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背景和目的苯丙酸诺龙和抑制素属于转化生长因子β二聚的多肽(TGF-β)总科和结合跨膜受体丝氨酸/苏氨酸激酶活性。本研究的目的是描述,在结肠癌细胞系和在正常和恶性人类结肠组织,抑制素亚基的表达参与苯丙酸诺龙/抑制素二聚体的形成,和I型和II激活素受体(actRI和actRII)。
方法抑制素亚基的表达和激活素受体被北方污点分析分析。抑制素βA和激活素受体表达也被评估使用聚合酶链反应(PCR)。此外,激活素A /抑制素βA本地化在人类结肠癌样本进行免疫组织化学和原位杂交。
结果CaCo2细胞中抑制素βA mRNA表达而不是SW 837或SW 1463细胞而抑制素βB和抑制素α低于检测水平。相比之下,所有四个激活素受体存在于三个细胞系。结肠癌中抑制素βA信使rna与正常结肠相比,这在四期超表达是最大的肿瘤。ActRIb mRNA水平在正常结肠略高于癌组织。通过免疫组织化学和原位杂交,激活素A和抑制素βA mRNA在场的粘膜上皮细胞在正常组织I期疾病患者,但缺席或弱存在于正常组织四期疾病患者。相反,他们现在在弱到中度水平阶段我癌症,但在四期癌症的高水平。
结论我们的发现表明苯丙酸诺龙是人类在结直肠肿瘤,特别是在四期疾病,提高苯丙酸诺龙的可能性在晚期大肠癌的可能作用。
- 结肠直肠癌
- 苯丙酸诺龙βA
- 北部污点分析
略语
- TGF-β
- 转化生长因子β
- actRI
- 激活素受体I型
- actRII
- 激活素受体2型
- 的边后卫
- 胎牛血清
- DMEM
- 杜尔贝科修改鹰的媒介
- 聚合酶链反应
- 聚合酶链反应
- BSA
- 牛血清白蛋白
- 麻省理工
- (3)- 4 5-methylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyl-tetrazolium溴离子
- RT
- 反转录
- 美国公共电视台
- 磷酸缓冲盐
来自Altmetric.com的统计
结直肠癌是第二个最常见的癌症死亡原因和第四最常见癌在西方世界。在美国大约有131 000新病例的结肠直肠癌和55 1997年000人死于这种疾病。1病人自满在报道往往会导致延误诊断和症状有助于生存的结果令人失望。尽管外科治疗的普遍提高,几乎50%的结直肠癌患者仍然死于转移性肿瘤,和转移患者的五年生存率仅为9%。2,3而生存的最佳预测这种疾病仍然是最初的肿瘤的组织病理学分期,4,5这种疾病侵略性的基础可能是由于部分改变一些监管途径,导致增强的肿瘤发生。因此多达70%的病人港口APC和p53肿瘤抑制基因的突变,大约50%港口在K -突变拉癌基因,而大约15%展览Smad4基因的突变和错配修复基因。6
损失的肿瘤抑制基因的功能在结肠癌和其他恶性肿瘤是加剧了无效的负增长监管增长通常施加的抑制因素。一个组件的负增长监管是由转化生长因子β(TGF-β)总科的生长因子和受体。7,8众所周知,TGF-βs发挥重要的监管作用,正常结肠上皮细胞的发展,9高血清水平的TGF-β1结直肠癌患者与疾病进展相关。10,11然而,结肠癌细胞抵抗TGF-β介导生长抑制由于Smad4的存在突变,和更少的一般Smad2突变。3此外,结肠癌往往表现出微卫星不稳定,导致II型TGF-β受体的突变,这也会导致失去响应TGF-βs的生长抑制行为。12,13
TGF-β通路在结肠致癌作用的重要性凸显了两个观察。首先,在结肠癌有显著增加频率在一个家庭在II型TGF-β受体基因的种系突变。14然而,家庭成员不表现出光学恶性肿瘤发病率的增加。14其次,Smad3突变小鼠统一开发转移性结直肠癌。15尽管这些观察,对结直肠癌的潜在作用TGF-β家庭的其他成员也通过Smad依赖信号通路。因此,在目前的研究中我们试图描述表达苯丙酸诺龙/抑制素TGF-β家族成员和苯丙酸诺龙/抑制素受体在结肠癌细胞系和零星的结肠癌症与正常结肠组织相比。
苯丙酸诺龙/抑制素家族由三个子单元的各种二聚体的抑制素βA,抑制素βB,和抑制素α。抑制素βA和抑制素βB是密切相关的氨基酸序列同源性为64%而抑制素α氨基酸同源性27%和23%股份与抑制素βA和抑制素βB,分别。16日至18日抑制素βAβB homo形式——和通过二硫键形成连锁产生生物活性苯丙酸诺龙(βA-βA),激活素B(βB-βB),苯丙酸诺龙AB(βA-βB)。此外,抑制素β亚基形成二聚体的抑制素α亚基,生成抑制素A(βA-α)和抑制素B(βB-α)。
苯丙酸诺龙和抑制素有助于正常的生长和发育,并参与调节性腺的和extragonadal功能。16日至18日他们通过跨膜信号serine-threonine激酶受体可分为两个截然不同的子类,I型和II型受体。21页描述了两个I型受体激活素。21页ActRIb似乎是专门针对苯丙酸诺龙而actRI可能由TGF-β家族的其他成员共享。此外,两个II型受体已确定在人类(actRII和actRIIb)和苯丙酸诺龙似乎有更高的亲和力比actRII actRIIb。激活适当的细胞内信号途径取决于I型和II受体和Smad2, 3和4的蛋白质。因此TGF-β和激活素受体的激活导致Smad2和/或Smad3磷酸化,磷酸化的复杂地层Smad2或者和Smad4 Smad3,和随后的易位这些hetero-oligomeric复合物到核调节基因转录。7,8
我们现在报告,两三个检测结肠癌细胞系表达激活素受体,但通常都对激活素A的生长抑制的行为我们也证明结肠癌癌体内苯丙酸诺龙,过表达,这超表达是四期疾病最为明显。
材料和方法
材料
购买以下材料:胎牛血清的边后卫,杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)和Leibovitz l - 15中,胰蛋白酶解,和青霉素溶液从欧文科学(美国加州圣安娜);Genescreen膜来自新英格兰核(美国马萨诸塞州波士顿市);核酸限制性内切酶,天才3非放射性检测设备,和天才4 RNA和随机启动标签工具从Ambion(美国得克萨斯州奥斯汀市);(α-32 P) dCTP Amersham(美国伊利诺伊州阿灵顿高地);聚合酶链反应(PCR)从生物合成引物,Inc .(美国德克萨斯州路易斯维尔);从Gibco BRL RT-Kit和DNA分子量标记(美国马里兰州盖瑟斯堡);和一个非常具体的亲和纯化小鼠单克隆抗体对人类βA亚基的抑制素、苯丙酸诺龙Serotec(美国北卡罗来纳州罗利)。所有其他试剂是σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。SW 837 SW 1463, CaCo2人类结肠癌细胞系得到从美式文化集合(美国马里兰州罗克维尔市)。激活素A的礼物AF Parlow博士(NIDDK国家脑垂体激素和程序)。
细胞培养和增殖试验
SW 837和人类结肠癌细胞系SW 1463经常生长在Leibovitz l - 15中,补充10%的边后卫和100 U /毫升青霉素(完全培养基),而CaCo2是生长在DMEM补充15%的边后卫和100 U /毫升青霉素(完全培养基)。执行增长化验,一夜之间,细胞被镀在10 000个细胞/密度在96孔板和随后孵化在无血清培养基(Leibovitz / DMEM含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)、5μg / ml转铁蛋白,5 ng / ml亚硒酸钠,和抗生素)或完全培养基。孵化项目持续了指定的倍没有或苯丙酸诺龙面前,之前的3 - (4 5-methylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl-tetrazolium溴化(MTT, 62.5μg /)四个小时。22细胞MTT水溶性酸性异丙醇。光密度测量在570 nm ELISA板读者(分子装置,门洛帕克,加利福尼亚州,美国),如前所报道。23
组织样本
正常结肠组织样本以及癌症样本(n = 41)得到的结直肠癌患者手术的疾病(见表1)。正常组织来自同一病人的距离至少10厘米的肿瘤。根据联盟的TNM分类国际歌靠le癌症,有13个阶段我癌症,七II期癌症、七III期癌症,14四期癌症。刚删除组织样本Bouin或10%福尔马林固定,石蜡包埋进行组织学分析。立即组织样本还在液态氮冷冻手术切除并存储在−80°C到RNA提取使用。所有研究都是伯尔尼大学的伦理委员会批准的人体试验委员会加州大学欧文。
向量的建设
我互补dna编码序列对应的激活素受体(actRI)和抑制素α亚基是由PCR扩增的单链cDNA逆转从人类胎盘RNA转录。PCR产品使用标准的条件下,生成subcloned成pGEM3Zf (actRI)和Bluescript-IISK +(抑制素α)向量,和真实性被测序证实。actRI cDNA由401个基点的片段核苷酸(172 - 572)和抑制素αcDNA由405个基点片段核苷酸(478 - 882),根据公布的人类的序列。月19 - 21日引物由一个三核苷酸伸展,后跟一个限制网站(下划线)和各自的cDNA序列。actRI底漆对5′-广汽是意义GGATCCTAAGCGTCACACTGCC亚美大陆煤层气有限公司,反义5′cagAAGCTTTT CC-CTGCTCATAAACCTGG。的抑制素α底漆对感觉5′广汽GGATCCGATACATGTTCCGGCCATC,反义5′cagGAATTCCAGAGCAGAGG GA-GACCAAG。1.7 kb Clal-Xbal人类actRIb cDNA片段,2.6 kb Xbal-BamHI片段的鼠标actRII cDNA同源性人类(93%),和鼠标actRIIb cDNA 1.7 kb EcoRI-BamHI片段(91%同源性人类)J博士的礼物Massague(纪念斯隆-凯特琳癌症中心纽约,纽约,美国)。380年英国石油苯丙酸诺龙βA(人类同源性91%)(核苷酸1025 - 1404;加入基因库X69619270个基点)和苯丙酸诺龙βB(人类同源性89%)(核苷酸180 - 449;加入基因库X69620)的碎片鼠标起源的礼物M奥康纳博士(美国威斯康辛州威斯康辛大学)。真实性被测序证实。
RNA提取和北部污点分析
硫氰酸胍盐总RNA提取的酚氯仿法。24表明,聚+rna在oligo-dT纤维素由亲和色谱法。RNA在1.2%琼脂糖/ 1.8米大小分级甲醛凝胶,electrotransferred到尼龙膜、紫外辐照和交叉链接。墨迹prehybridised和高紧缩条件下和互补脱氧核糖核酸探针杂交,洗之前报道。25,26屁股被暴露在−80°C柯达BiomaxMS电影和由此产生的放射能照像扫描量化射线的强度。BamHI 190 kb的鼠标7 s cDNA片段生存与人类细胞质RNA是用来证实等于RNA加载和转移。26
PCR分析
PCR扩增产品分馏1%琼脂糖凝胶含有溴化乙锭(0.1μg /毫升)和视觉紫外线透照。盐酸凝胶孵化在0.25 30分钟23°C。DNA是在0.4 M氢氧化钠毛细管作用转移到尼龙膜(Hybond N +)。与[α-杂交了32P] -dCTP称为cDNA 10毫升杂交方案(0.75 M氯化钠,5毫米EDTA, pH值8.0,50 mM磷酸钠,pH值7.4,25%的甲酰胺,5×Denhart的解决方案,10%的硫酸葡聚糖,1% SDS,鲑鱼和1%精子DNA)。膜清洗两次在23°C 2×SSC和两次在0.1×SSPE的42°C, 2% SDS,随后暴露在−80°C柯达BiomaxMS电影了适当的时间。引物的PCR分析包括三个核苷酸伸展,后跟一个限制网站(italised)和各自的cDNA序列。引物对:意义上,5′- AGTGGATCCAAAAGATGGCCACAAA CCTG反义,5′侠盗猎车手GAATTCTTT CCTCCTCAAATGGCAAC (actRII);意义上说,5′agtGGATCCACATGGTGGAGAAGAG GGTG反义,5′侠盗猎车手GAATTCGGG TGCTATGATCCA-GTCGT(苯丙酸诺龙βB);意义上说,5′agtGGATCCGCACTTGAAGAA GAGACCCG反义,5′侠盗猎车手GAATT CCTGCTGGAGACAGGGAAGAC(苯丙酸诺龙βA)。
执行定量逆转录聚合酶链反应(RT),总RNA(2μg /样本)汇集从每个肿瘤阶段和相应的正常组织样本(n = 41)反向转录合成第一链cDNA使用上标前置放大系统,并受两轮的PCR扩增。27在第一个PCR反应,两个合成引物。每个复合底漆的目标基因序列设计的引物序列连着一小段,相反的外源DNA片段杂交,从而产生大小不同的PCR产物目标DNA。这PCR产品相同的引物模板与目标DNA作为内部标准。PCR测定的浓度和稀释100 attomole /μl。在第二步中,稀释的控制PCR产品然后一起放大目标cDNA使用基因特定的引物。竞争性PCR在标准条件下进行了27周期。rt - pcr产品大小分级2%琼脂糖凝胶和溴化乙锭染色。乐队是由凝胶扫描和量化视频系统(鹰眼注视着二世;Stratagene)。目标的相对浓度cDNA计算与标准相比值。 We used the following primer pair: sense 5′-GCACTTG AAGAAGAGACCCG and antisense 5′-CTG CTGGAGACAGGGAAGAC.
免疫印迹
洗后用磷酸缓冲盐(PBS、4°C),细胞在细胞溶解水溶性缓冲区包含50毫米三,150毫米氯化钠,2毫米EDTA, 1%诺乃清洁剂p 40, 0.1% SDS, 1%钠脱氧胆酸盐、钒酸钠1毫米,50 mM氟化钠,苯甲脒100μg /毫升、10亮抑酶肽μg /毫升,1毫米phenylmethylsulphonyl氟化物。蛋白质受到SDS-polyacrylamide凝胶电泳和转移到止动剂P膜。膜是孵化90分钟与一个非常具体的亲和纯化小鼠单克隆抗体抑制素的人类βA单元/苯丙酸诺龙,对应于82 - 114年的肽的残留物。膜被清洗和孵化与二次抗体对小鼠60分钟。额外的洗涤后,影像是由增强化学发光。
免疫组织化学
同样的非常具体的单克隆抗体对人类的抑制素、苯丙酸诺龙βA单元用于免疫印迹也利用免疫组织化学。石蜡包埋的部分(4μm)从结肠癌和相应的正常结肠组织受到免疫染色使用streptavidin-peroxidase技术。25,26内源性过氧化物酶活性被孵化30分钟0.3%过氧化氢在甲醇。组织部分被孵化15分钟(23°C)有10%正常山羊血清和孵化16小时在4°C激活素抗体(10 ng / ml)包含1% BSA在PBS。结合抗体检测与生物素化的山羊antimouse二级抗体和免疫球蛋白streptavidin-peroxidase复杂,使用diaminobenzidine tetrahydrochloride衬底。部分和迈耶的苏木精复染色。部分没有孵化主要抗体并不会产生积极的免疫反应性。
原位杂交
进行原位杂交,组织部分(4μm厚)被放置在3-aminopropyl-methoxysilane涂布幻灯片,deparaffinised,和孵化23°C 20分钟和0.2 N HCl 37°C 15分钟10μg /毫升的蛋白酶k的部分被后缀五分钟在PBS含有4%多聚甲醛,并孵化两次与PBS包含2毫克/毫升甘氨酸和一次50% (V / V)甲酰胺/ 2×SSC一小时。杂交进行在一个潮湿的室16小时50°C,增加100年μl杂交缓冲中含有氯化钠0.6米,1毫米EDTA, 10毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值(7.6),0.25% SDS, 200μg /毫升酵母tRNA, 1×Denhart的解决方案,10%的硫酸葡聚糖,40%甲酰胺,和digoxigenin贴上riboprobe (100 ng / ml),如前所报道。28-31探针的标记与digoxigenin-UTP T3和T7 RNA聚合酶使用天才4 RNA标签设备。部分被洗42°C和50%甲酰胺/ 2×SSC 20分钟,2×鳞状细胞癌20分钟,和0.2×SSC 20分钟。天才3非放射性核酸检测设备用于免疫检测。28-31部分与缓冲洗1解决方案(三羟甲基氨基甲烷HCl液达到100毫米,150毫米氯化钠,pH值7.5)和孵化1% (W / V)阻断缓冲区1试剂溶液为60分钟23°C。孵化后30分钟23°C和碱性磷酸酶的1:20 00稀释共轭多克隆绵羊antidigoxigenin Fab片段抗体,部分洗两次15分钟在23日与缓冲1解决方案包含0.2%渐变20°C,和平衡与100毫米盐酸三两分钟,100毫米氯化钠,MgCl 50毫米2在pH值9.5。部分被孵化与色彩解决方案包含氮蓝四唑和X-phosphate黑盒2 - 3小时。反应停止后TE缓冲(10毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液,1毫米EDTA, pH值8.0),部分是安装在水介质。
结果
苯丙酸诺龙一个对结肠癌细胞生长的影响
在无血清培养基48小时孵化后,苯丙酸诺龙一个抑制SW 1463结肠癌细胞的生长以剂量依赖的方式。在三个实验中,最大的抑制性影响19(1)%(平均(SEM)) (p < 0.05)发生在100 ng / ml的激活素a浓度与生长的抑制作用(p < 0.05)也发生在中补充10%的边后卫。然而,苯丙酸诺龙CaCo2或SW 837细胞没有影响,无论缺乏或血清的存在。此外,所有三个细胞株抗TGF-β1的生长抑制作用。
ACTIVIN-INHIBIN亚基的表达和激活素受体在人结肠癌细胞系
北部污点分析聚+rna与SW 837 SW 1463, CaCo2结肠癌细胞系未能揭示的存在苯丙酸诺龙/抑制素βA,βB或αmRNA转录。相比之下,抑制素βA成绩单是在胎盘容易明显RNA作为积极的控制(无花果1A)。此外,苯丙酸诺龙βA不使用免疫印迹检测在所有三个细胞株。作为一个积极的控制我们使用苯丙酸诺龙βA容易检测到的抗体出现预期大小的一个乐队(没有显示)。北部污点分析聚+rna显示4.0 kb actRI mRNA一部分出现在相对平等的水平在所有三个细胞系(无花果1B)。此外,所有三个细胞系也表达了5.2 kb actRIb mRNA转录(无花果1B)。CaCo2细胞表达actRIb的最高水平,而SW 837和SW 1463细胞表达水平相对较低的mRNA一半(无花果1B)。ActRII和actRIIb mRNA转录水平以下的北部印迹聚的检测+rna(没有显示)。
北部污点分析聚+rna。聚+rna(2μg / lane)准备从细胞系SW 1463 SW 837和CaCo2杂交32P称为cDNA探针(500 000 cpm /毫升)特定的抑制素βA (A),或32P称为cDNA探针(500 000 cpm /毫升)具体actRI和actRIb (B)。人类胎盘RNA作为积极控制抑制素βA成绩单。曝光时间是12小时。
进一步评估的表达苯丙酸诺龙βA和II型激活素受体在结肠癌细胞系,rt - pcr分析高度敏感。这种分析揭示了存在的抑制素βA mRNA转录CaCo2细胞而不是SW 837或SW 1463细胞(无花果2A)。相比之下,actRII actRIIb成绩单和rt - pcr检测的所有三个细胞系。证实了真实性的PCR产品吸墨水使用α-南部32P标记actRII、actRIIb、苯丙酸诺龙βA cDNA片段它放大区域(图覆盖2B)。
聚合酶链反应(PCR)分析。RNA的细胞系(SW 1463 SW 837和CaCo2)反向转录,受到使用引物PCR抑制素βA, actRII, actRIIb,在材料和方法部分描述。(一)溴化乙锭染色。(B)印迹分析。过滤器与α-杂交32P称为cDNA片段(500 000 cpm /毫升)覆盖相应的放大区域。曝光时间为5个小时。
北部污点分析人类结肠组织
接下来,我们检查了组织样本的41对结直肠癌患者手术。病人的临床特点列于表1。所有的患者术前化疗或放疗。北部的污点分析总RNA分离出这些患者的结肠的正常部分显示6.5 kb抑制素βA mRNA一半是可见的只有两个样品。相比之下,抑制素βA强烈表达26 41癌症组织。此外,过度的频率的抑制素βA mRNA往往与疾病阶段。13因此,六个阶段我样品(46%)和13 14四期样品(93%)高水平的表达抑制素βA mRNA。一组代表的北方墨迹图所示3。
表达抑制素βA人类结肠。总RNA(20μg / lane) 28日(7 /阶段)结肠癌和相应的正常结肠粘膜受到北方污点分析样品。(一)32P标记抑制素βA cDNA探针(500 000 cpm /毫升)是用来执行杂交。曝光时间是12小时。(B)32P标记7 s cDNA探针(50 000 cpm /毫升)是用来证实等效荷载的车道。曝光时间是6个小时。左边的罗马数字显示疾病阶段。
量化的差异抑制素βA表达在正常和癌症样本,定量rt - pcr进行。所有四个阶段的疾病,抑制素βA mRNA水平升高与水平相比,癌症样本各自的控制组织(无花果4)。当数据被表示为一个比光密度对癌症与正常样本,阶段》表现出的5到6倍的增加水平的抑制素βA比相应的正常组织(无花果4)。有一个戏剧性的40倍增加这个比例在四期疾病(无花果4)。相比之下,抑制素βB和αmRNA转录水平以下的检测northern 41正常和肿瘤样本。
定量逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),抑制素βA mRNA。合成第一链cDNA从每个阶段使用池总执行信使rna (I-IV)和定量rt - pcr分析,在材料和方法部分描述。溴化乙锭(A)代表凝胶(第三阶段)。上箭头表示系列稀释而降低箭头表示放大抑制素βA信使RNA从汇集第三阶段RNA样本。(B)浓度的抑制素βA mRNA在正常结肠和癌变组织。在苯丙酸诺龙(C)比癌症/正常βA mRNA的表达。竖线表示SEM值。
我们下一个决心不同激活素受体的表达水平在同一组织。4.0 kb actRI mRNA转录是出现在所有癌症和正常组织样本(图415)。光密度分析表明,与正常结肠相比有下降1.7倍actRI mRNA水平阶段I和II, III期疾病,下降了3.1倍和1.8倍下降四期疾病。actRIb和actRIIb mRNA转录northern低于检测水平的总RNA在正常和癌组织(数据未显示)。相比之下,3.0和6.0 kb法RII mRNA转录在八13可见正常和八13 I期疾病、癌症样本和10的14正常,并在11日14四期疾病、癌症样本。总的来说,actRII mRNA水平类似在正常和癌症样本在所有四个阶段。
表达人类结肠actRI。总RNA(20μg / lane) 28日(7 /阶段)结肠癌和相应的正常结肠粘膜受到北方污点分析样品。(一)32P标记actRI cDNA探针(500 000 cpm /毫升)是用来执行杂交。曝光时间是12小时。(B)32P标记7 s cDNA探针(50 000 cpm /毫升)是用来证实等效荷载的车道。曝光时间是6个小时。左边的罗马数字显示疾病阶段。
免疫组织化学和原位杂交
的表达在结肠癌的抑制素样品/苯丙酸诺龙βA评估免疫组织化学和原位杂交。中强抑制素、苯丙酸诺龙βA免疫反应性存在于正常结肠粘膜的I期疾病患者,这是最明显的隐窝上皮细胞衬。样本较强烈的抑制素免疫反应性,也表达了相对较高的水平βA北部污点分析图所示6a。相比之下,只有微弱的抑制素、苯丙酸诺龙βA免疫反应性很明显在这个细胞类型在正常粘膜从四期疾病患者(无花果6D)。相反,微弱的抑制素、苯丙酸诺龙βA免疫反应性是在癌细胞从舞台我只是偶尔明显疾病(图7)而强烈的抑制素、苯丙酸诺龙βA免疫反应性存在于癌细胞从四期疾病(图7D,表2)。
免疫组织化学和原位杂交分析在正常结肠。适度抑制素、苯丙酸诺龙βA在正常粘膜免疫反应性是容易明显从I期疾病患者(A)。这个示例也表达了相对高水平的抑制素βA mRNA的北部污点分析。相比之下,抑制素、苯丙酸诺龙βA正常粘膜免疫反应性是相对较弱的患者从四期疾病(D)。原位杂交显示适度抑制素βA信使rna信号(B)在舞台上我疾病和一个非常弱的抑制素βA信使rna信号在四期疾病(E),感觉探针(C、F)没有产生任何特定的信号。规模的酒吧、25μm。
免疫组织化学和原位杂交分析结肠癌。只有微弱的抑制素免疫反应性/苯丙酸诺龙βA可见在I期疾病(A)而四期疾病表现出强烈抑制素、苯丙酸诺龙βA免疫反应性(D),原位杂交显示疲弱抑制素βA信使rna信号I期疾病(B)和一个强烈的信号在四期疾病(E),感觉探针(C、F)不产生任何特定的信号。规模的酒吧、25μm。
在21个结肠组织原位杂交进行确定的确切地点的表达抑制素βA mRNA。在正常组织中,原位杂交信号对应于抑制素βA mRNA在三个相对强劲的三阶段我样品(图6B)和缺席(n = 3)或很弱(n = 2)在第四阶段样品(图6E)。相比之下,抑制素βA mRNA表达在低水平在两个7 I期疾病患者样本,和在高水平在三四个四期疾病患者样本。原位杂交探针没有产生任何特定的感觉信号的正常(图6(图C、F)或癌症样本7C、F)。癌症样本的结果列于表3。
讨论
苯丙酸诺龙最初定性为刺激器从垂体前叶促卵泡激素的生产。32,33随后,他们发现在生殖和其他组织发现发挥重要的内分泌,旁分泌、自分泌和行动,导致细胞增殖的规定,开发和分化功能。16,17苯丙酸诺龙的多功能性质由发现苯丙酸诺龙强调抑制增长的细胞系,包括前列腺癌细胞系、血管内皮细胞、乳腺上皮细胞,肝细胞品种马非常但刺激增长BALB / c 3 t3成纤维细胞、颗粒细胞、红血球生成的祖细胞,卵巢癌细胞系。39-42有趣的是,抑制素α缺陷小鼠表现出高水平的循环激活素和发展性腺的间质肿瘤,43,44提高的可能性增加苯丙酸诺龙表达式在某些情况下可能是肿瘤发生的。支持这个概念发现胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和苯丙酸诺龙过表达,28,45,46,子宫内膜和宫颈癌症患者血清激活素水平高。47
在目前的研究中我们认为CaCo2大肠癌细胞表达抑制素βA mRNA而SW 837和SW 1463没有。所有四个激活素受体存在于这三个细胞系。然而,只有CaCo2细胞容易表现出actRI和actRIIb mRNA转录northern而ActRII和actRIIb只是容易被PCR分析。因此毫不奇怪,外源苯丙酸诺龙并没有改变SW 837或CaCo2细胞的生长。依然,苯丙酸诺龙产生了轻微的但在SW 1463个细胞显著增长的抑制作用,这种抑制作用并没有改变在血清的存在。这些结果与我们的研究结果在胰腺癌细胞株,其中一些增长刺激血清的存在和生长抑制。28这些观察表明,结肠癌细胞的行为通常都对苯丙酸诺龙,或略有增长抑制TGF-β家族的成员。这种阻力可能是由于扰动Smad信号级联或我们的细胞系表达低水平的actRII actRIIb,只能通过PCR检测。实际上,低水平的激活素受体与乳腺癌细胞的抗苯丙酸诺龙。48
人类结肠癌样本分析显示,抑制素βA,形式为收益率苯丙酸诺龙,在结肠癌中,尤其是在第四阶段的疾病。在我结直肠疾病阶段,只有46%的病人表示抑制素βA单元而几乎所有四期疾病患者(93%)显示增强了肿瘤细胞表达的亚基。此外,在正常组织样本相同的病人我们发现抑制素βA只在舞台上我情况下而在阶段II-IV这个成绩单是北部污点的检测分析的水平以下。
进一步描述这种差异表达,我们进行了定量rt - pcr池总RNA的每一个阶段。有一个阶段相关癌症正常比例的增加抑制素βA mRNA水平。因此在第四阶段疾病有一个减少抑制素βA mRNA水平在正常样本和增加癌症样本。因此,有一个40倍增加癌症的比率正常抑制素βA成绩单。这些观察是一致的与免疫组织化学数据显示微弱的苯丙酸诺龙βA免疫反应性的五阶段癌症样本我病,和强大的苯丙酸诺龙βA免疫反应性四个五个癌症样本中四期疾病。这是一个完全相反的研究结果在正常组织因为苯丙酸诺龙βA免疫反应性是中等强度的正常粘膜从舞台我疾病但没有或仅有弱四期的正常粘膜疾病。原位杂交数据证实,抑制素βA mRNA表达水平上高于I期疾病的正常粘膜相比四期疾病。它还表明,最强的和最丰富的抑制素βA信使rna信号的四期患者疾病的癌细胞。综上所述,这些观察结果表明,结肠癌细胞获得增加的能力表达抑制素βA正常结肠黏膜疾病进展而逐渐失去了这种能力。
ActRI表达减少结直肠癌与正常对照组相比,特别是在第三阶段的疾病。相比之下,actRII表达两组相似而actRIb和actRIIb低于检测水平。actRI水平下降,明显缺乏actRIb和actRIIb提高的可能性,在结肠癌癌肿瘤细胞耐苯丙酸诺龙介导的抑制增长。例如,I型TGF-β受体水平下降大约30%的胰腺癌,这已被证明是减少TGF-β1反应的下降有关。49结合这一事实约20%的零星的结肠直肠癌展览Smad4展览Smad2突变,突变和7%6,50,51这些发现表明,各种扰动的苯丙酸诺龙βA结肠癌细胞信号通路可能使他们对激活素介导的抑制增长。
目前结直肠癌分子模型表明序列基因改变是癌症形成的基础。这些改变包括扰动在APC /β-catenin通路,COX2的过度表达,p53和DNA错配修复基因突变,K -拉突变,和微卫星不稳定性与II型TGF-β受体突变有关。6大约有90%的直肠癌微卫星不稳定性和15%的零星的结肠直肠癌港口在这个受体突变。6突变在II型TGF-β受体或Smad4或Smad2基因50,51渲染抗结肠癌细胞生长抑制TGF-β的行动。6表面上,癌细胞派生TGF-β二聚体可以发挥旁分泌作用促进血管生成,抑制癌症的免疫机制,并改变细胞外基质的方式提高癌症扩散和转移。52在这种背景下,值得注意的是删除的Smad4基因通过同源重组HCT116人类大肠癌细胞最初包含两个正常Smad4等位基因导致的损失TGF-β1和苯丙酸诺龙响应能力。53此外,在所有TGF-β家庭成员、苯丙酸诺龙最像TGF-β受体激活和受体的模式结构。54结合,抑制素βA /苯丙酸诺龙明显在四期结肠癌,这些观察提高的可能性,像TGF-β,激活素可能通过旁分泌机制促进结肠癌扩散。此外,我们的研究结果表明,苯丙酸诺龙可能作为一种先进的结肠直肠癌的标志。
确认
这项工作是由公共卫生服务支持格兰特ca - 75059 Korc博士授予由国家癌症研究所。Wildi博士是收件人的博士后培训奖乌苏拉Zindel-Hilti-Foundation和Ciba-Geigy-Anniversary基础。他是一个研究员的内脏和伯尔尼大学医院的移植手术,瑞士。Kleeff博士奖学金奖的接受者从加州大学研究和教育的拨款基因治疗癌症。
略语
- TGF-β
- 转化生长因子β
- actRI
- 激活素受体I型
- actRII
- 激活素受体2型
- 的边后卫
- 胎牛血清
- DMEM
- 杜尔贝科修改鹰的媒介
- 聚合酶链反应
- 聚合酶链反应
- BSA
- 牛血清白蛋白
- 麻省理工
- (3)- 4 5-methylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyl-tetrazolium溴离子
- RT
- 反转录
- 美国公共电视台
- 磷酸缓冲盐