条文本

原始研究
基因变异的降低酒精相关性肝硬化患者发生肝细胞癌的风险:来自全基因组病例对照研究的结果
  1. Stephan Buch12
  2. 哈米什Innes3.4
  3. 菲利普·路德维格鲁茨5
  4. Hans Dieter Nischalke5
  5. Jens U马夸特6
  6. Janett费舍尔7
  7. 卡尔维斯8
  8. 乔纳斯Rosendahl9
  9. 阿斯特丽德马罗特1011
  10. Marcin Krawczyk1213
  11. 马库斯·卡斯珀12
  12. 弗兰克拉默特12
  13. Florian注视者14
  14. 阿恩特沃格尔15
  15. Silke Marhenke15
  16. 约翰·冯·Felden16
  17. 罗西尼沙玛17
  18. 斯蒂芬·拉胡尔·阿特金森17
  19. 安德鲁McQuillin18
  20. 雅各Nattermann5
  21. 克莱门斯Schafmayer19
  22. 安德烈因特网20.
  23. 基督教斯特拉斯堡5
  24. Rietschel玛塞拉21
  25. 海蒂•阿尔特曼22
  26. Stefan生气22
  27. 维拉Raghavan Thangapandi222
  28. 马里奥Brosch222
  29. 卡罗琳Lackner23
  30. 鲁道夫·E斯陶贝尔24
  31. 阿里Canbay25
  32. 亚历山大链接26
  33. 托马斯Reiberger27
  34. 这张Mandorfer27
  35. Georg Semmler27
  36. Bernhard史肯27
  37. 基督教Datz28
  38. 斯特凡诺罗密欧2930.
  39. 斯特凡诺Ginanni Corradini31
  40. 威廉吕西安·欧文32
  41. 乔安妮·R Morling33
  42. 因陀罗尼尔•古哈34
  43. 埃莉诺·巴恩斯35
  44. M Azim安萨里36
  45. 乔斯林Quistrebert36
  46. 卢卡·瓦伦蒂37
  47. 穆勒Sascha一38
  48. 玛莎伊冯·摩根39
  49. 让杜福尔40
  50. Jonel Trebicka41
  51. 托马斯·伯格42
  52. 皮埃尔Deltenre1011
  53. 塞巴斯蒂安•穆勒43
  54. Jochen Hampe222
  55. Felix Stickel4445
  1. 1医学院第一学系德累斯顿大学医院德累斯顿、德国
  2. 2德累斯顿再生疗法中心(CRTD)Technische Universität德累斯顿(德累斯顿工业大学)德累斯顿、德国
  3. 3.健康与生命科学学院格拉斯哥加里多尼亚大学健康和生命科学学院格拉斯哥、英国
  4. 4诺丁汉生物医学研究中心诺丁汉大学医院NHS信托诺丁汉、英国
  5. 5我系内科波恩大学波恩、德国
  6. 6医学院第一学系吕贝克大学人类医学吕贝克、德国
  7. 7消化和风湿病科,肝脏科莱比锡大学莱比锡、德国
  8. 8内科Krankenhaus萨勒姆海德堡、德国
  9. 9美国胃肠病学大学医院的哈雷哈雷、德国
  10. 10肠胃病与肝病科瓦杜瓦大学中心医院洛桑、瑞士
  11. 11印度国立大学那慕尔分校胃肠病和肝病科Université catholique de LouvainLouvain-la-Neuve、比利时
  12. 12萨尔大学医学中心二医学系萨尔州大学萨尔布吕肯、德国
  13. 13代谢性肝病实验室,普通、移植和肝脏外科,临床前研究中心华沙医科大学华沙、波兰
  14. 14Klinikum Rechts der Isar临床毒理学部门慕尼黑工业大学慕尼黑、德国
  15. 15消化内科,肝脏内科和内分泌内科汉诺威医学院汉诺威、德国
  16. 16内科汉堡埃本多夫大学医学中心汉堡、德国
  17. 17帝国学院汉默史密斯医院校园伦敦、英国
  18. 18《分子精神病学实验室伦敦大学学院伦敦、英国
  19. 19普通外科罗斯托克大学医学中心罗斯托克、德国
  20. 20.临床分子生物学研究所基尔大学基尔、德国
  21. 21曼海姆医学院中央精神健康研究所精神病学遗传流行病学系海德堡大学海德堡、德国
  22. 22医学院第一学系德累斯顿大学医院德累斯顿、德国
  23. 23病理研究所格拉茨大学格拉茨、奥地利
  24. 24内科格拉茨大学格拉茨、奥地利
  25. 25内科Ruhr-Universitat波鸿波鸿、德国
  26. 26肠胃病、肝病和传染病科奥托·冯·格里克马格德堡大学马格德堡、德国
  27. 27内科消化肝脏科维也纳医科大学维恩、奥地利
  28. 28奥伯恩多夫综合医院内科萨尔茨堡巴拉塞尔苏斯医科大学萨尔斯堡、奥地利
  29. 29分子与临床医学系哥德堡大学医学研究所,萨尔格伦斯卡学院,瓦伦堡实验室哥德堡、瑞典
  30. 30.临床营养组,内科和外科科学部大希腊卡坦扎罗大学Catanzaro、意大利
  31. 31转化与精准医学系消化病学研究室罗马大学罗马、意大利
  32. 32微生物学诺丁汉大学诺丁汉、英国
  33. 33流行病学和公共卫生司诺丁汉大学诺丁汉、英国
  34. 34诺丁汉消化疾病国家卫生研究所生物医学研究单位大学医院诺丁汉、英国
  35. 35纳菲尔德医学院牛津大学牛津大学、英国
  36. 36Peter Medawar病原体研究大楼,纳菲尔德医学系和牛津国立卫生研究所生物医学研究中心牛津大学牛津大学、英国
  37. 37内科和代谢性疾病IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico基金会米兰、意大利
  38. 38外科学系Hirslanden Klinik Beau-Site伯尔尼、瑞士
  39. 39皇家自由大学医学部伦敦大学学院肝脏和消化健康研究所伦敦、英国
  40. 40生物医学研究部伯尔尼大学伯尔尼、瑞士
  41. 41消化病学,肝病学,内分泌学和临床感染学明斯特大学明斯特、德国
  42. 42莱比锡大学医学中心医学部肝脏科莱比锡大学莱比锡、德国
  43. 43塞勒姆医疗中心,胃肠病和肝病科海德堡大学海德堡、德国
  44. 44肠肠肝病科苏黎世大学苏黎世、瑞士
  45. 45Hirslanden Klinik Beau-Site伯尔尼、瑞士
  1. 对应到德累斯顿大学医院第一医学系Stephan Buch医生,德累斯顿01307德国;Stephan.buch在{}uniklinikum-dresden.de

摘要

客观的肝细胞癌(HCC)常发生在酒精相关肝硬化患者中,年发病率高达2.5%。一些宿主遗传风险因素已被确定,但不能解释发生的大部分差异。本研究旨在确定酒精相关肝硬化患者HCC发生的新易感位点。

设计从德国、奥地利、瑞士、意大利和英国招募的酒精相关肝硬化和HCC患者(n= 1214例)和无HCC的对照组(n=1866例)纳入了一项两阶段全基因组关联研究,采用病例对照设计。1520名滥用酒精但没有肝病证据的人被纳入验证队列,以控制与酒精滥用可能的关联效应。使用InfiniumGlobal筛选阵列(V.24v2, Illumina)和OmniExpress阵列(V.24v1-0a, Illumina)进行基因分型。

结果与变体rs738409的关联PNPLA3和rs58542926TM6SF2在全基因组意义上证实了先前与酒精相关肝硬化患者HCC风险增加相关的基因。一种新的基因座rs2242652(A)(端粒酶逆转录酶)也与肝癌风险的降低相关,在联合meta分析中,具有全基因组显著性(p=6.41×10−9, OR=0.61 (95% CI 0.52 ~ 0.70)。在对性别、年龄、体重指数和2型糖尿病进行校正后,这种保护联系仍然显著(p=7.94×10)−5, OR=0.63 (95% CI 0.50 ~ 0.79)。rs2242652(A)的运输与白细胞端粒长度增加有关(p=2.12×10−44).

结论本研究识别了rs2242652作为一种新的保护因子在酒精相关肝硬化患者的HCC。

  • 肝细胞癌
  • 遗传多态性

数据可用性声明

根据合理的要求提供数据。

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这是一篇开放获取的文章,按照创作共用署名4.0未移植(CC BY 4.0)许可发布,该许可允许其他人复制、重新发布、混合、转换和基于此作品的任何目的,只要原始作品被正确引用,提供许可证链接,并说明是否进行了更改。看到的:https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

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关于这个问题,我们已经知道了什么?

  • 肝细胞癌(HCC)是肝脏最常见的原发性恶性肿瘤,每年在全世界造成约0.8万人死亡。大多数酒精相关hcc发生在已确诊的酒精相关肝硬化(ArC)患者中。

  • 高龄、男性、肥胖和2型糖尿病是ArC患者发生HCC的危险因素。

  • 只有三个基因位点-PNPLA3TM6SF2而且WNT3A-WNT9A迄今为止,在全基因组意义上,与酒精相关肝癌的发生有关。其他风险位点可能存在。

新的发现是什么?

  • 我们鉴定了rs2242652种系变异作为ArC中HCC发展的一个新的易感位点。

  • 具体来说,rs2242652 A等位基因与ArC患者发生HCC的风险降低相关。

  • rs2242652的运输与发生ArC的风险无关。

在可预见的未来,它会对临床实践产生怎样的影响?

  • 探索TERT变异的功能意义可以为ArC患者的HCC发病机制提供重要的见解。

  • ArC患者的基因图谱可能为HCC筛查计划提供信息。

简介

肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的原发性肝脏恶性肿瘤,每年造成约80万人死亡。1全球HCC发病率正在上升,到2025年可能超过每年100万例。2酒精相关肝病(ArLD)是欧洲和北美HCC的主要潜在病因。3 4大多数酒精相关的HCC发生在已确定肝硬化的患者中。队列研究表明,在专科护理中心就诊的酒精相关肝硬化(ArC)患者中,HCC的累积发生率每年接近2.5%。3 4ArC患者发生HCC的临床危险因素包括老年、男性、2型糖尿病和肥胖2个5但只能解释HCC发生的全部变异性中的一小部分。6 7

近年来,人们的兴趣集中在通过候选基因关联研究来解剖HCC的潜在宿主遗传学。在迄今进行的研究中,编码patatin样磷脂酶结构域的基因座含有3 (PNPLA3;Rs738409)和跨膜6超家族成员2 (TM6SF2;rs58542926)被证实会增加ArC患者发生HCC的风险,8而位点rs72613567:TA在羟甾体17- β脱氢酶13 (HSD17B13)和rs429358:C在载脂蛋白E (APOE),被发现可以降低风险。9 - 11由于这些基因的产物参与脂质转换和加工,因此同样的基因座也调节非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者发生肝癌的风险就不足为奇了。12

目前确定的与ArC中HCC风险相关的变异只占遗传风险的一小部分,这表明存在额外的遗传调节剂。7 8此外,迄今确认的遗传风险位点与被认为对肝癌发生至关重要的基因无关。13要确定这些额外的、潜在的肝癌发生的基因调节剂,需要进行大规模的全基因组关联研究(GWASs),在这些研究中,将ArC患者定义为伴HCC的ArC患者,而对照组为无HCC证据的ArC患者。这些定义对于检测与肝癌发生本身有直接分子联系的危险位点至关重要,而不是与酒精相关的脂肪变性、炎症或纤维化的发展有直接分子联系。

在ArLD的HCC的欧洲GWAS,虽然不符合这个确切的设计,但最近由Trépo进行14在他们的发现分析中,将775例HCC病例(80%伴有F3/F4纤维化)与1332例非HCC对照(94%伴有F3/F4纤维化)进行比较,发现在W附近的rs708113:T等位基因位点之间存在全基因组显著关联NT3A-WNT9A并降低了发生酒精相关肝癌的风险。14

他的研究目的是在ArC背景下对HCC患者进行GWAS,包括1066例病例和844例对照组,采用病例对照设计。

方法

病人群

德国/瑞士/奥地利酒精队列(发现队列)

ArC的诊断是基于长期、持续的酒精摄入史,女性至少每天40克,男性至少每天60克,并对肝组织进行组织学检查;或兼容历史、临床、实验室、放射学和内窥镜特征。如果患者有任何其他潜在的肝损伤原因,特别是如果他们乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、抗丙型肝炎IgG(抗丙型肝炎病毒(HCV) IgG)、抗核抗体(滴度>1:80)或抗线粒体抗体(滴度>1:40)阳性,血清铁蛋白水平升高,转铁蛋白饱和度为>50%,血清铜蓝蛋白<20 mg/dL (0.2 g/dL),血清α -1抗胰蛋白酶<70 mg/dL(13µmol/L),则被排除。肝癌的诊断是根据肿瘤组织的组织学检查,或基于使用多相CT或动态增强MRI获得的图像的标准15日16在线补充方法A).

英国酒精类队列(复制队列1)

英国生物银行(UKB)是一个大型生物医学数据库,包含了2006-2010年从英国招募的约50万中年人的前瞻性研究中获得的深度遗传和健康信息。17参与者的表现型很深,与英国医院的住院病人、癌症和死亡率登记有关。使用这个资源创建了一个嵌套的case-control数据集(n=860)。病例定义为入院符合ArC国际疾病分类10 (ICD10:K70.3)和HCC诊断(ICD10:C22.0或ICD9:155.0)的参与者。对照组为因ArC住院但无HCC诊断记录的参与者。分析仅限于英国白人血统的参与者。然后将这些嵌套病例对照数据与从伦敦皇家自由医院肝病中心招募的306例经组织学证实的ArC伴或不伴HCC的患者合并在一起18在线补充方法B).

德国和意大利酒精类队列(复制队列2)

复制队列包括来自波恩大学的238例ArC患者(42例伴有HCC)和来自米兰大学的72例ArC患者(36例伴有HCC)。

验证组

从德国精神科招募有酒精滥用史(AM)但无明显酒精相关肝损伤证据的患者(n=1080)。19日20来自德国海德堡(n=99)和英国伦敦(n=341)的肝脏病学中心18在线补充方法C).

基因分型和归责

发现一群

如前所述,使用从外周血样本中提取的基因组DNA进行基因分型。18GWAS(1期)包括1910例在InfiniumGlobal筛选阵列(V.24v2, Illumina)上基因分型的ArC患者(表1)(在线补充方法D).用Minimac4对单倍型参考联盟参考面板(HRC r1.1)进行基因型归因。21使用Michigan Imputation Server22在线补充方法E).

表1

纳入发现和复制队列的研究人群概述

复制和验证样本

来自伦敦皇家自由医院和德国的患者使用OmniExpress阵列(24v1-0a, Illumina)进行基因分型。12复制(2期)包括1170例ArC患者(表1).来自意大利的患者在InfiniumGlobal筛选阵列(24v2, Illumina)上进行基因分型(在线补充方法D).将每个队列的基因型数据归为HRC参考文献(在线补充方法E).从UKB资源中获得606例患者的归因基因型数据。23

统计分析

GWAS分析

使用Plink V.2.0软件对7 946 762个变量进行关联分析24以植入后获得的等位基因剂量(植入信息评分>0.3,次要等位基因频率>1%)。膨胀因子λGC未调整GWAS分析为1.085,表明种群分层较为微妙。为了解释观察到的膨胀,计算ld修剪数据集上的前20个主成分(pc),并将遗传祖先的前15个pc作为协变量纳入回归模型。25修正后的λGC是1.03。进行了两种发现性GWAS分析:GWAS 1(初级GWAS分析):只包括前15个pc作为回归模型的协变量。复制随访单核苷酸多态性(SNPs)的p值阈值设置为p<5×10−6允许在复制阶段包含有暗示性关联的基因座。GWAS 2(敏感性GWAS分析):以性别、年龄和前15位个体为协变量;第2期随访前15个独立位点。

位点发现和注释

独立的基因组风险位点和先导变异(p<5×10)−6)来源于fua (V.1.3.1)26根据GWAS汇总统计数据,如前所述。27一个位点要被定义为独立的,它必须与其他位点分离至少500kb的基因组距离;排名靠前的snp被认为是潜在的先导标记。

动力分析

使用GAS功率计算器计算出ArC中SNP与HCC发展之间真正关联的期望功率。28等位基因频率较小的snp的功率>相对风险为1.5的等位基因估计为20%,相对风险为49%,相对风险为1.6的等位基因估计为81%,p值阈值为5×10−8在线补充表1).

复制分析

在第二阶段,所选snp在来自英国、德国和意大利的独立样本中进行验证。使用固定效应meta分析进一步分析研究特异性β估计值和标准误差。证明复制需要两个标准:(1)p<5.55×10−3(对应于初次分析中9项试验Bonferroni校正后p<0.05);或者p < 3.33×10−3(对应敏感性分析中15个试验Bonferroni校正后p<0.05)(2)和发现样本与复制样本间等位基因效应方向的一致性(在线补充方法F).

额外的复制分析

新的危险位点与肝癌/肝癌之间的关系也通过以下方法进行了评估:(1)通过Trépo进行的最近一次酒精相关肝癌GWAS的公开汇总统计数据14;(2)来自两个大型人群队列(Finngen和日本BioBank)的数据和(3)来自英国hcv相关肝硬化(STOP-HCV)患者队列的数据(在线补充方法F).

与其他癌症的相关性(多效性)

此外,我们评估了在以UKB和FinnGen为基础的人群队列中,新的风险位点是否与选定的与肝脏无关的癌症相关。每种癌症表型由入院、死亡记录和癌症登记记录中的ICD编码定义。此外,在人类GWAS的NHGRI-EBI目录中搜索新的风险位点与癌症表型的关联(在线补充方法F).

荟萃分析GWAS

使用METAL对所有数据集中存在的标记进行固定效应meta分析(n=5 552 382)29目的:(1)在发现阶段使用总研究样本(n=3080),(2)确定在阶段1和阶段2数据集中复制位点的综合效应大小。

eQTL分析

采用基因型-组织表达项目(GTEx) V8版本数据库,检测新基因位点变异对基因表达的影响:(1)肝组织(n=266)30.(2)全血(n=24 376),使用eQTLGen Consortium数据库。31

SNP遗传分析

表型变异的比例由常见全基因组显著snp的加性遗传效应解释(h²单核苷酸多态性: SNP遗传力)使用GCTA中实现的基因组相关矩阵限制性极大似然分析进行估计32在线补充方法).

与hcc相关表型的关系

在总UKB中检测复制位点与两种hcc相关表型的关联:白细胞端粒长度33以及肝脏脂肪含量。34UKB中有474074名参与者的白细胞端粒长度(字段ID: 22191),而有8315名成像亚研究参与者的肝脏脂肪含量(字段ID: 22436) (在线补充方法H).

患者和公众的参与

本研究的设计和实施没有患者和公众参与。

结果

GWAS和基因座验证

植入后,共有7 946 762个带有MAF >0.01的突变体在1066例ArC和HCC患者中和844例ArC对照组中检测了与HCC的相关性,但没有HCC的证据(表1).

在全基因组意义上观察到与HCC的关联(p<5×10−8)为两个独立的基因组位点,即PNPLA3而且TM6SF2表2图1一个在线补充图1).最强的信号是rs2294915,位于PNPLA3(p = 6.21×10−15)编码1-酰基甘油-3-磷酸o -酰基转移酶。该标记SNP rs2294915,位于的内含子8PNPLA3,处于强连锁不平衡(LD) (r2=0.92)与功能变体rs738409 C>G p。的第3外显子I148MPNPLA3这产生了类似的p发现阶段的价值(p=7.23×10−15, OR (95% CI)=1.71(1.49至1.96))。

Genome-wide association study (Discovery GWAS) results. Principal findings of genetic analyses. (A): Manhattan plot of genome-wide association results for alcohol-related hepatocellular carcinoma (HCC) in the primary discovery cohort. P values (−log10) are shown for SNPs that passed quality control. The genome-wide significance threshold (5×10−8) is shown as a black line. The threshold for replication follow-up (p<5×10−6) is shown as a dashed line. Gene names for replicating loci (table 2) are shown. Variants with significance p<5×10−8 are highlighted in red, those with p<5×10−6 are highlighted in green. (B) Locus plot for HCC risk locus PNPLA3. The −log10 (p values, meta-analysis of discovery and replication samples) are plotted against SNP genomic position based on NCBI Build 37, with the names and location of nearest genes shown at the bottom. The variant with the lowest p value (lead variant) in the discovery analysis in the region is marked by a purple diamond. SNPs are coloured to reflect correlation with the most significant SNP, with red denoting the highest LD (r2 >0.8) with the lead SNP. The top association signal is located in exon 3 of PNPLA3. Estimated recombination rates from the 1000 Genomes Project (hg19, EUR population) are plotted in blue to reflect the local LD structure. (C) Locus plot for HCC risk locus TM6SF2. The top association signal is located in exon 6 of TM6SF2. (D) Locus plot for HCC risk locus TERT. Fine-mapping analysis of the TERT association signals. Annotated LD-Blocks are clusters of strong pairwise LD SNPs and reflect the LD pattern in the Discovery GWAS cohort. The lead association signal is located in intron 4 of the TERT gene (annotated on the reverse strand), located in LD block B-3 spanning from intron 4 to intron 2 of TERT. NCBI, National Center for Biotechnology Information; SNP, single-nucleotide polymorphism.
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
图1

全基因组关联研究(Discovery GWAS)结果。遗传分析的主要发现。(A):主要发现队列中酒精相关肝细胞癌(HCC)全基因组关联结果的曼哈顿图。P值(−log10)表示通过质量控制的snp。全基因组显著性阈值(5×10−8)以黑线显示。复制后续的阈值(p<5×10−6)显示为虚线。用于复制位点的基因名称(表2)所示。显著性p<5×10的变量−8用红色突出显示的是p<5×10−6用绿色突出显示。(B) HCC风险位点位点图PNPLA3.−log10 (p值,发现和复制样本的元分析)根据NCBI Build 37绘制SNP基因组位置,最接近的基因的名称和位置显示在底部。该地区发现分析中p值最低的变异(先导变异)用紫色钻石标记。SNP被着色以反映与最显著SNP的相关性,红色表示与领先SNP的最高LD (r2 >0.8)。的第3外显子上的关联信号PNPLA3.1000基因组计划(hg19, EUR人群)估计的重组率用蓝色表示,以反映局部LD结构。(C) HCC风险位点位点图TM6SF2.顶部关联信号位于的第6外显子TM6SF2.(D) HCC风险位点位点图.精细映射分析协会的信号。带注释的LD- block是成对的强LD snp簇,反映了Discovery GWAS队列中的LD模式。前导关联信号位于蛋白质的内含子4基因(注释在反链上),位于LD块B-3中,跨越4号内含子到2号内含子.国家生物技术信息中心;SNP(单核苷酸多态性。

表2

进入初级和敏感性GWAS分析验证阶段的区域先导标记的关联结果

另一个在全基因组意义上与HCC相关的信号是rs58489806,位于的内含子1MAU2(p = 1.49×10−9)编码MAU2姐妹染色单体内聚因子;另外49个全基因组显著snp被定位到该位点。变异rs58489806是强LD (r2=0.80)与编码变体rs58542926 p.E167K在TM6SF2基因座(编码跨膜6超家族成员2)产生(p=2.81×10−9, OR (95% CI)=1.94(1.56至2.42))。

在第二阶段,来自HCC相关位点的9个前导snp在来自英国、德国和意大利的固定效应meta分析的独立队列中得到验证(表1在线补充表2-4).除了rs2294915PNPLA3(p = 6.19×10−6)和rs58489806 inTM6SF2 / MAU2(p = 5.22×10−4), rs2242652中的小等位基因的疾病关联被复制(p=1.07×10−3)(端粒酶逆转录酶)(表2).在所有阶段1和阶段2样品的组合分析中,rs2242652:A在与酒精相关的HCC在全基因组具有显著性(p=6.41×10−9, OR (95% CI)=0.61(0.52至0.72)(表2).与运输有关的保护作用rs2242652:在校正性别、年龄、体重指数(BMI)、2型糖尿病和遗传祖先前15位pc后,A仍然显著,但没有达到全基因组显著性(p=7.94×10)−5;OR (95% CI)=0.63(0.50至0.79)(在线补充表5)反映出与分析中大量缺失的BMI和糖尿病数据点相关的能量损失(表1).

对性别和年龄进行调整的全基因组分析的敏感性分析也显示,两个独立的基因组位点与HCC的全基因组显著相关PNPLA3而且TM6SF2与肝细胞癌和提示性证据相关(p = 9.28×10−6表2在线补充图2和3).在前15个相关基因座中,只有PNPLA3TM6SF2而且复制(表2).

原发性1期和2期数据集的GWAS综合meta分析和敏感性分析证实了rs738409基因组位点与HCC的全基因组显著相关性PNPLA3, rs58542926TM6SF2和rs2242652.没有额外的风险位点达到全基因组显著性p<5.0×10−8在线补充表6).显示基因组位点之间关联的森林图PNPLA3 TM6SF2,叔肝细胞癌表现在在线补充图4-6.这三个位点的区域关联图见图1 b-1d而在在线补充图7-9

先前报道的ArC背景下的HCC与HSD17B13rs72613567:助教(p = 8.95×10−3;OR=0.81 (95% CI 0.69 ~ 0.95)和APOErs429358: C (p = 5.44×10−3;OR=0.74 (95% CI 0.60 - 0.91)在本研究中具有名义意义,但在发现队列中未达到全基因组意义(在线补充表5和7).相比之下,最近报道的rs708113:T nearWNT3A未经证实(在线补充表5和7).其他先前描述的HCC风险位点,例如,DEPDC5在与丙肝肝细胞癌35STAT4而且hla dq36在本研究中与arc相关的HCC无显著相关性(在线补充表7).

等位基因和基因型的联系在单因素分析中,HCC与ArC的比较具有显著性(P等位基因的= 2.81×10−11P基因型的2.32×10−10)和HCC与酒精滥用的关系,但不包括ArC与酒精滥用的关系,使用1期和2期数据集的联合基因型计数(在线补充表8图2).纯合载体对肝细胞癌的保护作用更大rs2242652:A (OR=0.41 (95% CI 0.25 ~ 0.67))比杂合子携带者(OR=0.61 (95% CI 0.51 ~ 0.72))高。相比之下,变异在PNPLA3而且TM6SF2与ArC和ArC相关的HCC密切相关(在线补充表9和10图2).

图2

小说()和已确认的基因座(PNPLA3TM6SF2)与HCC和肝硬化表型相关。与无肝硬化的酒精滥用者(AM)相比,酒精相关HCC和酒精相关肝硬化(ArC)易感位点的or和95% ci。HCC与ArC的比较显示1期和2期联合样本的等位基因ORs(荟萃分析),来自等位基因剂量数据,调整了年龄、性别、BMI、2型糖尿病状态和遗传祖先的前15个主要成分。* HCC与AM和ArC与AM的比较显示未经调整的等位基因or,来自2×2在总队列中观察到的等位基因计数列联表,提供在在线补充表2-4.BMI,身体质量指数;肝癌,肝细胞癌。

精细定位的轨迹

在阶段1和阶段2样本的初步荟萃分析中,rs2242652中的次要等位基因得到最强的关联信号:A (p=6.40×10−09年;OR=0.61 (95% CI 0.52 ~ 0.72)),尽管rs10069690:T中的替代等位基因也有类似的关联(p=5.19×10)−08年, OR=0.66 (95% CI 0.57 ~ 0.77))。这两个变体都位于的内含子4和相关(r2= 0.70;在线补充表11).对LD结构进行了分析基因座显示,关联信号从2号内含子到6号内含子的范围很窄-此处称为LD地块B-3区(在线补充表11和图7).对来自B-3区域的20个snp上rs2242652:A或rs10069690:T等位基因剂量的条件分析证实rs2242652为先导位点(在线补充表11和12).事实上,B-3基因块中的其他变异,包括rs10069690,在作用于rs2242652 (在线补充表11).

复制的变异与HCC的关系

在hcv相关肝硬化患者中,rs2242652:A与HCC之间存在显著相关性(p=0.047;OR=0.72 (95% CI 0.53 - 0.99),在基于人口的FinnGen、UKB和BioBank日本队列中(表3在线补充图10和表13).

表3

复制在酒精相关和慢性hcv相关肝硬化患者和基于人群的队列中的变异

协会非肝癌的变异

之间的关联rs2242652:在UKB和fingen (FG)队列中探索了A和10种最常见的癌症(在线补充图10).与膀胱癌有显著相关性(FG: p=6.10 × 106, OR=0.83 (95% CI 0.67 ~ 0.90)), UKB: p=5.82 × 10−7, OR=0.84 (95% CI 0.79 ~ 0.90)),前列腺癌(FG: p=5.11 × 10−11, OR=0.87 (95% CI 0.84 ~ 0.90)), UKB: p=6.16 × 10−16;OR=0.86 (95% CI 0.83 ~ 0.89)),而肺癌和皮肤癌的相关性较弱。在这些队列中,前列腺癌和膀胱癌的效应值小于HCC/原发性肝癌的效应值(UKB: HCC: p=0.028;OR=0.80 (95% CI 0.66 ~ 0.89), FG:原发性肝癌:p=0.009;OR=0.81 (95% CI 0.69 ~ 0.95))。这些效应大小与NHGRI-EBI人类GWASs目录(在线补充表14).

风险变异的相加效应

在发现和验证队列中,随着风险增加等位基因rs738409:G in的累积携带,发生HCC的ArC患者比例增加PNPLA3rs58542926: TTM6SF2和rs2242652: G在线补充图11).在发现队列中,携带3 - 4个危险等位基因的患者酒精相关HCC的OR值为2.12 (95% CI 1.76 ~ 2.56),携带5 - 6个危险等位基因的患者的OR值为5.24 (95% CI 2.82 ~ 9.77)。在线补充表15).在英国的复制队列中,携带3至4个风险等位基因和5至6个风险等位基因的or值甚至更高,分别为3.25 (95% CI 1.84至5.73)和17.8 (95% CI 6.38至49.6)(在线补充图12和表15).

UKB中白细胞端粒长度和肝脏脂肪含量的关系

先导变异的小等位基因rs2242652: (p = 2.12×10−44)与LTL的增加显著相关,rs10069690:T与前导变异呈强LD (p=4.08×10)−84)(在线补充表16).位于测试区间内的其他变量,即rs7726159,与LTL的相关性甚至更强(p=1.16×10−219)尽管弱LD与rs2242652 (r2= 0.354) (在线补充表11).HCC和LTL的主要相关信号均位于LD区B-3区,但未观察到相关强度的直接相关(在线补充图13和表11).导致变异PNPLA3而且TM6SF2与LTL-rs738409 (p=0.458)和rss58542926 (p=0.475)无显著相关性,但与肝脏脂肪含量有显著相关性即。rs738409 (p = 3.39×10−61), rs58542926 (p = 5.94×10−45),分别为(在线补充表16);rs2242652在与肝脏脂肪含量无显著相关性(p=0.144)。

eQTL分析

rs2242652:A的携带与表达增加有关在血白细胞中(p=1.39×10−5)(在线补充表11).然而,使用GTEx数据库在肝脏或任何其他组织中均未发现rs2242652的显著eqtl。30.

SNP遗传分析

ArC- HCC的百分率遗传率由全基因组snp表达为h2在观察量表(GWAS队列)中为29.6%,在负债量表(假设疾病患病率为1%或2.5%)中分别为20.4%或25.7%,(在线补充表2020)。表型变异的比例由于潜在的遗传变异PNPLA3/TM6SF2/LD区域,表示为h2,按观察量表为7.5%,按责任量表为4.2%或5.3%,假设疾病流行率相同(在线补充表17).由方差分量1 (PNPLA3/TM6SF2/模型1为25.5%,调整为15台电脑,模型2为22.2%,调整为性别、年龄和15台电脑。对领先变量rs738409的方差分量1进行调整后PNPLA3/ rs58542926TM6SF2/ rs2242652叔h2降至0.000001%,表明变异分量1的遗传风险被三个确定的先导变异完全捕获。

讨论

在这项研究中,在全基因组意义上的关联被确定在ArC的HCC和先前识别的变异之间PNPLA3而且TM6SF2,还有一种变种(端粒酶逆转录酶)在5号染色体上,此前与这种表型无关。综合起来,这三个位点可以解释ArC患者HCC中高达25%的SNP遗传力。

酒精相关肝癌的宿主遗传危险因素的鉴定主要是使用候选基因方法进行的。候选基因总是被选中,因为它们与酒精相关肝损伤的进展有关,并且与变异rs738409呈正相关PNPLA3,和rs58542926TM6SF2已确定。8 9已知这些变异可以改变肝脏脂肪含量和信号,但它们如何影响导致肿瘤启动或促进的机制尚不清楚。37 38在本研究中,ArC中HCC与rs738409之间风险增加的相关性PNPLA3和rs58542926TM6SF2在全基因组意义上得到了证实。

rs72613567在HSD17B13和rs429358APOE和一个减少ArC患者发生HCC的风险。9 - 11在这项研究中,这些保护性联系得到了证实,但未能达到可检测的全基因组显著性水平(在线补充表5).

Trépo最近提供了对ArLD背景下HCC基因图谱的进一步洞察14他在法国和比利时的合作中发现了ArLD谱系人群的HCC的GWAS。与这项研究相似,他们证实了全基因组与酒精相关HCC和变异的风险增加显著相关PNPLA3 TM6SF2。此外,他们发现与rs708113在WNT3A-WNT9A该区域与酒精相关肝癌发生的风险降低相关。这种变异的存在与肿瘤组织的免疫细胞浸润增加和-连环蛋白突变频率较低有关(CTNNB1),通常先于肝细胞癌的发生。39在有慢性HCV感染或NAFLD背景的HCC患者中未观察到rs708113的这种保护作用。14

在本研究中,rs708113在WNT3A-WNT9A区域与HCC的发生无显著相关性,这可能反映了两项研究队列组成的差异,尽管两项研究的参与者都是欧洲后裔。在某种程度上,在法国-比利时队列中rs58542926的效应大小在一定程度上支持了种群多样性的假设TM6SF2年超过rs738409PNPLA3在之前的候选基因关联研究中,它是ArLD最强的单一遗传风险位点。40

本研究的关键发现是确定了风险位点这与脂质转换、炎症或纤维形成无关,但似乎对HCC的发展有很大影响。41与任何癌症一样,当健康的肝细胞在调节细胞分裂的特定基因中获得突变时,就会发生HCC。在肝细胞癌,是最常见的突变基因,在高达60%的肿瘤中存在突变(主要在启动子区域)。42这为本研究中报告的遗传多态性之间的关联提供了明确的可信性和酒精肝。在其他类型的癌症中也发现了种系和体细胞变异之间的类似关系。43端粒调节的生物学仍在被解开,仍然不完全了解。编码端粒酶的催化亚基(hTERT),它维持端粒,即染色体末端的重复DNA片段。在大多数细胞中,随着细胞的反复分裂,端粒逐渐缩短,这最终导致细胞停止分裂或发生凋亡。在每个细胞分裂周期中,端粒酶通过在染色体末端添加小的重复DNA片段来抵消端粒的缩短。44端粒酶在大多数癌细胞中也异常活跃。45表达水平显著影响各种细胞和组织中端粒酶的活性。46先前的研究表明,年龄较大、男性和肝硬化(所有HCC的经典危险因素)与肝组织中端粒长度较短有关。47因此,本研究显示rs2242652:A降低了HCC风险,同时增加了端粒长度,这与之前的研究方向一致。从机制的角度来看,可能是较短的端粒使细胞更容易受到驱动基因突变的影响,从而加速了肝癌的发生。47重要的是要指出rs2242652和HCC之间的联系可能不完全通过端粒长度介导。确实,对于变体,我们发现与端粒长度的关联强度与与HCC的关联强度之间没有很好的相关性。因此,rs2242652不仅仅是端粒长度的替代品。与这一点相关的是,作为其非规范函数的一部分也调节WNT/β-catenin通路。48 49这一信号通路也被认为在酒精诱导的纤维形成和肝癌的发生中发挥作用。14个50然而,关于酒精诱导的纤维化/肝硬化的风险,我们的数据明确显示rs2242652与

在以前的出版物中也有一些支持这项研究的发现。在Trépo进行的GWAS中14rs2242652:在与肝癌风险降低相关,但OR较本研究弱,未达到统计学意义(p=0.179;OR=0.89 (95% CI 0.75至1.06))。然而,运输rs10069690:T在与rs2242652最接近的可用代理基因与HCC发生风险显著降低相关(p=0.036;OR=0.84 (95% CI 0.71至0.99))。rs2242652:A在在基于人群的fingen队列中发现肝癌和肝内胆管癌患者,在日本BioBank队列中发现HCC患者,进一步证实了本研究的发现。一项涉及473名汉族HCC患者和564名健康志愿者的病例对照研究在两份独立的出版物(Huang、张51 52),也发现了肝癌的发展;rs2242652:A in与HCC发生风险降低相关(OR =0.70, 95% CI 0.55 ~ 0.90, p= 0.004), rs10069690:T的携带也是如此(OR =0.75, 95% CI 0.59 ~ 0.96, p=0.021)。本研究排除了慢性HCV感染的患者,但目前尚不清楚HCC患者是否有潜在的慢性肝病,如果有,其病因也不清楚。

在慢性HCV背景下发生HCC的患者中,已经确定了许多HCC危险位点35和慢性乙肝病毒,36但在本研究中,与arc相关的HCC均无显著相关性。然而,有证据表明变异在可诱发其他类型的慢性肝病中的HCC。因此,在本研究中,通过对STOP-HCV的再分析,我们观察到rs2242652: a与hcv相关肝硬化患者发生HCC的风险降低之间存在显著的相关性53数据。还有,在小董书房54显示rs10069690中共有等位基因T的携带与慢性病毒性肝炎背景下发生HCC的风险增加相关(OR = 2.78, 95% CI 1.62 ~ 4.78, p=0.00014)。因此,rs2242652与HCC之间的联系可能超出其与ArC的关系。需要进一步的研究来评估类似的关联是否适用于NAFLD患者。先前的一项研究表明,罕见的功能丧失生殖系突变与对照组相比,NAFLD-HCC患者中rs2242652位点的含量较高,然而,rs2242652位点在该患者组中的具体相关性尚不清楚。55

Rs2242652也与其他癌症的易感性有关,但这种关联的方向似乎因癌症类型而异(在线补充表14).在本研究中,rs2242652:A在UKB和FinnGen队列中与膀胱癌和前列腺癌发病风险降低显著相关。Kote-Jarai56找到了那辆马车rs2242652:A:与前列腺癌发病风险较低相关,且与前列腺癌发病风险增加相关在前列腺癌中,这种表达被报道可以提高存活率。显然还需要更多涉及不同人群的大型研究。

本研究有许多优点,包括:(1)使用两阶段GWAS方法;(2)大量、精心挑选的病例和对照样本,重点关注已确诊的ArC患者中的HCC;(3)仔细排除混杂共病;(4)统一纳入欧洲血统的白种人参与者;(5) rs2242652:A对肝癌的保护作用已在日本和中国人群中得到证实,这表明它可能也适用于东亚人群。(6)尽管本研究设计仅限于ArC背景下的肝癌患者,但也纳入了hcv相关肝癌患者队列,以评估我们的发现对其他病因的普遍性。这项研究也有一些局限性:(1)它是回顾性的,因此可能重要的信息,如终生饮酒史、糖尿病和肥胖的信息一般无法获得;(2)在GWAS分析所需要的显著性水平上,它在检测真正疾病相关性方面的能力相对较低,效应值较小(OR <1.4)。(3)只有少数HCC病例得到组织学诊断的证实,因此无法获得用于分子分析的组织标本。

总之,本研究确定rs2242652:A作为ArC中HCC发展的一个新的遗传因子,证实了其重要性PNPLA3而且TM6SF2作为HCC的危险因素。而rs2242652:A与HCC的关系这种保护性等位基因携带的功能意义尚不清楚。rs2242652:A的携带与白细胞端粒长度的增加显著相关,但其影响的数据在肝组织中没有转录。因此,这种关联的功能含义需要进一步研究在这个特定的背景下,因为的影响转录、端粒长度和恶性肿瘤的风险仍有争议。57

数据可用性声明

根据合理的要求提供数据。

伦理语句

病人同意发表

伦理批准

本研究涉及人类参与者,伦理委员会名称:Ethikkommission Technische Universität德累斯顿(TU Dresden)伦理名称ID: EK 594122019伦理委员会名称:瑞士伯尔尼Kantonale Ethikkommision, Switzerland (KEK)伦理名称ID:062 /11。参与者在参与研究前给予知情同意。

致谢

作者要感谢所有研究参与者、研究人员、临床医生和管理人员,他们对这项研究做出了贡献。

参考文献

补充材料

  • 补充数据

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脚注

  • SB和HI是共同第一作者。

  • PD, SM, JH和FS是联合资深作者。

  • 推特@StephanB76, @lucavalenti75

  • SB和HI贡献相等。

  • PD、SM、JH和FS贡献相当。

  • 调整通知这篇文章在Online First发布后进行了修改。作者的名字,Sascha A Müller,已被更正。

  • 贡献者SB, HI,进行生物信息分析,分析数据,解释结果并撰写稿件;HI给出概念性建议;PLL, HDN, JUM, JF, KHW, JR, AM, MK, MC, FL, FE, AV, SM, JvF, RS, SRA, AM, JN管理样本的收集,进行表型分型和数据整理,参与讨论,解释结果;CS协调和监督样本的采集,进行表型分析,担任科学顾问;AF给出了概念性的建议,对手稿进行了批判性的审阅;CS, MR, HA, SS协调,管理样本采集,进行表型分型;VRT, MB, CL, RES, AC, AL, TR, MM, GS, BS, CD, SR, SGC, WLI, JRM, ING, EB, MAA, JQ,样本收集,进行表型分型和数据整理,参与讨论,解释结果;LV, SAM, JF-D, JT, TB, MYM获得样品,提出概念建议,参与讨论,解读结果,编辑稿件;PD, SM, JH, FS构思实验和分析设计,监督,解释结果,撰写和审查手稿。FS是本次研究的担保人。

  • 资金这项工作得到了德国联邦教育与研究部(BMBF)向JH提供的LiSyMKrebs (DEEP-HCC)网络资助(BMBF资助号031L0258A)。JT获得了德国研究基金会(DFG)项目ID 403224013- SFB 1382 (A09)的支持,德国联邦教育和研究部(BMBF)的DEEP-HCC项目,黑森州高等教育、研究和艺术部(HMWK)的ENABLE和ACLF-I集群项目。这项工作得到了瑞士国家基金(SNF no.)的进一步资助。310030_169196)和瑞士酒精研究基金会(SSA)对FS。HDN和US得到了德国克雷布希尔公司(70112169)的资助。HI得到医学研究基金会(C0825)的病毒性肝炎奖学金的支持。JM由英国医学研究理事会(MC_UU_12014/1)和医学研究基金会(C0365)资助。EB由英国医学研究委员会、牛津国立卫生研究院生物医学研究中心资助,是国立卫生研究院高级研究员。STOP-HCV研究由英国医学研究理事会的一笔赠款资助(赠款MR/K01532X/1)。这项工作也得到了由英国癌症研究中心(C30358/A29725)资助的Deliver研究的支持。 See:https://www.oxcode.ox.ac.uk/research-showcase/liver-cancer.AL获得了欧盟委员会通过“欧洲区域发展基金”(EFRE)以及萨克森-安哈尔特地区经济、科学和数字化部的资金支持,作为“lillife”项目(项目ID: ZS/2018/11/95324)“老年自治”(AiA)研究小组的一部分。MICROB-PREDICT(项目ID 825694)、DECISION(项目ID 847949)、GALAXY(项目ID 668031)、LIVERHOPE(项目ID 731875)和IHMCSA(项目ID 964590)项目获得了欧盟“地平线2020”研究和创新计划的资助。本研究使用了英国生物银行资源:申请号:8764。这项研究得到了德累斯顿生物银行资源(https://www.nct-dresden.de/forschung/core-units/biobank-dresden.html).

  • 免责声明该手稿仅反映作者的观点,欧盟委员会不对其所包含信息的任何使用负责。资助方对研究设计、数据收集和分析、发表决定或稿件准备没有影响。

  • 相互竞争的利益JT已从Versantis、Gore、Bayer、Alexion、Norgine、Grifols和CSL Behring收取演讲和/或咨询费。

  • 患者和公众的参与患者和/或公众未参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。

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