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原始研究
肝脏p63通过抑制SIRT1调节葡萄糖代谢
  1. 玛丽亚J Gonzalez-Rellan12
  2. 伊娃诺沃亚1
  3. 纳塔莉亚·达·席尔瓦·利马1
  4. 基本上罗德里格斯23.
  5. Christelle Veyrat-Durebex45
  6. 撒母耳Seoane1
  7. Begona Porteiro1
  8. 马科斯F Fondevila1
  9. Uxia费尔南德斯1
  10. 玛尔塔Varela-Rey6
  11. 安娜Senra1
  12. 克里斯蒂娜·伊格莱西亚斯1
  13. 阿德里亚娜Escudero1
  14. 米格尔Fidalgo1
  15. 戴安娜Guallar7
  16. 罗马Perez-Fernandez1
  17. 文森特Prevot8
  18. 马库斯Schwaninger9
  19. 米格尔·洛佩兹12
  20. 卡洛斯Dieguez12
  21. 罗伯特·Coppari45
  22. 能Fruhbeck23.
  23. 鲁本nogueira1210
  1. 1中国科学院生理学系圣地亚哥德孔波斯特拉大学圣地亚哥德孔波斯特拉、西班牙
  2. 2CIBERobn肥胖与营养分裂病理学西班牙、西班牙
  3. 3.内分泌与营养学系,代谢研究实验室纳瓦拉大学诊所潘普洛纳西班牙纳瓦拉、西班牙
  4. 4医学院细胞生理与代谢学系“,瑞士日内瓦大学日内瓦、瑞士
  5. 5糖尿病中心日内瓦大学医学院日内瓦、瑞士
  6. 6疾病中的基因调控圣地亚哥德孔波斯特拉CIMUS大学圣地亚哥德孔波斯特拉、西班牙
  7. 7生物化学系卫生研究所Investigación圣地亚哥德孔波斯特拉、西班牙
  8. 8里尔大学神经内分泌大脑发育与可塑性实验室欧洲糖尿病基因组研究所(EGID)巴黎、法国
  9. 9吕贝克大学实验与临床药理学与毒理学研究所吕贝克、德国
  10. 10加利西亚创新机构(GAIN)Xunta德加利西亚圣地亚哥德孔波斯特拉、西班牙
  1. 对应到ruen Nogueiras博士,CIMUS生理学系,Investigación西班牙瓦伦西亚卫生研究所;ruben.nogueiras在{}usc.es

摘要

客观的P63是p53蛋白家族中的一种转录因子,在发育、分化和预防衰老中起着关键作用,但其代谢作用在很大程度上仍不清楚。在此,我们研究了p63在糖代谢中的生理作用。

设计我们使用细胞系和小鼠模型对肝细胞中的p63进行基因调控。我们还测量了伴有或不伴有2型糖尿病(T2D)的肥胖患者肝脏中的p63。

结果我们发现肝脏p63表达在禁食时减少。肝脏中缺乏特异性亚型TAp63 (p63LKO)的小鼠显示出较高的餐后和丙酮酸诱导的葡萄糖游离。这些小鼠的SIRT1水平升高,而在p63LKO小鼠中SIRT1的降低使血糖正常。野生型小鼠过表达TAp63可降低餐后丙酮酸诱导的血糖和SIRT1水平。在肝细胞细胞系中进行的研究表明,TAp63通过抑制SIRT1启动子的转录激活来调节SIRT1启动子。TAp63还介导胰岛素对肝脏葡萄糖生成的抑制作用,因为沉默TAp63会损害胰岛素敏感性。T2D肥胖者中TAp63蛋白水平降低,与空腹血糖和稳态模型评价指数呈负相关。

结论。这些结果表明p63在生理上调节葡萄糖稳态。

  • 葡萄糖代谢
  • 糖尿病
  • 饮食

数据可用性声明

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关于这个话题我们已经知道了什么

  • p63在葡萄糖代谢中的作用已经通过对TAp63亚型(Su细胞金属底座16岁;(4):511 - 25)。这些小鼠肥胖,表现出过早衰老和寿命缩短,显示出较低的SIRT1水平。

这项研究补充了什么

  • 肝脏中p63的表达,更准确地说,是TAp63亚型,在禁食后减少,再喂养使TAp63的表达正常化。

  • 肝细胞中缺乏TAp63的小鼠,其体重、增殖或凋亡均未发生变化,在禁食诱导的喂养或丙酮酸给药过程中血糖漂移较高。

  • p63结合到SIRT1的启动子上,这对维持正常的糖异生至关重要,并抑制其活性。

  • 沉默TAp63肝KO小鼠的SIRT1使葡萄糖水平正常化。

  • 胰岛素刺激p63,小鼠和没有p63的人肝细胞对胰岛素诱导的糖异生抑制无反应。

  • 在2型糖尿病患者中,肝脏TAp63水平降低,与空腹血糖和胰岛素抵抗呈负相关。

这项研究将如何影响研究、实践和/或政策

  • P63是一种调节大量基因表达的转录因子。了解其在糖代谢中的功能可能有助于识别与糖代谢控制相关的新基因。

  • 我们的数据显示,TAp63水平在2型糖尿病患者中发生改变,这表明它们具有临床相关性。

简介

转录因子p53蛋白家族成员(包括p63和p73)通常具有高度的结构相似性,1 2但可表现出不同的功能和表达谱,并通过不同的机制产生不同的生物学效应。p63表达为两种主要的异构体:TAp63形式包含一个n端transactivation (TA)结构域,和n端截断(ΔNp63)结构域,缺乏该结构域。3 4P63作为干细胞多能性的主转录因子,在基础上皮发育、分化和预防衰老中起着至关重要的作用。然而,最近的证据表明,p63也参与代谢的不同方面。例如,杂合子p63小鼠显示体重减轻,5缺乏TAp63的小鼠会出现迟发型肥胖。6

肝脏在使燃料氧化适应营养可用性的代谢灵活性中起着关键作用。7在小鼠肝脏中,在摄入高脂饮食后,TAp63被诱导,其肝脏特异性敲除可通过减少炎症、内质网应激和新生脂肪生成来改善高脂饮食诱导的脂肪变性。8在人类鳞状细胞癌样本中,p63靶向脂肪酸合酶并促进促生存作用。9增殖的细胞不仅需要脂肪酸,而且需要大量的葡萄糖来满足它们的高能量需求。10值得注意的是,p63已被确定为在鳞状细胞癌中决定葡萄糖依赖的基因之一。11然而,p63在葡萄糖稳态中的生理作用仍不清楚。全身缺乏TAp63的小鼠表现出过早衰老和寿命缩短,12日13肥胖,葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。6考虑到:(1)p63广泛表达,(2)p63发挥组织特异性作用,(3)葡萄糖稳态在多个器官上被差异调节,关于糖代谢的全空模型的结论必须有额外的组织特异性模型和证据支持。

在目前的工作中,我们研究了肝脏p63在以下两个方面的具体作用:(1)在生理条件下维持血糖水平,基于肝脏在进食状态下存储葡萄糖作为糖原的能力;(2)在禁食期间释放葡萄糖,这一过程必须严格控制,以保护身体免受不可逆的资源损失。间歇性禁食在预防衰老和多种疾病的发展和进展方面发挥着有益的作用,这一发现增强了我们对揭示使这种平衡成为可能的代谢适应的兴趣。14日15我们的结果表明,肝脏中的p63在禁食时迅速下降,而在有食物时上升。肝脏中缺乏TAp63的小鼠表现出更高的糖异生能力,而过表达该转录因子的小鼠表现出相反的表型;这与TAp63结合SIRT1基因启动子抑制其转录表达的事实相吻合,SIRT1基因启动子是一种众所周知的肝葡萄糖产生的诱导因子。16最后,2型糖尿病(T2D)患者肝脏中TAp63降低,且与空腹血糖、体内平衡模型评估(HOMA)指数和SIRT1水平呈负相关。

方法

动物

动物实验是按照圣地亚哥德孔波斯特拉大学动物学院委员会批准的标准进行的,实验是按照《实验动物护理规则》和《国际动物实验法》进行的。

病人

肝脏样本来自Clínica大学(Universidad de Navarra)接受减肥手术的病态肥胖患者(n=60)。

具体方法见在线补充材料

结果

营养可获得性调节肝脏p63

24小时禁食小鼠肝脏中p63 mRNA表达减少;值得注意的是,与AD自由喂养的小鼠相比,再喂养不仅逆转甚至增加了其表达(图1一个).禁食诱导的表达减少早在禁食6小时时就被观察到(图1 b).夜间禁食12小时后,小鼠获得食物,肝脏p63表达迅速被诱导,在30min时有上调趋势(p=0.06), 1 h后显著上调(图1 b).小鼠实验结果在体外复制于人肝脏THLE-2细胞中:饥饿细胞中p63表达水平在30min后下降,并维持在低水平至4小时(图1 c).然后,我们对小鼠进行了为期4天的60%热量限制试验,这是一种(类似于禁食)促进肝脏糖异生的生理条件。17与随意喂养的小鼠相比,p63 mRNA表达也显著降低(图1 d).

图1

营养有效性调节肝脏p63。(A)随意喂食、禁食24小时或禁食24小时(RF)的野生型(WT)小鼠肝脏中p63 mRNA的水平。(B)自由喂养(基线)或禁食6、12小时后再进食30分钟、禁食12小时后再进食1小时或2小时的WT小鼠肝脏中p63 mRNA水平。(C) THLE-2细胞中p63 mRNA水平维持在完全培养基(CM)(基线)或在krebs - henseleett - hepes缓冲液(KHH)中饥饿指定时间。(D) 60%热量限制(CR) 4天小鼠肝脏中p63 mRNA水平。(E)随意喂养、禁食24小时或禁食24小时并喂糖的WT小鼠肝脏中p63 mRNA水平。(F) THLE-2细胞中p63 mRNA水平维持在CM中或饥饿在KHH中,有或没有葡萄糖(10 mM)。(G) THLE-2细胞中p63 mRNA水平维持在CM中或饥饿在KHH中,添加或不添加葡萄糖(10 mM)和2-脱氧葡萄糖(10 mM)。hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HPRT)表达作为加载对照,对照值归一化为100%。数据以平均值±SE平均值表示。 *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, using a Student’s t-test (B–D), or one way analysis of variancfollowed by a Bonferroni multiple comparison test (A,E–G).

由于在低血糖状态下(如禁食或热量限制),p63 mRNA水平较低,而在补食后(血糖升高),p63 mRNA水平较高,我们旨在找出营养状态的哪个信号是其调节的背后。我们首先评估了空腹必需激素胰高血糖素和FGF21是否可以调节肝脏p63水平。野生型(WT)小鼠和胰高血糖素受体敲除(KO)小鼠给药均未影响肝脏p63表达(在线补充图S1A).与这些发现一致的是,WT和空腹后胰高血糖素受体(GCNR) KO之间的肝脏p63水平没有差异(在线补充图S1B).此外,FGF21敲除不改变肝脏p63表达(在线补充图S1C,D).鉴于这些阴性结果,我们下一步研究循环葡萄糖本身是否可以调节肝脏p63的表达。为此,我们让老鼠24小时禁食,或不吃糖补充剂。正如之前报道的,8日18进食糖的禁食小鼠与未进食糖的禁食小鼠减轻了同样的体重,但它们的血糖水平保持稳定,与自由进食的小鼠相似。此外,禁食降低了肝脏p63的表达,但在禁食期间接受糖的小鼠显示p63表达显著增加,显著高于随意喂食的小鼠(图1 e).值得注意的是,在有或没有葡萄糖的饥饿培养基(krebs - henseleett - hepes缓冲液(KHH))中培养人类THLE-2细胞2小时后,我们观察到添加葡萄糖的细胞中p63水平高于未添加葡萄糖的细胞(图1 f).此外,葡萄糖诱导的p63上调被2-脱氧-d-葡萄糖的共给药完全阻断(图1 g),它不能进行进一步的糖酵解,这表明葡萄糖本身能够调节p63的表达。

此外,在24小时禁食的小鼠肝脏中,TAp63蛋白水平显著降低(在线补充图S1E),但ΔNp63和ΔNp63 mRNA的蛋白水平没有变化(在线补充图S1F,G).因此,p63亚型明显受营养缺乏的调控,只有TAp63受影响。我们还通过不同组织(如WAT、BAT、肌肉、肾脏和肠道)的营养有效性来测量p63的调节。我们发现p63在这些器官中的表达在禁食时保持不变(在线补充图S1H).为了进一步控制我们的动物模型在禁食中的效率,我们不仅在肝脏中,而且在与糖异生相关的肝外组织如肠道和肾脏中,我们还测量了这些器官中糖异生基因的表达。我们发现G6Pase和PCK1确实在禁食24小时时升高,在肾和肠中补食后降低(在线补充图S1I,J).

肝脏缺乏TAP63的小鼠显示糖异生能力增加

由于肝脏TAp63的表达受营养可得性的调节,我们建立了两个TAp63条件KO小鼠模型,以详细研究内源性肝脏TAp63在糖代谢中的作用。通过将AAV8-Cre注射到成年TAp63 floxed小鼠尾静脉中,在成年期产生肝脏KO (图2一个);在另一个模型中,将TAp63 floflotting小鼠与表达Cre重组酶的α-胎蛋白增强子白蛋白基因启动子(Alfp-Cre)控制下的小鼠进行杂交,导致从胚胎期开始肝细胞(TAp63LKO)特异性缺失TAp63 (图2 f).p63在其他组织包括白色脂肪组织(WAT)、棕色脂肪组织(BAT)、肌肉、肾脏和肠道(在线补充图S2A).

Hepatic TAp63 regulates postprandial glucose. (A) p63 mRNA levels in FloxTAp63 mice injected with AAV8-GFP or AAV8-Cre. (B) Blood glucose in FloxTAp63 mice injected with AAV8-GFP or AAV8-Cre and subjected to a pyruvate tolerance test (PTT). Food intake (C) and postprandial glucose levels (D) in FloxTAp63 mice injected with AAV8 expressing either GFP or CRE, refed (RF) with chow diet. (E) SIRT1 mRNA levels and hepatic protein levels of SIRT1, PCK1 and G6Pase. (F) p63 mRNA levels in control mice and Alfp-Cre FloxTAp63 (TAp63LKO) mice. (G) Blood glucose in TAp63LKO mice subjected to a PTT. Food intake (H) and postprandial glucose levels (I) in TAp63LKO mice RF with chow diet. (J) SIRT1 mRNA levels and hepatic protein levels of SIRT1, PCK1 and G6Pase. Area under curve (AUC) is also shown. (K) Glucose infusion rate in control mice and TAp63LKO. (L) Tissue glucose uptake from brown adipose tissue (BAT) white adipose tissue (WAT) and muscle in control mice and TAp63LKO. Subcutaneous adipose tissue (SAT), perigonadal visceral adipose tissue (pgVAT) and renal perivascular adipose tissue (rpVAT). (M) p63 mRNA levels in control and TAp63 LKO mice injected with AAV8-GPF and AAV8-TAp63. (N) Blood glucose in control and TAp63 LKO mice injected with AAV8-GPF and AAV8-TAp63 subjected to PTT. Food intake, postprandial blood glucose (O) and protein levels (P) of SIRT1, PCK1 and G6Pase in control and TAp63 LKO mice injected with AAV8-GPF and AAV8-TAp63. Expression of HPRT (qRT-PCR) and GAPDH (western blot) served as loading control, and control values were normalised to 100%. Data are presented as mean±SE mean. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, using a Student’s t-test (A,B,D–G,I,J,L), or one-way analysis of variance followed by a Bonferroni multiple comparison test (M–P). *Indicates differences compared with control group. #Indicates differences between AAV8-GFP and AAV8-CRE mice.
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
图2

肝脏TAp63调节餐后血糖。(A)注射AAV8-GFP或AAV8-Cre的FloxTAp63小鼠的p63 mRNA水平。(B)注射AAV8-GFP或AAV8-Cre并进行丙酮酸耐受性试验(PTT)的FloxTAp63小鼠血糖。注射了表达GFP或CRE的AAV8的FloxTAp63小鼠的食物摄入量(C)和餐后血糖水平(D),用周粮喂养(RF)。(E) SIRT1 mRNA水平和SIRT1、PCK1和G6Pase肝脏蛋白水平。(F)对照组小鼠和Alfp-Cre FloxTAp63 (TAp63LKO)小鼠的p63 mRNA水平。(G) PTT作用下TAp63LKO小鼠的血糖。随机饮食TAp63LKO小鼠的食物摄入量(H)和餐后血糖水平(I)(J) SIRT1 mRNA水平与肝脏SIRT1、PCK1和G6Pase蛋白水平。曲线下面积(AUC)也显示出来。 (K) Glucose infusion rate in control mice and TAp63LKO. (L) Tissue glucose uptake from brown adipose tissue (BAT) white adipose tissue (WAT) and muscle in control mice and TAp63LKO. Subcutaneous adipose tissue (SAT), perigonadal visceral adipose tissue (pgVAT) and renal perivascular adipose tissue (rpVAT). (M) p63 mRNA levels in control and TAp63 LKO mice injected with AAV8-GPF and AAV8-TAp63. (N) Blood glucose in control and TAp63 LKO mice injected with AAV8-GPF and AAV8-TAp63 subjected to PTT. Food intake, postprandial blood glucose (O) and protein levels (P) of SIRT1, PCK1 and G6Pase in control and TAp63 LKO mice injected with AAV8-GPF and AAV8-TAp63. Expression of HPRT (qRT-PCR) and GAPDH (western blot) served as loading control, and control values were normalised to 100%. Data are presented as mean±SE mean. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, using a Student’s t-test (A,B,D–G,I,J,L), or one-way analysis of variance followed by a Bonferroni multiple comparison test (M–P). *Indicates differences compared with control group. #Indicates differences between AAV8-GFP and AAV8-CRE mice.

与各自对照组小鼠相比,两组KO小鼠在葡萄糖耐量试验(GTT)、胰岛素耐量试验(ITT)和谷氨酰胺耐量试验(在线补充图S2B、C);然而,他们表现出丙酮酸引起的高血糖(图2 b, G),表明糖异生能力增加。接下来,我们对两种小鼠模型进行了一夜禁食后的再喂养实验;为了在这种生理条件下维持葡萄糖稳态,肝脏糖异生必须被抑制,作为从空腹到进食状态的必要代谢转移。19我们发现肝脏中缺乏TAp63的小鼠比WT小鼠表现出更高的血糖水平(图2 d,我),尽管吃了相同数量的食物(图2 c, H).值得注意的是,在口服葡萄糖耐量试验(OGTT)的挑战下,TAp63肝KO小鼠在15分钟后显示出更高的葡萄糖水平,但曲线下面积没有变化(在线补充图S2D).在分子水平上,在两种肝脏缺乏TAp63的模型中,再喂食后60分钟,葡萄糖合成相关蛋白均升高;这些蛋白质包括SIRT1(也在mRNA水平上被调节)、PCK1和G6Pase (图2 e, J).考虑到缺乏肝脏p63的小鼠在丙酮酸耐受性试验(PTT)中葡萄糖水平升高,而ITT和GTT没有变化,我们进行了一项正糖-高胰岛素钳夹,以确定这一发现是否可能是由于后一种试验中有助于维持正常血糖水平的任何组织/器官补偿。研究发现,在血糖-高胰岛素钳夹过程中,与对照组相比,TAp63肝型KO小鼠的葡萄糖输注率增加(图2 k).此外,这些小鼠在不同的白色脂肪库中也显示出较高的葡萄糖摄取,但在棕色脂肪或骨骼肌中没有(图2 l).

为了进一步探讨TAp63与肝脏葡萄糖生成的相关性,我们对肝脏中缺乏TAp63的小鼠模型及其对照组进行了24小时的禁食。他们的血糖水平较高(在线补充图S3A,E)与循环FGF21、胰高血糖素或转氨酶无差异(在线补充图S3B-H).重要的是,在这些动物模型的肠道和肾脏中也测量了糖异生酶的水平,但没有发现差异(在线补充图S3I-L),强调了肝糖异生在观察到的表型中的特定作用。最后,两种动物模型在复喂养后也测定了循环中FGF21和胰高血糖素的水平,差异无统计学意义(在线补充图S4).缺少肝脏TAp63对葡萄糖稳态的影响不是由凋亡或细胞增殖的改变引起的,因为在缺少肝脏TAp63的小鼠中,cleaved caspase 3和Ki67(分别是凋亡和增殖的标记物)的免疫染色与对照组小鼠相似(在线补充图S5).然而,在患有肝细胞癌的小鼠(作为对照)的肝脏中,这些影响是清晰可见的。

p63 binds to SIRT1. (A) Two putative motifs for TP63 found in the SIRT1 promoter using the JASPAR database. Eukaryotic Promoter Database identifies TP63 binding sites (black spots) in the SIRT1 promoter. (B) Luciferase reporter assay in AML12 cells transfected with the control si (si0) or sip63, and the control pTa-luciferase or pTA-202-Sirt1-luciferase for 48 hours, and luciferase activity was measured. (C) p63 and SIRT1 mRNA levels in AML12 cells transfected with si0 or sip63. (D) SIRT1 activity in AML12 cells transfected with si0 or sip63. Cells were kept in complete medium (CM). (E) Luciferase reporter assay in AML12 starved cells (kept in Krebs–Henseleit–HEPES buffer (KHH)) transfected with the control plasmid (p0) or a plasmid overexpressing Tap63 (pp63), and the control pTa-luciferase or pTA-202-Sirt1-luciferase for 24 hours. (F) p63 and SIRT1 mRNA levels in AML12 starved cells transfected with p0 or pp63. (G) SIRT1 activity in AML12 starved cells transfected with p0 or plasmid overexpressing TAp63. (H) Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay. Soluble chromatin prepared from AML 12 cells transfected with the pCDNA3 (empty vector) or the TAp63-FLAG vector for 48 hours was immunoprecipitated with an anti-FLAG antibody or control IgG. The immunoprecipitated DNA was amplified by PCR using primers amplifying the proximal binding site of p63 in the SIRT1 gene promoter. Intensity of the PCR product from three experiments was quantified. Expression of HPRT served as loading control, and control values were normalised to 100%. Data are presented as mean±SE mean. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, using a Student’s t-test (C,D,F–H), or one-way analysis of variance followed by a Bonferroni multiple comparison test (B,E).
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
图3

p63与SIRT1结合。(A)利用JASPAR数据库在SIRT1启动子中发现TP63的两个假定基序。真核启动子数据库识别了SIRT1启动子中的TP63结合位点(黑点)。(B)在转染对照si (si0)或sip63和对照pta -萤光素酶或pta -202- sirt1 -萤光素酶48小时的AML12细胞中进行萤光素酶报告实验,并测定萤光素酶活性。(C)转染si0或sip63的AML12细胞中p63和SIRT1 mRNA水平。(D) si0或sip63转染的AML12细胞中的SIRT1活性。细胞置于完全培养基(CM)中。(E)转染对照质粒(p0)或过表达Tap63的质粒(pp63)和对照的pta -萤光素酶或pta -202- sirt1 -萤光素酶24小时的AML12饥饿细胞(保存在krebs - henseleits - hepes缓冲液(KHH)中)的萤光素酶报告试验。(F)转染p0或pp63的AML12饥饿细胞中p63和SIRT1 mRNA水平。(G)转染过表达TAp63的p0或质粒的AML12饥饿细胞中的SIRT1活性。 (H) Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay. Soluble chromatin prepared from AML 12 cells transfected with the pCDNA3 (empty vector) or the TAp63-FLAG vector for 48 hours was immunoprecipitated with an anti-FLAG antibody or control IgG. The immunoprecipitated DNA was amplified by PCR using primers amplifying the proximal binding site of p63 in the SIRT1 gene promoter. Intensity of the PCR product from three experiments was quantified. Expression of HPRT served as loading control, and control values were normalised to 100%. Data are presented as mean±SE mean. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, using a Student’s t-test (C,D,F–H), or one-way analysis of variance followed by a Bonferroni multiple comparison test (B,E).

图4

肝脏TAp63通过SIRT1调控糖异生。(A)对照组或TAp63LKO小鼠在注射sh-荧光素酶或sh-SIRT1后进行丙酮酸耐量试验(PTT)、葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐量试验(ITT)。(B)对照组和TAp63LKO小鼠在注射sh-荧光素酶或sh-SIRT1后餐后血糖水平。(C)对照组或p63 LKO小鼠在喂食后注射sh-荧光素酶或sh-SIRT1后的SIRT1、PCK1和G6Pase蛋白水平(RF)。曲线下面积(AUC)也显示出来。(D)对照组或TAp63LKO小鼠在注射sh-荧光素酶或sh-SIRT1后的ALT和AST水平。(E)小鼠注射sh-荧光素酶或sh-SIRT1后的SIRT1 mRNA水平。GAPDH (western blot)的表达HPRT (qRT-PCR)作为加载对照,对照值归一化为100%。数据以平均值±SE平均值表示。*P<0.05, ** P< 0.01, *** P< 0.001,采用单因素方差分析,然后采用Bonferroni多重比较检验。 *Indicates differences compared with control group. #Indicates differences between sh-luciferase and sh-SIRT1 mice.

图5

肝脏TAp63过表达加重糖异生。(A)注射AAV8-GFP或AAV8-TAp63的野生型(WT)小鼠的p63 mRNA水平。注射AAV8-GFP或AAV8-TAp63的WT小鼠的食物摄入量(B)和累积体重增加(C)。(D)注射AAV8-GFP或AAV8-TAp63的WT小鼠丙酮酸耐量试验(PTT)、葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐量试验(ITT)。(E)随意喂食或接受60%热量限制(CR)的小鼠的体重和血糖。(F)上述各组的SIRT1蛋白水平。(G)自由喂养或禁食24小时的WT小鼠的SIRT1蛋白水平。注射AAV8-GFP或AAV8-TAp63的WT小鼠的血糖(H)和SIRT1蛋白水平(I)。以HPRT (qRT-PCR)或GAPDH (western blot)表达作为加载对照;对照值归一化为100%。 Data are presented as mean±SE mean. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, using a Student’s t-test (A,D,E,G–I), or one-way analysis of variance followed by a Bonferroni multiple comparison test (F). AUC, area under curve.

然后我们将TAp63LKO小鼠肝脏中的TAp63 (图2米)通过注入含有WT TAp63 cDNA的AAV8;TAp63的表达逆转丙酮酸和再食性高血糖(图2 n, O),在GTT或ITT期间没有差异(在线补充图S6).此外,在恢复TAp63LKO小鼠的肝脏TAp63后,我们没有检测到SIRT1或糖异生酶PCK1或G6Pase在再喂养(图2 p).总之,这些数据表明,肝脏TAp63的缺乏通过增加糖异生基因的水平,有利于肝葡萄糖的产生,而TAp63的挽救逆转了这些影响。p63结合SIRT1启动子并调节其活性

图6

肝脏TAp63介导胰岛素作用。(A)腔静脉注射生理盐水或胰岛素5 U/kg小鼠的p63 mRNA水平。(B) THLE-2细胞的p63 mRNA水平保持在完全培养基(CM), KHH或KHH与胰岛素(10 nM)。(C) THLE-2细胞中p63 mRNA水平保持在CM、KHH、KHH与胰岛素(10 nM)或KHH与胰岛素(10 nM)和LY294002 (10 nM)。(D)将表达GFP或经生理盐水或胰岛素处理的CRE的AAV8注射到腔静脉的FloxTAp63小鼠中,pAKT和SIRT1的蛋白水平。(E)经生理盐水或胰岛素(10 nM)处理的THLE-2细胞中pAKT和SIRT1的蛋白水平。(F)转染si0或sip63的THLE-2细胞在胰岛素存在或不存在的情况下产生葡萄糖(10 nM)。(G)注射了编码GFP或过表达TAp63病毒的野生型小鼠的SIRT1蛋白水平。以HPRT (qRT-PCR)或GAPDH (western blot)表达作为加载对照,对照值归一化为100%。数据以平均值±SE平均值表示。 *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, using a Student’s t-test (A,D,E), or one-way analysis of variance followed by a Bonferroni multiple comparison test (B,C,F,G).

SIRT1是一种营养敏感的去乙酰化酶,其水平和活性随着热量限制而增加,从而通过激活肝脏糖异生保持血糖状态。例如,SIRT1通过刺激必需的糖异生酶(包括G6Pase和PCK1)的表达,在禁食适应反应中发挥关键作用。16日20我们观察到,肝脏缺乏TAp63的小鼠中SIRT1水平升高,而TAp63LKO小鼠中TAp63表达后SIRT1水平恢复,我们评估了p63和SIRT1之间的关系,以调节肝脏糖异生。通过使用JASPAR数据库(http://jaspar.genereg.net/),我们总共发现了19个p63的假定结合位点(在线补充图S7A)在小家鼠和智人的SIRT1基因启动子中。然而,当应用限制性条件时,使用p值<0.001,我们仅在SIRT1启动子区域起始转录位点上游的前100个碱基对(bp)中检测到一个结合位点(https://epd.epfl.ch//index.php) (图3一).值得注意的是,这个片段在老鼠和人类之间是保守的(在线补充图S7B).

图7

肝脏TAp63与人类2型糖尿病相关。(A)正常血糖(NG)或2型糖尿病(T2D)患者的肝脏TAp63和SIRT1蛋白水平。(B) p63与空腹血糖、口服糖耐量试验(OGTT)和稳态模型评价(HOMA)指数的相关性。(C) TAp63蛋白水平与SIRT1蛋白水平的相关性。GAPDH表达作为加载对照,对照值归一化为100%。数据以平均值±SE平均值表示。***p<0.001,使用学生t检验(a)。

为了评估TAp63对SIRT1可能的转录调控作用,在p63缺失或存在的情况下,使用对照质粒(pTa luc)或含有−202 bp SIRT1启动子区(pTa -202- SIRT1 -荧光素酶)的质粒进行荧光素酶报告实验。首先,在AML12细胞中沉默p63后,发现SIRT1启动子中的荧光素酶活性显著增加(图3 b).与此一致的是,沉默p63增加了SIRT1的表达和活性(图3 c, D).相反,在转染过表达TAp63的质粒的饥饿细胞中,SIRT1启动子上的荧光素酶活性显著降低(图3 e在线补充图S7C), SIRT1 mRNA表达和活性均降低(图3 f, G).为了最终证明转录因子p63与SIRT1启动子的结合,我们进行了ChIP试验,证实这两个因子之间的相互作用(图3 h).这些结果表明,TAp63直接调控SIRT1,抑制其表达和活性。

肝脏中SIRT1的降低使缺乏TAp63的小鼠血糖水平恢复

我们接下来研究了SIRT1作为TAp63在体内葡萄糖代谢影响的中介是否具有功能相关性。为此,我们通过注射慢病毒shrna -荧光素酶(对照)或shRNA-SIRT1来抑制TAp63LKO小鼠肝脏中的SIRT1。如上所述,肝脏中缺乏TAp63加剧了丙酮酸诱导的高血糖,这是糖异生能力增加的结果。然而,当SIRT1也被敲除时,PTT期间的葡萄糖水平与在对照组小鼠中观察到的相同;这与GTT或ITT期间的变化无关(图4一).

我们还在一夜禁食后进行了再喂养实验,发现SIRT1的缺失使葡萄糖水平恢复到对照组小鼠的水平(图4 b).当我们测量与葡萄糖合成相关的蛋白质时,在TAp63LKO小鼠中SIRT1、PCK1和G6Pase的增加水平在SIRT1敲低后得到改善(图4 c).需要注意的是,血清天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平没有改变(图4 d),肝脏SIRT1的下调是特异性的,因为它在其他器官中的表达仍未改变(图4 e).这些结果表明SIRT1在介导TAp63对葡萄糖代谢的作用中起着关键作用。

我们还研究了这些喂食鼠粮的小鼠是否有脂质代谢和/或炎症的改变。三组小鼠的油红O染色无差异(在线补充图S8A).也评估了与新生脂肪生成(FAS, pACC/ACC)、脂质氧化(CPT1)和脂质摄取(LPL)有关的酶的蛋白质水平,未检测到显著差异(在线补充图S8B).炎症相关基因(Tnfα, Il1β, Il6, Tgfβ, F4/80)和脂质运输/胆固醇代谢相关基因(Cyp7a1, Apoa1, Hmgcr)的mRNA表达无差异(在线补充图S8C,D).最后,总CREB和磷酸化CREB蛋白水平也保持稳定(在线补充图S8E).

总之,我们的数据表明,在8-10周的鼠粮喂养的小鼠中,肝脏中缺乏p63并不会导致脂质储存、炎症或胆固醇代谢的显著变化。

肝脏中过表达TAp63会降低糖异生能力,增加胰岛素敏感性

为了测试TAp63是否作为肝糖异生的抑制因子,我们接下来进行了一个功能获得实验,给WT小鼠(图5一个).肝脏中TAp63的过表达对体重和摄食量无影响(图5 b, C).当用丙酮酸刺激小鼠时,TAp63水平上调组的葡萄糖水平比对照组低(图5 d).值得注意的是,与TAp63的KO模型相比,这些小鼠也表现出更高的胰岛素敏感性(图5 d),表明TAp63在减少糖异生中起重要作用。事实上,当小鼠受到热量限制或禁食(两种有利于产生葡萄糖的条件)时,在肝脏中表达异位TAp63的小鼠显示出葡萄糖水平和Sirt1表达降低,而Sirt1表达在对照WT小鼠中显著升高(图5练习).这些数据表明,TAp63水平的增加降低了肝脏的糖异生能力。需要注意的是,这些影响与细胞凋亡和/或细胞增殖的变化无关(在线补充图S9A)、胰高血糖素信号通路缺陷(在线补充图S9B).

为了更好地研究禁食如何影响p63和SIRT1的调节,我们在WT小鼠中进行了禁食时间-过程实验(6-12-24小时)。我们发现,正如预期的那样,空腹期间血糖水平逐渐下降,而SIRT1表达增加(在线补充图S10A).在整个禁食过程中肝脏p63表达增加(在线补充图S10A).与此一致的是,我们发现SIRT1与TAp63、SIRT1与血糖显著负相关,血糖与TAp63显著正相关(在线补充图S10B).禁食诱导的SIRT1表达在营养匮乏的细胞补食或补充葡萄糖后被逆转(在线补充图S10C,D).此外,我们还测量了禁食24小时后不同组织(WAT、BAT、肌肉、肾脏和肠道)中的SIRT1水平。我们的数据表明,在BAT中,空腹后SIRT1上调并回到基线水平,但在其他研究器官中保持不变(在线补充图S10E).我们还检测了对照组小鼠和肝脏缺乏TAp63小鼠的肝脏、WAT、BAT、肌肉、肾脏和肠道中的SIRT1,未能检测到差异(在线补充图S10F).

缺乏TAp63会阻碍胰岛素信号传递

除了脂肪组织和肌肉中胰岛素刺激的葡萄糖摄取外,降低餐后血糖浓度的另一个关键机制是胰岛素介导的抑制肝脏中葡萄糖的产生。21我们发现TAp63通过调节SIRT1活性,作为肝脏糖异生的抑制因子发挥重要作用,我们进一步评估了TAp63在胰岛素降糖作用中的潜在意义。胰岛素治疗小鼠p63 mRNA表达增加(图6).此外,THLE-2饥饿细胞中低水平的p63在胰岛素处理后增加(图6 b),这一效应被PI3K/AKT抑制剂联合使用完全阻断(图6 c).接受胰岛素治疗的小鼠显示肝脏中pAKT水平的升高与肝脏TAp63的敲除无关(图6 d).然而,虽然胰岛素处理的WT小鼠显示出SIRT1蛋白水平的预期降低,但缺乏TAp63的小鼠SIRT1蛋白水平保持不变(图6 d).与此一致的是,在与胰岛素孵育的THLE-2细胞中,pAKT增加,但当p63沉默时,Sirt1表达降低(图6 e),因此,胰岛素不能降低培养基中的葡萄糖水平(图6 f).最后,我们测量了胰岛素治疗过表达GFP或TAp63的WT小鼠的SIRT1,发现胰岛素在TAp63异位过表达后能更有效地降低SIRT1 (图6克).

由于SIRT1调节糖异生信号如Foxo1和Pgc1α已被证实,我们也评估了p63是否可以调节这些因子。首先,我们测量了PGC1a乙酰化水平,发现缺乏tap63的小鼠肝脏中PGC1a乙酰化水平降低,而tap63增加了SIRT1水平- (在线补充图S11A).最后,我们研究了Foxo1在无营养培养基中培养的细胞、用胰岛素处理的细胞和用胰岛素处理的p63之前被沉默的细胞中的细胞位置。我们的研究结果显示,在胰岛素治疗后,Foxo1被排除在细胞核外,正如之前报道的那样。22然而,当p63沉默时,胰岛素对Foxo1的影响被部分改善(在线补充图S11B).总的来说,这些结果表明胰岛素刺激了p63,而缺乏这个转录因子会减弱胰岛素信号。

TAp63在肥胖者和T2D中降低,与血糖和HOMA指数呈负相关

最后,为了了解临床前研究结果的潜在临床相关性,我们评估了血糖正常的肥胖者与T2D肥胖者肝脏中TAp63的水平在线补充表S1为我们队列的临床特征)。T2D患者肝脏中TAp63蛋白水平明显降低,与SIRT1蛋白表达升高相反(图7).此外,TAp63蛋白水平与空腹血糖、OGTT后2小时血糖和胰岛素抵抗呈负相关(如HOMA指数所示)(图7 b)、糖化血红蛋白aba1c (在线补充表S2)和SIRT1表达(图7 c).多元线性回归分析还显示,胰岛素抵抗、年龄和体重指数是肝脏p63蛋白水平的主要决定因素(在线补充表S3).总之,这一证据表明,肝脏TAp63与人类葡萄糖稳态有关。

p53家族成员在癌症中的作用被广泛认可,主要是作为肿瘤抑制因子。在抑制肿瘤进展的机制中,这些成员改变了增殖细胞的细胞代谢。23然而,p53家族成员与mTOR、AMPK或AKT等因子的相互作用,使它们也在与癌细胞无关的代谢方面发挥相关作用,这些因子参与了无数的生物过程。23日24在家族成员中,p53是最广泛的研究对象,越来越多的数据表明,它可以在不同的器官中发挥作用,调节能量和葡萄糖稳态的多个方面。例如,在特定的下丘脑神经元中缺乏p53的小鼠更容易发生饮食诱导的肥胖,25而抑制白色脂肪组织中的p53可以改善t2d样疾病小鼠的胰岛素抵抗。26在肝脏中,p53缺乏导致肝脏脂肪含量增加8 27 28降低糖异生能力。29 30我们对p63的代谢作用的了解出奇地少,因为p63的下游有大量基因,它们可能表现出许多不同的生物效应。

我们的研究结果表明,p63受营养可用性的调节,更准确地说,受血糖水平的调节,而不是FGF21或胰高血糖素的调节。禁食使肝脏中p63的表达迅速减少,而当有食物时,这一变化又迅速逆转。值得注意的是,这种调节与p53的调节完全相反,在禁食和限制卡路里摄入的小鼠中,p53稳定下来,在重新喂食后恢复到基线水平。29 30这些数据代表了p53和p63之间复杂相互作用的另一个例子,它们可以在细胞水平上相互补充或对抗31).

我们还发现肝脏TAp63参与调节肝脏葡萄糖的产生,肝脏中缺乏这种亚型的小鼠在给丙酮酸后,以及在禁食后再进食后,血糖漂移更高;而过表达TAp63的小鼠则表现出胰岛素敏感性的变化。这些影响与葡萄糖耐量的相关变化无关。然而,缺乏肝脏TAp63的小鼠对胰岛素更敏感,白色脂肪组织似乎负责增加葡萄糖的摄取。这些结果与在全球缺乏TAp63的小鼠中报告的结果不同,后者肥胖、葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗,并由于脂肪利用、脂肪酸氧化和葡萄糖利用缺陷而发展为肝脏脂肪变性。6不同的动物模型可能解释了这些不同的结果。使用所有组织中缺乏TAp63的小鼠模型来解决涉及器官串扰的问题,面临着不能解释哪些组织负责这些代谢改变的限制。例如,与缺乏TAp63的小鼠相比,肝脏中缺乏TAp63的小鼠对饮食诱导的脂肪变性具有保护作用。8此外,POMC中TAp63的抑制对雄性小鼠的体重和肥胖没有影响。32总的来说,肝脏TAp63在葡萄糖和脂质代谢的调节中起着器官特异性的作用。

我们发现TAp63的调控机制与肝糖代谢的重要调节因子SIRT1有关。16 33例如,肝脏SIRT1是空腹反应中糖异生的关键调节剂,34 35在禁食和/或喂养的不同阶段,由多种因素之间的复杂相互作用决定的一种效应。我们的结果表明,p63直接结合SIRT1启动子并抑制其在肝细胞中的活性,同时沉默p63诱导的SIRT1活性。与此一致的是,只有肝脏中SIRT1的下调,才会使缺乏肝脏TAp63的小鼠与葡萄糖代谢相关的特征减弱,即在TAp63肝脏KO小鼠中检测到的PTT和禁食诱导进食后血糖升高的减少。这与之前关于TAp63全球KO小鼠模型的报道不同,在TAp63全球KO小鼠模型中,当小鼠处于热量限制或禁食状态时,SIRT1水平较低。6该报告还表明,在从TAp63全球KO小鼠获得的小鼠胚胎成纤维细胞中,TAp63在转录上激活了SIRT1。6再一次,我们的发现和之前的发现之间的明显差异可能是由不同的细胞类型和所使用的动物模型解释的,因此我们相信,在特定的细胞类型(如肝脏,正如我们在这里所做的)和组织特异性的动物模型中研究这个转录因子可以更精确地揭示它的生物学作用。

最后,我们阐明了当前数据的潜在临床价值,发现与血糖正常的肥胖者相比,T2D肥胖者肝脏中TAp63下调。TAp63与空腹血糖、OGTT后血糖水平、HOMA指数、HbA1C和SIRT1水平均呈负相关。T2D患者肝脏中TAp63水平的降低,因为尽管这些患者显示出高水平的葡萄糖和胰岛素,这些患者的肝细胞是胰岛素抵抗的。由于这些肝细胞不“感知”胰岛素,因此不吸收葡萄糖,根据我们的临床前数据,较低的p63水平是预期的结果。所有这些临床结果表明,TAp63和SIRT1之间的相互作用以一种对人类很重要的方式调节血糖水平,这可能与T2D等病理生理情况有关。值得注意的是,T2D患者中TAp63的谱和相关性与p53不同,而p53在该患者组中稳定。30.这支持了p53家族成员对葡萄糖代谢有不同作用的假设。

综上所述,我们的数据表明肝脏中的TAp63受葡萄糖可用性的调节,缺乏这一转录因子通过刺激SIRT1活性提高空腹适应反应中的血糖水平。相反,过表达TAp63会增加胰岛素敏感性。值得注意的是,这些临床前结果得到了临床数据的支持。众所周知,新陈代谢的灵活性在许多情况下是通过调节葡萄糖摄取来实现的。我们的数据揭示了一种新的机制,为葡萄糖稳态提供了新的见解,这可能与糖尿病和其他疾病的生理病理有关。总之,这项工作确定了TAp63在非肿瘤细胞葡萄糖代谢中的新的生理作用。

数据可用性声明

资料应合理要求提供。

伦理语句

病人同意发表

伦理批准

本研究涉及人类参与者,并获得了Clínica纳瓦拉大学伦理委员会的批准(方案2017.104)。参与者在参与研究前给予知情同意。

参考文献

补充材料

  • 补充数据

    这个网络仅文件已由BMJ出版集团从作者提供的电子文件生产(s),并没有编辑的内容。

脚注

  • 推特@ChusaGzlzRellan、@MFdezFondevila @RubenNogueiras

  • MJG-R和EN的贡献相当。

  • 贡献者MJG-R, EN, NdSL, AR, CV-D, SS, BP, MFF, UF, MV-R, AS, CI和AE:研究概念和设计,数据采集,数据分析和解释。MJG-R, EN, MF, DG, RP-F, VP, MS, ML, CD, RC, RN:稿件撰写和审稿。RN作为担保人。

  • 资金这项工作得到联邦研究局/科学部长Innovación y大学-产业部Investigación (CD: BFU2017-87721;ML: rti2018 - 101840 b - i00;RN: RTI2018-099413-B-I00和RED2018-102379-T), Xunta de Galicia (ML: 2016-PG068;RN: 2021-CP085和2020-PG015), Fundación BBVA (RN: BBM_BAS_0062), Fundación Atresmedia (ML和RN: 2018-PO055), Fundación Jesús Serra (RN: 2021-003),欧洲糖尿病研究基金会(RN: 2018-PO069)和ffi - feder (GF: PI19/00785;基于“增大化现实”技术:PI19/00990)。该研究还获得了欧洲共同体H2020框架计划的资助(ERC Synergy赠款-2019- watch -810331,授予注册护士、副总裁和MS)。Investigación Biomédica en Red (CIBER) de Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición (CIBERobn), CIBER de Enfermedades Hepáticas y消化vas (CIBERehd)。CIBERobn和CIBERehd是西班牙卡洛斯三世Salud Carlos III研究所(ISCIII)的倡议,由联邦储备基金支持。

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