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  • mir - 541强化人类肝细胞癌索拉非尼治疗的反应通过抑制自噬

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肝脏病学
原始研究
mir - 541强化人类肝细胞癌索拉非尼治疗的反应通过抑制自噬
  1. Wen-Ping徐1,
  2. Jin-Pei刘1,
  3. Ji-Feng冯1,
  4. 敞蓬朱1,
  5. 杨元2,
  6. Wei-Ping周2,
  7. 金叮3,
  8. Chen-Kai黄4,
  9. 卫崔1,
  10. 陈虹叮1,
  11. 鑫张1,
  12. 本卢5,
  13. Wei-Fen谢1
  1. 1美国胃肠病学,长征医院,第二军医大学,上海,中国
  2. 2第三部门肝手术,东方肝胆的外科医院,第二军医大学,上海,中国
  3. 3国际合作实验室东方肝胆的外科研究所的信号转导,东方肝胆的外科医院,第二军医大学,上海,中国
  4. 4美国胃肠病学,南昌大学第一附属医院,南昌,中国
  5. 5部生化制药、药学院,第二军医大学,上海,中国
  1. 对应到Wei-Fen谢教授,胃肠病学,长征医院、第二军医大学,20003年上海世博会,中国;weifenxie在}{medmail.com.cn;鑫张教授,胃肠病学,长征医院、第二军医大学,上海200003,中国;zhang68在}{hotmail.com;陆教授本、生化制药、制药、学院第二军医大学,200433年上海中国;binlu在}{smmu.edu.cn

文摘

客观的自噬参与肝细胞癌(HCC)的进展和索拉非尼肝癌细胞的耐药性。我们调查的可行性感光调节mir - 541肝癌细胞索拉非尼——发起microRNA-autophagy轴。

设计获得,丧失化验进行评估mir - 541恶性性质的影响和人类肝癌细胞自噬。自噬被西方墨点法LC3的量化,透射电子显微镜分析和共焦显微镜扫描mRFP-GFP-LC3记者构造。荧光素酶记者进行了化验证实mir - 541的目标。建立了肝细胞癌异种移植肿瘤分析mir - 541的作用sorafenib-induced杀伤力。

结果mir - 541的表达在人类肝细胞癌组织表达下调,与恶性肿瘤临床病理的表型,复发和肝细胞癌患者的生存。mir - 541抑制了增长、转移和肝癌细胞自噬在体外和体内。预测软件和荧光素酶记者化验确定autophagy-related基因2 (ATG2A)和Ras-related蛋白质Rab-1B (RAB1B)作为mir - 541的直接目标。符合mir - 541模拟的影响,抑制ATG2A或RAB1B抑制肝癌细胞的恶性表型和自噬。此外,siATG2A和siRAB1B部分逆转恶性的增强性能和在mir - 541肝癌细胞介导的自噬抑制剂。更有趣的是,更高的mir - 541表达预测更好的应对索拉非尼治疗,和mir - 541和索拉非尼进一步抑制肝癌细胞的生长在体内较单一治疗。

结论失调的mir - 541 atg2a / RAB1B轴中起关键作用索拉非尼治疗的病人的反应。操纵这个轴HCC患者可能受益的生存,尤其是在高度追求的上下文策略来消除耐药性。

  • 肝细胞癌
  • 耐药性
  • 分子致癌作用

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2019 - 318830

来自Altmetric.com的统计

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    本研究的意义

    已经知道这个问题是什么?

    • 先进的肝细胞癌(HCC)的预后仍不满意,有效的治疗选择仍然是有限的。

    • 索拉非尼是目前一线系统目标药物批准用于治疗晚期肝癌,但治疗抵抗减少其临床医学方面的好处。

    • 自噬参与肝细胞癌的进展和肝癌的抗索拉非尼。

    有什么新发现吗?

    • mir - 541在人类肝细胞癌组织和相关donwregulated恶性临床病理的表型,复发和肝细胞癌患者的生存。

    • mir - 541抑制肝癌细胞的恶性属性和自噬在体外和体内的两个autophagy-associated基因表达下调,autophagy-related基因2和Ras-related蛋白质Rab-1B,作为癌基因和积极的自噬在HCC的调节器。

    • mir - 541高表达患者受益于索拉非尼治疗,和overexpressing mir - 541强化索拉非尼的敏感性肝癌细胞在体外和体内。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 方法设计来操纵mir - 541 mediatd自噬的调节异常轴可能提高患者对索拉非尼治疗的反应和降低肝癌复发。

    介绍

    根据最近的全球癌症统计,肝癌被评为第六届最常见的诊断癌症和第四2018年全世界癌症相关死亡的主要原因。1 2肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌,严重威胁人类的健康。3肝细胞癌的预后仍不满意,因为它往往是诊断处于高级阶段。索拉非尼,口服multikinase抑制剂,目前一线系统目标批准用于治疗晚期肝癌的药物。4然而,副作用和耐药性降低肝癌患者索拉非尼的临床益处。5索拉非尼阻力,因此,探索机制研究,旨在为HCC开发新型治疗靶点,以改善其预后非常重要。

    自噬是一种进化保守的真核生物细胞回收细胞器和细胞过程组件接触压力。6这个过程是由一群发起和严格的监管autophagy-related基因(atg)。6自噬已被证明在许多固体肿瘤特异表达,有证据表明癌细胞依赖于自噬在缺氧、营养差的微环境提供营养和能量。7越来越多的证据显示,自噬也起到多方面的角色在肝细胞癌,包括促进tumourigenesis,维持肿瘤生长,提高转移和编排适应性对索拉非尼治疗的反应。8 9因此,设计方法操纵自噬通过调节atg代表一个有前途的治疗肝细胞癌的策略。然而,atg失调及其上游HCC的监管机构仍不完全定义。

    小分子核糖核酸(microrna)影响人类癌症的自噬的每个阶段,包括肝细胞,通过调节atg。10 11如图所示在先前的研究中,mir - 375抑制自噬通过瞄准autophagy-related基因7 (ATG7)和降低肝癌细胞在缺氧条件下的可行性。12值得注意的是,microrna - 142 - 3 - p autophagy-related目标基因5 (ATG5)和autophagy-related蛋白质等16个1自噬和使敏感的灭活肝细胞索拉非尼。13这些研究证实microrna atg有重要的调控作用,和失调的microrna针对atg可能引起索拉非尼阻力,促进肝癌细胞的生长。

    印delta-like 1同族体(DLK1) -iodothyronine deiodinase 3 (DIO3)地区在人类染色体14恋人相遇,其中包含最大的microrna的集群,已被确定为一个癌症相关的基因区域。14日15如图所示在我们之前的研究中,核factor-4α肝细胞的转录调节mir - 379 - 656集群DLK1 / DIO3地区和mir - 134,位于这个集群,作为一个肿瘤抑制基因在肝癌细胞功能。16根据我们的初步数据,mir - 541,另一个microrna在这个集群,显著抑制肝癌细胞的增殖,16但mir - 541在肝癌中的作用尚未完全阐明。特别是,临床意义和mir - 541对自噬的影响没有被探索。在这项研究中,mir - 541抑制肝癌的恶性肿瘤,增强肝细胞癌的敏感性细胞基因表达下调两个autophagy-associated索拉非尼:autophagy-related基因2 (ATG2A)和Ras-related蛋白质Rab-1B (RAB1B),这表明逆转的放松管制mir - 541 ATG2A和RAB1B轴可能是肝癌治疗的新策略。

    方法

    人体组织

    人类肝脏组织样本取自病人手术切除和被专用诊断病理学家东方肝胆的外科医院(上海,中国)在获得书面知情同意。

    RNA提取和实时PCR

    从细胞或组织总RNA分离使用试剂盒(豆类,大连,中国)。microrna的表达测定采用凸环microrna存在Starter Kit (RiBio,广州,中国)。各种mrna的表达检测使用SYBR Green-based实时PCR(豆类)和ABI StepOne实时PCR检测系统(技术)。使用2基因表达进行了分析−ΔΔCT方法。引物序列中列出在线补充表1。

    试剂和转染

    小干扰rna (siRNAs), microrna的模仿和双链-控制(数控),和microrna的抑制剂和单链急于控制(数控抑制剂)从GenePharma购买(上海GenePharma有限公司、上海、中国)。所有序列中列出在线补充表2。mir - 541模拟和mir - 541抑制剂用于过表达或抑制mir - 541肝癌细胞中表达后验证了实时PCR分析mir - 541的表达。所有的核,microrna的模仿,microrna的抑制剂及其控制转染到细胞使用Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的指示。

    动物模型

    评估的效果的tumourigenicity mir - 541肝癌细胞,yy(1×10 - 8103细胞6)感染了腺病毒表达mir - 541 (ad - mir - 541)或控制Ad-Max病毒感染复数的100人皮下移植到两侧翼BALB / c裸小鼠。肿瘤的形成是估计如前所述。15检测的效果mir - 541 orthotopically植入肝细胞癌肿瘤的生长,yy(1×10 - 8103细胞6)感染了慢病毒表达mir - 541或控制病毒lentivector pCDH (LV-PCDH)和yy - 8103细胞(1×106),而不慢病毒治疗(空白)orthotopically注入肝荚膜的非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺气(NOD / SCID小鼠。肿瘤之间的质量比mir - 541 overexpressing组和对照组以及空白组移植后14天。

    yy(1×10 - 8103细胞6)稳定表达荧光素酶和感染Ad-Max或广告- mir - 541通过尾静脉注入NOD / SCID小鼠探索mir - 541在转移的影响。老鼠监控使用IVIS200成像系统(美国马萨诸塞州卡尺生命科学、数据)每周和牺牲细胞移植后4周。

    建设的记者和荧光素酶检测

    完整的3′未翻译区(3′UTR)人类ATG2A或RAB1B subcloned入psiCHECK2向量(Promega,麦迪逊,威斯康辛州,美国)构建荧光素酶报告质粒窝藏ATG2A 3′UTR或RAB1B 3′UTR。引物序列中列出在线辅助表3。3′utr人类ATG2A或RAB1B突变mir - 541结合位点被北京基因组研究所合成和subcloned psiCHECK2向量。荧光素酶化验使用Dual-Luciferase记者进行测定(Promega)光度计(美国BioTek协同4混合标)。

    透射电子显微镜(TEM)

    细胞治疗与指定的试剂和固定2.5%戊二醛含有0.1 mol / L钠甲次砷酸盐。样本与1%锇酸固定,紧随其后的是脱水与乙醇和环氧丙烷浓度梯度的增加。样品被嵌入,切成50 nm部分和沾3%醋酸双氧铀及柠檬酸铅。图像获得使用jem - 1200电子显微镜(JEOL、东京、日本)。六个随机领域的低功耗领域TEM观察自噬体。自噬体的平均数量在每个字段计算Ad-Max组和广告- mir - 541组,分别。

    检测自噬细胞使用LC3-RFP-GFP记者构造

    从Hanbio mRFP-GFP-LC3B腺病毒结构获得了(自噬-睡觉- gfp rfp lc3b - 1000, Hanbio,上海,中国。荧光的构建依赖于酸性pH值之间的差异自吞噬泡和中立的自噬小体,和红/绿(黄色)或红色荧光使研究人员监控病情恶化的自噬流量。简单,细胞感染了腺病毒使用共焦荧光显微镜成像。

    治疗的老鼠与索拉非尼的组合和mir - 541

    PLC /脉冲重复频率/ 5细胞(2×106)或yy - 8103细胞(1×106的右翼)皮下接种BALB / c裸小鼠。当达到肿瘤平均体积约为150 - 200毫米3小鼠随机分为4组(每组5小鼠在实验中与PLC /脉冲重复频率/ 5和10每小组在实验老鼠yy - 8103细胞),收到一封intratumour注入Ad-Max或广告- mir - 541 (2×109空斑形成单位(pfu) /注入每2天)结合的腹腔内注射二甲亚砜(DMSO)或索拉非尼(30毫克/公斤/天)。老鼠牺牲,肿瘤切除和体重。肿瘤体积计算使用以下方程:体积=长度×(宽度)2×π/ 6。

    统计分析

    所有使用SPSS V.22.0软件进行统计分析。比较两组之间的数据与正态分布进行使用学生的t。否则,使用非参数Mann-Whitney比较进行测试或Wilcoxon配对测试。一个执行kaplan - meier分析和生存率较比较不同组之间的生存概率。的χ2测试是用来评估统计学意义的表达差异mir - 541和肝细胞癌复发的患者。统计测试是正反和p值小于0.05被认为是具有统计学意义。

    材料和方法的详细描述中在线补充材料和方法。

    结果

    Downregulation mir - 541与较短的生存和更大的肝细胞癌患者复发

    我们第一次搜索www.kmplot.com对患者的预后价值mir - 541肝癌。mir - 541水平较低与更短的HCC患者的总生存期(OS) (图1一个)。我们进一步验证mir - 541表达的临床意义在HCC使用实时PCR检查mir - 541表达120年成对人类原发性肝癌及其附近non-tumourous肝组织。mir - 541的表达明显减少肿瘤组织与周围non-tumour肝组织(图1 b和在线辅助图S1, B)。Downregulation mir - 541被观察到在大多数情况下(图1 c和在线辅助图S1 C和D)。有趣的是,mir - 541的差别临床病理的分析表明,对这些基因在人类肝细胞癌明显与积极的临床和病理特征包括低分化(p = 0.042),大的肿瘤大小(p = 0.030),先进tumour-node-metastasis (TNM)阶段(p = 0.035)和不完整或缺失的存在肿瘤封装(p = 0.045;在线辅助表4)。与结果一致www.kmplot.com肝癌样品,mir - 541水平较低也与更短的操作系统相关的肝细胞癌患者(图1 d)。此外,mir - 541低表达组的复发率明显大于mir - 541高表达组(48.4%比27.2%,p = 0.029;图1 e)。至关重要的是,我们证实,mir - 541水平低与短recurrence-free生存(RFS) (图1 f)。基于这些数据,mir - 541表达与临床相关癌症的复发和患者的结果。

    miR-541 is associated with cancer recurrence and patient outcomes. (A) A Kaplan-Meier analysis of the data in www.kmplot.com was used to determine the overall survival (OS) of patients with high miR-541 expression and patients with low miR-541 expression, followed by the log-rank test. (B) Statistical analysis of miR-541 expression in 120 paired primary hepatocellular carcinoma (HCC) and adjacent non-tumourous liver tissues from patients, with medians of 2.22×10−6 and 3.02×10−6, respectively; p<0.001, Wilcoxon matched pairs test. (C) Real-time PCR analysis of miR-541 expression in 120 pairs of HCCs (T) and peritumour normal tissues (N). (D) OS was compared between 106 patients with low and high miR-541 expression for whom complete follow-up data were available using the log-rank test. The cut-off value to separate patients with high and low miR-541 expression was 1. (E) Statistical analyses were conducted based on miR-541 expression and the recurrence rate in 106 patients using the cut-off value for miR-541 expression defined above with the χ2 test. (F) Recurrence-free survival (RFS) was compared between 106 patients with HCC presenting low or high miR-541 expression in 106 patients with HCC based on the cut-off value of 1 using the log-rank test.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    mir - 541与癌症的复发和患者的结果。(一)kaplan meier对数据的分析www.kmplot.com被用来确定患者的总生存期(OS)高mir - 541表达与患者低mir - 541表达,其次是生存率较。(B)统计分析120年mir - 541表达的成对的原发性肝细胞癌(HCC)和邻近non-tumourous从病人肝组织,中位数为2.22×10−6和3.02×10−6分别;p < 0.001, Wilcoxon配对测试。(C)实时PCR分析mir - 541表达的120对肝癌(T)和peritumour正常组织(N) (D)操作系统之间的比较106例低和高mir - 541表达为谁使用生存率较完整的随访数据。截止值分离患者高低mir - 541表达是1。(E)统计分析进行了基于mir - 541表达和106名患者的复发率使用mir - 541的截止值表达式χ上面定义2测试。(F) Recurrence-free生存(RFS)之间的比较106例肝细胞癌患者呈现低或高mir - 541 106例肝细胞癌患者表达截止值的基础上使用生存率较1。

    然后我们发现mir - 541的表达在初级人类肝细胞和肝癌细胞株。mir - 541水平显著降低在所有的五肝癌细胞系,检测相对于肝细胞(在线辅助图S2A)。此外,我们还从tumourous孤立tumourous细胞和癌症相关的成纤维细胞组织,肝细胞和peritumoural non-tumourous组织的成纤维细胞16肝癌患者。mir - 541的差别,对这些只是tumourous细胞中发现,相比与肝细胞肝癌的患者减少mir - 541表达组织(在线辅助图S2罪犯)。这些结果表明,mir - 541减少肝癌组织主要是归因于其tumourous细胞中表达下降。

    mir - 541抑制恶性肝癌细胞体外和体内的属性

    然后我们评估的影响mir - 541在不同恶性性质的人类肝癌细胞株体外使转染细胞mir - 541模拟或mir - 541缓蚀剂。mir - 541显著抑制扩散的过度表达,集落形成、迁移和入侵肝癌细胞体外(图2 a e和在线辅助图S3)。相比之下,mir - 541增加了抑制肝癌细胞的恶性表型(图2 a e和在线辅助图S4)。

    miR-541 suppresses the malignant properties of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo. (A) The proliferation of YY-8103 cells transfected with the miR-541 mimic or negative controls (NC; left panel) and cells transfected with the miR-541 inhibitor or NC (right panel) is shown. (B) Quantification of the results of the colony formation assay using YY-8103 cells transfected with the miR-541 mimic or NC (the left two columns) and cells transfected with the miR-541 inhibitor or NC (the right two columns). (C) The miR-541 mimic inhibited colony formation in agar, while inhibitor of miR-541 increased the formation of YY-8103 cell colonies in agar. (D) Migration and (E) invasion assays of YY-8103 cells transfected with the miR-541 mimic and NC or miR-541 inhibitor and NC. (A)–(E) Experiments were performed in triplicate and data are presented as means±SD. *P<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 using two-tailed Student’s t-tests. (F) Growth curve of xenografts derived from YY-8103 cells infected with Ad-miR-541 and Ad-Max, respectively. P<0.001 using the Wilcoxon matched pairs test. n=6 in each group. (G) Representative images and (H) weights of xenografts derived from YY-8103 cells infected with Ad-miR-541 and Ad-Max. The horizontal line indicates median value. P=0.003 using the Wilcoxon matched pairs test. n=6 in each group. (I) Images of the in situ luciferase signals in the organs of NOD/SCID mice transplanted with YY-8103 cells infected with Ad-Max and Ad-miR-541 at 4 weeks after inoculation. Red arrows indicate the in situ luciferase signals in the bones of mice, while yellow arrows indicate luciferase signals in the lungs. (J) Quantification of the numbers of the mice with metastatic tumours in the bones and lungs in the Ad-Max and Ad-miR-541 groups. (K) Representative images of H&E-stained sections of tissues from the bones (the left panel) and the lungs (the right panel) collected from Ad-Max-infected and Ad-miR-541-infected groups. Arrows indicate tumour foci in the bones and lungs. Scale bar, 200 µm.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    mir - 541抑制肝细胞癌恶性特征的细胞在体外和体内。(A)的增殖yy - 8103细胞转染mir - 541模拟或消极的控制(数控;左面板)和细胞转染mir - 541抑制剂或数控(右面板)。(B)量化结果的集落形成试验使用yy - 8103细胞转染mir - 541模拟或数控(左边两列)和细胞转染mir - 541抑制剂或数控(正确的两列)。(C) mir - 541模拟抑制在琼脂集落形成,而mir - 541增加了形成的抑制剂在琼脂yy - 8103细胞的殖民地。(D)迁移和yy - 8103 (E)入侵检测细胞转染和mir - 541模拟数控或mir - 541抑制剂和数控。(一)——(E)的实验进行了一式三份和数据意味着±SD。* * * P < 0.05, P < 0.01, * * *使用双尾学生t P < 0.001。(F)异种移植来自yy - 8103细胞的生长曲线感染广告- mir - 541和Ad-Max,分别。P<0.001使用Wilcoxon配对测试。每组n = 6。(G)代表图像和(H)权重的异种移植来自yy - 8103细胞感染广告- mir - 541和Ad-Max。水平线表示中位数的值。P = 0.003使用Wilcoxon配对测试。每组n = 6。(我)原位荧光素酶的图像信号在NOD / SCID小鼠的器官移植yy - 8103细胞感染Ad-Max和广告- mir - 541在接种后4周。红色箭头指示原位荧光素酶信号在老鼠的骨骼,而黄色箭头表示荧光素酶信号在肺部。(J)量化的数字与转移性肿瘤的老鼠骨头和肺Ad-Max和广告- mir - 541组。(K)的代表图像H&E-stained部分骨骼的组织(左侧面板)和肺(右面板)从Ad-Max-infected收集和广告- mir - 541感染组。 Arrows indicate tumour foci in the bones and lungs. Scale bar, 200 µm.

    miR-541 inhibits the autophagy of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo. (A) Western blot analysis of LC3 expression and p62 expression in YY-8103 and PLC/PRF/5 cells transfected with the miR-541 mimic and negative control (NC) or miR-541 inhibitor and NC. GAPDH was used as a loading control. (B) Immunohistochemical staining for LC3B and (C) p62 in subcutaneous xenografts from YY-8103 cell treated with Ad-miR-541 or Ad-Max. Scale bar, 100 µm. (D) Autophagosomes were observed in PLC/PRF/5 cells infected with Ad-Max or Ad-miR-541 under the transmission electron microscopy (TEM). Yellow arrows indicate the autophagosomes. Magnification, 1000× in the left panel and 2000× in the right panel. Scale bar, 5 µm in the left panel and 2 µm in the right panel. (E) Ad-miR-541 significantly reduced the number of autophagosomes as detected by the TEM. Graphical data denote means±SD. *P<0.05 using two-tailed Student’s t-tests. (F) Confocal images (the left panel) and statistical analysis (the right panel) of LC3 puncta in PLC/PRF/5 cells expressing mRFP-GFP-LC3 that were transfected with the NC or miR-541 mimic. Scale bar, 10 µm. (G) PLC/PRF/5 cells expressing mRFP-EGFP-LC3 were transfected with NC and the miR-541 inhibitor. Autophagosomes were observed under a confocal microscope. Scale bar, 10 µm. (F) and (G) One hundred to 150 cells from each group were counted and 3 independent experiments were performed. Graphical data denote means±SD. * P<0.05 using two-tailed Student’s t-tests.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    mir - 541抑制肝癌细胞的自噬在体外和体内。(A)免疫印迹分析LC3表达和p62表达yy - 8103和PLC /脉冲重复频率/ 5细胞转染和mir - 541模拟负控制(数控)或mir - 541缓蚀剂和数控。GAPDH是用作加载控制。(B)免疫组织化学染色LC3B和(C)皮下异种移植中p62 yy - 8103细胞- mir - 541或Ad-Max对待广告。µm酒吧,规模100人。(D)自噬小体被观察到在PLC /脉冲重复频率/ 5细胞感染Ad-Max或广告- mir - 541透射电子显微镜(TEM)。黄色箭头表示自噬小体。放大,在左侧面板和2000年1000××在右侧面板中。规模的酒吧,5µm左侧面板和2µm在右侧面板中。广告(E) - mir - 541显著降低TEM检测到的自噬小体的数量。 Graphical data denote means±SD. *P<0.05 using two-tailed Student’s t-tests. (F) Confocal images (the left panel) and statistical analysis (the right panel) of LC3 puncta in PLC/PRF/5 cells expressing mRFP-GFP-LC3 that were transfected with the NC or miR-541 mimic. Scale bar, 10 µm. (G) PLC/PRF/5 cells expressing mRFP-EGFP-LC3 were transfected with NC and the miR-541 inhibitor. Autophagosomes were observed under a confocal microscope. Scale bar, 10 µm. (F) and (G) One hundred to 150 cells from each group were counted and 3 independent experiments were performed. Graphical data denote means±SD. * P<0.05 using two-tailed Student’s t-tests.

    Identification of autophagy-related gene 2A (ATG2A) and Ras-related protein Rab-1B (RAB1B) as direct targets of miR-541. (A) and (B) Predicted sequential pairing of the target region and the parallel mutant sequences in the 3′UTR of ATG2A (A) and RAB1B (B) with miR-541 using the prediction programmes. Seed sequences are shown in red, and mutant sequences are shown in green. (C) Western blot analysis of ATG2A levels in hepatocellular carcinoma (HCC) cells transfected with the miR-541 mimic or negative control (NC). (D) Western blot analyses were performed in HCC cells transfected with miR-541 inhibitor or NC to detect RAB1B levels. (E) Effect of miR-541 on the ATG2A 3′UTR. luciferase reporter plasmids carrying the ATG2A 3′UTR (ATG2A), ATG2A 3′UTR with miR-541 target-sequence mutation 1 (ATG2A-mut1), ATG2A 3′UTR with target-sequence mutation 2 (ATG2A-mut2) and 3′UTR with both mutation 1 and mutation 2 (ATG2A-mut1+mut2) were cotransfected into HEK293T cells with the miR-541 mimic or NC. (F) Luciferase activity was measured in HEK293T cells transfected with the miR-541 mimics or NC. The luciferase reporters expressing the wild type or indicated mutant human RAB1B 3′UTRs were used. (E) and (F) *P<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 using two-tailed Student’s t-tests. Experiments were performed in triplicate and data are presented as means±SD. (G) ATG2A and (H) RAB1B levels were analysed in HCC tissues from patients with different levels of miR-541 using western blotting. (I) Levels of the ATG2A and (J) RAB1B mRNAs were negatively correlated with miR-541 levels in HCC samples. Spearman’s correlation coefficients were calculated.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    识别autophagy-related基因2 (ATG2A)和Ras-related蛋白质Rab-1B (RAB1B)直接mir - 541的目标。(A)和(B)预测目标区域的序列配对和并行突变序列的3′UTR ATG2A (A)和RAB1B和mir - 541 (B)使用预测项目。种子序列所示红色,突变序列所示绿色。(C)免疫印迹分析ATG2A水平与肝细胞癌(HCC)细胞转染mir - 541模拟或消极的控制(NC)。(D)免疫印迹分析和mir - 541肝癌细胞转染抑制剂或数控检测RAB1B水平。(E)的影响在ATG2A 3′UTR mir - 541。荧光素酶报告质粒携带ATG2A 3′UTR (ATG2A) ATG2A 3′UTR mir - 541目标序列突变1 (ATG2A-mut1) ATG2A 3′UTR与目标序列突变2 (ATG2A-mut2)和3′UTR突变突变1和2 (ATG2A-mut1 + mut2) cotransfected进HEK293T细胞mir - 541模拟或数控。(F)荧光素酶活性测定在HEK293T细胞转染mir - 541模拟或数控。荧光素酶记者表达野生型或表示变异人类RAB1B 3′utr。(E)和(F) * * * P < 0.05, P < 0.01, * * *使用双尾学生t P < 0.001。 Experiments were performed in triplicate and data are presented as means±SD. (G) ATG2A and (H) RAB1B levels were analysed in HCC tissues from patients with different levels of miR-541 using western blotting. (I) Levels of the ATG2A and (J) RAB1B mRNAs were negatively correlated with miR-541 levels in HCC samples. Spearman’s correlation coefficients were calculated.

    在肝癌皮下移植瘤模型,发现了异种移植的小鼠接受细胞感染Ad-Max早在接种后第四天,只有一个结节是观察到的老鼠接受细胞感染广告- mir - 541 (在线辅助图S5得了)。此外,肿瘤生长和肿瘤重量显著降低广告- mir - 541组(图2 f-h)。实时PCR分析显示,mir - 541水平显著增加广告- mir - 541组相比Ad-Max集团(在线辅助图S5D)。此外,慢病毒介导mir - 541超表达也显著减少肝癌的肿瘤原位模型中的质量,进一步证实mir - 541肝癌生长的抑制效应(在线辅助图S6)。

    我们也调查了mir - 541对肝癌转移的影响体内注射NOD / SCID小鼠luciferase-labelled yy - 8103细胞感染- mir - 541或Ad-Max广告。荧光素酶检测信号的骨头在5 9 Ad-Max组的老鼠,但是只有2 10广告- mir - 541组小鼠细胞移植后4周使用体外成像(图2 i, J)。同样,荧光素酶信号检测在肺部的3 9 Ad-Max组的老鼠,但是只有1的老鼠在广告- mir - 541组(图2 i, J)。组织学分析证实了小骨肿瘤病灶,肺的广告- mir - 541组(图2 k)。这些数据表明,mir - 541作为一个强大的肿瘤抑制基因在肝细胞癌。

    mir - 541抑制自噬在肝癌细胞在体外和体内

    我们接下来检查mir - 541对肝癌细胞自噬的影响。LC3的可溶性形式的转换(LC3 I)投石击毙,autophagosome-associated形式(LC3 II)自噬的一个特点。6P62是一个自噬受体积累在细胞自噬流量是抑制。6mir - 541超表达降低的水平LC3 II和增强的水平在肝癌细胞中P62 (图3一)。相比之下,mir - 541抑制增加LC3 II的水平和减少P62表达式在肝癌细胞(图3一)。免疫化学染色显示少LC3积极的肿瘤细胞和多P62广告- mir - 541阳性肿瘤细胞治疗皮下异种移植相比Ad-Max-treated异种移植(图3 b, C)。TEM显示广告,mir - 541肝癌细胞的自噬小体数量减少(图3 d, E)。此外,自噬流量的速度,说明了live-cell成像使用mRFP-GFP-LC3记者构造,显著抑制了mir - 541超表达和增强mir - 541损耗(图3 f, G)。

    ATG2A和RAB1B mir - 541的直接目标

    我们进行了生物信息学分析识别假定的候选人mRNA mir - 541的目标,自噬和探索mir - 541抑制自噬的机制。所有六个microrna的预测计划,包括Targetscan (http://www.targetscan.org/),miRDB (http://mirdb.org/)microRNA.org (http://www.microrna.org/),戴安娜MICROT (http://diana.cslab.ece.ntua.gr/),TARGETMINER (http://www.isical.ac.in/)和RNA22 (https://cm.jefferson.edu/rna22v1.0-homo_sapiens/),表示miRNA-target mir - 541之间的相互作用和ATG2A和RAB1B (图4 a, B和在线辅助图S7A),自噬功能重要的调控作用。有趣的是,ATG2A RAB1B mrna和蛋白的水平是降低肝癌细胞的异位表达mir - 541 (图4 c, D和在线辅助图S7B, Cmir - 541)和增加的抑制剂(图4 c, D和在线辅助图S7D, E)。实时PCR分析还显示减少ATG2A和RAB1B水平Ad-miR541-treated yy - 8103细胞的异种移植(在线辅助图S7F, G)。使用microrna的预测计划,我们确定了两个结合位点预测mir - 541的3′UTR ATG2A mRNA,和四个潜在的结合位点mir - 541的3′UTR RAB1B mRNA (图4 a, B)。符合我们的预测,mir - 541超表达下降的荧光素酶活动构造包含野生型ATG2A RAB1B 3′utr,而点突变的靶序列的3′utr减少mir - 541在荧光素酶的影响的活动记者分析,表明这两个基因表示的直接目标mir - 541 (图4 e, F)。此外,mir - 541水平的增加伴随着ATG2A和RAB1B蛋白质的表达减少,免疫印迹和immumohistochemical染色发现,在人类肝癌样本(图4 g, H和在线辅助图S8A-C)。此外,ATG2A和RAB1B的水平负相关,mir - 541水平肝癌样本(图4 i, J和在线辅助图S8D和E)。

    ATG2A和RAB1B起到致癌作用,促进肝癌细胞自噬

    到目前为止,ATG2A的真实角色和RAB1B HCC是未知的。调查潜在的分子机制,mir - 541对其抗肿瘤的效果,我们首先检查这两个基因在肝细胞癌患者的预后价值www.kmplot.com。生存曲线显示之间的关联的高表达ATG2A RAB1B mrna和预后较差,这是与mir - 541的临床意义(图5 a, B)。我们下一个调查其影响使用siRNAs针对ATG2A (siATG2A)和RAB1B (siRAB1B) (在线辅助图S9A-D)。结果表明,siATG2A siRAB1B抑制增殖,肝癌细胞的集落形成、迁移和入侵(图5我和在线辅助图9 eg)。此外,siATG2A和siRAB1B LC3 II的水平降低,增加P62表达式在肝癌细胞(图5 j)和阻塞的自噬小体合成(图5 k, L)。基于这些结果,我们得出这样的结论:ATG2A RAB1B是自噬在肝细胞癌的致癌基因和积极的调节器。

    Reductions in autophagy-related gene 2A (ATG2A) and Ras-related protein Rab-1B (RAB1B) expression inhibit the malignant behaviours and autophagy of hepatocellular carcinoma (HCC) cells. (A) The Kaplan-Meier analysis was used to determine the overall survival (OS) of patients with high or low expression of ATG2A in www.kmplot.com, followed by the log-rank test. (B) Data from www.kmplot.com revealed a correlation between high RAB1B expression and a poor OS of patients with HCC. (C) siATG2A suppressed the proliferation of YY-8103 cells and (D) PLC/PRF/5 cells. (E) Proliferation of YY-8103 cells and (F) PLC/PRF/5 cells transfected with siRAB1B or negative control (NC). (G) Downregulation of ATG2A and RAB1B inhibited the colony formation abilities of YY-8103 cells and PLC/PRF/5 cells. (H) Migration was assessed in YY-8103 cells and PLC/PRF/5 cells transfected with NC, siATG2A and siRAB1B using transwell assays. (I) Invasion of YY-8103 cells and PLC/PRF/5 cells transfected with NC, siATG2A and siRAB1B. (C)–(I) *P<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 using two-tailed Student’s t-tests. Experiments were performed in triplicate and data are presented as means±SD. (J) Western blot analysis of LC3I and LC3II levels as well as p62 level in YY-8103 cells and PLC/PRF/5 cells transfected with NC, siATG2A and siRAB1B. (K) and (L) Confocal images (the left panel) and statistical analysis (the right panel) of LC3 puncta in PLC/PRF/5 cells expressing mRFP-GFP-LC3 that were transfected with siNC or siATG2A (K) and siNC or siRAB1B (L). Scale bar, 10 µm.*P<0.05, using two-tailed Student’s t-tests. Experiments were performed in triplicate and data are presented as means±SD
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    减少autophagy-related基因2 (ATG2A)和Ras-related蛋白质Rab-1B (RAB1B)表达抑制恶性行为和肝细胞癌(HCC)细胞的自噬。(一)kaplan meier分析是用来确定患者的总生存期(OS) ATG2A的高或低表达www.kmplot.com,其次是生存率较。(B)的数据www.kmplot.com显示相关性高RAB1B表达式和一个贫穷的OS的肝癌患者。(C) siATG2A yy - 8103细胞的增殖抑制和(D) PLC /脉冲重复频率/ 5细胞。(E) yy - 8103细胞的增殖和PLC /脉冲重复频率(F) / 5细胞转染siRAB1B或负控制(数控)。ATG2A和RAB1B差别(G)对这些抑制yy - 8103细胞的集落形成能力和PLC /脉冲重复频率/ 5细胞。(H)迁移评估在yy - 8103细胞和PLC /脉冲重复频率/ 5细胞转染与数控siATG2A并使用transwell siRAB1B化验。(我)入侵yy - 8103细胞和PLC /脉冲重复频率/ 5细胞转染与数控siATG2A siRAB1B。(C) -(我)* * * P < 0.05, P < 0.01, * * *使用双尾学生t P < 0.001。实验进行了一式三份和数据意味着±SD。(J)免疫印迹分析LC3I LC3II水平以及p62水平yy - 8103细胞和PLC /脉冲重复频率/ 5细胞转染与数控siATG2A siRAB1B。(K)和(L)共焦图像(左面板)和统计分析(右面板)LC3 puncta PLC /脉冲重复频率/ 5细胞转染的表达mRFP-GFP-LC3 siNC或siATG2A (K)和siNC或siRAB1B (L)。规模酒吧,10µm。* P < 0.05,使用双尾学生的t。 Experiments were performed in triplicate and data are presented as means±SD

    mir - 541抑制和自噬在肝癌的发展表达下调ATG2A RAB1B

    一系列救援化验是由cotransfecting mir - 541缓蚀剂和siATG2A或siRAB1B进一步研究分子机制负责mir - 541肝癌抑制介导的。mir - 541缓蚀剂的影响增加扩散、迁移和入侵肝癌细胞在细胞转染和siATA2A大大降低和siRAB1B (图6 f)。重要的是,mir - 541的作用在促进自噬抑制剂也逆转了siATG2A和siRAB1B (图6 g H)。ATG2A和差别总的来说,对这些RAB1B至少在一定程度上有助于功能mir - 541对肝癌细胞的影响。

    Autophagy-related gene 2A (ATG2A) and Ras-related protein Rab-1B (RAB1B) mediate the effects of miR-541 on hepatocellular carcinoma (HCC). (A) siATG2A or (B) siRAB1B partially blocked the effects of miR-541 inhibition on the proliferation of HCC cells. (C) HCC cells were cotransfected with siATG2A, (D) siRAB1B or the siNC along with the miR-541 inhibitor or negative control (NC). Transwell assays were used to analyse the migration of these cells. (E) ATG2A or (F) RAB1B silencing partially inhibited the effects of miR-541 inhibition on promoting the invasion of HCC cells. (G) The effect of the miR-541 inhibitor on promoting autophagy was blocked by siATG2A and (H) siRAB1B, as assessed by confocal imaging (left) and the subsequent statistical analysis of LC3 puncta (right) in PLC/PRF/5 cells expressing mRFP-GFP-LC3. Scale bar, 10 µm. (A)–(H) *P<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 using two-tailed Student’s t-tests. Experiments were performed in triplicate and data are presented as means±SD.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    Autophagy-related基因2 (ATG2A)和Ras-related蛋白质Rab-1B (RAB1B)调解的影响在肝细胞癌(HCC) mir - 541。(一)siATG2A或(B) siRAB1B部分屏蔽的影响,mir - 541对肝癌细胞的增殖抑制作用。(C)肝癌细胞与siATG2A cotransfected, (D) siRAB1B siNC连同mir - 541或抑制剂或消极的控制(NC)。Transwell分析是用来分析这些细胞的迁移。(E) ATG2A或(F) RAB1B沉默部分抑制mir - 541抑制的影响促进肝癌细胞的入侵。(G) mir - 541的作用在促进自噬抑制剂被siATG2A (H) siRAB1B,所评估的共焦成像(左)和后续的统计分析LC3 puncta(右)在PLC /脉冲重复频率/ 5细胞表达mRFP-GFP-LC3。比例尺,10µm。(一)——(H) * * * P < 0.05, P < 0.01, * * *使用双尾学生t P < 0.001。实验进行了一式三份和数据意味着±SD。

    mir - 541强化sorafenib-induced死亡的肝细胞在体外和体内

    考虑阻力自噬在加重索拉非尼的至关重要的作用,然后,我们调查了mir - 541对肝癌细胞的敏感性索拉非尼。我们最初探索mir - 541表达的显著影响反应在肝细胞癌患者索拉非尼。kaplan meier生存分析的患者分层分组与低或高mir - 541的表达表明,肝癌患者呈现高mir - 541水平得益于索拉非尼的政府,虽然mir - 541低表达患者没有(图7)。此外,肝细胞转染和mir - 541模拟对索拉非尼比控制细胞更敏感,说明了减少50%抑制的浓度(IC50),而细胞转染mir - 541缓蚀剂对索拉非尼比控制细胞,增加显示的IC50 (图7中)。在符合mir - 541的影响,siATG2A siRAB1B也减少了索拉非尼的IC50在肝癌细胞(在线辅助图S10)。

    Synergistic effects of the combination of sorafenib and miR-541 on hepatocellular carcinoma (HCC) cells. (A) Overall survival rates of patients with HCC presenting low miR-541 levels (left) or high miR-541 levels (right), who were treated with or without sorafenib after surgical resection were compared using the Kaplan-Meier analysis. The cut-off value to separate patients with high and low miR-541 expression was the median of miR-541 in all the HCC tissues. (B) Dose–response curves of YY-8103 cells and (C) PLC/PRF/5 cells transfected with the miR-541 mimic or negative control (NC) and treated with sorafenib. Bars denote the SD, with n=3 for each treatment combination. (D) and (E) Dose–response curves of YY-8103 cells (B) and PLC/PRF/5 cells (C) transfected with the miR-541 inhibitor or NC and treated with sorafenib. (F) Tumours from mice with YY-8103 xenografts that received intratumour injections of Ad-miR-541 or Ad-Max combined with intraperitoneal injections of sorafenib or the DMSO vehicle. (G) Statistical analysis of tumour volumes and (H) weights in different groups, n=10 mice/group, non-parametric Mann-Whitney test. (I) Immunohistochemical staining for Ki-67, autophagy-related gene 2A (ATG2A) and RAB1B in different groups. Scale bar, 100 µm.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    协同效应的组合索拉非尼和mir - 541肝细胞癌(HCC)细胞。肝癌患者(A)的整体存活率呈现mir - 541含量低(左)(右)或高mir - 541水平,有或没有索拉非尼治疗后手术切除使用kaplan meier分析比较。截止值分离患者高低mir - 541表达的中位数mir - 541在肝细胞癌组织。(B) yy - 8103细胞的剂量反应曲线和(C) PLC /脉冲重复频率/ 5细胞转染mir - 541模拟或消极的控制(NC)和索拉非尼治疗。酒吧表示SD, n = 3为每个治疗组合。(D)和(E)剂量反应曲线的yy - 8103细胞(B)和PLC /脉冲重复频率/ 5和mir - 541 (C)转染细胞抑制剂或数控和索拉非尼治疗。(F)肿瘤与yy - 8103异种移植小鼠接受intratumour注射的广告- mir - 541或Ad-Max结合腹腔注射索拉非尼或DMSO车辆。(G)的统计分析肿瘤数量和权重(H)在不同的组,n = 10 /组小鼠,非参数Mann-Whitney测试。ki - 67 (I)免疫组织化学染色,autophagy-related基因2 (ATG2A)和RAB1B在不同的组。µm酒吧,规模100人。

    最后,我们评估治疗ad - mir - 541是否会加强索拉非尼对肝癌的影响。裸小鼠皮下移植与肝癌细胞和接收intratumour注射Ad-Max或广告- mir - 541,以及腹腔内注射索拉非尼或车辆DMSO溶液。广告- mir - 541和索拉非尼抑制生长,肿瘤的体积和重量(图7 f-h和在线辅助图S11)。值得注意的是,广告- mir - 541和索拉非尼的组合产生了协同效应,导致最大抑制肿瘤生长与对照组相比图7 f-h和在线辅助图S11)。实时PCR和原位杂交证实了upregulation mir - 541的广告- mir - 541异种移植治疗(在线辅助图S12)。免疫组织化学染色显示减少数量的ki - 67 -广告- mir - 541阳性肿瘤细胞治疗或sorafenib-treated肿瘤与Ad-Max-treated和DMSO-treated肿瘤相比,而广告的结合——mir - 541和索拉非尼进一步降低ki - 67水平(图7我和在线辅助图向)。此外,治疗ad - mir - 541或广告- mir - 541和索拉非尼的结合导致了不同的ATG2A和RAB1B表达减少,而索拉非尼治疗导致ATG2A表达增加,RAB1B与对照组相比(Ad-Max + DMSO) (图7我和在线辅助图向)。总的来说,抑制肝癌生长的索拉非尼被mir - 541增强,这是至少部分归因于其监管对ATG2A和RAB1B表达的影响。

    讨论

    为适应机制,激活自噬对肿瘤细胞是重要的生存条件下的营养不足。17众所周知,自噬中发挥着重要作用的发展阻力索拉非尼治疗肝癌。抑制自噬增强了肿瘤抑制索拉非尼对肝癌的影响。13 18 19因此,理想的anti-HCC代理应该同时抑制增殖和抑制自噬。12

    研究人员证实,mir - 541参与多种生理过程,包括心肌的发育和分化,20.成骨细胞,21神经元22和胰腺。23此外,mir - 541抑制前列腺癌的扩散24和肺癌,25这表明mir - 541可能作为肿瘤抑制microrna。然而,mir - 541的体内作用在肿瘤,包括肝癌、尚未报道,mir - 541对自噬的影响仍然是难以捉摸的。在目前的研究中,我们发现mir - 541抑制生长和转移,抑制肝癌细胞的自噬在体外和体内,表明mir - 541是一个强大和多才多艺的肿瘤抑制microrna在肝细胞癌。重要的是,mir - 541提升sorafenib-induced死亡的肝细胞在体外和体内。因此,我们得出结论,mir - 541可能是一个有前途的索拉非尼在肝癌治疗感光剂。

    ATG2A是atg本土化的自噬膜和表面的脂质滴,功能的形成早期autophagosomal膜和脂滴的大小和分布的规定。代谢途径几个atg,差别的对这些如Beclin ATG5, ATG7 ATG12,增加肿瘤细胞的抗癌药物的敏感性。29日然而,真实ATG2A对恶性肿瘤的影响,包括肝癌,尚不清楚。ATG2A是唯一调节ATG etoposide-treated海拉细胞,30.和一个缺乏ATG2A开关从接受cytoprotective海拉细胞和白血病细胞自噬细胞凋亡,31日表明ATG2A维持肿瘤细胞的生存。我们目前的研究显示,高水平的ATG2A与一个贫穷的OS的肝癌患者,和ATG2A沉默明显抑制肝癌细胞的恶性性质。此外,ATG2A mir - 541的是一个真正的目标,和mir - 541对肝癌的抑制作用部分归因于其监管影响ATG2A表达式。这些发现绝对支持ATG2A在肝细胞癌的致癌作用和建议ATG2A小说代表了另一个潜在的治疗肝癌的目标。

    RAB1B内质的所需是一小GTPase reticulum-to-Golgi泡贩运。32RAB1B需要自噬体形成,击倒RAB1B抑制自噬,也支持假设RAB1B函数作为autophagy-associated基因。32 33根据翟等的报告,34siRNAs针对RAB1B抑制结肠癌细胞生长和诱导细胞周期阻滞。RAB1B最近被证明是招募到高尔基体网络增强tumourigenic效应蛋白的分泌。35此外,RAB1B要么是过表达36或显示一个高频体细胞拷贝数变化的肝癌,37建议RAB1B在HCC的放松管制。然而,其在肝癌病理功能需要进一步的研究。在目前的研究中,超表达的RAB1B预测肝癌患者预后差,和siRAB1B抑制肝癌细胞的恶性表型。此外,RAB1B被认定为直接目标mir - 541和mir - 541对肝癌的影响做出了贡献。这些结果进一步证实RAB1B在肝细胞癌的致癌作用。

    已经评估microrna标志物预测肝癌的预后或药物反应。38-40具体来说,特定microrna的失调与整体存活率的差异或肝癌患者的无进展生存。15 38这里,mir - 541是经常与恶性肝癌中表达下调和相关临床病理的表型,可怜的总体生存和RFS,表明mir - 541可能代表一个预测肝癌的预后的新标志。有趣的是,microrna也已报预测HCC的索拉非尼的反应。39在两个研究小群sorafenib-treated肝癌患者,mir - 224和mir - 425 - 3 - p建立了候选标记预测患者的预后。41 42然而,作者无法排除这种可能性,这些microrna实际上是与患者的生存有关,但不是索拉非尼的反应,随着军团只包括sorafenib-treated病人。在目前的研究中,我们发现,mir - 541水平较高肝癌样本与更长的OS sorafenib-treated和sorafenib-untreated肝癌患者。然而,较低的人力资源mir - 541 sorafenib-treated患者高于没有索拉非尼治疗的患者(在线辅助图S14系列)。此外,进一步的分析表明,mir - 541水平高患者受益于索拉非尼政府表明mir - 541表达式可以预测患者对索拉非尼的回应。基于这些发现,mir - 541的测量时间均表达可能是一个有效的方法来预测患者对索拉非尼治疗的反应。更重要的是,与mir - 541索拉非尼的组合可能会产生有益的影响患者低mir - 541在肝癌组织的表达。

    总之,目前的研究突出了mir - 541在肝细胞癌的生物学意义和阐发先前未被发现的分子机制肝癌的进展。这些发现提供了三个新型治疗靶点和个性化治疗肝细胞癌预后标记。转化研究,提出了基于mir - 541参与测试和治疗干预措施将有利于肝细胞癌患者。

    确认

    本研究以前作为海报胃肠病学19国会的中国,27 - 29 2019年9月,在J挖Dis.2019和抽象;20 (1):4 - 67。

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    脚注

    • W-PX、J-PL J-FF和C-PZ共同第一作者。

    • W-PX、J-PL J-FF和C-PZ同样起到了推波助澜的作用。

    • 贡献者XZ W-PX,提单和W-FX获得资金和研究概念和设计;W-PX、J-PL J-FF、C-KH Y-LC C-HD导致数据的采集;W-PX C-PZ导致数据的分析和解释;W-PX进行统计分析;W-PX, XZ W-FX导致文稿的起草;YY W-PZ提供材料支持;JD提供了重要的修订手稿的重要知识内容;XZ、提单和W-FX监督这项研究。

    • 资金这项工作得到了国家自然科学基金(W-FX W-PX 81502077, 81530019, 81572377 XZ和81472283提单);上海市科学技术委员会(15431907100 W-FX);“陈光”项目(15 cg41)从上海市教育委员会和上海教育发展基金会。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 病人同意出版不是必需的。

    • 伦理批准所有的人类实验伦理委员会批准第二军医大学(上海,中国)。动物实验都是根据协议执行机构批准的动物保健和使用委员会第二军医大学。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

    • 数据可用性声明没有数据是可用的。