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Neurogastroenterology
原文
Apelin以肠道收缩为目标，通过大脑控制葡萄糖代谢
  1. Audren Fournel1，2，3.，
  2. 安妮Drougard1，2，3.，
  3. 鲍特Duparc2，4，
  4. Alysson马林1，2，3.，
  5. 斯图亚特·米那5，6，7，
  6. 乔尔·卡斯特罗5，
  7. 苏菲Le-Gonidec1，2，3.，
  8. 伯纳德•马斯里8，
  9. 安德烈·科罗姆1，2，3.，
  10. 亚历山大·卢卡斯1，2，3.，
  11. Perrine Rousset3.，9，
  12. 尼古拉斯Cenac3.，9，
  13. 娜塔莉Vergnolle3.，9，
  14. 菲利普的管家1，2，3.，
  15. 帕特里斯·D Cani2，4，
  16. 克劳德。可耐福1，2，3.
  1. 1国家疾病研究所Santé和研究研究所Médicale (INSERM)， U1048，疾病研究所Métaboliques和心血管研究所(I2MC)，图卢兹Cedex 4、法国
  2. 2NeuroMicrobiota，欧洲联合实验室(EAL) INSERM/UCL
  3. 3.大学保罗Sabatier，图卢兹、法国
  4. 4Université天主教鲁汶(UCL)，鲁汶药物研究所，LDRI，代谢和营养研究小组，WELBIO(瓦隆卓越生命科学和生物技术)，布鲁塞尔、比利时
  5. 5内脏疼痛组，阿德莱德大学医学系营养和胃肠道疾病中心，南澳大利亚健康和医学研究所，南澳大利亚阿德莱德、澳大利亚
  6. 6消化科和肝病科，皇家阿德莱德医院，南澳大利亚阿德莱德、澳大利亚
  7. 7健康科学学院生理学学科“，，阿德莱德大学，南澳大利亚阿德莱德、澳大利亚
  8. 8法国国立研究中心Santé法国国立研究中心Médicale (INSERM)， U1037，图卢兹研究中心Cancérologie (CRCT)，楚兰格伊尔，图卢兹,Cedex 4、法国
  9. 9国家研究中心Santé和国家研究中心Médicale (INSERM)， U1043，图卢兹Purpan生理病理中心(CPTP)， Purpan，图卢兹Cedex 03、法国
  1. 对应到Patrice D Cani教授，Université鲁万大教堂(UCL)，鲁万药物研究所，LDRI，代谢和营养课题组，WELBIO, WELBIO(瓦隆卓越生命科学和生物技术)，Av. E. Mounier, 73 B1.73.11，布鲁塞尔B-1200，比利时;Patrice.cani在{}uclouvain.be
  2. Claude Knauf教授，法国国立研究中心Santé和研究中心Médicale (INSERM)， U1048，疾病和心血管研究所Métaboliques (I2MC)， Université Paul Sabatier, CHU Rangueil, Jean大道1号Poulhès, BP84225, 31432，法国图卢兹Cedex 4;Claude.knauf在{}inserm.fr

摘要

客观的肠-脑轴被认为是控制葡萄糖内稳态的主要调节检查点。十二指肠中检测到的营养物质和/或激素告知下丘脑宿主的营养状况。这一过程可能是通过下丘脑神经元调节一氧化氮(NO)的中枢释放来进行的，而一氧化氮反过来又控制葡萄糖进入组织。肠神经系统(ENS)调节肠道收缩以响应各种刺激，但这种相互作用在通过大脑控制葡萄糖稳态中的重要性尚不清楚。我们研究了apelin(一种存在于肠道中的生物活性肽)是否调节ens引起的收缩，从而确定了通过下丘脑控制葡萄糖利用的新的生理伙伴。

设计我们通过遥测探头和等张传感器在正常和肥胖/糖尿病小鼠中测量apelin对十二指肠电和机械反应的影响。用特定的安培探头实时评估了由apelin调节的十二指肠收缩引起的下丘脑NO释放的变化。用口服放射性标记葡萄糖来测定组织中的葡萄糖利用率。

结果在正常和肥胖/糖尿病小鼠中，响应apelin的ENS/收缩活动的减少改善了葡萄糖的利用，这产生了下丘脑NO释放的增加。结果，葡萄糖进入肌肉的量显著增加。

结论在这里，我们发现了肠和下丘脑之间控制葡萄糖利用的一种新的交流模式。此外，我们的数据确定口服apelin给药是治疗代谢障碍的一个新的潜在靶点。

  • 肥胖
  • 肠神经系统
  • 肠道激素
  • 胃肠生理
  • 葡萄糖代谢

这是一篇根据创作共用署名非商业性(CC BY-NC 4.0)许可发布的开放获取文章，该许可允许其他人以非商业性的方式发布、混编、改编、构建本作品，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是原始作品被正确引用且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2015-310230

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    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • 循环apelin是一种生物活性肽，在各种器官(大脑、肌肉、脂肪组织)中发挥多效作用，以控制葡萄糖的利用和血糖血症。

    • 肠-脑轴在控制葡萄糖稳态中至关重要，在代谢性疾病(如2型糖尿病)中被严重改变。

    • 肠神经系统(ENS)受到瘦素等多种生物活性因子的影响，瘦素可由管腔转运至肠壁。

    新的发现是什么?

    • 管腔尾翼能够通过肠道转运到十二指肠内结构。

    • Apelin控制ENS神经递质的释放，即乙酰胆碱和一氧化氮，与十二指肠收缩的变化有关。

    • Apelin触发ens诱导的十二指肠收缩，导致肌肉葡萄糖通过下丘脑接力吸收。

    • 长期口服apelin可改善正常和肥胖/糖尿病小鼠的糖耐量，与十二指肠动力下降密切相关。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 这项研究提供了明确的证据，说明调节ENS/十二指肠收缩是一种通过大脑控制外周葡萄糖利用的新的生理系统。更重要的是，口服apelin可能是治疗胰岛素抵抗状态的一个有前途的治疗靶点。

    简介

    肠-脑轴在控制能量内稳态中具有至关重要的作用。肠道脂质的检测或“感知1和葡萄糖2激活肠壁的外源性传入神经，它通知下丘脑消化道中营养物质的存在。随后，下丘脑神经元对这些外围信号的响应调节导致代谢功能的改变，包括产热，3.食物摄入和葡萄糖在组织中的利用。4

    最近的研究证明了肠道营养感应在控制葡萄糖稳态中的重要性。5十二指肠和/或空肠营养检测的改变6干扰下丘脑反应，可能有助于增加肝葡萄糖的产生7和胰岛素抵抗,22型糖尿病的特征。识别能够修饰肠-脑轴的新的分子机制对于发现新的和成功的治疗策略具有重要意义。例如，瘦素，在肠道管腔部分分泌对营养物质的反应，可以改变空肠磷脂酰肌醇3激酶的活性，以减少肝葡萄糖的产生。7除瘦素外，apelin是另一个在全身发挥多效作用的潜在靶点。值得注意的是，apelin被认为是一种与葡萄糖代谢控制有关的生物活性肽。8在中枢神经系统(CNS)中，apelin是一种能够靶向下丘脑神经元控制血糖的神经递质。9在外周，apelin是一种脂肪因子，可以改善正常和肥胖/糖尿病小鼠肌肉的胰岛素敏感性。8，10最近的资料显示，apelin也存在于肠腔部并被释放，以刺激葡萄糖的吸收。11

    在胃肠道中，肠神经系统(ENS)参与各种生理功能，包括调节肠收缩。ENS本质上是由兴奋性(胆碱乙酰转移酶(ChAT))运动神经元或抑制性运动神经元(神经元一氧化氮合酶(nNOS))组成，刺激或抑制肠道收缩和运动能力。12已知这些ENS神经元可以表达各种因子的受体，如瘦素13胰高血糖素样肽-2 (GLP-2)。14在糖尿病的后期，肠近端(最先受到影响的部分)ENS的改变与肠高收缩有关。12此外，一些研究表明，在糖尿病期间，肠道近端有抑制神经元的丧失和胆碱能神经支配的增加。12ENS控制的十二指肠收缩是否与通过大脑控制的葡萄糖稳态有关尚不清楚。

    在这里，我们研究GI apelin是否可以修改' ENS/收缩'夫妇的活动，通过大脑控制全身葡萄糖的利用。总的来说，我们的研究揭示了一种涉及十二指肠机械收缩力的新的交流模式，这可能被认为是2型糖尿病患者通过大脑改善组织葡萄糖利用的潜在治疗靶点。

    材料和方法

    老鼠

    雄性C57BL/6J小鼠(法国查尔斯河实验室，l’arbresle)免费获得食物和水。小鼠被喂食含有20%蛋白质、35%碳水化合物和45%脂肪的正常饲料或高脂饲料(HFD)(研究饮食，美国新泽西州新不伦瑞克)。这些小鼠在3个月的HFD后变得肥胖和胰岛素抵抗。9在喂养的小鼠中记录了相应的数据，即肠段波产生以增加营养吸收率的阶段。15

    急性注射(APJ受体拮抗剂，NOS抑制剂，β-肾上腺素能受体激动剂，尼古丁受体和辣椒素拮抗剂)

    协议在联机补充方法一节中描述。

    慢性给药apelin

    在其他实验组小鼠中，100 μ L的[Pyr]apelin-13以1 μ M的浓度或100 μ L的H2O组口服灌胃，每日1次，连续1周。

    胃内和脑室内手术、遥测、等张收缩、免疫组化、胞吞、乙酰胆碱释放、葡萄糖和apelin吸收、葡萄糖利用、qPCR、代谢参数、胰岛素和apelin测定、口服糖耐量试验

    在联机补充方法一节中描述了协议。

    细胞培养和荧光显微镜

    HEK-293T细胞按照前面描述的方法培养16测试apelin-TAMRA的功能。协议在联机补充方法一节中详细描述。apelin - tamra是一种功能性apelin分子，能够结合并激活其受体APJ(参见在线补充图S1)。

    十二指肠体外实时NO测定

    在喂食条件下对小鼠实施安乐死。解剖后，十二指肠碎片在Krebs-Ringer碳酸氢盐/葡萄糖缓冲液(pH 7.4)中在95% O的气氛中洗涤2-5%的公司2然后浸泡在含有400µL相同培养基的Eppendorf管中。经过10分钟的恢复期后，使用直接植入十二指肠的NO特异性安培探针(ISO-NOPF, 100 μ m直径，5 mm长，World Precision Instruments, Aston Stevenage, UK)，在37°C持续20分钟下测量NO自发释放。数据用基础条件下NO释放的变化(δ)表示。9

    活体下丘脑实时NO测定

    喂食条件下用异氟醚麻醉小鼠。在头骨顶部做一个1厘米的中线切口，将动物置于立体定向装置上，如前所述。6结果以平均值±SEM表示。在安培测量期间，动物接受H2O或药物经10µL/min的灌胃注射，使用注射泵持续10 min。我们先前证明H2O是葡萄糖管理的首选载体。2，6，17此外，我们还证实了H2与NaCl(0.9%)相比，O没有改变下丘脑c-Fos的表达(一种神经元活性的标记物)。因此，如前所述，所有对照组都被灌水。2

    统计分析

    数据用平均值±SEM表示。在适当的情况下，采用非配对Student和单向或双向方差分析评估实验组之间的差异，然后采用事后Bonferroni检验。数据分析使用GraphPad Prism V.5.00用于Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA)。p<0.05时认为结果有统计学意义。

    结果

    Apelin作用于ENS神经元以控制十二指肠收缩

    十二指肠是营养感应的第一个肠道部位5以及apelin对葡萄糖吸收的影响。11通过免疫组化，我们发现APJ受体在ChAT和nNOS神经元上表达(图1A).为了确定apelin是否能够通过肠道进行细胞转运，我们使用apelin- tamra，一种能够与apelin受体APJ结合的功能性apelin分子(参见在线补充图S1)。我们观察到apelin能够到达底层结构，如神经丛(图1B)，暗示apelin和瘦素等其他脂肪因子一样，18接受transcytosis。

    Apelin receptor (APJ) is expressed in enteric nervous system neurons. (A) Duodenal sections from mice stained with anti-APJ antibody (left panels, green: white arrows), anti-choline acetyl transferase (ChAT) or anti-neuronal nitric oxide synthase (nNOS) antibodies (middle panels, red: white arrows) and merge (right panels, yellow arrows). Pictures are representative of four mice per groups. Bars=10 µm. Right panel: schematic representation of a transverse section through the duodenum. (B) Duodenal sections from mice perfused for 5 min with H2O (Control) (left panel) or apelin-TAMRA (right panel). Apelin-TAMRA appears in red (red arrows). Pictures are representative of three mice per groups. Bars=10 µm.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    APJ受体在肠神经系统神经元中表达。(A)染色有抗apj抗体(左图，绿色:白色箭头)、抗胆碱乙酰转移酶(ChAT)或抗神经元一氧化氮合酶(nNOS)抗体(中间图，红色:白色箭头)和合并(右图，黄色箭头)的小鼠十二指肠切片。图片代表每组4只老鼠。酒吧= 10µm。右面板:十二指肠横切面示意图。(B)小鼠十二指肠切片灌注H2O (Control)(左面板)或apelin-TAMRA(右面板)。Apelin-TAMRA显示为红色(红色箭头)。图片代表每组三只老鼠。酒吧= 10µm。

    为了评估apelin是否能够通过ENS控制十二指肠运动，我们使用等压传感器测量体外机械收缩(参见在线补充图S2A)。通过使用l - ng -硝基精氨酸甲酯(L-NMMA)(一种NOS酶抑制剂)和异丙肾上腺素(一种肾上腺素能受体激动剂)，对该技术进行了验证19和抑制20.(见在线补充图S2B)。在离体十二指肠制剂中应用apelin可增加肠收缩幅度(10 pM至100 nM) (图2A)但不影响宫缩的频率(见在线补充图S2C)。apelin的作用是针对十二指肠的，因为apelin不调节空肠和回肠的收缩(参见在线补充图S2D)。然而，apelin >1µM的浓度产生的收缩曲线振幅与在基础水平观察到的相似，这表明存在从刺激作用(10 pM到100 nM)到基础和/或抑制状态(1 - 10µM)的生理切换(图2最后的结果表明两种剂量存在两种不同的信号通路，所有这些影响都被一种APJ受体拮抗剂F13A(参见在线补充图S2E)拮抗。为了达到这个目的，我们选择将我们的意图集中在这个生理切换中涉及的最接近的剂量(即100 nM和1 M)。apelin对肠道收缩的刺激作用需要ChAT神经元，因为六甲铵，一种尼古丁受体拮抗剂，阻断了其作用(图2B).此外，apelin 100 nM对十二指肠收缩的刺激与十二指肠乙酰胆碱释放的增加相关(图2C)无剂量效应(见在线补充图S3A)，而NO在暴露于100 nM apelin (图2D). Apelin 1µM对十二指肠乙酰胆碱释放的影响与Apelin 100 nM相同(图2C)。相反，apelin 1µM增加了十二指肠NO的实时释放，表明apelin的浓度依赖于nNOS神经元来调节其对十二指肠收缩的作用(图2D).这种效应被APJ拮抗剂F13A拮抗(见在线补充图S3B)。

    Apelin acts on the enteric nervous system to control duodenal contractions. (A) Ex vivo measurement of duodenal mechanical contraction amplitude in response to Krebs–Ringer solution (Control) or increasing concentrations of apelin (1 pM to 10 µM). n=5–6 per group. *p<0.05 vs Control. (B) Ex vivo measurement of duodenal mechanical contraction amplitude in response to Krebs–Ringer (Control), apelin 100 nM, hexamethonium (Hx) 500 µM alone or with apelin 100 nM. n=5–6 per group. *p<0.05 vs Control. ##p<0.01, ###p<0.001. (C) Ex vivo measurement of duodenal acetylcholine release in basal condition and in response to Krebs–Ringer (Control), apelin 100 nM or apelin 1 µM. n=4 per group. *p<0.05. (D) Ex vivo measurement of duodenal nitric oxide (NO) release in response to Krebs–Ringer (Control), apelin 100 nM or apelin 1 µM. n=5–8 per group. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs Control. #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 vs apelin 100 nM. (E) In vivo measurement of duodenal electrical activity in response to H2O (Control), apelin 100 nM or apelin 1 µM. n=4–5 per group. *p<0.001 vs Control and versus apelin 1 µM. #p<0.001 vs Control and versus apelin 100 nM. (F) Schematic representation of the results: apelin modulates ENS activity causing a modification of duodenal contractions.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    Apelin作用于肠神经系统以控制十二指肠收缩。(A)对克雷布斯-林格溶液(对照)或增加apelin浓度(1 pM至10µM)时十二指肠机械收缩幅度的体外测量。n =每组5 - 6。* p < 0.05 vs控制。(B)体外测量十二指肠机械收缩振幅对克雷伯斯-林格(对照)，apelin 100 nM，六甲铵(Hx) 500 μ M单独或与apelin 100 nM的响应。n =每组5 - 6。* p < 0.05 vs控制。# #p < 0.01,# # #p < 0.001。(C)在基础条件下和对克雷布斯-林格(对照)、apelin 100 nM或apelin 1µM。n = 4 /组。* p < 0.05。(D)体外测定十二指肠一氧化氮(NO)释放对Krebs-Ringer(对照)、apelin 100 nM或apelin 1 μ M的响应。n = 5 - 8每组。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001对比对照。＃p < 0.05,# #p < 0.01,# # #p<0.001 vs apelin 100 nM。(E)在体内测量十二指肠电活动对H2O(对照)，apelin 100nm或apelin 1µM。n =每组4 - 5。与对照组和apelin 1相比，*p<0.001＃p<0.001与对照组比较，与apelin 100 nM比较。(F)结果示意图:apelin调节ENS活性，导致十二指肠收缩的改变。

    为了评估在体内条件下是否观察到这种开关，我们通过一种新方法实时测量十二指肠电活性，该方法使用连接到遥测系统的十二指肠周围电极(参见在线补充图S3C)。Apelin通过胃内导管直接注射到十二指肠，由此十二指肠的电活动与机械活动密切相关。21我们发现，apelin 100 nM可显著增加十二指肠电活性，而apelin 1 μ M可降低这种活性(图2E). APJ拮抗剂消除了所有效应，证明apelin作用的特异性(见在线补充图S3D)。因此，apelin能够通过一种涉及ENS (图2F)。

    十二指肠和空肠是各种动物近端肠的两个部分，都参与控制葡萄糖的吸收。22，23十二指肠也表达肠道葡萄糖转运蛋白和传感器。24 - 27日先前的研究表明，肠道运动的刺激与营养吸收的增加有关。15我们的数据显示，与apelin 1µM (图3A).在我们的实验模型中没有观察到apelin吸收的显著变化(图3B)，但在apelin处理的十二指肠碎片中，十二指肠壁apelin水平显著升高(见在线补充图S6A)。在体内条件下，肠道apelin灌注并没有改变门静脉apelin浓度(图3C).这些最后的结果加强了ENS中apelin对十二指肠壁的特异性作用的概念。

    Apelin modulates duodenal glucose absorption. (A) Ex vivo glucose absorption in duodenal everted sacs in response to Krebs–Ringer (Control), apelin 100 nM, apelin 1 µM, F13A alone or with apelin 100 nM. n=5–7 per group. *p<0.05, **p<0.01. (B) Ex vivo apelin absorption in duodenal everted sacs in response to Krebs–Ringer (Control), apelin 100 nM or 1 µM, and F13A alone or F13A plus apelin 100 nM. n=4–6 per group. (C) In vivo measurement of plasma apelin in portal vein, in response to oral gavage of H2O (Control), apelin 100 nM or apelin 1 µM. n=5–6 per group.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    Apelin调节十二指肠葡萄糖吸收。(A)十二指肠外转囊对克雷伯斯-林格(对照)的体外葡萄糖吸收，apelin 100 nM, apelin 1 M, F13A单独或与apelin 100 nM。n = 5 - 7每组。* * * p < 0.05, p < 0.01。(B)十二指肠外转囊对克雷伯斯-林格(对照)的体外apelin吸收，apelin 100 nM或1 μ M, F13A单独或F13A加apelin 100 nM。n =每组4 - 6。(C) H灌胃后门静脉血浆apelin的体内测定2O(对照)，apelin 100nm或apelin 1µM。n =每组5 - 6。

    十二指肠apelin控制下丘脑NO释放

    NO是控制葡萄糖稳态的中心区下丘脑作用体。28此外，与肠-脑轴相关的肠道葡萄糖传感的改变与2型糖尿病患者的NO下丘脑反应异常相关。6十二指肠收缩是否能够改变下丘脑NO的释放尚不清楚。通过在小鼠下丘脑植入特定探针，我们发现异丙肾上腺素减少十二指肠收缩会导致下丘脑NO释放增加(参见在线补充图S4A)，这表明肠道运动能够控制下丘脑活动。使用相同的技术，肠内给药apelin 100 nM减少了下丘脑NO释放，而apelin 1µM允许返回基础NO水平(图4重要的是，这种作用被APJ拮抗剂F13A阻断(参见在线补充图S4B, C)。此外，用六甲铵阻断尼古丁受体或用辣椒素破坏传入神经末梢可消除肠apelin对下丘脑NO释放的影响(图4B-D，见在线补充图S4D, E)。

    Duodenal apelin controls the gut motility-to-brain axis. (A) In vivo effect of intragastric perfusion of H2O (Control), apelin 100 nM or apelin 1 µM, on nitric oxide (NO) hypothalamic release frequency. n=5–7 per group. **p<0.01 vs Control. (B) In vivo effect of intragastric perfusion of H2O (Control), apelin 100 nM, hexamethonium (Hx) 500 µM alone or with apelin 100 nM, on NO hypothalamic release frequency. n=5–8 per group. *p<0.01, ***p<0.001 vs Control. ###p<0.001 vs apelin 100 nM. (C) In vivo effect of intragastric perfusion of H2O (Control), apelin 1 µM, Hx 500 µM alone or with apelin 1 µM, on NO hypothalamic release frequency. n=5–8 per group. ***p<0.001 vs Control. ###p<0.001 vs apelin 1 µM. (D) In vivo effect of intragastric perfusion of H2O (Control) and apelin 100 nM in mice pretreated or not by capsaicin on NO hypothalamic release frequency. n=4–7 per group. *p<0.01, ***p<0.001 vs Control. ###p<0.001 vs apelin 100 nM. (E) Schematic representation of the results: by modifying duodenal contractility, apelin modulates NO hypothalamic release.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    十二指肠apelin控制肠道运动到大脑的轴。(A) H2O(对照)，apelin 100 nM或apelin 1 μ M，对一氧化氮(NO)下丘脑释放频率的影响。n = 5 - 7每组。* * p < 0.01 vs控制。(B) H2O(对照)，apelin 100 nM，六甲铵(Hx) 500 μ M单独或与apelin 100 nM，对NO下丘脑释放频率。n = 5 - 8每组。*p<0.01， ***p<0.001 vs对照组。# # #p<0.001 vs apelin 100 nM。(C) H2O(对照)，apelin 1µM, Hx 500µM单独或与apelin 1µM结合，对NO下丘脑释放频率的影响。n = 5 - 8每组。* * * p < 0.001 vs控制。# # #p<0.001 vs apelin 1µM。(D) H2O(对照)和apelin 100 nM对辣椒素预处理和未处理小鼠的NO下丘脑释放频率的影响。n = 4 - 7每组。*p<0.01， ***p<0.001 vs对照组。# # #p<0.001 vs apelin 100 nM。(E)结果示意图:通过改变十二指肠收缩力，apelin调节NO在下丘脑的释放。

    在这里，我们的数据证明了肠道和大脑之间存在着一种交流模式，即apelin诱发信号后的十二指肠收缩能够改变下丘脑NO的释放(图4E)。

    十二指肠apelin通过下丘脑NO控制肌肉葡萄糖的利用

    为了测量十二指肠收缩的改变对葡萄糖经大脑利用的影响，我们在小鼠中测量了口服apelin和放射性标记葡萄糖示踪剂后葡萄糖进入不同组织的反应。胃内apelin 100 nM可减少葡萄糖进入肌肉，但对肝脏和脂肪组织均无影响(图5a - c)。与观察到的十二指肠机械和电活动的影响相似，apelin 1µM不改变肌肉的基础葡萄糖入口。为了进一步研究NO的大脑释放是否与胃内apelin 1µM处理对葡萄糖肌入口的影响有关，我们通过脑室内注射L-NMMA阻断了NO在大脑中的释放。我们发现阻断大脑中NO的释放可以减少葡萄糖进入肌肉(参见在线补充图S5A-C)，从而显示了大脑NO在猿肠-大脑-肌肉轴上的关键作用。

    Duodenal apelin modulates muscle glucose utilisation. In vivo measurement of glucose entry in liver (A), muscle (B) and adipose tissue (C) in response to oral gavage of radiolabeled glucose in combination with H2O (Control), apelin 100 nM alone or with F13A, apelin 1 µM alone or with F13A and F13A alone. n=9–11 per group. *p<0.05 vs Control and versus F13A. #p<0.01 vs apelin 1 µM and versus apelin 1 µM+F13A. $p<0.001 vs apelin 100 nM+F13A. (D) Schematic representation of the results: duodenal apelin controls muscle glucose utilisation via a hypothalamic relay.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    十二指肠apelin调节肌肉葡萄糖的利用。在体内测量葡萄糖进入肝脏(A)，肌肉(B)和脂肪组织(C)对口服放射标记葡萄糖和H的反应2O(对照)，apelin 100 nM单独或与F13A结合，apelin 1 M单独或与F13A和F13A单独结合。n =每组9 - 11。*p与对照组和F13A相比<0.05。＃p<0.01 vs apelin 1µM和apelin 1µM+F13A。＄p<0.001 vs apelin 100 nM+F13A。(D)结果示意图:十二指肠apelin通过下丘脑继电器控制肌肉葡萄糖的利用。

    总之，我们的数据显示apelin 100 nM增加十二指肠收缩力，减少肌肉葡萄糖的利用(图5D)通过下丘脑NO中继。

    慢性apelin灌胃通过降低十二指肠运动增加葡萄糖耐量

    我们假设高水平apelin的慢性刺激可以引起十二指肠收缩力的下降，并可能与改善葡萄糖耐量有关。为了测试慢性apelin治疗是否能改善十二指肠的基础收缩能力，进而改善葡萄糖的利用，我们测量了口服apelin(1µM) 1周小鼠十二指肠的基础机械活性。在这里，我们表明，长期口服apelin增加了十二指肠的apelin浓度，但在空肠和回肠没有;这一观察结果强化了十二指肠是经细胞转染的apelin的主要靶点的事实(参见在线补充图S6B)。慢性apelin治疗可降低十二指肠基底收缩力(图6A)，葡萄糖耐量增加(图6B)和胰岛素释放对葡萄糖的反应(图6C)。此外，这与葡萄糖转运体4型(GLUT 4) mRNA表达的增加有关(图6D)和葡萄糖进入肌肉(图6E)。没有观察到葡萄糖进入肝脏和脂肪组织的显著变化(见在线补充图S6C, D)。葡萄糖耐量的改善与体重的改变无关(对照组=25.2±0.8 g vs apelin 1µM=23.3±0.9 g)。

    Chronic oral gavage of apelin 1 µM increases glucose tolerance via a decrease in duodenal contractility. (A) Ex vivo measurement of duodenal mechanical contraction in mice orally gavaged for 1 week with H2O (Control) or apelin 1 µM. n=4–5 per group. *p<0.05 vs Control. (B) Oral glucose tolerance test (OGTT) in 6 h fasted mice, orally gavaged for 1 week with H2O (Control) or apelin 1 µM. n=4–5 per group. *p<0.05, ***p<0.001 vs Control. The adjacent graph represents the average area under the curve. (C) OGTT-associated insulinemia in 6 h fasted mice, orally gavaged for 1 week with H2O (Control) or apelin 1 µM. n=4–5 per group. *p<0.05. (D) Relative expression of glucose transporter type 4 mRNA in muscle of mice orally gavaged for 1 week with H2O (Control) or apelin 1 µM. n=9–10 per group. *p<0.05 vs Control. (E) In vivo measurement of glucose entry in muscle in response to oral gavage of radiolabeled glucose, in mice orally gavaged for 1 week with H2O (Control) or apelin 1 µM. n=7 per group. **p<0.01 vs Control.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    长期灌胃apelin 1µM可通过降低十二指肠收缩能力增加葡萄糖耐量。(A) H灌胃小鼠1周后十二指肠机械收缩的体外测定2O(对照)或apelin 1µM。n =每组4 - 5。* p < 0.05 vs控制。(B)禁食6 h小鼠口服糖耐量试验(OGTT)，灌胃h2O(对照)或apelin 1µM。n =每组4 - 5。*p<0.05， ***p<0.001与对照组比较。相邻的图表示曲线下的平均面积。(C) 6 h禁食小鼠ogtt相关胰岛素血症，灌胃1周2O(对照)或apelin 1µM。n =每组4 - 5。* p < 0.05。(D) H灌胃1周小鼠肌肉中葡萄糖转运体4型mRNA的相对表达2O(对照)或apelin 1µM。n = 9 - 10每组。* p < 0.05 vs控制。(E)用H灌胃小鼠1周后，口服放射性标记葡萄糖对肌肉葡萄糖进入的体内测量2O(对照)或apelin 1µM。n = 7 /组。* * p < 0.01 vs控制。

    Apelin在肥胖/糖尿病小鼠中恢复正常的十二指肠运动并改善糖耐量

    与在血浆和各种组织(如脂肪组织、肌肉)中观察到的相似，我们发现在HFD小鼠的十二指肠中apelin mRNA水平显著升高，但在空肠和回肠中没有升高(参见在线补充图S7A)。与对照组小鼠相比，HFD小鼠肠道近端APJ mRNA表达未发生改变(见在线补充图S7B)。首先，我们测量了HFD小鼠的十二指肠收缩对急性apelin 1µM。我们发现apelin 1µM在体外和体内条件下平衡了HFD处理产生的十二指肠高收缩性(图7A、B和在线补充图S7C)。这一效应与十二指肠NO释放增加有关(图7C)与正常小鼠相似(图2D).然后，十二指肠收缩力的降低与，首先，肠道葡萄糖吸收的减少(图7D)，对apelin吸收无影响(图7E)，第二，HFD apelin治疗小鼠的下丘脑NO释放增加(图7F和在线补充图S7D)。apelin对肠-脑轴的调节与肌肉中葡萄糖利用的改善有关(图7胃肠道)。

    Apelin 1 µM decreases duodenal contractility and improves glucose utilisation in obese/diabetic mice. (A) Ex vivo measurement of duodenal mechanical contraction amplitude in response to Krebs–Ringer (Control) (in normal chow or high-fat diet (HFD) mice) and apelin 1 µM (in HFD mice). n=5–6 per group. *p<0.05. (B) In vivo measurement of duodenal electrical activity in response to H2O (Control HFD) and apelin 1 µM. n=4–7 per group. ***p<0,001 vs Control HFD. (C) Duodenal nitric oxide (NO) release in response to Krebs–Ringer (Control HFD) or apelin 1 µM. n=4–7 per group. *p<0.05, **p<0.01 vs Control HFD. (D) Ex vivo glucose absorption in duodenal everted sacs in response to Krebs–Ringer (Control HFD) and apelin 1 µM. n=4–6 per group. *p<0.05 vs Control HFD. (E) Ex vivo apelin absorption in duodenal everted sacs in response to Krebs–Ringer (Control HFD) and apelin 1 µM. n=6 per group. (F) In vivo effect of intragastric perfusion of H2O (Control HFD) and apelin 1 µM on NO hypothalamic release frequency. n=6 per group. **p<0.01 vs Control HFD. In vivo measurement of glucose entry in liver (G), muscle (H) and adipose tissue (I) in response to oral gavage of radioactive glucose in combination with H2O (Control HFD) and apelin. n=4–6 per group. *p<0.05 vs Control HFD.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    Apelin 1µM可降低肥胖/糖尿病小鼠的十二指肠收缩力并改善葡萄糖利用。(A)对Krebs-Ringer(对照组)(正常饲料或高脂饲料(HFD)小鼠)和apelin 1 μ M (HFD小鼠)反应的十二指肠机械收缩振幅的体外测量。n =每组5 - 6。* p < 0.05。(B)在体内测量十二指肠电活动对H的反应2O(对照HFD)和apelin 1µM。n = 4 - 7每组。***p<0,001 vs Control HFD。(C)十二指肠一氧化氮(NO)释放对Krebs-Ringer(对照HFD)或apelin 1µM。n = 4 - 7每组。*p<0.05， **p<0.01 vs对照HFD。(D)十二指肠外翻囊对Krebs-Ringer(对照HFD)和apelin 1的体外葡萄糖吸收反应。n =每组4 - 6。*p<0.05 vs对照HFD。(E)十二指肠外翻囊对Krebs-Ringer(对照HFD)和apelin 1的体外吸收。 n=6 per group. (F) In vivo effect of intragastric perfusion of H2O(对照HFD)和apelin 1对NO下丘脑释放频率的影响。n = 6 /组。**p<0.01 vs对照HFD。在体内测量葡萄糖进入肝脏(G)，肌肉(H)和脂肪组织(I)对口服放射性葡萄糖和H的反应2O(对照HFD)和apelin。n =每组4 - 6。*p<0.05 vs对照HFD。

    为了测试通过apelin靶向十二指肠运动是否可以被认为是治疗2型糖尿病的潜在治疗靶点，我们测量了HFD小鼠慢性(1周)apelin灌胃的影响。首先，我们发现慢性口服apelin改善了喂养血糖血症、禁食胰岛素血症和体内稳态模型评估HFD小鼠的胰岛素抵抗(图8A).第二，慢性口服apelin治疗可降低十二指肠基底动力(图8B)与改善葡萄糖耐量有关(图8C)和胰岛素抵抗指数(图8D) HFD小鼠。第三，慢性apelin治疗增加了肌肉中GLUT4 mRNA的表达(图8E)。

    Apelin 1 µM treatment increases glucose tolerance via a decrease in duodenal contractility. (A) Effects of high-fat diet (HFD) on metabolic parameters in mice orally gavaged for 1 week with H2O (Control HFD) or apelin 1 µM. n=6 per group. (B) Ex vivo measurement of duodenal mechanical contraction in HFD mice orally gavaged for 1 week with H2O (Control HFD) or apelin 1 µM. n=6 per group. **p<0.01 vs Control HFD. (C) Oral glucose tolerance test (OGTT) in 6 h fasted HFD mice, orally gavaged for 1 week with H2O (Control HFD) or apelin 1 µM. n=6 per group. **p<0.01, ***p<0.001 vs Control HFD. The adjacent graph represents the average area under the curve (AUC). (D) OGTT-associated insulin resistance index in 6 h fasted HFD mice, orally gavaged for 1 week with H2O (Control HFD) or apelin 1 µM. n=6 per group. *p<0.05 vs Control HFD. (E) Relative expression of glucose transporter type 4 (GLUT-4) mRNA in muscle of HFD mice orally gavaged for 1 week with H2O (Control HFD) or apelin 1 µM. n=9–10 per group. *p<0.05 vs Control. HOMA-IR, homeostasis model assessment insulin resistance; NC, normal chow.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8
    图8

    Apelin 1µM处理可通过降低十二指肠收缩性来增加葡萄糖耐量。(A)高脂饲料(HFD)对H2O(对照HFD)或apelin 1µM;n = 6 /组。(B) HFD小鼠灌胃1周H2O(对照HFD)或apelin 1µM;n = 6 /组。**p<0.01 vs对照HFD。(C)禁食6 h的HFD小鼠口服糖耐量试验(OGTT)，灌胃1周2O(对照HFD)或apelin 1µM;n = 6 /组。**p<0.01， ***p<0.001与对照HFD比较。相邻图表示曲线下平均面积(AUC)。(D) 6 h空腹HFD小鼠ogtt相关胰岛素抵抗指数，灌胃h2O(对照HFD)或apelin 1µM;n = 6 /组。*p<0.05 vs对照HFD。(E) H灌胃1周HFD小鼠肌肉中葡萄糖转运体4型(GLUT-4) mRNA的相对表达2O(对照HFD)或apelin 1µM;n = 9 - 10每组。* p < 0.05 vs控制。HOMA-IR，内稳态模型评估胰岛素抵抗;数控,正常的食物。

    讨论

    循环apelin被认为是通过直接作用于组织(脂肪组织、肌肉、肠道)的葡萄糖利用来控制葡萄糖内稳态的一个因素。在大脑中，apelin根据营养状态和它在下丘脑中的水平发挥双重作用。我们以前已经证明，低剂量的apelin脑室内给药改善喂养小鼠的血糖。9这种效应可能与在黑暗期(对应于喂食状态)观察到的等离子体apelin的轻微和持续增加有关。所有这些数据表明，在急性静脉注射后，apelin在全身的生理上升对葡萄糖代谢有有益的作用。10在这里，我们显示apelin对ENS神经元具有类似于在中枢神经系统中观察到的双重影响。特别地，我们证明了apelin诱导十二指肠收缩性的调节，随后通过下丘脑NO释放的变化改变下丘脑活动，以控制肌肉葡萄糖的利用。因此，猿皮林对ENS和CNS神经元的作用可以相提并论。在大脑中，apelin对下丘脑释放因子的作用因给药剂量的不同而不同。低剂量apelin刺激NO的释放，中央高剂量apelin对葡萄糖代谢有不良作用9)释放过氧化氢而不是NO。29在十二指肠中，观察到类似的对NO释放的差异效应，这表明十二指肠nNOS神经元对apelin的反应的招募依赖于注射的剂量。事实上，apelin在100 nM和1µM时能够刺激乙酰胆碱的释放，但apelin对十二指肠收缩的这种潜在刺激作用被apelin 1µM对十二指肠NO释放的作用所抵消。因此，apelin 1µM对正常小鼠十二指肠收缩的影响与对照组相似。这一假设得到了HFD小鼠的数据支持，因为apelin 1µM刺激十二指肠NO释放，以减少十二指肠的高收缩性。我们不能完全排除apelin 1µM在我们的实验模型中对APJ表达的下调，类似于在肥胖大鼠的下丘脑中观察到的，30.但我们的数据倾向于限制这种可能性。首先，我们发现HFD小鼠十二指肠apelin mRNA表达增加，而APJ mRNA表达没有改变。这一结果支持了文献数据，提示外周apelin表达增加可能是一种平衡胰岛素抵抗的适应性途径。8其次，十二指肠破片对apelin 1µM释放NO，而不是100 nM，这加强了两种不同分子作用体的存在，分别阻断和刺激十二指肠收缩。因此，我们的数据表明ENS神经元是apelin对十二指肠运动作用的潜在靶点，因为(1)apelin调节十二指肠乙酰胆碱和NO的释放，(2)apelin的刺激作用被六甲铵阻断，(3)apelin受体APJ在ENS神经元上表达。由于APJ受体在肠壁中表达，我们可以推测apelin可能对其他肠细胞也有作用。因此，我们不能排除apelin对肠平滑肌直接作用的可能性。

    在目前的研究中，我们提出了一种新的和生理相关的肠道和大脑之间的交流模式，控制葡萄糖的利用。具体地说，我们的数据表明，外周葡萄糖的利用可以通过下丘脑继电器的十二指肠收缩力来控制。在生理条件下，我们的数据表明apelin在消化过程中对ENS神经元有不同的影响。因此，我们提出以下模型，在食物摄入初期，apelin通过作用于GLUT2易位对肠道葡萄糖吸收有刺激作用(1)11(2)十二指肠运动。这种对肠道收缩的刺激作用导致下丘脑NO封锁，减少组织中葡萄糖的利用，以避免潜在的低血糖。餐后，高水平的apelin靶向nNOS神经元:(1)减缓十二指肠波并停止葡萄糖吸收，(2)恢复下丘脑NO释放，(3)增加肌肉葡萄糖利用。由于下丘脑NO释放的增加刺激周围血管流量，导致葡萄糖进入肌肉，我们的小组先前已经证实了中枢NO和外周葡萄糖利用之间的联系。28

    在消化过程中，这种葡萄糖内稳态的调控涉及肠-脑轴和肠道传感器，这已经明确确立。我们之前已经证明，在高血糖期间，肠道葡萄糖感应产生的肝糖生成增加，通过中央中继防止下一段时间的禁食。17这一现象暗示了下丘脑的GLP-1通路;GLP-1与apelin类似，是一种存在于大脑中的肠道激素，作为神经递质发挥着重要作用。2所有这些涉及肠激素感应和机械感应的数据都强调了“肠-脑-外周”轴在控制葡萄糖代谢中的重要性。

    2型糖尿病与胰岛素抵抗有关。我们之前已经证明，肠道葡萄糖感应的改变参与了在肥胖/糖尿病小鼠中观察到的胰岛素抵抗状态。2，6事实上，肠道炎症和氧化应激与异常的葡萄糖感应有关，导致下丘脑NO释放异常。6这种葡萄糖检测的改变可能与机械检测的干扰有关。因此，有研究表明，2型糖尿病与ENS中nNOS神经元数量的减少有关12增加肠动力的产生肠动力的增加的12，31肠道高运动首先会引起十二指肠葡萄糖吸收增加，导致喂养性高血糖，其次，根据我们的结果，它可能通过大脑引起胰岛素抵抗。本研究表明，高水平的apelin能够恢复十二指肠基底部收缩，特别是在正常和肥胖/糖尿病小鼠的肠道近端。针对ENS神经元通过apelin或其他分子靶点调节肠道收缩是减少十二指肠收缩的宝贵工具，这可能对治疗高血糖和胰岛素抵抗等2型糖尿病合并症的新治疗策略具有真正的潜在兴趣。我们的数据支持这一假设，因为慢性口服apelin可改善HFD小鼠的糖耐量。

    许多因素可以到达ENS神经元来调节它们的活动。其中一些可能来自血浆，另一些可能像瘦素一样从肠腔通过胞吞作用到ENS。18已知Apelin在肠细胞对葡萄糖的反应中在管腔内释放，以帮助葡萄糖的吸收。11在这项研究中，我们发现十二指肠中apelin的转运通过一种ens依赖性机制控制葡萄糖吸收。因此，我们的数据强调了一种涉及肠道因子的葡萄糖稳态调节新模式。肠道激素如GLP-1在控制葡萄糖代谢中的重要性已被证实32代表了一种治疗代谢紊乱的创新方法。除了对胰岛素敏感组织的直接影响外，这些因素在“ENS/收缩-大脑-外周”轴上的潜在作用可能带来改善糖尿病状态的新的可能性和组合。实际上，2型糖尿病治疗策略的目标是GLP-1，它是由回肠的l细胞释放的。我们工作的另一个创新之处是瞄准第一个营养物质检测的部位，也就是十二指肠，它现在被认为和空肠一样，7作为糖尿病患者恢复葡萄糖稳态的未来目标。5营养感应在2型糖尿病中发生了很大的改变，5可通过调节十二指肠收缩作为一种抑制高血糖的治疗作用来补偿。这一假设得到了桑多瓦尔的工作的支持等,33这表明禁食后十二指肠的内部机械操作会产生肠道激素的释放。我们推测，除了本研究中证实的辣椒素敏感传入神经信号外，apelin或其他因素对肠收缩的调节可能涉及激素介导的信号。

    总之，我们提供的证据表明，ENS、十二指肠收缩力和大脑之间的相互作用对控制生理条件下的葡萄糖利用至关重要。此外，我们证明了肠apelin是一个关键的角色，在这个系统中发挥主要作用。此外，存在许多可能性:(1)针对该系统的潜在其他分子因子(如激素)或(2)对生理功能(如食物摄入、脂质代谢)的潜在影响;我们的研究阐明了肠apelin的作用机制及其对葡萄糖稳态的影响。未来的探索有必要证明这一轴在治疗人类代谢性疾病中的作用。

    致谢

    我们感谢Sophie Allart和Astrid Canivet在图卢兹INSERM UMR 1043细胞成像设施提供的技术援助，感谢Phénotypage UMS US006/INSERM服务提供的遥测测量，感谢Simon Nicolas和Isabelle Castan-Laurell进行的有益讨论。

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    补充材料

    • 补充数据

      这个网络仅文件已由BMJ出版集团从作者提供的电子文件生产(s)，并没有编辑的内容。

    脚注

    • 贡献者AF和AD贡献相当。AF、AD、TD、AM、SMB、JC、SL-G、BM、AC、AL、PR、NC、PDC和CK采集数据。AF、AD、PDC和CK分别进行了研究概念和设计。AF、AD、PDC和CK对数据进行了分析和解释。AF、AD、TD、SMB、JC、NC、NV、PV、PDC、CK撰稿。

    • 资金这项工作得到了科学研究基金会(Fonds de la Recherche science - fnrs)对FRFS-WELBIO项目的支持，项目资助:WELBIO-CR-2012S-02R。这项工作得到英博- baillet Latour基金(2015年医学研究拨款)的部分支持。作者感谢法国营养学协会(SFN)和研究基金会Médicale (FRM)的财政支持(Grant ING20150532586)。PDC是FNRS(公约J.0084.15，公约3.4579.11)、PDR(研究项目，公约:T.0138.14)、FRM(医学研究基金会)和ARC(研究行动Concertée-Communauté française比利时公约:12/17-047)的赠款接受者。PDC也是2013年ERC启动拨款的接受者(欧洲研究理事会，启动拨款336452-ENIGMO)。NV是ERC(整合商授权，PIPE)的接受者。SMB是NHMRC澳大利亚R.D赖特生物医学研究员。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 伦理批准实验是根据欧共体有关保护实验动物的法规进行的，并得到当地动物保护和使用委员会的批准。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。