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胃
原始研究
METTL3-mediated米6HDGF mRNA的修饰促进胃癌进展，具有预后意义
免费的
  1. 羌王1，
  2. 陈陈2，
  3. 青青叮3.，
  4. 严赵4，
  5. Zhangding王4，
  6. 俊杰陈2，
  7. Zerun江2，
  8. 燕张1，
  9. 闺房徐4，
  10. 晶晶张5，
  11. 健胃周2，
  12. 北城的太阳1，
  13. 小平邹4，
  14. Shouyu王1，2，6，7
  1. 1肝胆外科，南京大学医学院附属鼓楼医院，南京，江苏省中华人民共和国
  2. 2分子细胞生物学与毒理学学系，江苏省肿瘤生物标志物重点实验室，肿瘤防治中心;南京医科大学公共卫生学院，南京，江苏省中华人民共和国
  3. 3.老年肿瘤科，南京医科大学第一附属医院，南京，江苏省中华人民共和国
  4. 4美国胃肠病学，南京大学医学院附属鼓楼医院，南京，江苏省中华人民共和国
  5. 5广东医科大学附属医院，湛江，广东省中华人民共和国
  6. 6公共卫生研究中心，南京大学医学院，南京，江苏省中华人民共和国
  7. 7江苏省分子医学重点实验室，南京大学医学院，南京，江苏省中华人民共和国
  1. 对应到中华人民共和国江苏省南京市南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科王守玉教授;sywang在}{nju.edu.cn；中华人民共和国江苏省南京市南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科孙北成教授;sunbc在}{njmu.edu.cn；中华人民共和国江苏省南京市南京大学医学院鼓楼附属医院消化内科邹小平教授;13770771661 163.} {com

摘要

客观的N6-methyladenosine (m6A) RNA甲基化及其相关甲基转移酶METTL3通过调节RNA功能参与肿瘤的发生和发展。本研究探讨了METTL3在胃癌中的生物学功能及临床意义。

设计METTL3表达的预后价值通过组织芯片和免疫组化染色分析在人类GC队列中进行评估。体外和体内研究METTL3在GC肿瘤生长和肝转移中的生物学作用和机制。

结果m的水平6A RNA在GC中显著增加，METTL3是参与大量m的主要调控因子6一个RNA修改。胃癌组织中METTL3表达明显升高，与预后不良相关。多因素Cox回归分析显示，METTL3表达是胃癌患者的独立预后因素和有效预测因子。此外，METTL3过表达促进GC增殖和肝转移。机制上，p300介导的METTL3启动子H3K27乙酰化激活诱导METTL3转录，从而刺激m6HDGF mRNA修饰，m6然后，读取器IGF2BP3直接识别并绑定到m上6HDGF mRNA上的一个位点，增强了HDGF mRNA的稳定性。分泌的HDGF促进肿瘤血管生成，而核HDGF激活GLUT4和ENO2的表达，随后GC细胞糖酵解增加，这与随后的肿瘤生长和肝转移有关。

结论METTL3表达升高促进胃癌肿瘤血管生成和糖酵解，提示METTL3表达是胃癌潜在的预后生物标志物和治疗靶点。

  • METTL3
  • 米6一个
  • 血管生成
  • 糖酵解
  • 胃癌

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2019-319639

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    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • 胃癌(GC)是世界上第五大常见肿瘤和第三大致命癌症。

    • 糖酵解和血管生成被认为是癌症的明显标志。

    • m6RNA和m的修饰6甲基转移酶METTL3已被报道与肿瘤进展相关。

    新的发现是什么?

    • m的水平6由于METTL3的表达升高，胃癌中A RNA显著增加。

    • 由于p300介导的H3K27乙酰化活化导致胃癌中METTL3表达增高，这与胃癌预后不良有关。

    • METTL3促进m6HDGF mRNA修饰，m6读取器IGF2BP3直接识别并与m结合6HDGF mRNA上的一个位点，增强HDGF mRNA的稳定性。

    • 分泌的HDGF促进肿瘤血管生成，而核HDGF激活GLUT4和ENO2的表达，随后GC细胞糖酵解增加，进而导致肿瘤生长和肝转移。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • METTL3作为一种促胃癌发生、进展和预后不良的致癌因子，可能是一种有前途的预后生物标志物和治疗靶点。

    简介

    胃癌(GC)是世界上第五大最常见的肿瘤和第三大最致命的癌症，几乎一半的全球胃癌病例在东亚被诊断。1 2大多数胃癌患者最初诊断为晚期恶性增生和转移。3.不幸的是，晚期胃癌患者的预后仍然很差。4个5因此，为胃癌的诊断和治疗寻找新的生物标志物和治疗靶点是迫切需要的。

    能量代谢的重新编程被认为是癌症的一个明显标志。6癌细胞通过代谢重编程来支持恶性肿瘤的发生和发展。7有氧糖酵解的特征是葡萄糖摄取的增加，即使在氧气存在的情况下也优先产生乳酸，这是癌症代谢重编程的主要特征。8好氧糖酵解可以满足持续增殖和转移的能量和生物合成要求。9因此，靶向葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶仍然是一种有吸引力的治疗干预措施，几种阻断糖酵解的潜在抑制剂已在临床前研究中应用。9新的证据还表明，新的肿瘤驱动或抑制因子通过调节不同类型癌症的糖酵解调节肿瘤的发生和进展。10 - 12此外，糖酵解在调节肿瘤微环境中起着至关重要的作用，影响炎症因子分泌、免疫逃避和肿瘤血管生成等方面。13日14我们之前的研究报道血管生成是胃癌增殖转移的关键过程。15因此，了解GC中糖酵解和血管生成的分子机制对开发未来的诊断和治疗策略至关重要。

    N6-methyladenosine (m6A)甲基化被认为是真核mrna中最丰富、普遍存在的修饰。16m的影响6修饰包括调控mRNA的稳定性、剪接、转运、定位和翻译;和rna蛋白质交互。17m6修饰在哺乳动物细胞中是动态可逆的，可通过m6甲基转移酶(也称为写酶:METTL3, METTL14和WTAP)被m6一种去甲基酶(也叫擦除酶:FTO和ALKBH5)。此外，特定的rna结合蛋白(也称为解读蛋白:YTHDF1/2/3, eIF3, IGF2BP1/2/3, HNRNPA2B1等)可以与m结合6直接或间接影响RNA功能的基序。18在过去的几年中，m6据报道，A调节剂与干细胞分化、组织发育、昼夜节律和肿瘤进展有关。18然而，m6A和人类GC中潜在的调节机制仍然难以捉摸。

    在本研究中，我们揭示了m的生物学作用6METTL3介导的胃癌的修饰，提出METTL3可能是胃癌进展的一种新的预测生物标志物和治疗靶点。

    材料和方法

    详细内容见补充材料和方法。

    结果

    METTL3表达升高与胃癌患者预后不良相关

    阐明m的功能作用6作为GC中的一个修改，我们首先检查了m628个GC组织和配对的正常胃粘膜的RNA水平。我们发现m6A RNA水平在气相色谱组织中显著升高(图1一个)．用比色ELISA法对结果进行了验证6RNA甲基化量化试剂盒(图1 b)．m6改性主要由m催化6一个是写作者和橡皮擦，所以我们假设增加的m6GC中的RNA水平是由写字和橡皮的失调引起的。然后比较关键m的mRNA水平6在28对GC和配对的正常胃组织中，有一个写入器(METTL3, METTL14和WTAP)和擦除器(ALKBH5和FTO)。GC中核心甲基转移酶METTL3表达明显上调，其余表达无明显差异(图1 c；在线补充图S1A-D)．m6在28个GC组织中，RNA水平与METTL3表达显著相关(R2= 0.4647, p < 0.0001,在线补充图S1E)．癌症基因组图谱(TCGA)数据也证实了METTL3 mRNA在GC中显著上调(图1 d)．使用线上生物资讯工具Kaplan-Meier Plotter (http://kmplot.com/analysis/)，我们还发现METTL3 mRNA水平升高的GC患者总生存期(OS)较差(图1 e)．

    Elevated METTL3 expression correlates with poor prognosis of patients with GC. (A) The mRNAs isolated from GC tissues and paired normal gastric mucosa were used in dot blot analyses with an anti-m6A antibody, and MB (methylene blue) staining served as the loading control (representative images in left panel). The relative m6A contents on mRNA in GC tissues and paired normal gastric mucosal tissues were calculated (right panel, n=28). (B) The m6A RNA levels in the same 28 GC tissues and paired normal gastric mucosa were detected by colorimetric ELISA-like assay via the m6A RNA methylation quantification kit. (C) The levels of METTL3 expression in GC and paired normal gastric mucosal tissues were measured by qRT-PCR (n=28). (D) The levels of METTL3 expression were analysed in GC (n=413) and normal gastric mucosal tissues (n=32) using TCGA data. (E) Kaplan-Meier survival curves of OS based on METTL3 expression using the online bioinformatics tool Kaplan-Meier Plotter. (F) METTL3 protein levels were measured in GC tissues and paired normal gastric mucosal tissues by western blotting (n=14). (G) Representative IHC images on the tissue microarray (TMA) probed with the anti-METTL3 antibody (scale bars=200 µm or 50 µm, respectively) are shown. (H) The distribution of the difference in METTL3 immunoreactivity score (IRS) (△IRS=IRST−IRSN). The IRS of METTL3 staining was available in 83 pairs of tissues. (I) Kaplan-Meier OS analysis of METTL3 expression in patients with GC (n=83, p<0.001, log-rank test). (J) Multivariable analyses were performed in the GC cohort. All bars correspond to 95% CIs. (K) The time-dependent receiver operating characteristic (ROC) analysis for the clinical risk score (TNM stage), the METTL3 risk score, and the combined METTL3 and clinical risk scores in the GC cohort. AUC, area under the curve; CI, confidence intervals; GC, gastric cancer; HR, hazard ratio; IHC, immunohistochemistry; OS, overall survival; TCGA, The Cancer Genome Atlas; TNM, tumour, node, metastases.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    METTL3表达升高与胃癌患者预后不良相关。(A)从GC组织和配对的正常胃粘膜中分离的mrna用抗m6抗体和MB(亚甲基蓝)染色作为加载对照(左图为代表性图像)。相对米6计算GC组织和配对的正常胃粘膜组织中mRNA的含量(右面板，n=28)。(B)的m6用elisa -比色法检测相同28个GC组织和配对正常胃黏膜的RNA水平6RNA甲基化量化试剂盒。(C)用qRT-PCR检测胃癌和配对正常胃粘膜组织中METTL3的表达水平(n=28)。(D)利用TCGA数据分析胃癌(n=413)和正常胃粘膜组织(n=32)中METTL3的表达水平。(E)利用在线生物信息学工具Kaplan-Meier Plotter，基于METTL3表达的OS Kaplan-Meier生存曲线。(F)用western blotting法测定胃癌组织和配对的正常胃粘膜组织中的METTL3蛋白水平(n=14)。(G)用抗mettl3抗体检测的组织芯片(TMA)上的代表性IHC图像(比例尺分别为200 μ m或50 μ m)。(H) METTL3免疫反应性评分(IRS)差异分布(△IRS=IRS)T−国税局N)．83对组织有METTL3染色的IRS。(I)胃癌患者METTL3表达Kaplan-Meier OS分析(n=83, p<0.001, log-rank检验)。(J) GC队列进行多变量分析。所有的条形对应95%的ci。(K) GC队列中临床风险评分(TNM分期)、METTL3风险评分、METTL3和临床风险评分合并的时间依赖性受试者工作特征(ROC)分析。AUC，曲线下面积;CI,置信区间;GC,胃癌;人力资源风险比; IHC, immunohistochemistry; OS, overall survival; TCGA, The Cancer Genome Atlas; TNM, tumour, node, metastases.

    与这些结果一致的是，通过western blot, METTL3蛋白水平在12/14(86%)人胃癌组织中显著高于其配对的正常胃组织(图1 f)．此外，与人正常胃粘膜组织相比，GC细胞中METTL3蛋白水平显著升高(在线补充图S1F)．这些结果在胃癌患者的组织芯片中得到证实，通过免疫组化(IHC)染色，胃癌组织中METTL3的表达明显高于匹配的正常胃组织(n=83, p<0.001;图1 g, H)．胃癌队列中METTL3蛋白表达与临床病理特征显著相关，如淋巴结转移(p=0.046)和肿瘤、淋巴结、转移(TNM)分期(p=0.005);而METTL3的表达在弥漫性和肠型胃癌患者间无统计学意义(p=0.171;在线补充表S1)．此外，数据显示METTL3表达增加的GC患者5年总生存率较低(n=83, p<0.001, log-rank检验;图1我)．同时，单因素Cox回归分析显示，胃癌患者的淋巴结转移、TNM分期和METTL3表达与5年生存率存在显著相关性(在线补充图S1G多因素Cox回归分析显示，METTL3是胃癌患者预后的独立预测指标(HR=4.495, 95% CI (2.354 ~ 8.584);图1 j)．为了进一步评估METTL3表达的预测能力，我们进行了一个时间依赖的受试者工作特征曲线分析，结果表明，在GC队列中，临床风险评分(TNM分期)和METTL3风险评分的组合比单独的任何一个都贡献更大(图1 k)．例如，临床风险评分在第3年的曲线下面积为0.711，而结合临床风险评分和METTL3风险评分的曲线下面积显著增加到0.796。综合以上结果表明，m6一种修饰和METTL3水平在胃癌中升高，METTL3可能是胃癌患者的独立预后因素。

    p300介导的H3K27ac激活GC中的METTL3转录

    为了探索METTL3在GC中高表达的机制，我们首先通过UCSC基因组生物信息学位点(http://genome.ucsc.edu/)．所示图2一个，在METTL3的启动子区发现大量H3K27乙酰化(H3K27ac)信号，提示METTL3可能受染色质乙酰化的调控。已知H3K27ac是由P300/CBP配合物催化的。19通过TCGA数据分析，我们发现P300 mRNA表达在GC中显著上调(在线补充图S2A)，而CREB结合蛋白(CBP)在GC和正常胃组织中的表达无差异(数据未显示)。然后我们用靶向P300的组蛋白乙酰转移酶抑制剂C646处理HGC-27细胞，结果显示METTL3的表达显著降低，且呈时间依赖性和剂量依赖性，但在HGC-27细胞中未表现出明显的细胞毒性(图2 b；在线补充图S2B、C)．这一结果也在其他两种GC细胞系中得到证实(图2 c, D；在线补充图S2D, E)．western blot检测发现C646处理后H3K27ac和METTL3蛋白水平降低(图2 e)．接下来，我们使用两个特定的sirna直接敲除P300 (图2 f；在线补充图S2F)，并发现P300的敲低显著降低了METTL3的mRNA和蛋白水平(图2 g, H)．此外，染色质免疫沉淀(ChIP)实验结果表明，METTL3启动子区域富集P300结合和H3K27ac信号，敲低P300可显著降低H3K27ac信号在METTL3启动子中的富集(图2 i, J)．这些数据证实了METTL3启动子中p300介导的H3K27ac激活可能是METTL3上调的部分原因(图2 k)．

    P300-mediated H3K27ac activates METTL3 transcription in GC. (A) Data from the UCSC genome bioinformatics site (http://genome.ucsc.edu/) showed high enrichment of H3K27ac in the promoter of METTL3. (B–D) The mRNA levels of METTL3 in C646 (20 µM)-treated HGC-27 (B), NCI-N87 (C) and SGC7901 (D) cells at the indicated time points were measured by qRT-PCR. (E) The METTL3 and H3K27ac protein levels in HGC-27 and NCI-N87 cells were measured by western blotting after C646 treatment (20 µM) for 24 hours. (F) The P300 knockdown efficiency was verified at the protein levels in NCI-N87 cells by western blotting. (G) qRT-PCR analysis of the expression of METTL3 in NCI-N87 cells with P300 knockdown. (H) The METTL3 and H3K27ac protein levels in NCI-N87 cells with P300 deficiency were determined by western blotting. (I, J) ChIP assays were used to determine the level of P300 binding (I) and the enrichment of H3K27ac (J) at the promoter of METTL3 in P300 deficiency or control HGC-27 cells. (K) Graphical illustration of the mechanism by which P300-mediated H3K27ac activation induces METTL3 transcription. The data are the means±SEMs of three independent experiments. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. H3K27ac, H3K27 acetylation; ChIP, chromatin immunoprecipitation; DMSO, dimethyl sulfoxide; GC, gastric cancer.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    p300介导的H3K27ac激活GC中的METTL3转录。(A)来自UCSC基因组生物信息学网站(http://genome.ucsc.edu/)显示H3K27ac在METTL3启动子中高度富集。(B - D)采用qRT-PCR检测C646 (20 μ M)处理的HGC-27 (B)、NCI-N87 (C)和SGC7901 (D)细胞在指定时间点的METTL3 mRNA水平。(E) C646处理24小时(20 μ M)后，western blotting检测HGC-27和NCI-N87细胞中METTL3和H3K27ac蛋白水平。(F)通过western blotting在NCI-N87细胞蛋白水平上验证P300敲除效率。(G) qRT-PCR分析METTL3在P300敲低的NCI-N87细胞中的表达。(H)用western blotting法检测P300缺陷的NCI-N87细胞中METTL3和H3K27ac蛋白水平。(I, J) ChIP检测用于测定P300缺乏或对照HGC-27细胞中P300结合水平(I)和METTL3启动子上H3K27ac (J)的富集情况。(K)图解p300介导的H3K27ac激活诱导METTL3转录的机制。数据为三个独立实验的均数±sem。* p < 0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. H3K27ac, H3K27 acetylation; ChIP, chromatin immunoprecipitation; DMSO, dimethyl sulfoxide; GC, gastric cancer.

    METTL3促进GC增殖和血管生成

    为了检测METTL3在GC中的功能，我们建立了稳定的过表达METTL3的GC细胞(BGC823和AGS) (图3一；在线补充图S3A)．METTL3的上调显著促进GC细胞软琼脂集落形成效率(图3 b)和克隆能力(图3 c)．接下来，我们研究了METTL3是否促进GC细胞增殖依赖于它的m6一种催化活性，表达野生型METTL3或其催化突变体(aa395-398, DPPW→APPA)的质粒在之前的研究中构建，20.和米6与野生型细胞相比，催化突变体METTL3显著降低BGC823细胞的A水平(图3 d)．此外，它还揭示了m6METTL3的催化活性是其促进BGC823细胞克隆能力所不可或缺的(图3 e)．

    METTL3 promotes GC proliferation and angiogenesis in vitro and in vivo. (A) The protein levels of METTL3 in BGC823 and AGS cells with METTL3 overexpression were measured by western blotting. (B) Upregulation of METTL3 enhanced GC cell (BGC823 and AGS) anchorage-independent growth in soft agar (scale bars=200 µm, left panel). Quantification of the soft agar colony formation assay results (right panel). (C) Overexpression of METTL3 increased the colony-formation ability of AGS cells (left panel). Quantification of the colony formation assay results (right panel). (D) The protein levels of METTL3 in BGC823 cells with wild type or catalytic mutant METTL3 overexpression were measured by western blotting (left panel). The mRNAs isolated from wild type or catalytic mutant METTL3-overexpressing GC cells were used in dot blot analyses with m6A antibody (right panel). MB (methylene blue) staining served as a loading control. (E) The clonogenic ability in BGC823 cells with wild type or catalytic mutant METTL3 overexpression was determined (left panel). Quantification of the colony formation assay results (right panel). (F) The protein levels of METTL3 in HGC-27 cells with METTL3 knockout were measured by western blotting (upper panel). The mRNAs isolated from METTL3 knockout or wild type GC cells were used in dot blot analyses with m6A antibody (bottom panel). MB staining served as a the loading control. (G) The anchorage-independent growth of METTL3 knockout HGC-27 cells or control cells in soft agar was determined (scale bars=200 µm, left panel). Quantification of the soft agar colony formation assay results (right panel). (H) Knockout of METTL3 impaired the colony formation ability of HGC-27 cells (left panel). Quantification of the colony formation assay results (right panel). (I) Overexpression of METTL3 effectively promoted GC subcutaneous tumour growth in nude mice (n=6). (J) The tumour volume was monitored every other day, and tumour growth curves were generated. (K) The tumours were extracted and weighed after 20 days. (L) Sections of tumours were stained with anti-Ki-67 and anti-CD31 antibodies by IHC (scale bars=100 µm). (M)Tube formation assay and cell growth in HUVECs cultured with medium collected from BGC823 cells with METTL3 overexpression or from the corresponding control cells. Tubes were imaged (scale bars=200 µm, left panel), and tube formation and cell growth were quantified (right panel). (N) Representative images of three different GC organoids transfected with METTL3 overexpression vectors or control lentivirus for 2 weeks (scale bars=250 µm, left panel) and quantification of organoid diameters (right panel). The data are the means±SEMs of three independent experiments. * p<0.05; *** p<0.001. GC, gastric cancer; HUVEC, human umbilical vein endothelial cell; IHC, immunohistochemistry; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    METTL3促进GC增殖和血管生成。(A)用western blotting法检测METTL3过表达BGC823和AGS细胞中METTL3的蛋白水平。(B) METTL3增强的GC细胞(BGC823和AGS)在软琼脂中非锚定生长(刻度条=200µm，左图)。软琼脂集落形成的定量分析结果(右图)。(C) METTL3过表达增加了AGS细胞的集落形成能力(左图)。菌落形成分析结果的量化(右面板)。(D)用western blotting法检测METTL3过表达野生型或催化突变型BGC823细胞中METTL3的蛋白水平(左图)。从野生型或催化突变型过表达mettl3的GC细胞中分离的mrna用m6抗体(右侧)。MB(亚甲基蓝)染色作为加载对照。(E)测定过表达野生型或催化突变体METTL3的BGC823细胞的克隆能力(左图)。菌落形成分析结果的量化(右面板)。(F) METTL3敲除HGC-27细胞中METTL3蛋白水平用western blotting法测定(上图)。从METTL3敲除或野生型GC细胞中分离的mrna用m6抗体(底部面板)。MB染色作为加载控制。(G)测定METTL3敲除的HGC-27细胞或对照细胞在软琼脂中的非锚定生长(刻度条=200µm，左图)。软琼脂集落形成的定量分析结果(右图)。(H)敲除METTL3损伤HGC-27细胞集落形成能力(左图)。菌落形成分析结果的量化(右面板)。(I) METTL3过表达能有效促进裸鼠GC皮下肿瘤生长(n=6)。(J)每隔一天监测肿瘤体积，生成肿瘤生长曲线。(K) 20天后取出肿瘤并称重。(L)用免疫组化法对肿瘤切片进行抗ki -67和抗cd31抗体染色(比例尺=100µm)。 (M)Tube formation assay and cell growth in HUVECs cultured with medium collected from BGC823 cells with METTL3 overexpression or from the corresponding control cells. Tubes were imaged (scale bars=200 µm, left panel), and tube formation and cell growth were quantified (right panel). (N) Representative images of three different GC organoids transfected with METTL3 overexpression vectors or control lentivirus for 2 weeks (scale bars=250 µm, left panel) and quantification of organoid diameters (right panel). The data are the means±SEMs of three independent experiments. * p<0.05; *** p<0.001. GC, gastric cancer; HUVEC, human umbilical vein endothelial cell; IHC, immunohistochemistry; WT, wild type.

    我们还建立了稳定的METTL3敲除GC细胞(HGC-27和NCI-N87，在线补充图S3B, C)，通过聚类规则间隔短回文重复序列/Cas9基因编辑系统生成METTL3敲除HGC-27细胞(图3 f)．不出所料，m6在METTL3击倒或击倒时，一个等级急剧降低(图3 f；在线补充图S3C)．敲除或敲除METTL3明显抑制软琼脂集落形成效率和克隆能力(图3 g, H；在线补充图S3D, E)．我们还进行了肿瘤异种移植研究，以验证METTL3在体内的作用，结果显示，METTL3过表达显著促进肿瘤生长，这反映在肿瘤的大小和重量与来自载体控制细胞的肿瘤相比(图3 i (k)．此外，IHC结果显示，与对照组相比，METTL3过表达组的肿瘤组织中增殖的生物标志物Ki-67表达增加(图3 l)．令人惊讶的是，通过CD31(一种血管生成的标志)染色来评估微血管密度，15与载体对照组相比，METTL3过表达组的肿瘤组织明显增加(图3 l)．为了进一步研究METTL3在GC血管生成中的作用，我们在体外研究了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的生长和管的形成。与载体对照的条件培养基相比，过表达METTL3的BGC823细胞的条件培养基显著增加了管的形成和HUVEC的生长(图3米）;而过表达催化突变体METTL3的AGS细胞条件培养基对HUVEC生长和管形成无显著影响(在线补充图S3F)．相应的，METTL3敲除HGC-27细胞的条件培养基显著损害了管的形成和HUVEC的生长(在线补充图S3G)．为了进一步验证METTL3的潜在临床价值，我们还使用三个不同GC患者的类器官建立GC类器官模型。结果表明，慢病毒过表达METTL3可显著促进胃癌细胞在三种不同GC类器官中的增殖(图3 n)．这些数据表明，METTL3可能作为一种癌基因，促进胃癌增殖和血管生成依赖于它的m6催化活性。

    METTL3促进GC在体外和体内转移

    为了确定METTL3在胃癌转移中的作用，我们首先在体外进行了迁移和侵袭试验。结果表明，异位表达METTL3促进BGC823和AGS细胞的迁移和侵袭(图4 a, B）;而过表达催化突变体METTL3对GC细胞的迁移和侵袭无明显影响(在线补充图S4A)．相反，在HGC-27和NCI-N87细胞中敲除或敲除METTL3产生相反的效果(图4 c；在线补充图S4B、C)．我们进一步评估了METTL3在体内对胃癌转移的影响。过表达METTL3的bgc823 -荧光素酶细胞及相应对照细胞经裸鼠脾门静脉注射。8周后，METTL3的上调显著促进胃癌肝转移，生物发光成像显示(图4 d)和肝转移病灶的数量和大小(图4 e, F)与对照组相比。相比之下，METTL3缺失的NCI-N87细胞显著抑制GC肝转移，这可以从肝转移病灶的数量和大小与相应对照组相比得到证明(图4 g, H)．总的来说，这些结果表明了METTL3在促进胃癌转移中的关键作用。

    METTL3 promotes GC metastasis in vitro and in vivo. (A–C) Cell migration and invasion assays of BGC823 cells (A), AGS cells (B) and HGC-27 cells (C) after overexpression or knockout of METTL3. Representative images (scale bars=200 µm, upper panel) and quantification (bottom panel) of the cell migration and invasion assay results were shown. (D–F) Overexpression of METTL3 significantly increased GC liver metastasis in nude mice (n=6). (D) Representative bioluminescence imaging of mice 8 weeks after splenic portal vein injection of BGC823 cells with METTL3 overexpression or vector-transfected cells (left panel) and quantification of the results of bioluminescence imaging in the liver region (right panel). (E) Representative images of the metastatic nodes in the livers (scale bars=5 mm, left panel) and quantification of the metastatic nodes (right panel). (F) H&E-stained liver sections (scale bars=200 µm). (G, H) Knockdown of METTL3 in NCI-N87 cells markedly suppressed GC liver metastasis in nude mice (n=6). (G) Representative images of the metastatic nodes in the livers (left panel) and quantification of the metastatic nodes (right panel). (H) H&E-stained liver sections (scale bars=200 µm). The data are the means±SEMs of three independent experiments. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. GC, gastric cancer; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    METTL3促进GC在体外和体内转移。(A - C) METTL3过表达或敲除后BGC823细胞(A)、AGS细胞(B)和HGC-27细胞(C)的细胞迁移和侵袭测定。细胞迁移和侵袭实验结果的代表性图像(刻度条=200µm，上图)和定量图(下图)。(D-F) METTL3过表达显著增加裸鼠胃癌肝转移(n=6)。(D)脾门静脉注射METTL3过表达BGC823细胞或载体转染细胞8周后小鼠的代表性生物发光成像(左图)和肝区生物发光成像结果的量化(右图)。(E)肝脏转移淋巴结的代表性图像(标尺= 5mm，左图)和转移淋巴结的量化(右图)。(F) h&e染色肝脏切片(比例尺=200 μ m)。(G, H) NCI-N87细胞中METTL3的敲除能显著抑制裸鼠胃癌肝转移(n=6)。(G)肝脏转移淋巴结的代表性图像(左图)和转移淋巴结的量化(右图)。(H) h&e染色肝脏切片(比例尺=200µm)。 The data are the means±SEMs of three independent experiments. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. GC, gastric cancer; WT, wild type.

    METTL3-mediated米6HDGF mRNA的修饰维持了其依赖于igf2bp3的稳定性

    为了确定METTL3促进GC进展的分子机制，我们在METTL3过表达和敲除稳定的GC细胞中进行RNA测序(RNA-seq)，并进行m6a修饰RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)在METTL3过表达稳定的GC细胞和对照细胞中(图5一个)．RNA-seq显示，在METTL3过表达时，3806个转录本显著上调(倍数变化为>2)，而在METTL3敲除时，2346个转录本显著下调(倍数变化<0.5)。MeRIP-seq发现m69930个转录本的A峰丰度增加(倍变>1.2)。有趣的是，RNA-seq和MeRIP-seq数据中有3个转录本重叠，它们来自三个不同的基因，即HDGF、C12orf45和CDKN2A (图5一个)．m6这三个转录本的丰度在METTL3上调时分别增加了1.47-、1.57-和1.41倍P值分别为7.94328E-35、0.049和0.1。接下来，我们在METTL3过表达的GC细胞系(BGC823和AGS)和METTL3敲除或敲除的GC细胞系(HGC-27和NCI-N87)中验证了这三个候选基因的mRNA水平。在所有四种GC细胞系中，只有HDGF而不是C12orf45和CDKN2A被METTL3一致调控(图5 b, C；在线补充图S5A-G)．我们还通过western blot实验证实，在不同GC细胞系中，METTL3正向调控HDGF蛋白水平(图5 d)．同时，我们发现催化突变体METTL3过表达不能在mRNA和蛋白水平上调控HDGF (图5 e；在线补充图S5H)．此外，与相应的对照细胞相比，过表达METTL3的BGC823细胞在条件培养基中HDGF水平显著升高，但催化突变体METTL3的HDGF水平不升高(图5 f)．METTL3敲除的HGC-27细胞与对照细胞相比，条件培养基中HDGF水平也显著降低(在线补充图S5I)．所示图5克HDGF定位于细胞质和细胞核中，METTL3敲除后，这两个隔室中的HDGF水平均降低。此外，METTL3过表达导致GC肝转移灶中HDGF染色明显增加，但敲低METTL3显著降低HDGF染色(在线补充图S5J)．

    METTL3-mediated m6A modification of HDGF mRNA maintains its IGF2BP3-dependent stability. (A) RNA-seq and MeRIP-seq identified differentially expressed genes in METTL3 stable overexpression and knockout cells when compared with their corresponding controls. (B–C) The mRNA levels of HDGF in METTL3-overexpressing (B), and METTL3 knockout (C) GC cells were detected by qRT-PCR. (D) The levels of the indicated proteins in METTL3-overexpressing and METTL3-deficient GC cells were detected by western blotting. (E) The protein levels of HDGF in wild type or catalytic mutant METTL3-overexpressing AGS cells were measured by western blotting. (F) The HDGF levels in conditional medium from wild type or catalytic mutant METTL3-overexpressing BGC823 cells were measured via ELISA assay. (G) Immunofluorescence (IF) assay was used to detect the expression and location of HDGF in METTL3 wild type and knockout GC cells (magnification: × 40). (H) Global profiling of m6A in BGC823 cells and the sequence motif identified from the top 1000 m6A peaks. (I) The m6A abundances on HDGF mRNA transcripts in BGC823 cells as detected by MeRIP-seq were plotted. (J) MeRIP-qPCR analysis was employed to demonstrate METTL3-mediated HDGF m6A modifications. The m6A modification of HDGF was increased on upregulation of METTL3, while it was depleted on knockout of METTL3. (K) The levels of HDGF expression in METTL3-overexpressing, METTL3 knockout and their corresponding control GC cells treated with actinomycin D (2 µg/mL) at the indicated time points were detected by qRT-PCR. (L) The mRNA levels of HDGF in IGF2BP3 knockdown GC cells were detected by qRT-PCR. (M) RNA immunoprecipitation (RIP)-qPCR assay using IGF2BP3-specific antibody and IgG control antibody to detect the enrichment of IGF2BP3 binding to HDGF m6A modification sites. (N) The levels of HDGF expression were detected in GC and paired normal gastric mucosa by qRT-PCR (n=28). (O) The levels of HDGF expression were analysed in GC (n=413) and normal gastric mucosa (n=32) using TCGA data. (P) The levels of IGF2BP3 expression were detected in GC and paired normal gastric mucosa by qRT-PCR (n=28). (Q) The levels of IGF2BP3 expression were analysed in GC (n=413) and normal gastric mucosa (n=32) using TCGA data. (R, S) METTL3 (R) and IGF2BP3 (S) expression were positively correlated with HDGF expression in GC (linear regression). (T) Knockdown of METTL3, HDGF, IGF2BP3 effectively inhibited NCI-N87 GC cells subcutaneous tumour growth in nude mice (n=6). (U) The tumour volume was monitored every other day, and tumour growth curves were generated. (V) The tumours were extracted and weighed after 21 days. The data are the means±SEM of three independent experiments, * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. GC, gastric cancer; MeRIP-seq, m6A-modified RNA immunoprecipitation sequencing; RNA-seq, RNA sequencing; TCGA, The Cancer Genome Atlas; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    METTL3-mediated米6HDGF mRNA的修饰维持了其依赖于igf2bp3的稳定性。(A) RNA-seq和MeRIP-seq在METTL3稳定过表达和敲除细胞中与相应对照进行比较，识别出差异表达基因。(B - C)用qRT-PCR检测METTL3过表达(B)和METTL3敲除(C) GC细胞中HDGF的mRNA水平。(D)用western blotting法检测mettl3过表达和mettl3缺乏的GC细胞中指示蛋白的水平。(E)用western blotting法检测过表达mettl3的野生型或催化突变型AGS细胞中HDGF的蛋白水平。(F)通过ELISA法测定过表达mettl3的野生型或催化突变型BGC823细胞条件培养基中的HDGF水平。(G)免疫荧光(IF)法检测HDGF在METTL3野生型和敲除型GC细胞中的表达和定位(放大倍数:× 40)。(H) m6在BGC823细胞中A和从顶部1000 m中识别的序列基序6一个峰值。(我)m6用MeRIP-seq检测BGC823细胞中HDGF mRNA转录物的丰度。(J)采用MeRIP-qPCR方法检测mettl3介导的HDGF6一个修改。m6HDGF的修饰在METTL3上调时增加，而在METTL3敲除时减少。(K)用qRT-PCR检测放线菌素D处理的METTL3过表达、METTL3敲除及其相应对照GC细胞(2µg/mL)在指示时间点的HDGF表达水平。(L)用qRT-PCR检测IGF2BP3敲低的GC细胞中HDGF的mRNA水平。(M) RNA免疫沉淀(RIP)-qPCR法，使用IGF2BP3特异性抗体和IgG对照抗体检测IGF2BP3结合HDGF M的富集6修改网站。(N)用qRT-PCR检测胃癌和配对正常胃黏膜中HDGF的表达水平(N =28)。(O)利用TCGA数据分析胃癌(n=413)和正常胃黏膜(n=32)中HDGF的表达水平。(P)用qRT-PCR检测胃癌和配对正常胃黏膜中IGF2BP3的表达水平(n=28)。(Q)用TCGA数据分析胃癌(n=413)和正常胃黏膜(n=32)中IGF2BP3的表达水平。(R, S) METTL3 (R)和IGF2BP3 (S)的表达与GC中HDGF的表达呈正相关(线性回归)。(T)敲除METTL3、HDGF、IGF2BP3能有效抑制裸小鼠NCI-N87 GC细胞皮下肿瘤生长(n=6)。(U)每隔一天监测肿瘤体积，生成肿瘤生长曲线。(V) 21天后取出肿瘤并称重。数据为三个独立实验的均值±SEM， * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. GC, gastric cancer; MeRIP-seq, m6a修饰RNA免疫沉淀测序;RNA-seq, RNA序列;TCGA，癌症基因组图谱;WT,野生型。

    m6A多出现在rach (R=G或A, H=A, C或U)一致性序列中。21我们的MeRIP-seq结果显示，AGACC motif在METTL3过表达的免疫纯化RNA中高度富集(图5 h)和m6METTL3上调后HDGF mRNA丰度显著增加(p=7.94328E-35) (图5我)．有趣的是，AGACC motif和GAACA motif都包含在HDGF的外显子中。用MeRIP-qPCR对所得数据进行了验证，结果表明，与对照抗体IgG相比，m6a特异性抗体显著富集METTL3过表达部位的HDGF mRNA6a特异性抗体显著降低METTL3敲除后HDGF mRNA的富集(图5 j)．考虑到m6修饰后的HDGF mRNA水平有正调控作用6修饰影响了HDGF mRNA的稳定性。GC细胞用放线菌素D(一种转录抑制剂)处理指定的时间。HDGF mRNA水平在METTL3过表达时高度稳定，而在METTL3敲除时则显示相反的作用(图5 k)．最近的一项研究报道igf2bp，包括IGF2BP1/2/3，是一个独特的m6一种通过识别m6在高通量测序结果中，HDGF是IGF2BP1/2/3的靶点之一。22因此，我们探索了IGF2BP1/2/3对HDGF mRNA稳定的影响。我们针对IGF2BP1/2/3的每个靶点设计了两个特定的sirna，并确认了这些结构的敲除效率(在线补充图S5K-M)．只有IGF2BP3的表达下调显著抑制了HDGF mRNA的表达，而IGF2BP1/2对HDGF mRNA的表达无显著影响(图5 l；在线补充图S5N, O)．所示图5米与对照抗体相比，在RIP-qPCR实验中，igf2bp3特异性抗体显著富集HDGF mRNA。接下来，我们比较了28个GC组织和TCGA数据中HDGF和IGF2BP3的mRNA水平。结果表明，与正常胃组织相比，胃癌组织中HDGF和IGF2BP3的表达明显上调(图5 n q)．我们还发现METTL3和IGF2BP3的表达与HDGF的表达显著相关(R2= 0.232, p = 0.009;R2= 0.1709, p = 0.0287) (图5 r, S)．我们还进行了肿瘤异种移植研究，以验证HDGF和IGF2BP3在体内的作用，结果表明，与对照组相比，METTL3、HDGF和IGF2BP3的敲除显著抑制肿瘤生长(图5过程)．总之，我们的研究结果表明mettl3介导的m6通过igf2bp3依赖的HDGF mRNA的稳定性来维持HDGF的表达。

    METTL3通过上调HDGF的表达加速GC的恶性过程

    为了进一步描述HDGF在GC中的致癌功能，我们设计了三种不同的sirna来靶向HDGF，并通过qRT-PCR和western blotting (图6)．抑制HDGF显著抑制菌落形成(图6 b)、细胞迁移和侵袭(图6 c)、HUVEC生长及管的形成(图6 d)．此外，HDGF重组蛋白(rHDGF)挽救了METTL3敲除GC细胞的集落形成能力(图6 e)．正如预期的那样，HDGF的表达在过表达mettl3的AGS细胞中被其特异性的sirna敲除，显著抑制了mettl3诱导的GC细胞迁移和侵袭(图6 f；在线补充图S6A)，但rHDGF挽救了METTL3敲除GC细胞的迁移和侵袭能力(在线补充图S6B)．此外，HDGF抗体可阻断METTL3过表达引起的HUVEC生长和管形成，rHDGF抗体可挽救METTL3敲除引起的GC细胞HUVEC生长和管形成(在线补充图S6C, D)．此外，敲低HDGF显著抑制mettl3诱导的体内GC生长和血管生成(图6 g-j)．因此，我们的数据表明，METTL3通过上调HDGF表达促进GC恶性进展。

    METTL3 accelerates GC malignant progression by upregulating HDGF. (A) The HDGF knockdown efficiency was verified at the mRNA levels (upper panel) and protein levels (bottom panel) in HGC-27 cells by qRT-PCR and western blot assay, respectively. (B) Knockdown of HDGF impaired colony formation ability in HGC-27 cells (upper panel); quantification results of colony formation (bottom panel). (C) Knockdown of HDGF impaired cell migration and invasion ability in HGC-27 cells (scale bars=200 µm, upper panel); quantification results of cell migration and invasion (bottom panel). (D) Tube formation assay in HUVECs cultured with medium collected from HGC-27 cells with HDGF deficiency and corresponding control cells. tubes were imaged (scale bars=200 µm, upper panel) and quantified for tube formation and cell growth (bottom panel). (E) Representative images (left panel) and quantification results (right panel) of the colony formation abilities of METTL3 knockout HGC-27 cells added with human rHDGF or PBS. (F) Representative images (scale bars=200 µm, left panel) and quantification results (right panel) of the cell migration and invasion abilities of METTL3-overexpressing AGS cells transfected with the HDGF siRNAs or their corresponding controls. (G) Knockdown of HDGF inhibited METTL3-induced AGS GC cells subcutaneous tumour growth in nude mice (n=6). (H) The tumour volume was monitored every other day, and tumour growth curves were generated. (I) The tumours were extracted and weighed after 19 days. (J) Sections of tumours were stained with anti-Ki-67 and anti-CD31 antibodies by IHC (scale bars=100 µm). The data are the means±SEM of three independent experiments, * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. GC, gastric cancer; HUVEC, human umbilical vein endothelial cell; rHDGF, HDGF recombinant protein; IHC, immunohistochemistry; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    METTL3通过上调HDGF加速GC恶性进展。(A)分别通过qRT-PCR和western blot检测，在HGC-27细胞的mRNA水平(上图)和蛋白水平(下图)上验证HDGF的敲除效率。(B) HDGF的抑制降低了HGC-27细胞集落形成能力(上图);菌落形成的定量结果(下面板)。(C) HDGF抑制HGC-27细胞的迁移和侵袭能力减弱(标尺=200 μ m，上图);细胞迁移和侵袭的定量结果(下图)。(D)用从HGC-27缺乏HDGF的细胞和相应对照细胞中收集的培养基培养HUVECs的管形成试验。对管进行成像(刻度条=200 μ m，上面板)，并对管的形成和细胞生长进行量化(下面板)。(E) METTL3敲除HGC-27细胞加入人rHDGF或PBS后集落形成能力的代表性图像(左图)和定量结果(右图)。(F)转染HDGF sirna或相应对照的过表达mettl3的AGS细胞迁移和侵袭能力的代表性图像(标尺=200 μ m，左图)和定量结果(右图)。 (G) Knockdown of HDGF inhibited METTL3-induced AGS GC cells subcutaneous tumour growth in nude mice (n=6). (H) The tumour volume was monitored every other day, and tumour growth curves were generated. (I) The tumours were extracted and weighed after 19 days. (J) Sections of tumours were stained with anti-Ki-67 and anti-CD31 antibodies by IHC (scale bars=100 µm). The data are the means±SEM of three independent experiments, * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. GC, gastric cancer; HUVEC, human umbilical vein endothelial cell; rHDGF, HDGF recombinant protein; IHC, immunohistochemistry; WT, wild type.

    METTL3通过hdgf激活GLUT4和ENO2的表达增强GC的糖酵解

    糖酵解是癌症的主要代谢特征之一。23RNA-seq数据显示，不同的代谢途径，特别是糖酵解/糖异生，参与了METTL3过表达的GC进展(在线补充图S7A)．因此，我们研究了METTL3是否调节糖酵解促进GC恶性过程。所示图7 a, B在BGC823细胞中，上调METTL3表达显著增加葡萄糖摄取和乳酸生成。相反，在HGC-27细胞中敲除METTL3显著减少葡萄糖摄取和乳酸生成(在线补充图S7B、C)．为了研究HDGF是否能恢复METTL3敲除细胞的糖酵解活性，将HDGF过表达质粒转染到METTL3敲除细胞中。HDGF的过表达首次被证实(在线补充图S7D)，发现HDGF过表达恢复糖酵解活性，并显著增加METTL3敲除GC细胞的乳酸产量(图7 c)．细胞外酸化速率动力学曲线进一步表明，过表达METTL3的BGC823细胞的糖酵解活性显著增加，敲除METTL3的HGC-27细胞的糖酵解活性显著降低(图7 d, E)．为了进一步研究METTL3调节糖酵解的机制，我们检测了METTL3过表达和METTL3敲除GC细胞中葡萄糖代谢相关基因的转录(图7 f；在线补充图S7E)．我们还检测了这些基因是否受HDGF调控，并检测了HDGF敲低GC细胞中的葡萄糖代谢相关基因(图7 g)．有趣的是，只有GLUT4和ENO2的表达水平主要通过上调METTL3增强(倍变化>1.5)，但通过敲除METTL3或敲除HDGF, GLUT4和ENO2的表达水平持续下降(倍变化<0.5)。考虑到HDGF可以定位于细胞核并作为转录调节因子，24我们研究了HDGF是否可以通过转录激活GLUT4和ENO2的表达。采用ChIP检测，结果显示HDGF直接与GLUT4和ENO2的启动子区域结合，而与HK2的启动子区域不结合(图7 h)．此外，IHC结果显示，METTL3过表达导致AGS异种肿瘤中HDGF、GLUT4和ENO2染色明显增加，而当HDGF敲低时，GLUT4和ENO2表达明显降低(图7我)．METTL3缺失的NCI-N87肿瘤移植瘤中HDGF、GLUT4和ENO2染色明显降低(图7 j)．综上所述，这些结果表明METTL3/HDGF部分通过糖酵解途径促进GC肿瘤发生和肝转移。

    METTL3-HDGF axis enhances glycolysis by targeting GLUT4 and ENO2 in GC cells. (A, B) Overexpression of METTL3-induced glucose uptake (A) and lactate production (B) in BGC823 cells. (C) Overexpression of HDGF rescues lactate production in METTL3 knockout HGC-27 cells. (D, E) The ECAR profile was monitored in METTL3-overexpressing (D) or METTL3 knockout (E) GC cells with a Seahorse XF24 analyser for 100 min. The metabolic inhibitors were injected sequentially at different time points as indicated. (F, G) GLUT4 and ENO2 were identified as METTL3/HDGF-regulated genes. The expression of a panel of glucose metabolism-related genes was detected by qRT-PCR in METTL3-overexpressing (F) or HDGF knockdown (G) cells and their corresponding control cells. (H) ChIP assay was used to detect the ability of HDGF binding to GLUT4, ENO2 and the HK2 promoter. (I) Sections of tumour xenografts from METTL3-overexpressing or METTL3-overexpressing with knockdown of HDGF AGS cells subcutaneously injected nude mice were stained with METTL3, HDGF, GLUT4 and ENO2 antibodies by IHC (scale bars=100 µm). (J) Sections of tumour xenografts from METTL3 knockdown NCI-N87 cells subcutaneously injected nude mice were stained with METTL3, HDGF, GLUT4 and ENO2 antibodies by IHC (scale bars=100 µm). The data are the means±SEM of three independent experiments, * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. ChIP, chromatin immunoprecipitation; ECAR, extracellular acidification rate; GC, gastric cancer; IHC, immunohistochemistry; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    METTL3-HDGF轴通过靶向GLUT4和ENO2在GC细胞中增强糖酵解。(A, B) mettl3在BGC823细胞中诱导葡萄糖摄取(A)和乳酸生成(B)的过表达。(C)在METTL3敲除的HGC-27细胞中，过表达HDGF可以挽救乳酸的生成。(D, E)用Seahorse XF24分析仪在METTL3过表达(D)或METTL3敲除(E) GC细胞中监测ECAR谱，持续100分钟。按照指示，在不同时间点依次注射代谢抑制剂。(F, G) GLUT4和ENO2被鉴定为METTL3/ hdgf调控基因。用qRT-PCR方法检测mettl3过表达(F)或HDGF敲低(G)细胞及其相应对照细胞中葡萄糖代谢相关基因的表达。(H) ChIP法检测HDGF结合GLUT4、ENO2和HK2启动子的能力。(I)裸鼠皮下注射过表达或过表达敲除HDGF AGS细胞的肿瘤移植瘤切片，用免疫组化法染色METTL3、HDGF、GLUT4和ENO2抗体(比例尺=100µm)。(J)皮下注射裸鼠的METTL3敲除NCI-N87细胞肿瘤移植瘤切片，用免疫组化法染色METTL3、HDGF、GLUT4和ENO2抗体(比例尺=100µm)。数据为三个独立实验的均值±SEM， * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. ChIP, chromatin immunoprecipitation; ECAR, extracellular acidification rate; GC, gastric cancer; IHC, immunohistochemistry; WT, wild type.

    为了研究METTL3/HDGF轴在促进GC糖酵解和血管生成中的临床意义，我们检测了胃癌患者癌组织中METTL3、HDGF、GLUT4、ENO2和CD31的表达，并将这些组织分为METTL3-低组和METTL3-高组，并确定它们在GC中的相关性(图8)．54例胃癌患者中METTL3的表达与HDGF、CD31、GLUT4、ENO2的表达呈正相关(图8 b)．此外，我们通过在线生物信息学工具Kaplan-Meier Plotter (http://kmplot.com/analysis/；补充图S7F)．这些数据表明，METTL3/HDGF轴通过诱导糖酵解和血管生成促进人类GC进展。

    The clinical significance of the METTL3/HDGF axis in inducing tumour angiogenesis and glycolysis in human GC. (A, B) METTL3 levels were significantly associated with the expression of HDGF, CD31, GLUT4, and ENO2 in 54 primary human GC specimens. (A) Two representative cases are shown (scale bars=50 µm). (B) The percentages of specimens showing low or high METTL3 expression relative to the levels of HDGF, CD31, GLUT4 and ENO2 are shown. (C) The graphic illustration of METTL3 modulating tumour glycolysis and angiogenesis promoting tumour growth and liver metastasis of GC. *** p<0.001. GC, gastric cancer.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8
    图8

    METTL3/HDGF轴在人胃癌肿瘤血管生成和糖酵解诱导中的临床意义。(A, B)在54例原发性胃癌标本中，METTL3水平与HDGF、CD31、GLUT4和ENO2的表达显著相关。(A)有两个代表性的案例(比例尺=50µm)。(B) METTL3低表达或高表达相对于HDGF、CD31、GLUT4和ENO2水平的标本百分比显示。(C) METTL3调节肿瘤糖酵解和血管生成促进胃癌肿瘤生长和肝转移的图解。* * * p < 0.001。GC,胃癌。

    讨论

    人类RNA中存在超过100种化学修饰。17个25在RNA修饰中，m6A在mRNA和非编码RNA中最为普遍。26最近的一系列研究表明，m6基因修饰与多种人类疾病有关，包括II型糖尿病、癌症进展、病毒感染和心力衰竭。27-31m6修改通过m进行动态调节6一个甲基转移酶，去甲基化酶和解读器，它们调节RNA的生物功能。32在本研究中，我们证明了m6由于GC中甲基转移酶METTL3的上调，A水平显著升高。机制上，p300介导的METTL3启动子中的H3K27ac激活诱导METTL3转录，从而刺激m6HDGF mRNA修饰，m6然后读取器IGF2BP3直接与m结合6HDGF mRNA上的一个位点，维持该mRNA的稳定性。分泌型HDGF促进肿瘤血管生成，核型HDGF激活GLUT4和ENO2的表达，进而使GC细胞糖酵解增加，促进GC进展，导致临床预后恶化(图8 c)．

    最近的报告显示，m6在各种癌症的发展过程中，基因修饰起着重要而多样的生物学功能。33在米6作为一种调节剂，METTL3在各种类型的癌症中得到了广泛的研究。34先前的研究报道METTL3促进了肝细胞癌的进展，21膀胱癌,35肺癌,20.乳腺癌,36胶质母细胞瘤29还有急性髓系白血病。37在这里，我们首次发现H3K27ac激活了GC中METTL3的转录并增加了METTL3的表达。随后，METTL3诱导m6GC中的一个修改。此外，我们的数据表明，METTL3的表达与胃癌患者的不良预后相关，包括METTL3的表达可以提高临床风险评分的预测能力，提示METTL3可能是胃癌诊断的生物标志物。Lauren的标准是GC中应用最广泛的分型，包括肠型、弥漫性和混合型，这与GC的预后有关。然而，在GC患者中，METTL3的表达在弥漫型和肠道型之间没有统计学差异。体外和体内研究表明，METTL3依赖于其基质促进胃癌肿瘤生长和肝转移6催化活性。因此，METTL3可作为GC的潜在预测生物标志物和治疗靶点。

    通过RNA-seq和MeRIP-seq，我们发现HDGF是GC中METTL3的关键下游靶标。HDGF是一种新的生长因子，最初是从HuH-7肝癌细胞系的条件培养基中纯化出来的。24 38据报道，HDGF参与了许多癌症过程，包括癌症生长、凋亡、血管生成和转移。39在不同的条件下，HDGF可以在细胞质和细胞核之间穿梭。40细胞外HDGF可通过受体介导的途径刺激肿瘤的发生和进展。39核HDGF可以通过与下游基因的DNA结合来调节下游基因的转录。39 41通过筛选一组葡萄糖代谢相关基因，我们确定GLUT4和ENO2为METTL3/HDGF的靶基因。此外，HDGF直接结合GLUT4和ENO2的启动子，诱导其表达。有报道称HDGF可作为转录抑制因子调节基因表达;但也有一些转录因子或共转录因子在调控基因表达方面具有双面性，如YAP、42小胡子,42YY1。43因此，我们认为HDGF在一定条件下也可以作为激活剂调节细胞的生物学功能。此外，GLUT4是一种促进葡萄糖摄取的葡萄糖转运蛋白，而ENO2是一种促进糖酵解的细胞质糖酵解酶。44 45在GC组织中，METTL3的表达与HDGF、CD31、GLUT4和ENO2的表达呈正相关，提示METTL3/HDGF轴在促进GC糖酵解和血管生成方面具有临床意义。这些数据提供了一个新的METTL3在GC进展中的调控模型。

    总之，我们的研究结果揭示了METTL3在胃癌发展中的致癌作用。机制上，METTL3/HDGF/GLUT4/ENO2轴通过增加糖酵解和血管生成促进GC肿瘤发生和转移。此外，METTL3在胃癌中表达明显增加，与胃癌患者预后不良相关。因此，METTL3可能是GC潜在的预测指标和治疗靶点。

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    脚注

    • QW, CC和QD是共同第一作者。

    • QW、CC和QD贡献相当。

    • 贡献者QW、CC、QD、YZ、ZW、JC、ZJ、YZhao分别进行了实验;QW和CC分析数据;GX、JZ、QD、BS、XZ提供样品;QW和SW撰写论文;BS和JZhang对研究进行了评论并对论文进行了修改;SW设计了这项研究。

    • 资金国家自然科学基金资助项目(81773383,81370078,31771628,81903085);江苏省杰出青年科学基金项目(BK20170047);中央高校基本科研业务费专项资金(021414380439);中国博士后科学基金项目(2019M651808)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 病人同意发表不是必需的。

    • 伦理批准本研究使用人胃癌组织和放弃患者同意，分别获得南通肿瘤医院和南京鼓楼医院临床研究评审委员会的批准。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》所表达的原则进行的。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。

    • 数据可用性声明资料应合理要求提供。