。2 b吗?二维)．此外，具有IL-17A膜结合形式的转染物生长速度的增加被证明是由于更快速的细胞周期进展(无花果。而且4)．由于在没有基质细胞或免疫细胞的培养基中，IL-17A的膜结合形式增加了生长速度，因此很可能Mb-IL-17A通过细胞间直接接触刺激增殖。推测CT26细胞上Mb-IL-17A和IL-17A受体之间的并列交流比S-IL-17A和IL-17A受体之间的相互作用更稳定、更强。IL-17A在癌细胞中的直接结合和信号转导已经有报道;内源性分泌的IL-17被证明可以直接诱导B16黑色素瘤和膀胱癌细胞分泌IL-6，从而激活Stat3信号，引发促生存和促血管生成反应(王等，2009)．在Mb-IL-17A转染物增强细胞周期进程方面，我们的结果也与一些报道一致，表明IL-17A调节细胞有丝分裂原和细胞周期基因的表达。在角质形成细胞中，分泌型IL-17A通过上调细胞周期相关基因如CCNE1、CDCA5和CDCA25A，直接促进细胞增殖并抑制细胞分化(Chiricozzi等，2014)．在结肠炎相关癌症的发展过程中，IL-17A敲除导致关键细胞周期调控因子cyclin D1、cyclin依赖性激酶2和cyclin E的表达减少。Hyun等人，2012)．进一步研究IL-17A膜结合形式诱导的下游信号传导，将有助于剖析IL-17调节肿瘤细胞生长的机制。相比之下， 在体外产生分泌形式IL-17A的CT26转染细胞的增殖与对照CT26细胞没有区别，尽管它们在皮下植入BALB/c小鼠时生长得更快(图2)．这些结果与之前的一篇报道一致，纤维肉瘤和结肠腺癌细胞的分泌型IL-17转染物比对照组生长得更快 在活的有机体内但不是 在体外（Numasaki等，2003)．

我们没有观察到可溶性IL-17A对MHC I类表达的任何影响(图5)．另一方面，平原 等．报道称，在可溶性il -17转染的冰毒a细胞中，MHC抗原表达(I类和II类)增加，CD4介导的抗肿瘤免疫也增加+和CD8+T细胞(Hirahara等人，2001)．他们的结果与我们的结果之间的差异可能是由于肿瘤模型和系统的不同。我们还测试了IL-17A对干细胞抗原-1 (Sca-1)的影响，因为越来越多的证据表明Sca-1在致瘤性中起作用(巴茨等人，2011年；Upadhyay等，2011；Xin等，2005)．由于Sca-1参与TGF-β信号通路，这表明Sca-1可能与IL-17A有关。我们发现表达IL-17A的肿瘤克隆具有更高水平的Sca-1表达(图6)．此外，外源性IL-17A处理野生型CT26细胞也增强了Sca-1的表达。这是IL-17A直接诱导Sca-1表达的第一个证据。在未来的研究中需要更多的定量分析来证实这一点。进一步研究这一过程的机制应该增加我们对细胞因子对肿瘤免疫的一般影响的理解。

数据

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图1所示。生成稳定表达S-IL-17A或Mb-IL-17A的CT26克隆。(A) IL-17A (S-IL-17A)分泌形式的构建由信号序列(1?和IL-17A结构域(26?158同上)。膜结合型(Mb-IL-17A)由小鼠TNF-α的细胞质结构域(CY 75 ~ 45)、跨膜片段(TM 44 ~ 24)和19个细胞外氨基酸(23 ~ 5)和IL-17A结构域(26?158同上)。(B)检测几种肿瘤类型中IL-17A的内源性表达。Meth-A;冰毒a纤维肉瘤，B16F10;B16黑色素瘤和CT26;CT26结肠癌。(C)后续实验使用mRNA水平上表达IL-17A的S-IL-17A转染物(S11, S15)和Mb-IL-17A转染物(Mb6, Mb10)。M; a mock-vector transfected CT26 clone. (D) IL-17A expression in the culture supernatant of CT26 clones was analyzed by ELISA. Wild-type CT26 cells (P) and a mock-vector transfected CT26 clone (M) were used as negative controls. (E) Membrane-bound IL-17A was stained with polyclonal anti-mouse IL-17A antibody and analyzed by flow cytometry. Each transfectant was also stained with the isotype control and Cy-3-conjugated secondary antibody. Mean florescence intensity was determined by subtracting the basal level from each sample. Data are shown as fold change relative to the mock control (M). Data are means ± SEM of three independent experiments.
图2所示。Mb-IL-17A增强了CT26细胞的生长速度和致瘤性。A, 1 × 104将野生型CT26细胞(P)和指示转染物的细胞接种于96孔板中。在48 h内用MTT法分析其生长速率。数据代表三个独立实验的均值±SEM。Mb6、MB10与M比较，采用单因素方差分析(ANOVA)分析差异的统计学意义。* * * P< 0.001。(B)等角为1 × 106每个亚系的细胞都被皮下注射到小鼠体内。用游标卡尺测量肿瘤大小，并按“材料和方法”中描述的方法计算。(C)肿瘤克隆植入后第18天的肿瘤体积。采用单因素方差分析分析S11、Mb6、MB10与M的差异。＊ P< 0.05;** P< 0.01;NS，不显著。(D)植入肿瘤克隆后第25天处死动物，收集肿瘤组织。展示了不同组的动物及其肿瘤的代表性照片。
图3所示。mb - il - 17a促进细胞周期进展，由秋凝诱导的中期阻滞证实。(A)细胞播种培养30 h。每组细胞在指定时间点收获，用碘化丙啶(PI)染色。流式细胞术检测G1期、S期和G2/M期细胞比例。(B) 1 × 106用0.1 μg/ml秋水酰胺处理各转染类型细胞，用PI染色和流式细胞术测定各时间点G2/M期细胞的比例。两组间差异用双向方差分析分析。＊ P< 0.05;** P< 0.01;* * * P< 0.001。
图4所示。Mb-IL-17A的表达增强了colcemid去除后细胞周期的进展。(A, B)将指示转染物用0.5 μg/ml秋水仙苷处理20 h，用不含秋水仙苷的新鲜培养基代替。在指定时间点采集细胞，用PI染色，用流式细胞仪测定含8N DNA的细胞比例。24、32、47 h时MB6值之间的差异采用双向方差分析。＊ P< 0.05;* * * P< 0.001。(C)祛溃后3天的指示细胞照片。(D)在BrdU的指数生长过程中对转染物进行脉冲标记，并通过流式细胞术分析BrdU的掺入情况。
图5所示。表面MHC I类表达由Mb-IL-17A异位表达诱导。使用anti-L分析在指定克隆中MHC I类的表达dMHC I类单克隆抗体(24-14-8S)和fitc偶联小鼠二级抗IgG。用流式细胞仪分析细胞(左)。流式细胞术测定的平均值与M的相对变化用柱状图表示。组间差异分析采用双向方差分析。＊ P< 0.05;** P< 0.01;NS，不显著(右)
图6所示。IL-17A增强了CT26细胞中Sca-1的表达。(A)用抗Sca-1抗体和流式细胞术分析指定克隆中Sca-1的表达(左)。流式细胞术测定的平均值与M的相对变化用柱状图表示。组间差异分析采用双向方差分析。** P< 0.01;* * * P< 0.001(右)。(B) 1 × 107指示克隆的细胞在50 ml新鲜培养基中培养3天。收集各培养上清，用0.22 μm滤镜过滤，野生型CT26细胞与1:1稀释的培养上清孵育72 h，流式细胞术检测Sca-1的表达。组间差异分析使用学生 t以及。** P< 0.01。

参考文献

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文章

文章

Mol. Cells 2016;39 (7): 536 - 542

网上发布2016年7月31日https://doi.org/10.14348/molcells.2016.0048

版权所有©韩国分子和细胞生物学学会。

IL-17A膜结合形式促进结肠癌细胞生长和致瘤性

Van Anh Do Thi1、3、朴桑民1、3， Hayyoung Lee2, *和金永相(Young Sang Kim)1, *

1忠南大学自然科学学院生物化学系，大田305-764;2忠南大学生物技术研究所，大田305-764;3.这些作者对这项工作做出了同样的贡献。

通信:＊对应：young@cnu.ac.kr(YSK);hlee@cnu.ac.kr(HL)

收到了2016年2月23日;修改后的: 2016年5月17日;接受: 2016年5月27日

摘要

白细胞介素- 17a是IL-17家族的一员，在老鼠体内被称为CTLA8。它由T淋巴细胞和NK细胞产生，具有促炎作用，诱导细胞因子和趋化因子的产生。然而，它在肿瘤生物学中的作用仍有争议。我们通过将编码IL-17A的基因以分泌或膜结合的形式转移到CT26结肠癌细胞中，研究了局部产生的IL-17A的作用。CT26细胞的膜结合形式的表达显著增强了它们的增殖 在体外．增强的生长被证明是由于细胞周期进展速度的增加:在同步细胞后，加入和退出秋水胺，表达IL-17A膜结合形式的细胞的细胞周期进展速度远远快于对照细胞。分泌型和膜结合型IL-17A均可诱导癌细胞中Sca-1的表达。当肿瘤克隆被移植到同基因BALB/c小鼠中，表达IL-17A膜结合形式的肿瘤克隆迅速生长;表达分泌型的细胞也比野生型CT26细胞生长得快，但比表达膜结合型的克隆生长得慢。这些结果表明IL-17A通过增强细胞周期进程促进肿瘤的致瘤性。在治疗肿瘤和免疫相关疾病时应考虑这一发现。

关键字:结肠癌，白介素17A，膜结合细胞因子，促肿瘤，sca-1

介绍

Th17淋巴细胞是最近发现的CD4+ T淋巴细胞的一个子集，它在IL-6、TGF-β和IL-23的作用下发育。它们的典型特征是分泌细胞因子IL-17 (韦弗等人，2006；2007)．IL-17最早被克隆并称为细胞毒性T淋巴细胞抗原8 (CTLA-8)，以IL-17A-F亚型的形式存在(Rouvier等人，1993；Yao等，1996)．其中IL-17A和IL-17F同源性最高，主要由活化的T淋巴细胞产生(Moseley等人，2003年)．IL-17是一种促炎细胞因子，通过NF-κB、ERK、JNK和p38 MAPK细胞内信号通路，促进巨噬细胞和成纤维细胞分泌IL-6、IL-1β和趋化因子。它还可以通过诱导过度的炎症反应引起自身免疫性疾病。由于IL-17受体在免疫细胞和各种上皮组织中广泛表达(Moseley等人，2003年)， IL-17信号通路可能影响免疫系统以外的细胞内稳态。

细胞因子在调节致瘤性的免疫应答中起着重要作用。IL-17的功能作用在肿瘤生物学中也有研究。简而言之，一些肿瘤如前列腺肿瘤和卵巢肿瘤已被发现可产生Th17细胞(Miyahara等，2008；Sfanos等人，2008年)．然而，在大多数类型的癌症中，IL-17的分泌形式的异位表达对其没有显著影响 在体外增长(Hirahara等人，2001；Numasaki等，2003；Tartour等人，1999年)．将产生il -17的肿瘤移植到具有免疫功能的同基因小鼠中得到了相反的结果;IL-17在某些造血癌细胞和纤维肉瘤中的异位表达抑制了其移植后的生长(Benchetrit等人，2002年；Hirahara等人，2001)，而其他一些癌症的生长则受到刺激(Numasaki等，2003；Tartour等人，1999年)．阻断内源性IL-17表达也会增加或减少肿瘤生长，这取决于癌症类型和系统(Hyun等人，2012；Kryczek等，2009；王等，2009；2010)．

尽管某些细胞因子具有强大的抗肿瘤作用，但全身给药的细胞因子具有显著的毒性，这限制了它们的临床应用(阿特金斯等人，1997；Car等人，1999；莱纳德等人，1997年)．为了避免这一问题，人们尝试了实现细胞因子本地化生产的基因转移策略。在许多情况下，以膜结合形式表达的细胞因子比以分泌形式表达的细胞因子更能提高肿瘤细胞的免疫原性，并能更有效地刺激抗肿瘤免疫(Ji等，2002；Kim等人，2000年；Marr等人，1997年；Hoo Soo等，1999)．先前我们发现，表达膜结合IL-12p35的肿瘤细胞可降低致瘤性，并导致CD8+甲沙细胞的T细胞依赖性抗肿瘤免疫(Lim等人，2010)．在本研究中，我们研究了IL-17A膜结合形式在CT26结肠癌细胞上的表达是否促进或抑制其肿瘤生长，首次发现膜结合形式的IL-17A大大增加了其增殖和致瘤性 在体外而且 体内。

材料与方法

小鼠和肿瘤细胞系

雌性BALB/c小鼠6 ~ 8周龄，来自韩国化学技术研究院(Korea Research Institute of Chemical Technology, Korea)。所有的动物程序都得到了忠南大学实验动物保护委员会的批准和指导。以BALB/c小鼠为来源的小鼠结肠肿瘤细胞系CT26在添加10%热灭活胎牛血清(FBS;GIBCO-BRL)， 2 mM l -谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素(Sigma St, Louis, MO)在37°C湿度5% CO2中。以G-418 (Santa Cruz, US) 0.2 μg/ml作为转染的选择剂。细胞孵育24小时，然后暴露于含有秋水胺或IL-17A的培养基中。

抗体和试剂

抗il - 17a多克隆抗体(ab79056)和fitc偶联抗mhc Class 1 (ab25056)购自Abcam(美国)。抗sca1抗体由Alfred L. M. Bothwell博士(美国耶鲁大学)提供。fitc偶联山羊抗小鼠IgG和cy3偶联驴抗兔IgG(711-165-152)购自美国Sigma公司。山羊抗小鼠(sc-2005)和山羊抗兔(sc-1004) HRP偶联二抗体来自Santa Cruz Biotechnology(美国)。

质粒的构建和转染

以小鼠脾细胞cDNA为模板扩增S-IL-17A和mb-IL-17 cDNA。小鼠TNF-α cDNA由Sang Young Chun博士(全南国立大学，韩国)提供。为了构建pcDNA3.1/S-IL-17A和嵌合的pcDNA3.1/ pb - il - 17asplasmidas，我们使用针对S-IL-17A的引物(Forward 5 ' TCA GGATCCGCAAACATGAGTCCAGGG 3 '、Reverse 5 ' GGTCTCGAGTTAGGCTGCCTGGCGGAC 3 ')、pb - il - 17a (Forward 5 ' AGTGGATCCAAGCAGCGATCATCC CTC 3 '、Reverse 5 ' ggtctcttaggctgcctggcggac 3 ')和TNF-α (Forward 5 ' TCAAGCTTATGAGCACAGAAAGC 3 '、Reverse 5 ' ATTGGATCCCTCCGGCCA TAGA 3 ')分别扩增各自的cDNA片段。对S-IL-17A (501bps)和Mb-IL-17A (410 bps) PCR片段进行酶切 Bam你好/ XhoI.用酶切法消化一个240 bp的TNF-α cDNA片段，编码跨膜区(79 ~ 45)、细胞质区(44 ~ 24)和细胞外区(23 ~ 5) 欣dIII / BamHI和连接到Mb-IL-17A表达质粒。然后将嵌合cdna亚克隆到pcDNA3.1(+)表达载体中。通过DNA测序(Genotech，韩国)确认构建。使用BioT转染试剂(Morganville Scientific, USA)将这些构建物或空载体转染CT26结肠癌细胞。48 h后，将细胞置于含G418 (1mg /ml)的培养基中。耐药菌落通常可见。转染后3周。

rt - pcr

为了检测S-IL-17A和Mb-IL-17A mrna的表达，使用Hybrid-R试剂盒(GeneAll，韩国)提取总RNA。用低聚(dT)引物和M-MLV逆转录酶(Affymetrix, USA)在42°C下逆转录2 μg总RNA 1 h。在DNA热循环器(Biorad;美国)。

IL-17A ELISA

采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养上清中IL-17A的浓度。1 × 106细胞在24孔培养板中1 ml培养基中37°C培养24 h。用酶扩增敏感免疫分析试剂盒(KOMA Biotech Inc.，韩国)测定上清中的IL-17A。

流式细胞术分析

用染色缓冲液(1×含0.02%叠氮化钠和2%胎牛血清的PBS)稀释一抗，4℃孵育1 h。用染色缓冲液洗去未结合抗体后，用合适的二抗在4°C黑暗下染色45分钟。进一步清洗后，用流式细胞仪(FACSCalibur, Becton Dickinson, USA)分析。BrdU染色用50 μM BrdU孵育最后12 h。采收后，将其固定在70%乙醇中，用2 M HCl渗透。用抗BrdU (Santa Cruz)和fitc标记的抗小鼠IgG抗体染色后，用流式细胞术检测BrdU的掺入。

在体外细胞增殖试验

1 × 104细胞被镀在96孔板上。培养72h，采用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)法检测细胞增殖情况。

肿瘤的挑战

5只同基因BALB/c小鼠分别用CT26克隆进行挑战。肿瘤细胞用PBS洗涤两次，并在PBS中悬浮。1 × 106用1 ml一次性注射器将肿瘤细胞PBS 100 μl皮下注射到小鼠左后下象限。用卡尺连续测量肿瘤大小，计算公式为:0.52 × S2× L，其中L为肿瘤长度，S为肿瘤宽度。作为对照，5只BALB/c小鼠分别被CT26野生型或模拟转染的CT26细胞挑战。实验结束时，动物被CO杀死2-含腔，收集肿瘤。

细胞周期进展率分析

稳态动力学方法是一种中期酶抑制技术，提供有丝分裂的进入率或细胞出生率(帕克和斯蒂芬，1963年)．在这项研究中，激素动力剂，秋水胺，被用来分析细胞增殖。用0.5 μg/ml秋水仙苷(Gibco)培养细胞20 h，去除秋水仙苷后定期采集样品。样品用70%冰冷乙醇固定，用FACSCalibur (Becton Dickinson, USA)分析DNA含量。用RNAase消化细胞RNA后，用50 μg/ml碘化丙啶染色核DNA。

统计分析

所有数据以平均数±标准差(误差条)表示。单向或双向方差分析(ANOVA)和学生的 t-tests用于分析组之间的差异，如图图例所示。一个 P-value小于0.05被认为是显著的。

结果

CT26结肠癌细胞中分泌型和膜结合型IL-17A的表达

为了确定IL-17A在癌细胞中的作用，我们使用了来自BALB/c小鼠的小鼠CT26结直肠癌细胞。细胞转染控制载体(pcDNA3.1+)或分泌型IL-17A (S-IL-17A, 1?158 a.a.的IL-17A)或膜结合的IL-17A (Mb-IL-17A)。Mb-IL-17A是TNF-α和26?158 a.a.的IL-17A (图1一个)．排除TNF-α-转换酶(TACE)的细胞质区切割位点，以形成稳定的膜结合形式的嵌合蛋白(Horiuchi等，2010)．野生型CT26细胞不表达内源性IL-17A (图1 b)．用G418选择转染稳定的细胞系，RT-PCR检测S-IL-17A和Mb-IL-17A mrna的表达(图1 c)．选择两个表达S-IL-17A-和mb - il - 17a的细胞克隆进行进一步实验，分别命名为S11/S15和Mb6/Mb10。ELISA法检测CT26亚系培养上清中IL-17A蛋白含量。在S-IL-17A转染物S11和S15的培养上清中检测到，而在Mb-IL-17A转染物(图1 d)．流式细胞术分析IL-17A的表面表达，在重复实验中检测到Mb-IL-17A克隆与野生型CT26细胞(P)和模拟转染细胞(M)的基础水平相比，表达明显增加(图1 e)．

结肠癌细胞表达Mb-IL-17A促进肿瘤细胞生长

将S-IL-17A和Mb-IL-17A克隆转染物在常规培养基中培养，用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)法分析其增殖情况。48小时后，Mb-IL-17A克隆的细胞数量比野生型或模拟转染细胞的细胞数量高出约2.3倍，而S-IL-17A转染细胞的生长与对照CT26细胞相似(图2一个)．

看是否有差异 在体外将IL-17A表达细胞和对照CT26细胞皮下植入同基因BALB/c小鼠体内。每组5只，每只取1 × 106观察肿瘤生长1个月，IL-17A表达和对照的CT26细胞均形成实体瘤。S11和S15的生长速度快于对照组，但慢于Mb6和Mb10 (图2 b)．在第18天，S11和S15转染物形成的肿瘤体积比模拟转染细胞形成的肿瘤体积(1030 mm)大1.5倍3.1034毫米3. vs。675毫米3.) (图2 c)．在第18天，Mb6和Mb10形成的肿瘤体积分别是对照组的3.9倍和2.6倍(2754 mm)3.1742毫米3. vs。675毫米3.)．在第25天拍摄的肿瘤照片证实了这一结果(图2 d)．这一发现表明，IL-17A的异位表达增加了CT26细胞的致瘤性，特别是表达IL-17A膜结合形式的细胞。

Mb-IL-17A在癌细胞上的表达促进细胞周期的进展

分析Mb-IL-17A的表达对细胞增殖的影响 在体外我们使用了秋水胺，一种在中期诱导细胞周期停止的试剂(Kung等人，1990；里德和帕拉佐，1992年)．我们假设，如果两种不同的细胞群有不同的细胞循环率，在给定的时间内，在中期被秋水胺捕获的细胞比例将是不同的。因此，用碘化丙啶对模拟对照和表达il - 17a的CT26肿瘤克隆进行分析，并测量各期细胞的比例。在没有秋水胺处理的情况下，转染物在每个阶段的细胞比例没有差异(图3)．0.1 μg/ml的秋水酸处理后，每隔2小时收集样品，用碘化丙啶染色，发现Mb6和Mb10在G2/M期的积累比其他细胞系更快(图3 b)．在Mb6和Mb10中，超过60%的细胞在8 h时已经进入G2/M期，而S11和S15在G2/M期积累较慢，细胞积累的最大比例不超过50%。这些数据表明，Mb6和Mb10细胞的细胞周期进展比S11和S15细胞或对照细胞更快。

已知，当colcemid同步的4N细胞群从抑制中释放时，一部分细胞产生2N或8N细胞，其余细胞通过凋亡和衰老死亡(Rieder和Maiato, 2004年)．我们假设如果两种不同的细胞群以不同的速度循环，它们从中期阻滞释放后的细胞周期进展将是不同的。因此，将colcemid从细胞培养物中去除，观察肿瘤克隆从4N到8N的加倍时间为80 h。在模拟转染克隆以及S11和S15细胞中，8N DNA含量在32 h时达到峰值，然后下降(图4)．而在Mb6和Mb10中，8N细胞在24 h时达到第一个峰值，在47 h时形成第二个峰值，表明Mb6和Mb10中4N细胞的倍增时间远短于对照和S-IL-17A转染物(图4 b)．在去除秋水胺72小时后用光学显微镜观察细胞，表达mb - il - 17a的克隆都比其他细胞系形成了更多的细胞(图4摄氏度)．此外，在BrdU存在12小时的转染物中，与mock和S-IL-17A转染物相比，表达mb - il - 17a的克隆中BrdU融入复制DNA的数量显著增加(图4 d)．这些数据表明，表达膜结合IL-17A的肿瘤细胞增殖越快是细胞周期进展越快的结果。进一步研究IL-17A膜结合形式诱导的下游信号通路，将有助于深入剖析IL-17调控肿瘤细胞生长的机制。

IL-17A刺激CT26癌细胞中Sca-1的表达

为了评估MHC I类分子的表达，野生型CT26和il - 17a转染的克隆用抗MHC I- l类进行染色d单克隆抗体。表达mb - il - 17a的克隆上MHC I类分子的表面表达高于野生型CT26或模拟载体转染的细胞，但S-IL-17A克隆上MHC I类分子的表达没有增强(图5)．通过阻断gdf10依赖的TGF-β信号，干细胞抗原(Sca-1)，一种甘油磷脂酰肌醇连接的表面蛋白，已被证明可以增强致瘤性(巴茨等人，2011年；Upadhyay等，2011；Xin等，2005)．由于IL-17A是一种重要的TGF-β驱动细胞因子，因此我们检测了IL-17A与Sca-1表达的关系。表达S-IL-17A-和mb - il - 17a的克隆与野生型CT26细胞或模拟载体转染的克隆相比，细胞表面Sca-1抗原的表达增加(图6)．Sca-1在mock、S11、S15、Mb6和Mb10细胞中表达峰值的平均值分别为9.49、22.7、14.62、27.78和43.53，与各同型对照的峰值相减。在进一步的分析中，野生型CT26细胞与模拟对照细胞和S11细胞培养上清液处理72 h (图6 b)．S11上清液明显增加了CT26细胞上Sca-1的表达，说明IL-17A诱导了癌细胞中Sca-1的表达。

讨论

许多细胞因子在促进或抑制肿瘤免疫方面的作用已被广泛研究，但仍有几种细胞因子的作用尚未明确。在本研究中，我们研究了CT26结肠癌细胞上表达的IL-17A膜结合形式是否促进或抑制肿瘤生长，我们首次发现它大大增加了细胞生长和致瘤性 在体外而且 在活的有机体内．我们的发现是根据几次观察得出的。首先，在常规培养基中培养的Mb-IL-17A克隆转染物显示细胞增殖显著增强(图2一个)．第二，将Mb-IL-17A异位表达植入同基因BALB/c小鼠皮下，显著增加CT26的致瘤性(无花果。2 b吗?二维)．此外，具有IL-17A膜结合形式的转染物生长速度的增加被证明是由于更快速的细胞周期进展(无花果。而且4)．由于在没有基质细胞或免疫细胞的培养基中，IL-17A的膜结合形式增加了生长速度，因此很可能Mb-IL-17A通过细胞间直接接触刺激增殖。推测CT26细胞上Mb-IL-17A和IL-17A受体之间的并列交流比S-IL-17A和IL-17A受体之间的相互作用更稳定、更强。IL-17A在癌细胞中的直接结合和信号转导已经有报道;内源性分泌的IL-17被证明可以直接诱导B16黑色素瘤和膀胱癌细胞分泌IL-6，从而激活Stat3信号，引发促生存和促血管生成反应(王等，2009)．在Mb-IL-17A转染物增强细胞周期进程方面，我们的结果也与一些报道一致，表明IL-17A调节细胞有丝分裂原和细胞周期基因的表达。在角质形成细胞中，分泌型IL-17A通过上调细胞周期相关基因如CCNE1、CDCA5和CDCA25A，直接促进细胞增殖并抑制细胞分化(Chiricozzi等，2014)．在结肠炎相关癌症的发展过程中，IL-17A敲除导致关键细胞周期调控因子cyclin D1、cyclin依赖性激酶2和cyclin E的表达减少。Hyun等人，2012)．进一步研究IL-17A膜结合形式诱导的下游信号传导，将有助于剖析IL-17调节肿瘤细胞生长的机制。相比之下， 在体外产生分泌形式IL-17A的CT26转染细胞的增殖与对照CT26细胞没有区别，尽管它们在皮下植入BALB/c小鼠时生长得更快(图2)．这些结果与之前的一篇报道一致，纤维肉瘤和结肠腺癌细胞的分泌型IL-17转染物比对照组生长得更快 在活的有机体内但不是 在体外（Numasaki等，2003)．

我们没有观察到可溶性IL-17A对MHC I类表达的任何影响(图5)．另一方面，平原 等．报道称，在可溶性il -17转染的冰毒a细胞中，MHC抗原表达(I类和II类)增加，CD4介导的抗肿瘤免疫也增加+和CD8+T细胞(Hirahara等人，2001)．他们的结果与我们的结果之间的差异可能是由于肿瘤模型和系统的不同。我们还测试了IL-17A对干细胞抗原-1 (Sca-1)的影响，因为越来越多的证据表明Sca-1在致瘤性中起作用(巴茨等人，2011年；Upadhyay等，2011；Xin等，2005)．由于Sca-1参与TGF-β信号通路，这表明Sca-1可能与IL-17A有关。我们发现表达IL-17A的肿瘤克隆具有更高水平的Sca-1表达(图6)．此外，外源性IL-17A处理野生型CT26细胞也增强了Sca-1的表达。这是IL-17A直接诱导Sca-1表达的第一个证据。在未来的研究中需要更多的定量分析来证实这一点。进一步研究这一过程的机制应该增加我们对细胞因子对肿瘤免疫的一般影响的理解。

图1所示。

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图1所示。生成稳定表达S-IL-17A或Mb-IL-17A的CT26克隆。(A) IL-17A (S-IL-17A)分泌形式的构建由信号序列(1?和IL-17A结构域(26?158同上)。膜结合型(Mb-IL-17A)由小鼠TNF-α的细胞质结构域(CY 75 ~ 45)、跨膜片段(TM 44 ~ 24)和19个细胞外氨基酸(23 ~ 5)和IL-17A结构域(26?158同上)。(B)检测几种肿瘤类型中IL-17A的内源性表达。Meth-A;冰毒a纤维肉瘤，B16F10;B16黑色素瘤和CT26;CT26结肠癌。(C)后续实验使用mRNA水平上表达IL-17A的S-IL-17A转染物(S11, S15)和Mb-IL-17A转染物(Mb6, Mb10)。M; a mock-vector transfected CT26 clone. (D) IL-17A expression in the culture supernatant of CT26 clones was analyzed by ELISA. Wild-type CT26 cells (P) and a mock-vector transfected CT26 clone (M) were used as negative controls. (E) Membrane-bound IL-17A was stained with polyclonal anti-mouse IL-17A antibody and analyzed by flow cytometry. Each transfectant was also stained with the isotype control and Cy-3-conjugated secondary antibody. Mean florescence intensity was determined by subtracting the basal level from each sample. Data are shown as fold change relative to the mock control (M). Data are means ± SEM of three independent experiments.
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图2所示。

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图2。Mb-IL-17A增强了CT26细胞的生长速度和致瘤性。A, 1 × 104将野生型CT26细胞(P)和指示转染物的细胞接种于96孔板中。在48 h内用MTT法分析其生长速率。数据代表三个独立实验的均值±SEM。Mb6、MB10与M比较，采用单因素方差分析(ANOVA)分析差异的统计学意义。* * * P< 0.001。(B)等角为1 × 106每个亚系的细胞都被皮下注射到小鼠体内。用游标卡尺测量肿瘤大小，并按“材料和方法”中描述的方法计算。(C)肿瘤克隆植入后第18天的肿瘤体积。采用单因素方差分析分析S11、Mb6、MB10与M的差异。＊ P< 0.05;** P< 0.01;NS，不显著。(D)植入肿瘤克隆后第25天处死动物，收集肿瘤组织。展示了不同组的动物及其肿瘤的代表性照片。
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图3所示。

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图3。mb - il - 17a促进细胞周期进展，由秋凝诱导的中期阻滞证实。(A)细胞播种培养30 h。每组细胞在指定时间点收获，用碘化丙啶(PI)染色。流式细胞术检测G1期、S期和G2/M期细胞比例。(B) 1 × 106用0.1 μg/ml秋水酰胺处理各转染类型细胞，用PI染色和流式细胞术测定各时间点G2/M期细胞的比例。两组间差异用双向方差分析分析。＊ P< 0.05;** P< 0.01;* * * P< 0.001。
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图4所示。

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图4。Mb-IL-17A的表达增强了colcemid去除后细胞周期的进展。(A, B)将指示转染物用0.5 μg/ml秋水仙苷处理20 h，用不含秋水仙苷的新鲜培养基代替。在指定时间点采集细胞，用PI染色，用流式细胞仪测定含8N DNA的细胞比例。24、32、47 h时MB6值之间的差异采用双向方差分析。＊ P< 0.05;* * * P< 0.001。(C)祛溃后3天的指示细胞照片。(D)在BrdU的指数生长过程中对转染物进行脉冲标记，并通过流式细胞术分析BrdU的掺入情况。
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图5所示。

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图5。表面MHC I类表达由Mb-IL-17A异位表达诱导。使用anti-L分析在指定克隆中MHC I类的表达dMHC I类单克隆抗体(24-14-8S)和fitc偶联小鼠二级抗IgG。用流式细胞仪分析细胞(左)。流式细胞术测定的平均值与M的相对变化用柱状图表示。组间差异分析采用双向方差分析。＊ P< 0.05;** P< 0.01;NS，不显著(右)
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图6所示。

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图6。IL-17A增强了CT26细胞中Sca-1的表达。(A)用抗Sca-1抗体和流式细胞术分析指定克隆中Sca-1的表达(左)。流式细胞术测定的平均值与M的相对变化用柱状图表示。组间差异分析采用双向方差分析。** P< 0.01;* * * P< 0.001(右)。(B) 1 × 107指示克隆的细胞在50 ml新鲜培养基中培养3天。收集各培养上清，用0.22 μm滤镜过滤，野生型CT26细胞与1:1稀释的培养上清孵育72 h，流式细胞术检测Sca-1的表达。组间差异分析使用学生 t以及。** P< 0.01。
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摩尔。细胞
2022年11月30日第45卷第11期，763~867页
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幼稚(青色)和轴突切除(品红)视网膜神经节细胞轴突非洲爪蟾蜍tropicalis(Choi et al.，第846-854页)。
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eISSN 0219 - 1032
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