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利用人肝胆类器官研究SARS-CoV-2感染机制
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  9. Haipeng肖5，
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  11. Xiaoxing李2，
  12. 历下徐2，3.，
  13. 6月于2，7
  1. 1肝胆胰外科中心肝外科，中山大学附属第一医院，广州，广东,中国
  2. 2精准医学研究所，中山大学附属第一医院，广州，广东,中国
  3. 3.肿瘤科，中山大学附属第一医院，广州，广东,中国
  4. 4广东省公共卫生研究所，广东省疾病预防控制中心，广州，广东,中国
  5. 5内分泌科，中山大学附属第一医院，广州，广东,中国
  6. 6李光前医学院，南洋理工大学、新加坡
  7. 7消化疾病国家重点实验室，消化疾病研究所，内科与治疗科，香港中文大学，香港特别行政区,中国
  1. 对应到于军，香港中文大学消化疾病国家重点实验室，内科及治疗学系教授，香港，新界沙田;junyu在{}cuhk.edu.hk；徐丽霞教授，中山大学附属第一医院肿瘤科，广东广州;xulixia在}{mail.sysu.edu.cn；李晓星教授，中山大学第一附属医院精准医学研究所，广东广州;lixiaox23在}{mail.sysu.edu.cn

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-326617

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    我们饶有兴趣地阅读了韦伯最近发表在《Gut》杂志上的一项研究等，1报告患者γ -谷氨酰转移酶(37%)和总胆红素(5%)异常升高，这与covid -19相关死亡率较高有关。然而，SARS-CoV-2是否能感染人肝细胞和胆管细胞，从而造成局部损伤，目前尚无报道。在这里，人类类器官被用于研究SARS-CoV-2感染及其在细胞和分子水平上诱导的肝损伤(图1一个)．

    (A) Scheme of liver and biliary organoid culture establishment and performed assays. The liver and biliary organoids were generated from adjacent normal tissues of patients with liver cancer and coculture with SARS-CoV-2. (B) Differentiated liver and biliary organoids were immunostained using antibodies against human homologues to show albumin (green), ASGR1 (red), CK18 (red) and CK19 (red) protein, respectively. Nuclei are stained with DAPI (blue). Scale bar, 50 µm. (C) Immunofluorescent staining of SARS-CoV-2 infected liver organoids and biliary organoids at 24-hours. Virus are identified by SARS-CoV-2 spike (S) glycoprotein protein (red), nuclei and actin filaments are stained with DAPI (blue) and phalloidin (green), respectively. Scale bar, 50 µm. (D) Real time quantitative PCR analysis for viral sequences shows virus can productively replicate in the liver organoids at 0, 24, 48, 96 hours and in the biliary organoids at 0, 24, 48 hours after infection with SARS-CoV-2. (E) Live virus can be detected by RT-qPCR in supernatant and lysed organoids at 0 and 24 hours after infection with SARS-CoV-2.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    (A)肝、胆道类器官培养建立方案及检测。肝和胆道类器官来自肝癌患者的邻近正常组织，并与SARS-CoV-2共培养。(B)对分化后的肝脏和胆道类器官进行免疫染色，分别显示白蛋白(绿色)、ASGR1(红色)、CK18(红色)和CK19(红色)蛋白。细胞核用DAPI染色(蓝色)。比例尺，50µm。(C) SARS-CoV-2感染的肝脏类器官和胆道类器官24小时免疫荧光染色。病毒用SARS-CoV-2尖刺(S)糖蛋白(红色)识别，细胞核和肌动蛋白丝分别用DAPI(蓝色)和phalloidin(绿色)染色。比例尺，50µm。(D)病毒序列实时定量PCR分析显示，病毒在感染SARS-CoV-2后0、24、48、96小时可在肝脏类器官中高效复制，在感染后0、24、48小时可在胆道类器官中高效复制。(E) SARS-CoV-2感染后0和24小时，上清液和溶出的类器官均可通过RT-qPCR检测到活病毒。

    我们首先从7例肝癌患者的邻近正常组织中建立了5个肝类器官系和2个胆道类器官系(图1 b；在线补充图1A,B；在线补充方法)．我们检测了人类肝脏和胆道类器官对SARS-CoV-2的敏感性(广东/20SF014/2020;EPI_ISL_403934;19A)直接从中度COVID-19患者中分离出来。免疫荧光染色显示，SARS-CoV-2尖刺(S)糖蛋白在人肝脏和胆道类器官的斑块区容易表达，但在未感染对照组中不表达(图1 c；在线补充图1C)．感染后24小时，新冠病毒在肝脏(肝1至肝4)和胆道类器官(胆1和胆2)中的病毒载量显著增加，在肝脏类器官中稳定96小时，在胆道类器官中稳定48小时(图1 d；在线补充图2A；在线补充表S1)．同时，我们发现活SARS-CoV-2可在裂解的类器官(肝5)及其培养上清液(图1 e；在线补充表S1)，推断人类肝脏和胆道类器官易受SARS-CoV-2感染，并支持强大的病毒复制。

    新冠病毒主要通过ACE2受体进入靶细胞。2考虑到ACE2受体在胆管细胞(59.7%)中比在肝细胞(2.6%)中表达更高，3.在透射电镜下观察新型冠状病毒感染胆道类器官的超微结构，发现病毒颗粒存在于类器官的管腔、底外侧和顶端，以及膜结合的囊泡中(图2一个)．因此，TEM捕捉到了SARS-CoV-2在感染胆道类器官中的关键位置，揭示了SARS-CoV-2进入胆道细胞的潜在传播途径。

    (A) Representative TEM imaging of biliary organoids at 0 and 24 hours of SARS-CoV-2 virus infection. Coronaviruses were observed in the lumen of the organoid (arrows) and are found at the membrane-bound vesicles (arrows). Scale bar 500 nm to 5 µm. (B, C) Heatmaps depicting the 19 most significantly enriched genes related to viral infection and immune system on SARS-CoV-2 infection in liver and biliary organoids. Coloured bar represents the log2-transformed values. (D, E) KEGG orthology-based annotation system of differential gene expression profiles from SARS-CoV-2-infected liver and biliary organoids compared with mock infection. TEM, transmission electron microscope.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    (A) SARS-CoV-2病毒感染0和24小时胆道类器官的代表性TEM成像。冠状病毒在类器官的腔内观察到(箭头)，在膜结合的囊泡处发现(箭头)。比例尺500nm至5µm。(B, C)肝脏和胆道类器官SARS-CoV-2感染中病毒感染和免疫系统相关19个最显著富集基因的热图。彩色条表示log2转换后的值。(D, E)基于KEGG orthology的sars - cov -2感染肝脏和胆道类器官与模拟感染比较差异基因表达谱的注释系统。透射电子显微镜。

    通过RNA测序检测新冠病毒感染后肝脏和胆道类器官的基因表达变化。差异表达基因的热图和火山图显示，在sars - cov -2感染的肝脏和胆道类器官中，促炎趋化因子/细胞因子(包括CXCL1)被强烈诱导。KEGG Orthology Based Annotation系统一致显示感染类器官中有多条促炎通路上调，包括NF-κB信号通路等。值得注意的是，感染组TNF信号通路和凋亡通路明显上调，提示SARS-CoV-2感染可能诱导肝细胞和胆管细胞死亡。此外，UGT1A1在sars - cov -2感染的肝脏和胆道类器官中表达上调，这与胆红素升高有关。而胆汁酸转运体基因SLCO4C1在sars - cov -2感染的胆道类器官中显著降低，类固醇激素生物合成和胆汁分泌通路上调，可能导致胆汁酸积累。此外，IL1R2和IL1RL1的上调可能与白蛋白产生抑制有关，从而损害肝功能。4据报道，ASGR1是一种相互作用的宿主受体，可作为新型冠状病毒的替代功能受体，为进一步研究新型冠状病毒的向性和发病机制提供依据。5我们发现ASGR1在感染的肝类器官中表达上调，这可能解释了SARS-CoV-2病毒载量在肝类器官中高于胆道类器官，而ACE2受体在胆道细胞中表达上调(图2中；在线补充图2B；在线补充表S1)．据报道，非幸存者的胆红素水平明显高于感染SARS-CoV-2的幸存者。1 - 6免疫组化进一步验证了sars - cov -2感染胆道类器官中炎症因子CXCL8和CXCL11的表达与模拟相比上调(在线补充图2C)．

    综上所述，SARS-CoV-2可有效感染人类肝脏和胆道类器官。SARS-CoV-2病毒在受感染的类器官中快速复制，诱导产生促炎细胞因子/趋化因子，导致局部肝细胞和胆管细胞损伤，进而导致胆汁酸积累，可能导致肝损伤。

    伦理语句

    患者发表同意书

    伦理批准

    本研究以人为本，经中山大学附属第一医院机构伦理审查委员会批准。参与者在参与研究前均知情同意参与研究。

    参考文献

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    补充材料

    脚注

    • YZ、XR和JL的贡献相当。

    • 贡献者YZ和XR进行实验并起草手稿。JL进行了实验并修改了手稿。MinghuiH和MingleH进行了生物信息学分析。ZL和LY进行实验。MK收集了人类样本，并对这项研究发表了评论。HX和JJYS对研究进行监督和评论。XL, LX和JY设计，监督研究并修改手稿。

    • 资金国家自然科学基金项目(82173191)、广东省科技计划项目(2021B1212030007)资助。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。