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  • 69卷，第2期
  • 在阿尔茨海默病动物模型中，健康菌群的转移减少了淀粉样蛋白和tau蛋白的病理

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肠道微生物群
在阿尔茨海默病动物模型中，健康菌群的转移减少了淀粉样蛋白和tau蛋白的病理
免费的
  1. Min-Soo金1，2，
  2. Yoonhee金3.，
  3. 不过崔4，
  4. Woojin金5，
  5. Sumyung公园5，
  6. Dongjoon李3.，
  7. 金东奎3.，
  8. 金幸俊3.，
  9. Hayoung崔3.，
  10. Dong-Wook Hyun1，
  11. June-Young李1，
  12. 崔恩英5，
  13. Dong-Sup李5，
  14. Jin-Woo Bae1，
  15. Inhee Mook-Jung3.，4
  1. 1生命与纳米制药科学系和生物学系，庆熙大学，Dongdaemun-gu,首尔，大韩民国
  2. 2微生物与分子生物学系“，，忠南大学，大田市，大韩民国
  3. 3.生物化学与生物医学科学系“，，首尔大学医学院，首尔，大韩民国
  4. 4基因工程跨学科研究生课程“，，首尔国立大学，Gwanak-gu,首尔，大韩民国
  5. 5生物医学科学系，首尔大学医学院，首尔，大韩民国
  1. 对应到韩国庆熙大学生命与纳米制药科学系与生物学系教授裴振宇(音译)，首尔02447;baejw在{}khu.ac.kr；首尔国立大学医学院生物化学与生物医学科学系教授，韩国首尔03080;inhee在{}snu.ac.kr

摘要

客观的脑淀粉样变和严重的脑牛皮病是阿尔茨海默病(AD)的主要病理特征。尽管肠道菌群对AD有很强的影响，但肠道菌群与AD病理生理之间的因果关系仍不清楚。

设计利用最近发现的伴有淀粉样蛋白和神经纤维缠结(ADLP)的ad样病理恰当的)的AD转基因小鼠模型，其大脑中显示淀粉样斑块、神经纤维缠结和反应性胶质细胞增生，并伴有记忆缺陷，我们检查了肠道菌群对AD发病的影响。

结果ADLP中肠道菌群的组成恰当的与健康野生型(WT)小鼠不同。此外,ADLP恰当的小鼠显示上皮屏障完整性的丧失和慢性肠道和全身炎症。WT小鼠粪便菌群的频繁转移和移植到ADLP中恰当的小鼠改善β淀粉样蛋白斑块和神经纤维缠结的形成，神经胶质反应性和认知障碍。此外，粪便菌群转移逆转了ADLP中肠道巨噬细胞活性和循环血液炎性单核细胞相关基因的结肠表达异常恰当的收件人老鼠。

结论这些结果表明，微生物介导的肠道和系统免疫畸变是ADLP AD发病的重要原因恰当的对肠道(结肠基因表达、肠道通透性)、血液(血液免疫细胞群)和脑(病理)轴与AD(记忆缺陷)之间的关系提供了新的见解。因此，恢复肠道微生物稳态可能对AD的治疗有有益作用。

  • 阿尔茨海默病
  • 肠道微生物群
  • 粪便菌群转移
  • β-淀粉样蛋白
  • 过度磷酸化τ

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2018-317431

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    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • 阿尔茨海默病(AD)是一种与年龄有关的神经退行性疾病，其特征是脑内β -淀粉样斑块积累、神经纤维tau蛋白缠结和神经炎症;记忆缺陷也是AD的一个常见特征。

    • 对AD患者的人体研究表明，AD患者和年龄匹配的对照组之间的肠道微生物多样性是不同的，益生菌可以改善AD患者的认知功能。

    • 使用包括5×FAD小鼠在内的几种AD动物模型的研究也发现了肠道菌群和淀粉样蛋白病理之间的相关性;然而，肠道菌群和tau蛋白缠结之间的因果关系尚未被研究。

    新的发现是什么?

    • 肠道菌群改变，上皮屏障完整性丧失，肠道和全身炎症表现为ad样病理，伴有淀粉样和神经纤维缠结(ADLP)恰当的)小鼠，一个最近开发的转基因AD小鼠模型显示β -淀粉样蛋白(a β)和tau蛋白在大脑中一起病理。

    • 健康野生型小鼠粪便菌群的长期、频繁转移和移植可缓解ADLP的Aβ沉积、tau病理、反应性胶质细胞增生和记忆障碍恰当的老鼠。

    • 具体来说，健康的粪便菌群长期转移到ADLP恰当的小鼠逆转肠道巨噬细胞活性和循环血液Ly6C嗨单核细胞数量，与野生型小鼠水平相似。

    • 它为肠道(结肠基因表达、肠道通透性)、血液(血液免疫细胞群)和脑(病理)轴与AD之间的关系提供了新的见解。

    本研究的意义

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 肠道菌群的恢复和健康菌群的维持有助于延缓AD的发病和随年龄增长的认知障碍。

    • 改变或维持肠道菌群环境是AD患者或认知障碍受试者临床治疗和老年人群临床预防需要考虑的因素之一。

    简介

    阿尔茨海默病(AD)的特征是在整个大脑中积聚β -淀粉样蛋白(Aβ)和过度磷酸化的tau蛋白，并伴有突触功能障碍。1此外，炎症信号的改变发生在AD大脑中，正如激活的小胶质细胞和星形胶质细胞所揭示的那样。2这些特征会导致认知障碍和记忆丧失。3.尽管AD的神经病理学特征有很好的文献记载，但目前还没有有效的治疗方法能够阻止或延缓AD的进展。因此，我们需要考虑基于各种病理途径的AD治疗新方法。

    肠道菌群被认为是一种被遗忘的宿主生理和代谢调节剂，4微生物群的影响延伸到大脑发育和认知功能。5在帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症中，肠道菌群和神经退行性疾病之间可能存在联系。6 7对转基因AD模型和患者的微生物组学研究试图完善先前对AD发病机理的认识，并对AD病理进行不同的表征。在小鼠AD模型和人类AD患者中观察到肠道菌群的组成和生物多样性的变化。8 9应用抗生素治疗APP/PS1小鼠(ABX)103×Tg注射益生菌的AD小鼠11脑Aβ沉积减少，外周循环细胞因子、趋化因子和肠道激素模式改变。此外，a β病理可通过将改变的菌群移植到无菌环境中传播应用程序转基因小鼠,8这表明肠道菌群在早期AD发病机制中起着隐藏的作用。然而，包括tau蛋白缠结在内的AD发病机制背后的肠道菌群的特定信号介质或机制目前尚不清楚。

    在这项研究中，我们在最近开发的转基因小鼠AD模型中检测了肠道菌群对AD发病机制的影响，AD样病理伴有淀粉样蛋白和神经纤维缠结(ADLP)恰当的)，显示了大脑中的Aβ和tau病变。12我们发现，肠道微生物群落组成的改变和上皮屏障完整性的丧失诱发了以ADLP为表现的病理条件下的全身慢性炎症恰当的老鼠。值得注意的是，来自健康野生型(WT)小鼠的粪便菌群的频繁转移和移植减轻了Aβ斑块和tau蛋白纠缠的形成，以及ADLP中的记忆缺陷和反应性胶质细胞增生恰当的老鼠。此外，肠道菌群的调节改变了结肠基因表达和外周免疫细胞数量。我们的研究结果阐明了肠道菌群在AD发病机制中的关键作用，并提示异常免疫反应作为宿主大脑和肠道菌群之间远程通信的潜在调节器。

    方法

    行为测试

    y迷宫自发交替是一种短期空间学习和记忆的行为测试。13情境恐惧条件反射是对长期空间学习和记忆功能的一种测试。14开放场试验通常用于评估啮齿类动物的焦虑样行为。15

    基于16S rRNA基因的群落分析

    提取粪便宏基因组DNA，用454焦磷酸测序GS FLX Titanium (Roche)和Illumina MiSeq测序(Illumina)对16S核糖体RNA (rRNA)基因高可变区进行测序。

    粪便菌群的频繁转移和移植

    给ADLP灌胃WT小鼠新鲜粪便恰当的频繁的粪便菌群转移(FMT)，以及abx预处理的ADLP恰当的小鼠粪便菌群移植4周。

    Aβ ELISA分析

    采用ELISA法检测ADLP大脑皮层Aβ水平恰当的老鼠。16

    免疫组织化学

    游离组织切片用适当的一抗和Alexa荧光团偶联二抗体染色进行共聚焦成像。

    数据库提交

    16S rRNA扩增子和结肠RNA-Seq数据集存放在欧洲核苷酸档案馆，注册号为PRJEB24580。

    详细的程序和附加方法描述在在线补充附录．

    结果

    ADLP肠道菌群的社区水平改变恰当的老鼠

    为了测试AD大脑的神经病理改变是否与肠道菌群的改变有关，我们研究了ADLP肠道菌群的组成恰当的8月龄小鼠出现严重的Aβ和tau病变。使用16S rRNA基因扩增子的454焦磷酸测序，基于操作分类单位(OTUs)的肠道菌群比较WT和ADLP之间的肠道菌群恰当的基于Bray-Curtis (OTU含量)和Jaccard (OTU发生)差异进行主坐标分析。ADLP的肠道菌群恰当的小鼠和WT小鼠在out水平的细菌种类(p=0.03)的出现率(p=0.019)和丰度(p=0.019)方面是不同的。图1A、B)，表示ADLP恰当的老鼠的肠道菌群发生了变化。

    The alteration of gut microbiota composition and high intestinal permeability along with the intestinal and systemic inflammation in ADLPAPT mice. The bacterial community composition of 8-month-old WT (n=5) and ADLPAPT (n=5) mice was compared by PCoA on the basis of (A) Bray-Curtis dissimilarity (p=0.03) and (B) Jaccard dissimilarity (p=0.019). Statistical significance was evaluated by ANOSIM with 999 permutations. (C) High intestinal permeability of ADLPAPT mice was observed as compared with WT mice by the FITC-dextran method (p=0.0014). (D) Similar concentrations of faecal albumin were detected in WT and ADLPAPT mice (p=0.0516). (E) High concentrations of faecal lipocalin 2 (LCN2) conducive to intestinal inflammation were detected in ADLPAPT mice compared with WT mice (p=0.0360). (F) High concentrations of serum lipopolysaccharide-binding protein (LBP) conducive to systemic inflammation were found in ADLPAPT mice compared with WT mice (p=0.0454). The WT (n=18) and ADLPAPT (n=22) mice at the age of 6 months were used. All data are mean±SEM; *p<0.05, **p<0.01, according to two-tailed Student’s t-test. ADLPAPT, AD-like pathology with amyloid and neurofibrillarytangles; ANOSIM, analysis of similarities; FITC, fluorescein isothiocyanate; PCO1 and PCO2, principal coordinates; PCoA, principal coordinate analysis; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    ADLP中肠道菌群组成的改变和高肠通透性伴随肠道和全身炎症恰当的老鼠。8月龄WT (n=5)和ADLP的细菌群落组成恰当的(n=5)只小鼠在(A) Bray-Curtis不相似度(p=0.03)和(B) Jaccard不相似度(p=0.019)的基础上进行PCoA比较。用999个排列的ANOSIM评估其统计学意义。(C) ADLP肠通透性高恰当的采用fitc -葡聚糖法观察小鼠与WT小鼠的差异(p=0.0014)。(D)在WT和ADLP中检测到相似浓度的粪便白蛋白恰当的老鼠(p = 0.0516)。(E)在ADLP中检测到高浓度的有利于肠道炎症的粪便脂质2 (LCN2)恰当的与WT小鼠比较(p=0.0360)。(F)在ADLP中发现高浓度的有利于全身炎症的血清脂多糖结合蛋白(LBP)恰当的与WT小鼠比较(p=0.0454)。WT (n=18)和ADLP恰当的(n=22)只6月龄小鼠。所有数据均为平均值±SEM;*p<0.05， **p<0.01，根据双尾Student 's t检验。ADLP恰当的， ad样病理伴有淀粉样和神经纤维缠结;ANOSIM，相似性分析;FITC:异硫氰酸荧光素;PCO1和PCO2，主坐标;PCoA，主坐标分析;WT,野生型。

    为了弄清楚这些微生物群落的改变是否在AD病理发生之前就开始了，我们监测了ADLP肠道菌群的组成恰当的2、4、6月龄小鼠。通过Illumina MiSeq对16S rRNA基因扩增子进行测序，确定ADLP的肠道菌群恰当的2月龄时，小鼠与WT小鼠在OTU的发生(p=0.017)和丰度(p=0.017)方面有显著差异。虽然这种分离在4月龄时减弱，即在ad相关病理发生时(OTU发生，p=0.263;OTU丰度，p=0.207)，当AD病理进展时，6月龄分离开始复发(OTU发生率，p=0.042;OTU丰度，p=0.143;在线补充图1A、B)．这些观察结果表明ADLP恰当的小鼠在生命早期有一个改变的肠道菌群，肠道菌群的改变可能归因于转基因ad相关的修饰。

    ADLP的细菌多样性恰当的小鼠在各年龄阶段均略高于WT小鼠，但未达到统计学意义(在线补充图1C)．为了确定与AD发展相关的特定细菌群，我们确定了细菌类群，区分WT和ADLP的肠道菌群恰当的小鼠采用线性判别分析效应量(LEfSe)分析。17少数特定于WT或ADLP的细菌属恰当的但它们随着年龄的变化而变化，没有通常针对ADLP的细菌群恰当的小鼠被鉴定(在线补充图2A-F)．这些数据表明，肠道菌群中群落水平的改变(而不是单个细菌分类单元的改变)可能与ADLP的AD发展有关恰当的老鼠。

    ADLP的慢性低级别肠道和全身炎症恰当的小鼠和高肠道通透性ADLP恰当的老鼠

    研究肠道菌群改变对ADLP的影响恰当的对小鼠肠道屏障功能的影响，我们测定了WT和ADLP的肠通透性恰当的小鼠采用异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖法。18我们发现在ADLP中fitc -葡聚糖的血清浓度恰当的小鼠显著高于WT小鼠，提示ADLP的肠通透性增加恰当的老鼠(图1 c)．我们测定了WT和ADLP的粪便白蛋白水平恰当的但没有观察到差异(图1 d)，提示ADLP肠通透性高恰当的小鼠可能不归因于细胞损伤。此外，高浓度的粪脂质2代表肠道炎症19在ADLP中得到证实恰当的与WT小鼠比较(图1 e)，提示ADLP中存在慢性低级别炎症恰当的肠。ADLP中肠屏障完整性的丧失恰当的小鼠可使从肠腔通过门静脉流向周围器官的血流定向。在这方面，我们测量了血清脂多糖结合蛋白(LBP)水平，作为微生物群衍生化合物引起全身炎症的系统传播的标志。20.我们发现ADLP患者血清LBP水平升高恰当的与WT小鼠比较(图1 f)，指出可能是由肠道微生物群衍生抗原(包括脂多糖(LPS))流入ADLP的循环系统引起的系统性炎症恰当的老鼠。总之，这些结果提供了证据，微生物成分，如来自ADLP改变的肠道菌群的LPS恰当的小鼠可能通过可渗透的肠道屏障参与AD的发病。

    粪便菌群的频繁转移可减轻ADLP的认知障碍、Aβ斑块负担、tau病理和反应性神经胶质激活恰当的老鼠

    为了阐明改变的肠道菌群对AD发病机制的影响，我们几乎每天都将WT小鼠的粪便材料转移到ADLP中恰当的小鼠4个月(FMT) (图2一个)．FMT对ADLP改变的肠道菌群有很大影响恰当的老鼠。FMT小鼠2个月(4月龄小鼠)后肠道菌群组成发生显著变化(p<0.05);最后，它与WT和ADLP的菌群都有相似之处恰当的4个月FMT后的小鼠(6月龄小鼠)(WT, p＝0.186;ADLP恰当的， p=0.201) (在线补充图3)．我们进行了两项行为测试来评估空间学习和记忆功能。21在y迷宫中，与ADLP相比，FMT小鼠的空间短期记忆障碍得到了显著的挽救恰当的小鼠，在总条目数上无显著差异(图2B、C)．我们接下来在背景恐惧条件反射实验中评估FMT小鼠。而在恐惧条件反射测试中，所有组在暴露于脚部电击后都表现出相似的冻结行为(图2 d)， FMT小鼠在情境测试中表现出改善长期记忆障碍的趋势(图2E, H)．这些数据表明，持续接触健康的肠道菌群可能改善ADLP受损的认知功能恰当的老鼠。

    Improved memory deficits in ADLPAPT mice after FMT. (A) Study design. The animals were separated by genotype within 4 weeks after birth. After that, 4 or 5 mice of each group were raised in the same cage for 6 months under the identical specific pathogen-free conditions. The WT (n=16) and ADLPAPT (n=14) groups received the faecal extract from healthy WT mice and diseased mice (strain ADLPAPT), respectively. Another ADLPAPT group (FMT, n=16) received the faecal extract from WT donors to directly change gut microbial composition. All three groups of the 8-week-old mice underwent oral delivery of faecal microbiota 5 days a week for 4 months, and their faeces were collected as indicators of the gut microbiota every 2 months. The 6-month-old animals subjected to the experiment were euthanised, after which blood, colon and brain samples were collected. (B) Percentage of spontaneous alternations performance and (C) number of total entries of WT mice (n=16), ADLPAPT mice (n=13) and FMT mice (n=16) at the age of 6 months in the Y-maze task. (D) Percentage of time spent freezing during the 180 s before foot-shock exposure (pre) and during 90 s after foot-shock exposure (post) in the fear-conditioning, and (E) percentage of time spent freezing in the contextual test of WT mice (n=16), ADLPAPT mice (n=13) and FMT mice (n=16) at the age of 6 months. (F) Schematic diagram of the contextual fear-conditioning test. (G) The learning curves during the fear-conditioning (day 1) and (H) percentage of time spent freezing during the contextual test (day 2). Data represent mean±SEM; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, according to one-way analysis of variance followed by Tukey’s multiple comparison test. ADLPAPT, AD-like pathology with amyloid and neurofibrillarytangles; FMT, faecal microbiota transfer; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    改善ADLP的记忆缺陷恰当的小鼠FMT后。(一)研究设计。动物在出生后4周内按基因型进行分离。之后，每组4只或5只小鼠在同一笼中，在相同的特异性无病原体条件下饲养6个月。WT (n=16)和ADLP恰当的(n=14)组分别取健康WT小鼠和患病小鼠的粪便提取物(ADLP株)恰当的),分别。另一个ADLP恰当的FMT组(n=16)采用WT供体粪便提取液直接改变肠道微生物组成。三组8周龄小鼠每周5天口服粪便菌群，持续4个月，每2个月收集粪便作为肠道菌群指标。接受实验的6个月大的动物被实施安乐死，之后采集血液、结肠和大脑样本。(B)自发交替表现的百分比和(C) WT小鼠(n=16)的总条目数，ADLP恰当的小鼠(n=13)和6月龄FMT小鼠(n=16)进行y -迷宫实验。(D)在恐惧条件反射实验中，足电击暴露前180 s(前)和足电击暴露后90 s(后)冻结时间的百分比;(E)在WT小鼠(n=16)、ADLP环境试验中冻结时间的百分比恰当的小鼠(n=13)和FMT小鼠(n=16) 6月龄。(F)情境恐惧条件反射测试示意图。(G)恐惧条件反射(第1天)期间的学习曲线和(H)背景测试(第2天)期间花在冻结上的时间百分比。数据表示均值±SEM;*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001， ****p<0.0001，经单因素方差分析后经Tukey多重比较检验。ADLP恰当的， ad样病理伴有淀粉样和神经纤维缠结;FMT，粪便菌群转移;WT,野生型。

    为了确定健康肠道菌群对Aβ斑块沉积的影响，我们检测了ADLP中的Aβ斑块负担恰当的老鼠。额叶皮层斑块总面积(图3A、B)和海马(图3G、H)在FMT小鼠中明显小于ADLP恰当的老鼠。此外，ELISA分析表明，与ADLP相比恰当的小鼠，可溶性和不溶性Aβ40FMT小鼠的大脑皮层水平显著降低(图3C, D)．此外，FMT小鼠有改善Aβ的趋势42聚合(p=0.0683) (图3E, F)．

    Reduced Aβ plaque burden in ADLPAPT mice after FMT. Immunostaining for Aβ plaque burden in the brain slices from 6-month-old ADLPAPT mice after FMT treatment. Representative confocal images of (A) Aβ plaque (Biotin-4G8) staining and (B) quantification of Aβ-positive area proportion in the frontal cortex of ADLPAPT mice (n=14) and FMT mice (n=16). ELISA analysis for measuring Aβ levels in the brain lysates from 6-month-old ADLPAPT mice after FMT treatment. (C–F) RIPA soluble and insoluble Aβ levels in the cerebral cortex of ADLPAPT mice (n=14) and FMT (n=16). Representative confocal images of (G) Aβ plaque (Biotin-4G8) staining and (H) quantification of the Aβ-positive area proportion in the hippocampus of ADLPAPT mice (n=14) and FMT mice (n=16). Data represent mean±SEM; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, according to two-tailed unpaired t-test. Scale bars in A and G: 200 µm. Aβ, beta-amyloid; ADLPAPT, AD-like pathology with amyloid and neurofibrillarytangles; DAPI, 4',6-Diamidino-2-Phenylindole; FMT, faecal microbiota transfer; n.d., non-detection; RIPA, radioimmunoprecipitation assay; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    减少ADLP中Aβ斑块负担恰当的小鼠FMT后。6个月ADLP脑组织切片中Aβ斑块负荷的免疫染色恰当的小鼠经FMT处理后。代表性共聚焦图像(A) Aβ斑块(Biotin-4G8)染色和(B) ADLP额皮质Aβ阳性面积比例定量恰当的小鼠(n=14)和FMT小鼠(n=16)。ELISA分析测定6月龄ADLP脑组织裂解液中Aβ水平恰当的小鼠经FMT处理后。(C-F) RIPA可溶性和不溶性Aβ在ADLP大脑皮层的水平恰当的小鼠(n=14)和FMT (n=16)。典型共聚焦图像(G) Aβ斑块(Biotin-4G8)染色和(H) ADLP海马区Aβ阳性面积比例定量恰当的小鼠(n=14)和FMT小鼠(n=16)。数据为均值±SEM;＊P <0.05， ** P <0.01， *** P <0.001， **** P <0.0001，符合双尾不配对t检验。A和G的比例尺:200µm。β,β-淀粉样蛋白;ADLP恰当的， ad样病理伴有淀粉样和神经纤维缠结;DAPI 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole;FMT，粪便菌群转移;无数据,非探测;RIPA:放射免疫沉淀法;WT,野生型。

    接下来，我们发现fmt诱导的肠道菌群变化减少了ADLP海马中的病理性tau聚集恰当的老鼠(图4A、B)．使用AT180 (Thr231位点过度磷酸化代表tau蛋白病理的早期事件)和AT8 (Ser202/Thr205位点过度磷酸化代表tau蛋白病理的中后期事件)抗体，我们发现在ADLP中AT180检测到的和AT8检测到的成对螺旋丝样tau蛋白显著减少恰当的小鼠FMT (图4氟)．这些结果表明，暴露于健康的肠道菌群可以削弱大脑中的Aβ沉积和tau病理。

    Reduced aggregation of tau in the hippocampus of ADLPAPT mice after FMT. Immunostaining for tau pathology in the brain slices from 6-month-old ADLPAPT mice after FMT treatment. Representative confocal images of (A) human tau (Tau13) staining and (B) quantification of the Tau13-positive area in the hippocampus of ADLPAPT mice (n=14) and FMT mice (n=16). Representative confocal images of (C) PHF-tau (AT180) staining and (D) quantification of the AT180-positive area in the hippocampus of ADLPAPT mice (n=14) and FMT mice (n=16). Representative confocal images of (E) PHF-tau (AT8) staining and (F) quantification of AT8-positive area in the hippocampus of ADLPAPT mice (n=14) and FMT mice (n=16). Data represent mean±SEM; *p<0.05, **p<0.01, according to two-tailed unpaired t-test. Scale bars in A, C and E: 200 µm. ADLPAPT, AD-like pathology with amyloid and neurofibrillarytangles; DAPI, 4',6-Diamidino-2-Phenylindole; FMT, faecal microbiota transfer; n.d., non-detection; PHF, paired helical filament; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    ADLP患者海马区tau蛋白聚集减少恰当的小鼠FMT后。6个月ADLP的脑切片tau蛋白病理免疫染色恰当的小鼠经FMT处理后。具有代表性的共聚焦图像(A)人tau蛋白(Tau13)染色和(B) ADLP海马区Tau13阳性区域的定量恰当的小鼠(n=14)和FMT小鼠(n=16)。代表性共聚焦图像(C) PHF-tau (AT180)染色和(D) ADLP海马区AT180阳性区域的定量恰当的小鼠(n=14)和FMT小鼠(n=16)。代表性共聚焦图像(E) ADLP海马区PHF-tau (AT8)染色和(F) AT8阳性区域定量恰当的小鼠(n=14)和FMT小鼠(n=16)。数据为均值±SEM;*p<0.05， **p<0.01，符合双尾不配对t检验。A、C、E的比例尺:200µm。ADLP恰当的， ad样病理伴有淀粉样和神经纤维缠结;DAPI 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole;FMT，粪便菌群转移;无数据,非探测;PHF，成对螺旋丝;WT,野生型。

    由于中枢神经系统(CNS)的胶质细胞增生是AD的一个公认的病理体征，22我们发现了被电离的钙结合适配器分子(Iba1)染色的激活小胶质细胞，23胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色的增生性反应性星形胶质细胞。24与ADLP相比恰当的小鼠的iba1阳性小胶质细胞和gfap阳性星形胶质细胞(图5 a - c)在FMT小鼠额叶皮层中显著减少，表明健康肠道菌群的转移减弱了胶质瘤，这反过来可能减少了ADLP大脑中的免疫病理反应恰当的老鼠。

    Suppression of microgliosis and astrogliosis in ADLPAPT mice after FMT. Immunostaining for gliosis in the brain slices from 6-month-old ADLPAPT mice after FMT treatment. Representative confocal images of (A) microgliosis (Iba1) and/or astrogliosis (GFAP) staining in the frontal cortex of WT mice (n=16), ADLPAPT mice (n=14) and FMT mice (n=16). Graphs represent the quantification of (B) Iba1-positive and (C) GFAP-positive area. Data represent mean±SEM; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, according to one-way analysis of variance followed by Tukey’s multiple comparison test. Scale bars in A: 200 µm. ADLPAPT, AD-like pathology with amyloid and neurofibrillarytangles; FMT, faecal microbiota transfer; GFAP, glial fibrillar acidic protein; Iba1, ionised calcium-binding adaptor molecule; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    ADLP中小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生的抑制作用恰当的小鼠FMT后。6个月大的ADLP脑组织胶质瘤的免疫染色恰当的小鼠经FMT处理后。WT小鼠(n=16)额叶皮层(A)微胶质细胞增生(Iba1)和/或星形胶质细胞增生(GFAP)染色的代表性共聚焦图像，ADLP恰当的小鼠(n=14)和FMT小鼠(n=16)。图表示(B) iba1阳性和(C) gfap阳性区域的量化。数据为均值±SEM;*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001， ****p<0.0001，经单因素方差分析后经Tukey多重比较检验。A中的比例尺:200µm。ADLP恰当的， ad样病理伴有淀粉样和神经纤维缠结;FMT，粪便菌群转移;胶质纤维酸性蛋白;Iba1，电离钙结合适配器分子;WT,野生型。

    在abx治疗的ADLP中，菌群移植改善了行为障碍、Aβ斑块负担、tau病理和反应性胶质激活恰当的老鼠

    为了进一步阐明微生物群诱导的AD病理抑制作用，我们移植了WT或ADLP的粪便微生物群恰当的小鼠转染受体ADLP恰当的五种ABX预处理小鼠(在线补充图4A-C)．首先，我们证实ABX能有效抑制微生物活性(在线补充图4B)，但Aβ斑块沉积未见变化(在线补充图5A-E和H)、tau缠结形成(在线补充图5F, I和J)和胶质细胞增生症(在线补充图5G, K)．移植WT粪便菌群改变了abx处理的ADLP的肠道菌群组成恰当的老鼠;两组接受abx治疗的ADLP的肠道菌群恰当的小鼠按供体小鼠分离(p=0.003, OTU发生率;OTU丰度p＝0.059) (在线补充图6A-C和E)．有趣的是，ADLP恰当的微生物移植abx处理的ADLP恰当的与WT微生物移植abx处理的ADLP相比，小鼠表现出更高的肠道通透性恰当的老鼠(在线补充图6D)．WT微生物移植也改善了abx治疗的ADLP的过度活跃恰当的老鼠(在线补充图7)．

    我们接下来测试了粪便菌群移植是否影响AD在大脑中的发病机制。捐赠者ADLP恰当的小鼠和ADLP恰当的微生物移植abx处理的ADLP恰当的小鼠表现出类似水平的Aβ斑块，而WT菌群移植延缓了abx处理的ADLP额皮层Aβ斑块沉积恰当的老鼠(o在线补充图8A, B)．at180检测到的tau蛋白减少(在线补充图8C, D)以及at8检测到的tau蛋白(在线补充图8E, F)在abx处理的ADLP中观察到恰当的而ADLP对小鼠无明显影响恰当的微生物群移植。此外，我们还观察到abx处理的ADLP在胶质分化方面的差异恰当的接受WT或ADLP的小鼠恰当的微生物群(在线补充图9A-C)．将结果与abx处理的ADLP结合在一起恰当的结果表明，重建健康的肠道菌群可减轻ADLP患者脑内肠道屏障的完整性和AD病理恰当的老鼠。

    FMT逆转ADLP中与组织变性和肠道巨噬细胞活性相关的结肠转录变化恰当的老鼠

    阐明fmt诱导ADLP中ad相关病理逆转的肠道相关机制恰当的小鼠，我们对WT、ADLP的结肠组织进行RNA-Seq分析恰当的和6月龄FMT小鼠。因此，每只小鼠获得3.1±0.3 Gb(平均±SD)的高质量reads，得到19 257±115个基因分配。利用结肠转录组数据的差异表达分析，我们认为基因在ADLP中上调恰当的表达水平显著高于WT小鼠;我们认为基因在ADLP中是下调的恰当的小鼠的表达水平显著低于WT小鼠(在线补充图10A、B)．结果发现ADLP中有78个上调基因和136个下调基因恰当的与WT小鼠比较(问< 0.05;图6而且在线补充表1)，表明ADLP的结肠转录组恰当的小鼠被改变了。研究FMT治疗对ADLP结肠转录组的影响恰当的，我们通过比较FMT小鼠和WT小鼠的基因表达水平来追踪上调和下调基因的变化(在线补充图10C, D)．在ADLP上调的78个基因中恰当的在FMT小鼠中，我们没有发现60个基因的表达有显著差异。在136个下调基因中，有83个基因在ADLP之间无显著差异恰当的和FMT小鼠(图6 b)，表明大多数表达水平改变的结肠基因通过FMT正常化。根据差异表达(DE)基因的表达水平，FMT小鼠比ADLP更接近于WT小鼠恰当的老鼠(图6 c)．

    The reversal of the altered colonic gene expression in ADLPAPT mice after FMT. (A) RNA-Seq analysis revealed differentially expressed (DE) colonic genes upregulated or downregulated in ADLPAPT mice (n=5) as compared with WT mice (n=6) in a Venn diagram. (B) The majority of the DE genes were recovered in FMT mice (n=6). (C) The profile of the DE genes in WT, ADLPAPT and FMT mice was visualised on a heat map. The gene profiles of the three groups were clustered on the basis of Euclidean distance by the UPGMA method. (D) Bar graphs represent the gene ontology terms of the DE genes categorised by biological processes. ADLPAPT, AD-like pathology with amyloid and neurofibrillarytangles; ATP, adenosine triphosphate; DE, differentially expressed; ERK, extracellular signal-regulated kinase; FMT, faecal microbiota transfer; IFN-γ, interferon gamma; rRNA, ribosomal RNA; TGF-β, transforming growth factor beta; UPGMA, unweighted pair group method with arithmetic mean; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    ADLP结肠基因表达改变的逆转恰当的小鼠FMT后。(A) RNA-Seq分析显示差异表达(DE)结肠基因在ADLP中上调或下调恰当的小鼠(n=5)与WT小鼠(n=6)在维恩图中比较。(B)大部分DE基因在FMT小鼠中恢复(n=6)。(C) WT、ADLP的DE基因图谱恰当的在热图上观察FMT小鼠。用UPGMA方法根据欧氏距离对三组的基因谱进行聚类。(D)柱状图表示按生物过程分类的DE基因的基因本体术语。ADLP恰当的， ad样病理伴有淀粉样和神经纤维缠结;ATP，三磷酸腺苷;DE，差异表达;ERK，细胞外信号调节激酶;FMT，粪便菌群转移;IFN-γ，干扰素γ;rRNA，核糖体RNA;TGF-β，转化生长因子β;UPGMA，无加权算术平均对组法;WT,野生型。

    通过基因本体分析，我们发现ADLP的DE基因发生了改变恰当的小鼠与衰老相关的组织退行性变和黏膜免疫退化有关(图6 d而且在线补充表2)．具体来说，在ADLP中基因上调恰当的小鼠有助于减少细胞增殖，细胞衰老和细胞生长停滞，这些都是与衰老相关的表型。25ADLP中与线粒体和核糖体活性相关基因的下调恰当的小鼠可能导致ATP合成和蛋白质合成的畸变，这被认为是衰老和神经退行性疾病的关键特征。26日27日此外,ADLP恰当的小鼠显示出与粘膜免疫反应相关的基因下调，其中许多与肠道巨噬细胞活性和单核-巨噬细胞轴相关。在肠道中，循环血液Ly6C不断补充的肠道巨噬细胞嗨单核细胞有助于肠道内稳态，包括组织内稳态。28因此，结肠转录组的比较分析显示，FMT逆转了肠道相关异常，如ADLP中年龄诱导的组织变性和巨噬细胞介导的免疫功能障碍恰当的老鼠。

    FMT返回过大的Ly6G种群−Ly6C+CD115+ADLP中的髓样细胞恰当的小鼠的WT水平

    确定与ADLP中AD病理相关的血液免疫细胞群恰当的通过FMT，我们比较了WT和ADLP的外周血白细胞(PBLs)恰当的和FMT小鼠(在线补充图11A)．由于结肠转录组数据显示与肠道巨噬细胞相关的基因表达改变，我们将重点放在CD11c的变化上−CD11b+骨髓细胞。流式细胞术分析中，CD11c的部分变化−CD11b+Ly6G−Ly6C+CD115+根据疾病严重程度的变化检测炎性单核细胞。的确，ADLP的PBLs中炎性单核细胞的比例明显更高恰当的小鼠(平均63.87%)高于WT小鼠(平均42.28%)和FMT小鼠(平均39.94%)(图7A, B)，表明在ADLP中炎性单核细胞与疾病严重程度相关恰当的老鼠。然而，FMT不影响其他髓细胞(在线补充图11B-D)．这些数据提供了证据，肠道微生物相关信号可能参与ADLP大脑AD的发病机制恰当的其中循环炎性单核细胞可作为细胞中介促进小鼠。

    FMT induces alteration of a peripheral immune cell population. Flow cytometric analysis of PBLs of 6-month-old ADLPAPT mice after FMT treatment. Representative (A) flow cytometry histograms and (B) a graph of the proportion (%) of CD11c−CD11b+Ly6G−Ly6C+CD115+ subsets in the WT mice (n=10), ADLPAPT mice (n=9) and FMT mice (n=10). Data represent mean±SEM; *p<0.05, **p<0.01, according to one-way analysis of variance followed by Tukey’s multiple comparison test. (C) A schematic diagram for this study. The alterations of gut microbial community and leaky gut in ADLPAPT mice increased LPS-binding protein and inflammatory monocyte in the blood. Transfer of a healthy intestinal microbiota ameliorates AD pathologies including amyloid plaques, tau tangles and reactive gliosis in the brains of ADLPAPT mice. AD, Alzheimer’s disease; ADLPAPT, AD-like pathology with amyloid and neurofibrillarytangles; FMT, faecal microbiota transfer; LPS, lipopolysaccharide; PBLs, peripheral blood leucocytes; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    FMT诱导外周免疫细胞群的改变。流式细胞术分析6月龄ADLP的PBLs恰当的小鼠经FMT处理后。代表性的(A)流式细胞仪直方图(B) CD11c的比例(%)图−CD11b+Ly6G−Ly6C+CD115+在WT小鼠(n=10)的亚群中，ADLP恰当的小鼠(n=9)和FMT小鼠(n=10)。数据为均值±SEM;*p<0.05， **p<0.01，经单因素方差分析及Tukey多重比较检验。(C)本研究的示意图。ADLP患者肠道微生物群落和漏肠的改变恰当的小鼠血液中lps结合蛋白和炎性单核细胞增加。健康肠道菌群的转移可改善AD病理，包括ADLP患者大脑中的淀粉样斑块、tau蛋白缠结和反应性胶质细胞增生恰当的老鼠。AD，阿尔茨海默病;ADLP恰当的， ad样病理伴有淀粉样和神经纤维缠结;FMT，粪便菌群转移;有限合伙人,脂多糖;PBLs，外周血白细胞;WT,野生型。

    讨论

    本研究的目的是探讨肠道菌群对AD发病机制的潜在影响。本研究揭示了ADLP早期肠道菌群组成的改变恰当的小鼠引起慢性肠道炎症和上皮完整性的丧失，随后导致全身炎症。在ADLP中，这些肠道相关的异常与Aβ沉积、tau病理、反应性胶质细胞增生和认知障碍一致恰当的老鼠;单核细胞募集与肠道巨噬细胞功能障碍密切相关。值得注意的是，ADLP的致病特征恰当的小鼠被ADLP中经常转移或移植的正常菌群显著减弱恰当的．因此，我们的研究结果值得注意，因为它支持了肠-脑双向交流影响AD神经病理发展的观点。

    ADLP肠道菌群组成的差异恰当的从WT小鼠的小鼠开始在生命早期(2个月大)显示，并且在老年小鼠中更明显，这表明肠道菌群的改变可以归因于转基因修饰。AD转基因诱导的微生物改变没有达到全师级或门级的变化;ADLP的鉴别细菌类群较少恰当的对小鼠进行了检测，但这些细菌类群并不局限于不同年龄的特定细菌群。这些观察表明，通过肠道-大脑轴的复杂信号级联是有影响的，但不是肠道菌群特定成员的严格决定因素。这些也指出了群落生态、微生物-微生物相互作用或微生物功能能力(而不是单个细菌分类单元的重要性)对AD发病的重要性。在此背景下，值得注意的是，fmt诱导的对WT小鼠菌群模式的修饰似乎改善了ADLP中的淀粉样变、tau病理、反应性胶质细胞增生和认知障碍恰当的老鼠。而铸币工人等10应用ABX鸡尾酒抑制APP/PS1小鼠的微生物活性，Bonfili等11在3×Tg AD小鼠中测试益生菌混合物。最近,太阳等29WT小鼠处理后的粪便物质作用于APP/PS1小鼠。然而，对几种AD模型小鼠肠道菌群的不同操作对病理生理特征有相似的影响，这表明肠道微生物失调至少可以被视为AD的加速器。

    ADLP结肠基因表达模式恰当的小鼠与WT小鼠也有差异，其中许多基因参与单核细胞趋化和巨噬细胞激活的炎症反应。肠道巨噬细胞已被发现对启动微生物监测的免疫反应至关重要，28并在清除凋亡或衰老细胞以及上皮完整性和重塑中发挥主要作用。30 31如循环Ly6C嗨单核细胞局部成熟为肠道巨噬细胞，单核细胞的补充(如C-C基序趋化因子配体2 - C-C趋化因子受体2 (CCL2-CCR2轴)是肠道巨噬细胞维持的必要过程。32因此，下调趋化因子介导的单核细胞募集相关基因可能导致单核细胞补充不完全，从而导致ADLP中肠道巨噬细胞的缺乏恰当的老鼠。在这方面，干扰素-γ信号下调33以及细胞外信号调节激酶信号34巨噬细胞激活通路可能归因于ADLP肠道内免疫和上皮内稳态的扰动恰当的老鼠。有趣的是，大多数ADLP恰当的小鼠特异性改变的DE基因通过FMT恢复到几乎正常的表达;这些巨噬细胞介导的变化可能进一步有助于抑制ADLP中的脑淀粉样变、牛皮病、反应性胶质细胞增生和认知缺陷恰当的小鼠通过Ly6C循环+单核细胞。

    这些肠道相关的变化可能相互促进了ADLP肠道中肠道屏障通透性的增加和慢性炎症恰当的老鼠;这些问题被认为是AD的潜在危险因素。35为了确定Aβ相关神经退行性变和taua相关神经退行性变对肠道屏障功能的不同贡献，我们还评估了仅表达Aβ病理的ADLP小鼠的肠道通透性APP / PS1小鼠)或tau病理(ADLPτ老鼠)。ADLP显示肠通透性高恰当的与tau相关的病理相比，小鼠与Aβ斑块更相关(在线补充图12A)．此外，高肠道通透性被认为是与大脑中a β沉积相关的一个显著特征，因为在AD的App敲入小鼠模型中也观察到类似的情况36（在线补充图12B)．这种与微生物相关的肠屏障功能障碍已经在老年人中观察到，37岁的老鼠38而且果蝇苍蝇39被认为是引发与衰老相关的慢性、低级别全身性炎症的诱因。根据结肠转录组数据和粪便白蛋白水平，ADLP的肠屏障功能障碍恰当的小鼠的特征可能是上皮细胞衰老和巨噬细胞介导的屏障完整性障碍，而不是肠道上皮层的细胞损伤。这些发现与Thevaranjan的结果相似等40提示老年小鼠肠道渗漏是由于细胞旁通透性所致。此外，肠道免疫反应本身的持续异常会引发微生物失衡，41从而导致慢性炎症的恶性循环。考虑到肠道通透性先于全身炎症，40微生物群衍生的化合物从肠道转移到血液循环是全身炎症的强大驱动因素，它随后介导了随着年龄增长的组织损伤。42事实上,ADLP恰当的小鼠血清LBP浓度升高，老年人LBP浓度升高与全身炎症相关。43特别是，通过FMT，炎症单核细胞的改变恢复到WT小鼠类似的状态，这表明ADLP恰当的小鼠全身暴露于肠道相关的细菌内毒素，如LPS。考虑到循环微生物内毒素通过诱导单核细胞从骨髓迁移增加循环中单核细胞的频率，44ADLP的代谢性内毒素血症恰当的小鼠可能为Ly6C提供了机会+炎性单核细胞进入血液循环。外周炎性单核细胞的增加可通过直接浸润大脑或向大脑产生信号分子来影响AD的发病。45因此，循环单核细胞在AD中的作用还有待进一步研究。

    高的肠道通透性可使血脑屏障恶化，中枢神经系统容易暴露在改变的肠道菌群内容物中。46LPS在大脑中被发现，并参与AD病理。LPS和Aβ肽的体外培养促进了Aβ纤维的发生，47体内注射细菌LPS可导致WT小鼠和转基因AD小鼠模型的认知障碍，海马区形成Aβ沉积和tau聚集。48 49此外，在AD患者死后脑组织中观察到LPS与Aβ斑块共定位。50考虑到Aβ表达已被描述为抗脑内微生物感染的抗菌活性，51可渗透的肠道屏障和随后的全身炎症可能是ADLP中a β斑块负担的原因恰当的老鼠。根据最近的研究显示，5×FAD小鼠在小胶质细胞耐受期失去了吞噬功能，52据推测，微生物群衍生的代谢物和/或细菌的慢性转位进入循环是导致ADLP小胶质细胞代谢缺陷的原因恰当的老鼠。

    近年来，FMT在治疗疾病方面受到了广泛关注艰难梭状芽胞杆菌炎症性肠病和自闭症。53 54在这项研究中，我们首先检查了FMT对AD小鼠模型中Aβ和tau病变的影响。值得注意的是，用健康肠道菌群替代的微生物群缓解了大脑中的Aβ、tau和反应性神经胶质病理(图7 c)．在这些发现的基础上，我们认为AD的异常系统因素是该病新的治疗靶点。因此，包括菌群在内的周边系统的调控可能为研究AD的发病机制提供一个新的视角。

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    脚注

    • M-SK、YK和HC贡献相当。

    • 贡献者IM-J, J-WB, M-SK, YK和HyC设计研究。M-SK、YK、HyC、DL、DKK、HJK、DW-H和J-YL进行了实验。IM-J、J-WB、M-SK、YK和HyC对数据进行分析。WK、SP、HaC、EYC和DL进行了FACS分析。IM-J、J-WB、M-SK、YK和HyC撰写了手稿。所有作者审阅并批准了稿件。

    • 资金本研究得到了韩国科学、ICT和未来规划部(MSIP)资助的韩国国家研究基金(NRF)的职业中期研究员计划(2016R1E1A1A02921587)、SRC (NRF- 2018r1a5a1025077)和培育新后基因组产业的协同基因组计划(2015M3C9A2054299)的资助(给J-WB)。该项目还得到了来自NRF (2018R1A2A1A19019062)和MRC (NRF- 2018r1a5a2025964)(授予IM-J)和NRF- 2017r1a6a3a01004073(授予YK)的资助。NRF的基础研究实验室拨款(2017R1A4A1015745)也支持这项工作(EYC和D-SL)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 病人同意发表不是必需的。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 数据可用性声明没有相关数据。