条文本gydF4y2Ba
PDFgydF4y2Ba
摘要gydF4y2Ba
背景:gydF4y2Ba对人体胰腺和胆道中的细菌群落结构进行了评估。gydF4y2Ba
方法:gydF4y2Ba利用核糖体RNA靶向Cy3/Cy5(碳青氨酸)标记的寡核苷酸探针荧光原位杂交(FISH)研究了153例患者的胆囊结石、20例胆囊壁、6例总胆管结石、52例胆管支架、21例十二指肠活检、9例胰管活检和5例胆管。gydF4y2Ba
结果:gydF4y2Ba十二指肠、胆囊和胆管壁均无细菌。钙化性胰腺炎患者的胰管内和胆道支架内均存在密集的多物种细菌生物膜，与诊断无关。生物膜的浓度、密度和对FISH和DNA染色的适应性随支架闭塞程度的增加而逐渐下降。FISH在完全闭塞的支架和棕色/混合胆结石中发现了最低的细菌检测浓度。FISH在胆固醇胆结石中未检测到细菌。gydF4y2Ba
结论:gydF4y2Ba许多不同的分支和细菌群参与了异物表面生物膜的形成，如胆道支架、混合胆结石或钙化胰管，但不参与纯胆固醇胆结石表面生物膜的形成。支架闭塞导致生物膜的逐渐消失和其组成部分的木乃伊化。胆固醇或其他物质在生物膜基质中的沉积可能是宿主防御这些生物膜中存在的细菌的一种新的机制。gydF4y2Ba
- Cy3/Cy5，不同的碳菁染料用于荧光显微镜标记寡核苷酸探针gydF4y2Ba
- DAPI 4 6-diamidino-2-phenylindolegydF4y2Ba
- FISH，荧光原位杂交gydF4y2Ba
- PCR，聚合酶链式反应gydF4y2Ba
- 细菌生物膜gydF4y2Ba
- 胆固醇gydF4y2Ba
- 胰腺gydF4y2Ba
- 胆道gydF4y2Ba
- 胆结石发病机制gydF4y2Ba
- 支架阻塞gydF4y2Ba
数据来自Altmetric.comgydF4y2Ba
- Cy3/Cy5，不同的碳菁染料用于荧光显微镜标记寡核苷酸探针gydF4y2Ba
- DAPI 4 6-diamidino-2-phenylindolegydF4y2Ba
- FISH，荧光原位杂交gydF4y2Ba
- PCR，聚合酶链式反应gydF4y2Ba
细菌生物膜越来越多地被认为是许多顽固性细菌感染的来源，如牙周病、心内膜炎、慢性阻塞性肺病、异物相关感染等。gydF4y2Ba1，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba胆结石是一种自然发生的异物。在胆结石形成过程中，细菌的发生率、分布和影响尚不清楚。目前公认的细菌受累概念主要来自20世纪60年代的培养研究，并得到电子显微镜研究的支持gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba4gydF4y2Ba以及利用聚合酶链式反应(PCR)的分子遗传学方法，随后在20世纪90年代进行了克隆和测序。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba
培养和PCR技术的主要缺点是，它们不能提供任何关于细菌彼此之间或生物膜附着表面的空间组织的信息。因此，它们在评价复杂生物膜方面的用途有限。gydF4y2Ba
我们的目的是研究十二指肠、胰腺和胆管上皮表面的细菌生物膜的组成和空间组织在胆管支架内、胆总管/胆囊结石和胆囊壁上。我们使用荧光原位杂交(FISH)与rRNA靶向荧光探针在结构域和组水平gydF4y2Ba6gydF4y2Ba探讨细菌在支架闭塞和胆结石发病机制中的潜在影响。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
所有的人体样本都因临床适应症而被移除，并且在大多数情况下代表了原本会被丢弃的材料。Charite医院的机构人类研究委员会批准了将这种组织学材料用于研究目的并获得额外的十二指肠活检，所有患者均给予书面知情同意。gydF4y2Ba
对153例胆囊结石患者进行了调查。同时研究了20例相应的胆囊壁和6例内镜下切除的胆总管结石。此外，我们研究了52例内镜切除的胆道支架，12例相应的十二指肠活检，9例钙化性胰腺炎患者的胰管和相应的9例十二指肠活检，以及5例胆管癌手术患者的总胆管。所有慢性胰腺炎患者均有胰管狭窄病史，既往均行括约肌切开术，4例置入假体。没有人做过胰腺手术。gydF4y2Ba
组织准备gydF4y2Ba
手术切除胆囊，胰腺、十二指肠和胆管组织活检固定在Carnoy溶液中gydF4y2Ba7gydF4y2Ba初步送往病理科进行组织学检查。然后对这些组织的石蜡块进行FISH评价。gydF4y2Ba
胆结石处理gydF4y2Ba
术后立即将所有胆结石置于10%中性缓冲福尔马林中。132例为胆固醇胆结石(胆固醇含量>70%)，19例为混合色素胆结石(胆固醇含量30-70%)，2例为棕色色素胆结石(胆固醇含量<30%)。6例胆总管结石中4例为混合胆固醇胆结石，2例为棕色色素胆结石。将100毫克的胆结石切片放入1.5毫升生理盐水中碾碎，用力摇晃5分钟。混合物在700℃离心gydF4y2BaggydF4y2Ba30秒。取上清750 μl，加入新鲜生理盐水750 μl，摇匀，再次离心30秒。上清液750 μl, 6500下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。沉淀物在75%乙醇中重新悬浮并储存在- 20°C。剩余的石头和完整的石头储存在- 20°C的无水酒精中，用于制备涂片和切片。gydF4y2Ba
胆道支架gydF4y2Ba
取下未损坏的胆道支架(Wilson-Cook Medical, Limerick, Ireland)置于10%中性缓冲福尔马林中。从支架的肝脏和十二指肠端切下2个2厘米的碎片，检查阻塞的迹象。生理盐水(2ml)用注射器通过2cm支架片的管腔注入。测定了收集污泥的体积。为了估计支架片的内部体积，将支架片浸在一碟水中。支架的一端在水面下闭合。然后取出支架，放入2ml Eppendorf管中。离心后，Eppendorf管内液体体积与支架片内部体积相等。提取的污泥体积除以支架内部体积，量化支架闭塞程度。污泥体积<支架体积30%的支架被归类为狭窄。 Stents with a sludge volume of 30–70% were considered partially occluded. The stent portion was defined as occluded if the sludge volume was >70% of stent volume.
从污泥中提取细菌，并根据从胆结石中提取细菌的方案进行储存。gydF4y2Ba
将胆道支架邻近的肝端和十二指肠端切下3mm切片，石蜡包埋，以进一步研究细菌生物膜。gydF4y2Ba
鱼gydF4y2Ba
在玻片上进行荧光原位杂交。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba寡核苷酸探针在5 '端用Cy3或Cy5(碳氰)活性荧光染料合成(MWG生物技术，Ebersberg，德国)。一套28个域和组级别的FISH探针，以及一个物种特异性探针gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba(表1)。根据参考文献选择甲酰胺浓度和杂交温度，以达到最佳的严格度。gydF4y2Ba
荧光原位杂交探针gydF4y2Ba
在污泥或石头的涂片或4 μm厚的相应材料切片(如休克冷冻胆结石、石蜡包埋的胆囊或胆管壁、胆道支架或胰腺或十二指肠活检)上研究细菌的空间排列和结合行为。gydF4y2Ba
为了固定无定形胆固醇石材料和支架部分的重塑料部分，在休克冷冻胆石或支架上涂上耐温度的Tesa胶带(NeoLab, Heidelberg, Germany)，并在Tesa薄膜下面切下4 μm厚的部分。然后将带有结石或支架部分的胶带粘在玻璃载玻片上，将结石/支架表面贴在上面。gydF4y2Ba
从石头/污泥中提取细菌的定量gydF4y2Ba
通过污泥溶解和差动离心法提取的细菌仍然被有机基质结合在一起，形成致密的集合体。为了更好地定量细胞数量，将50 μl菌悬液用温和超声法分散到980 μl 0.1%焦磷酸钠中(Branson Sonifer B-12;丹伯里,美国)。超声悬浮液离心分散于初始体积，将5 μl细菌连续稀释置于明胶包覆的显微镜载玻片上(0.1%明胶，0.01% KCr(SOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba）gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
当细菌用FISH、4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)或革兰氏染色法观察时，分别从不同部位准备了100个细菌的三次计数，并用尼康e600荧光显微镜(Nikon, Tokyo, Japan)记录照片，以供以后比较。gydF4y2Ba
生物膜结构gydF4y2Ba
针对几乎所有细菌的Eub338探针(远红色荧光Cy5)可以同时看到组特异性信号(橙色荧光Cy3)，反之亦然。评估了整个细菌群落中特定群体的位置。gydF4y2Ba
用尼康DXM1200相机和软件(尼康，东京，日本)在显微镜载玻片上不同位置拍摄了10张细菌的数码照片。gydF4y2Ba
对FISH和DNA染色的适应性gydF4y2Ba
核糖体的数量可达10个gydF4y2Ba5gydF4y2Ba每一个代谢活跃的细菌细胞，允许强烈的荧光信号。混合信号的强度随细胞死亡后活性下降或细胞结构退化而减弱。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba因此，细菌对FISH和其他DNA染色的适应性是表征细菌状态和完整性的参数。gydF4y2Ba
用三个不同的参数来评估细胞对FISH的适应性:(1)Eub338 Cy3阳性细胞与革兰氏阳性细胞的比例;(2)实现荧光信号所需的杂交时间;(3)时间直至特异性荧光完全耗尽。gydF4y2Ba
在细菌对FISH适应性低的情况下，使用辣根过氧化物酶标记的寡核苷酸探针和酪胺来增强信号。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba
统计数据gydF4y2Ba
使用Fisher精确检验和Mann-Whitney U检验来确定差异的显著性。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
十二指肠、胆囊、胆管壁正常gydF4y2Ba
在21例十二指肠活检、20例胆囊壁和5例胆管壁表面均未检测到生物膜。gydF4y2Ba
钙化胰管gydF4y2Ba
在钙化性胰腺炎患者的胰管活检中，有7/9的细菌附着在胰管上皮上(图1-3)。在三次活检中，密集的生物膜覆盖了胰管的重要部分。细菌丝状排列在上皮表面的栅栏状或卷曲的毛状层中，由单一的球菌混合或包被，或由葡萄状的球菌结构插入(图1-3)。gydF4y2Ba
来自钙化胰管的生物膜同时与组特异性(A)和通用(B)探针杂交。多物种细菌均匀地编织成生物膜。gydF4y2Ba
来自钙化胰管的生物膜同时与组特异性(A)和通用(B)探针杂交。多物种细菌均匀地编织成生物膜。gydF4y2Ba
来自钙化胰管的生物膜同时与组特异性(A)和通用(B)探针杂交。细菌形成了一种斑块状的生物膜，其中由相同细菌组成的、可能来自单个细胞的微菌落被另一种来源的微菌落插入。gydF4y2Ba
超过19%的DAPI染色细胞也呈Eub338阳性。大约50%的Eub338阳性细菌可能属于不同的类群(表2)。gydF4y2Ba
细菌浓度，对荧光原位杂交(FISH)的适应性，生物膜结构和组成gydF4y2Ba
细菌的结合行为是多种多样的(图1-3)。30%到40%的细菌均匀地编织在生物膜中。然而，大多数情况下，生物膜是由斑块状岛屿组成的，其中由相同细菌组成的微菌落，可能来自单个细胞，被另一种来源的微菌落插入(表2，图3)。gydF4y2Ba
胰管活检中的细菌在杂交1小时后呈高荧光，即使在暴露60秒后，杂交信号仍可测量。DAPI染色1分钟后即可观察到细菌。gydF4y2Ba
胆道支架gydF4y2Ba
52个支架中有4个没有检测到污泥。两端被5个支架堵住。9个支架在肝侧闭塞，十二指肠侧部分闭塞。6个支架两侧部分闭塞。12个支架在肝侧部分闭塞，在十二指肠侧狭窄。16例支架腔内狭窄，无相关闭塞。gydF4y2Ba
4个无污泥的胆道支架冲洗液中无细菌。然而，在显微镜下观察支架切片时，发现一层薄薄的“无梗”细菌生物膜附着在支架壁上。狭窄和闭塞的支架切片原位杂交显示，由模糊的长丝组成的多物种生物膜相互交织，或多或少均匀地穿插着杆和球菌。生物膜或直接附着于支架内表面，或覆盖在污泥基质上，污泥基质连续覆盖支架内侧(图4-7)。细菌总是在污泥基质的上方，而不是下方。gydF4y2Ba
整个支架与通用Eub338探针混合。细菌(绿橙色信号)总是分布在污泥基质的上方，而不是下方。随着胆管支架的堵塞，细菌从腔内消失。部分闭塞支架的十二指肠部分。gydF4y2Ba
整个支架与通用Eub338探针混合。细菌(绿橙色信号)总是分布在污泥基质的上方，而不是下方。随着胆管支架的堵塞，细菌从腔内消失。肝侧部分闭塞的支架。gydF4y2Ba
整个支架与通用Eub338探针混合。细菌(绿橙色信号)总是分布在污泥基质的上方，而不是下方。随着胆管支架的堵塞，细菌从腔内消失。完全闭塞支架的十二指肠侧。gydF4y2Ba
整个支架与通用Eub338探针混合。细菌(绿橙色信号)总是分布在污泥基质的上方，而不是下方。随着胆管支架的堵塞，细菌从腔内消失。肝侧完全闭塞的支架。gydF4y2Ba
由于在玻璃上固定沉重的塑料支架部分被证明是困难的，因此在污泥涂片上研究了支架生物膜中细菌群落的组成。在所有狭窄或部分闭塞支架的污泥中发现了丰富的复杂细菌生物膜。gydF4y2Ba
污泥中95%以上的细菌以凝块状结构组织，只有一小部分细菌单一地分布在玻璃表面(表2，图8-10)。gydF4y2Ba
支架污泥与群体特异性和通用荧光原位杂交探针杂交。与所示的组特异性探针(A)和检测所有细菌的Eub338探针(B)杂交显示相同的区域。胆道支架中的大多数细菌主要组织在异质混合的多物种生物膜中。gydF4y2Ba
支架污泥与群体特异性和通用荧光原位杂交探针杂交。与所示的组特异性探针(A)和检测所有细菌的Eub338探针(B)杂交显示相同的区域。胆道支架中的大多数细菌主要组织在异质混合的多物种生物膜中。gydF4y2Ba
支架污泥与群体特异性和通用荧光原位杂交探针杂交。与所示的组特异性探针(A)和检测所有细菌的Eub338探针(B)杂交显示相同的区域。胆道支架中的大多数细菌主要组织在异质混合的多物种生物膜中。gydF4y2Ba
拟杆菌gydF4y2Ba，gydF4y2BaGamma-ProteobacteriagydF4y2Ba，gydF4y2Ba厚壁菌门gydF4y2Ba,gydF4y2Balituseburense梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba在所有的Eub338阳性细菌中，最多占60%。与HGC、Ato291、Clit135、Lab158、Bif164和Erec482组探针一起，90%以上的FISH可接近细菌可隶属于组(表2)。除这些主要组外，所有探针(表1)在至少10个标本中杂交阳性。虽然该百分比通常低于样本中所有FISH可接近细菌的1%，但生物膜中“代表性不足”细菌的总浓度为>10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba/ml，因此显著。gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba没有找到。所有患者的生物膜中都没有少于10种不同的细菌群。gydF4y2Ba
支架的闭塞程度gydF4y2Ba
生物膜的组成、密度和适应性强烈依赖于支架闭塞的程度。gydF4y2Ba
缩小支架gydF4y2Ba
在两端狭窄但未闭塞的支架中发现细菌浓度最高(表2)。支架的肝脏端细菌浓度高于十二指肠端。生物膜大多是多物种来源的异质混合。然而，正如钙化胰管研究中所指出的那样，偶尔会在生物膜层中发现嵌入单个单菌种和长链的岛屿。这些“岛屿”最常与Strc493、Gam42a、Bac303和LGC探针杂交。细菌对FISH和DAPI的适应性较高。革兰氏染色检测到的细菌数量与用Eub338探针杂交测得的细菌数量相似(表2)。gydF4y2Ba
部分闭塞的支架gydF4y2Ba
部分闭塞支架的平均细菌浓度显著低于狭窄支架(p<0.05)。从视觉上看，细菌生物膜的密度要低得多。所有的细菌都表现出一种典型的结合行为，形成几乎均匀分布的多物种集团。细菌“单一培养”的岛屿已不复存在。细菌对FISH和DAPI染色的适应性明显降低。隔夜混合是稳定信号的必要条件。杂交过夜后，荧光失效时间<10秒。革兰氏染色法观察到的细菌数量是FISH法的两倍。DAPI染色阳性需要超过3小时(表2)。gydF4y2Ba
闭塞的支架gydF4y2Ba
与狭窄支架相比，闭塞支架中FISH检测到的细菌平均浓度显著降低(p<0.001)。杂交12小时后才获得阳性荧光。荧光信号在曝光3-6秒后熄灭。通过自身荧光或革兰氏染色观察到的细菌中只有不到10%对FISH有反应。gydF4y2Ba
在狭窄和闭塞的胆道支架中发现的细菌群相似(表2)，但生物膜内主要细菌群的比例相对于数量较少的细菌群的比例有所下降。gydF4y2Ba
在5个完全闭塞的支架的四个肝端中，没有生物膜，只有浓度可忽略不计的分散细菌。gydF4y2Ba
胆结石gydF4y2Ba
细菌浓度10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba在23种混合胆固醇胆结石中有8种和所有4种棕色色素胆结石中均观察到(p<0.03)。FISH检测到的细菌平均浓度与在支架闭塞部分观察到的细菌浓度没有统计学差异。革兰氏染色和自身荧光显示大量类似细菌的结构。然而，其中大多数无法确定，只有一小部分给出了阳性杂交信号。荧光非常微弱，往往在照片聚焦时消失。由于荧光信号微弱，很难证明与群特异性探针杂交的特异性。我们发现闭塞支架与胆结石或胆囊与胆总管结石之间的微生物群组织没有显著差异。gydF4y2Ba
所有132例胆固醇结石的洗脱液中未检测到细菌，而23例混合结石中的15例洗脱液中可见“类似细菌的阴影”背景(p<0.001)。这些阴影内低浓度的单个细菌与Eub338探针杂交呈阳性。革兰氏染色难以解释，DAPI染色无帮助。FISH使用辣根过氧化物酶标记的寡核苷酸探针和酪胺信号放大并没有导致信号强度的增加。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba
由于阳性杂交菌浓度低，形态各异，故未使用群体特异性探针进行进一步分化。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
我们的数据首次在原位证明了病变胰腺和胆道内存在丰富的微生物生物膜。由于在相应的十二指肠活检中没有发现生物膜，或者在胆囊或胆管壁的上皮上也没有发现生物膜，我们必须假设在胆道支架、钙化胰管或胆结石中检测到的细菌是利用异物或破坏性解剖变化的机会性新来者，而不是胰胆树中专门为生命而存在的无梗居民。与化脓性病变的情况类似，我们预计支架闭塞会阻碍宿主抑制细菌生物膜，并且与支架开放部分相比，闭塞部分的细菌浓度更高。结果正好相反。细菌浓度、密度以及对FISH和DNA染色的适应性随着支架的清除程度的增加而逐渐降低。在完全闭塞的支架中，细菌浓度比狭窄部分低4个对数。在混合胆固醇和棕色色素胆结石中发现了类似于支架闭塞部分的低细菌浓度。细菌浓度最低，几乎为零，在完全闭塞支架的肝端和胆固醇胆结石中被发现。尽管在这种富含胆固醇的材料中仍然可以看到大量类似细菌的结构，但大多数没有或仅与细菌探针杂交。gydF4y2Ba
杂交探针可靶向的核糖体数量随着细胞结构的退化而下降。细胞壁渗透性的改变也会阻碍探针穿透细胞并到达目标分子。在富含胆固醇的胆结石中观察到的荧光信号强度和DAPI染色的变化可能表明生物膜内细菌的活力萎缩，细菌壁和结构的木乃伊化。在胆固醇胆结石和一些完全闭塞的支架碎片中缺乏杂交信号并不意味着细菌在物理上不存在。在我们之前使用定量PCR和随后的克隆和测序的研究中，我们发现几乎所有的胆固醇胆结石都含有不同细菌群的DNA序列，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细菌DNA浓度在冷冻石头储存的几周内下降。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba因此，细菌显然存在，但在调查时无法存活，正在降解。gydF4y2Ba
胆结石传统上分为三大类:胆固醇(>70%的胆固醇)、棕色色素胆结石(<30%的胆固醇)和黑色色素胆结石(几乎没有胆固醇)。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba在我们的胆总管结石系列中，混合胆固醇胆结石的高发生率是由于内窥镜难以恢复无定形棕色色素胆结石。“代谢性”黑色色素结石的数量通常很少，在我们的系列中没有一例。细菌很容易在棕色色素结石中发现，但在胆固醇胆结石中没有，这导致了棕色色素结石是传染性来源，而胆固醇结石是由于代谢紊乱。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba
在20世纪60年代，葡萄糖醛酸酶被证明来自gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba解凝双蓝尿酸胆红素，释放胆汁中的胆红素，然后沉淀为不溶性胆红素钙，褐色胆结石的主要成分。细菌诱导的胆红素解凝仍被认为是褐色结石形成的主要机制。然而，棕色胆结石和胆固醇胆结石之间有广泛的结构重叠。大量胆囊结石是混合或至少部分混合胆固醇和棕色色素胆结石。这导致人们猜测，棕色和胆固醇胆结石的发病机制可能相似，但由于不同的途径。因此，用每一种新出现的技术对胆固醇胆结石进行细菌筛查。应用电子显微镜和分子遗传学方法。在胆固醇结石中发现了细菌残留，但没有存活的细菌种群。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba因此，细菌参与胆固醇胆石形成的假设从未流行过。胆胆固醇饱和机制是目前研究的主流。一个非常重要的问题一直没有答案。胆固醇结石如何保持无菌?胆石不均匀的裂隙表面为微生物生物膜提供了理想的庇护所。胆结石中的有机成分可能是能量来源。胆道的一侧是肠道，这是一个复杂微生物群的大型培养发酵罐，另一侧是肝脏，它过滤和分泌血液中的细菌。胆结石应该为生物膜的发展提供一个理想的环境，因为它们在人体内持续存在数十年。但在选择性胆囊切除术期间，尽管有文献记载有化脓性胆管炎发作，但胆固醇结石大多是无菌的。为什么会这样?gydF4y2Ba
非梗阻性胆道支架表面与棕色、胆固醇胆结石表面的整体情况相同。营养物质的缺乏或胆汁中可溶性抑制剂的存在都可以解释从胆汁支架到胆固醇胆结石的细菌生物膜的损耗。gydF4y2Ba
我们假设，胆固醇结石的形成和支架阻塞可能代表了对胆道内异物生物膜传播的阻力的生理反应。然而，胆固醇等物质的具体作用尚未明确。这些研究可能有助于了解新的机制，身体可以保护自己，否则极端顽固的细菌生物膜。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
我们感谢Eli and Edythe L Broad基金会的Broad医学研究项目对该项目的支持。gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
利益冲突:没有声明。gydF4y2Ba
相关的文章gydF4y2Ba
- 评论gydF4y2Ba