从阿姆斯特丹地区的门诊招募了新发病的T1D患者。受试者年龄18-35岁，体重指数(BMI)正常(18.5-25 kg/m²，抗gad /IA-2阳性)，在被诊断为T1D时纳入，纳入前最长时间为6周，且仍有β细胞功能(MMT后血浆C肽>0.2 mmol/L和/或>1.2 ng/mL)。排除标准为最近3个月内诊断或出现其他自身免疫性疾病、免疫力低下、使用任何全身药物(胰岛素除外)和使用抗生素或质子泵抑制剂。

瘦(BMI <25 kg/m²)，杂食性、健康的白种人男性和女性被招募来充当粪便捐赠者。选择标准描述在 在线补充方法．受试者采用计算机随机化以1:1的方式分配，分别在0、2和4个月时用新鲜产生的粪便经鼻十二指肠管接受三次自体或异体粪便移植( 图1 b)，而供体的性别与上文所述相同 24详细内容见 在线补充方法．所有患者和研究人员均未接受治疗分配。

有关每次考察的详细说明，请参阅 在线补充方法．在0、2、6、9和12个月时进行混合餐试验(剩余β细胞功能)、肠道微生物群分析和免疫分析，包括荧光激活细胞分选、淋巴细胞刺激试验(LST)和人白细胞抗原多聚体分析，以枚举CD8 T细胞对胰岛自身抗原(CD8量子点(QDot))的自身免疫。在0、6和12个月时测量靶向血浆代谢物(Metabolon, Morrisville, North Carolina, USA)。在0和6个月时进行胃十二指肠镜和十二指肠活检以评估小肠微生物群，并进行定量逆转录PCR以评估十二指肠基因表达(见 在线补充表1)．在所有时间点进行生物特征测量和血糖参数( 图1 b)．有关这些分析技术的详细描述，请参阅 在线补充方法．

每组样本量为17例(共34例)，需要提供80%的功率来检测混合膳食试验(MMT)刺激的C肽曲线下面积(AUC)在12个月时的50%差异(360 mmol/L/min vs 180 mmol/L/min, SD为170 mmol/L/min) 26日27日采用α=0.05的双侧检验，并假设有10%的退出。之所以选择这个分界点，是因为它是T1D研究中已确定的分界点，通常被其他T1D干预研究使用。 27所有分析均基于预先指定的意向治疗队列。对主要终点、文本和图中提到的免疫参数以及粪便微生物群和代谢物进行了完整的病例分析。其他(次要)端点中的缺失值被假设为随机缺失或完全随机缺失。缺失值的详细信息可在 在线补充方法(在“缺失值”的小标题下)。试验的主要终点是与基线(0个月)相比，6个月和12个月(MMT刺激)C肽释放的保存。因此选择这个主要终点是因为该研究主要关注肠道微生物群介导的β细胞功能的影响。虽然有更好的临床标志物来监测糖尿病治疗效果，如糖化血红蛋白、稳态模型评估(HOMA)或每日胰岛素单位数，但这些都受内源性胰岛素分泌和饮食、胰岛素顺应性和胰岛素抵抗的影响;因此，我们不认为这些标记物可以作为我们研究的主要终点。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》(2013年更新版)在学术医疗中心(阿姆斯特丹)进行的。所有参与者提供书面知情同意书。该研究在荷兰试验注册中心进行前瞻性注册( https://www.trialregister.nl/trial/3542)．患者的安全由一个独立的数据安全监测委员会(DSMB)保护。患者没有参与研究过程。

关于主要和次要终点的统计分析的细节在 在线补充方法．为了确定哪些参数(作为基线值或相对变化)最能预测治疗组和有应答者与无应答者，我们应用了极端梯度增强(XGBoost)机器学习分类算法， 28结合稳定性选择程序。 29中提供了这些预测模型分析与接受者-操作者曲线(AUROC)值下面积和每个模型的前三个预测特征的概述 在线补充表S2．关于这些分析的详细信息描述在 在线补充方法．

自体FMT的效果并不令人惊讶，因为它通过将粪便微生态引入密度低得多的小肠来影响内稳态。 30.因此，对FMT有应答者与无应答者进行了事后分析，与治疗组无关，其中最相关的特征显示在 在线补充表2．关于这些分析的详细信息描述在 在线补充方法．

各组间基线时平均空腹血浆C肽相似(自体组为319 pmol/L±118 (SD) vs异体组为327±89;p=0.86, Student 's t检验)，但自体FMT组在12个月时与异体FMT组恶化(348 pmol/L±115 vs 202±85,Student 's t检验p值=0.0049;线性混合模型p=0.00019， 图1C和F)．通过刺激C肽反应AUC表达的剩余β细胞功能也看到了类似的影响，其在基线时相同(自体组为77 mmol/L/min±21，异体组为78±33;(85 mmol/L/min±27 vs 53±33,Student 's t-test p值=p=0.033, LMM p值=0.000067， 图1D和G)．不出所料，在T1D诊断后开始外源性胰岛素治疗后，自体和异体FMT组的A1c水平在12个月时下降。提供相似量的每日外源性胰岛素(0.47 IU/kg/day vs 0.45 IU/kg/day, p值分别为0.71)。自体FMT组与异体FMT组相比，血糖控制无明显改善(A1c 46 vs 53.5 mmol/mol, p=0.19, Mann-Whitney U检验(MWU) p=0.19, LMM p值=0.12， 图1E和H)．0、6和12个月的糖代谢参数见 表2．最后，体重、粪便钙保护蛋白、微量白蛋白尿、血脂和饮食摄入量(单独评估总热量、脂肪、饱和脂肪、蛋白质、碳水化合物和纤维)在基线时没有差异( 表1)或在研究期间( 在线补充图S1A-E为膳食参数，S1F为体重)。

从全血中分析了广泛的先天性和适应性免疫细胞表型样本(各组的基线中位数列于 在线补充表S3)．个体T细胞对IA-2、GAD65和胰岛素前原(增殖试验和LST)的反应或胰岛自身反应性CD8+ T细胞(Qdot)的血液频率在研究时间点6个月和12个月时，使用预测模型或MWU在治疗组之间没有显着差异。同样，胰岛自身反应性CD8+ T细胞的频率在治疗组之间没有显著差异。此外，流式细胞术所定义的35个白细胞亚群的频率并未因FMT而发生显著变化( 在线补充图2)．然而，值得注意的是，CD4+ CXCR3+细胞在组间确实有差异(p=0.01, MWU)。基线和12个月之间的变化与我们的主要终点C肽AUC的变化呈负相关(p=0.046, rho=−0.47)( 在线补充图3A-C)．各组CD8+ CXCR3+细胞在基线时存在差异(p=0.0076, MWU)。治疗组间CD8+ CXCR3+细胞的变化也存在差异;然而，这与C肽AUC的变化( 在线补充图3D-F)．

治疗组间小肠菌群的α多样性在基线时无显著差异。在6个月时，自体FMT组和异体FMT组之间存在边缘性显著差异(p=0.054)，同时异体FMT组的多样性显著增加(p=0.009; 图2一个)．当在冗余度分析(rda图)中沿坐标轴绘制时，各组间小肠微生物群组成在基线时不同，并且在治疗组间也发生了变化( 图2 b)．FMT治疗组的分配可通过特定小肠菌群的变化(AUROC 0.89±0.18 (CI))可靠地预测 普氏菌和 链球菌oralis（ 图2 c)．然而，在门、科、属和种水平的变化中，小肠菌群组成没有明显变化( 在线补充图4)．这些物种的相对丰度在自体粪便移植后均有所下降，而同种异体粪便移植后均有所增加( 图2 d-f)．值得注意的是，相对丰富的 普氏菌1组间基线差异(p=0.033)。两组间δ值有显著差异 普氏菌2(p=0.048) 普氏菌1(p = 0.069) 美国oralis．此外，观察到显著的负相关 普氏菌1相对丰度和受刺激C肽AUC (Spearman p=0.015, rho=−0.55，见 图2 g)．值得注意的是，十二指肠基因表达的变化(在0和6个月时测量)并不能可靠地预测治疗组的分配(AUROC为0.61±0.22)。

T1D和健康供体的粪便微生物组成在基线时是不同的，在治疗组之间也有差异( 在线补充图S5A和B)．然而，在基线、6个月或12个月时，FMT治疗组之间以及供者和受者之间的alpha多样性均无显著差异。在门、科、属和种水平上，类群间存在一定的变化( 在线补充图5)．基于0 - 12个月间粪便微生物群分类变化的组分配预测显示AUROC为0.72±0.24。 脱磷孤菌属猪在治疗组中，最具差异性的菌株( 在线补充图6A)．根据代谢途径预测治疗组AUROC较差，为0.68±0.27。两个FMT组之间最具差异的代谢途径是硒-氨基酸生物合成途径( 在线补充图6B)．有趣的是，大量的 d .猪在随访6个月(p=0.024, MWU)和12个月(p=0.023)时，治疗组之间的差异( 图3 a - b)．此外，在 d .猪与空腹C肽变化呈正相关(p=0.009， 图3 c)和血浆1-花生四烯醛- gpc水平(p=0.004， 图3 d，这种代谢物将在下一段讨论)。此外，相对丰度的变化 d .猪两者相对丰度的变化是否呈负相关 普氏菌1（ 图3 e), 普氏菌2 ( 图3 f)．

通过0 - 12个月间空腹血浆代谢物变化可靠地预测治疗组的分配(AUROC 0.79±0.23)。10个最具预测性的代谢物的相对重要性显示在 图3 g．在前三种代谢产物中， 1-myristoyl-2-arachidonoyl-GPC (MA-GPC) (p=0.02, MWU)和 1-arachidonoyl-GPC(A-GPC) (p=0.02) (1) - 1-enyl-palmitoyl−2-linoleoyl-GPE(EPL-GPE)， 12个月时各组间差异( 图3 h-j)．此外，血浆MA-GPC水平的变化与空腹C肽的变化显著相关(p=0.012, MWU， 图3 k)以及FMT组和捐赠者之间的总体血浆代谢物随时间的变化( 图3 l)．

接下来，我们进行了事后分析，以研究基线粪便菌群组成是否预测FMT的临床反应( 图4 a - b)，确实如此(AUROC 0.93±0.14)。在这方面，肠道水平 拟杆菌caccae和 Coprococcus卡图斯最具差异性的微生物( 在线补充图7)，在应答者中，两者在基线时均显著高于无应答者( 图4 c - d)．其他区分肠道细菌菌株， Paraprevotellaspp, Collinsella aerofaciens， 拟杆菌eggerthii和 瘤胃球菌属callidus有反应者和无反应者在基线时也有显著差异( 在线补充图8A-E)．的变化呈显著负相关 c·卡图斯C肽AUC (p=0.053, r=−0.44， 图4 e)．

相比之下，通过粪便微生物群组成的变化(AUROC 0.76±0.23)预测治疗反应的准确性低于基线组成。然而，变化分化反应最好的物种是 ph8拟杆菌，粘胶放线菌，陶氏拟杆菌，唾液链球菌，溴瘤胃球菌和 leptum梭状芽胞杆菌（ 在线补充图9A)，其中 B. bacterium ph8(p=0.015, MWU)和 r . bromii(p=0.013)在应答者中比无应答者少， 唾液链球菌(p=0.045)在应答者中比无应答者多 亚种在基线时有显著差异，且应答者呈下降趋势( 在线补充图9B-I)．

同样，基线粪便微生物代谢途径(AUROC 0.85±0.22)比粪便微生物代谢途径变化(AUROC 0.69±0.27)更准确地预测临床反应。基线丰度最能预测反应的代谢途径包括脂肪酸和-氧化I、丙酮酸发酵到丙酮和可拉酸的生物合成( 在线补充图10)，在基线时应答者显著高于无应答者(p=0.014, p=0.0015和p=0.015, MWU， 图4 f-h)．然而，在应答者与无应答者之间，这些通路没有显著的差异变化。此外，这些通路的基线丰度和这些通路的变化都与主要终点(MMT刺激C肽反应)不相关。

与十二指肠基因表达变化(AUROC 0.73±0.24)相比，基线十二指肠基因表达更准确地预测临床反应(AUROC 0.83±0.21)。基线时，最多的分化基因为CCL22、CLDN12、CCL4、CD86、CCL13、CCL19、CXCL12、CLDN14、CX3CL1和CXCL1 ( 图5一个)，而CCR5及CCL18 ( 图5 b)是差异变化最显著的基因。有应答者和无应答者在基线时这些基因的表达有显著差异:CCL22 (p=0.0039, MWU)、CCL19 (p=0.011)、CXCL12 (p=0.0039)、CXCL1 (p=0.021)和CCR5 (p=0.015) ( 图5 c g)．此外，这些基因的基线值与受刺激C肽AUC的变化有良好的相关性( 图5 h l)．有趣的是，FMT治疗后，所有这些基因都减少了，但只有CCL19的减少(p=0.049)具有统计学意义。最后，紧连接蛋白CLDN12的基因表达在基线无反应组中较高( 在线补充图S11A)，而应答者中CCL4和CD86的基因表达较高( 在线补充图S11B和C)．

研究了FMT显著影响参数之间的相关性。由于在两个治疗组中都发现了应答者，因此相关性首先在我们的合并数据集中进行了探索(n=20) ( 图6)，然后分别在治疗组内( 图6B和C)和FMT的临床应答者( 在线补充图S12)．在已池化数据集中( 图6)，发现了一组相互交织的显著参数，这些参数与葡萄糖调节标志物(即C肽AUC，空腹C肽和A1c; 图6)．一方面，高度相关的血浆代谢物MA-GPC和A-GPC准确预测胰岛素分泌的保存，与胰岛素分泌的保存呈正相关 d .猪，与空腹C肽呈正相关。另一方面， 普氏菌1， 普氏菌2和 美国oralis与葡萄糖调节和代谢产物MC-GPC和A-GPC负相关。此外，剩余的β细胞功能与CCL22活性和CD4+ CXCR3+ T细胞呈负相关，而CD4+ CXCR3+ T细胞又与CCL22活性呈负相关 d .猪．分别分析治疗组，自体组中保存的β细胞功能(高C肽)在基线时的特征为高 c·卡图斯高诱导的可拉酸生物合成，脂肪酸和-氧化途径，高CCL22和CXCL12表达，以及随后的降低 r . bromii，与这两种途径和基线时的CCL22呈负相关( 图6 b)．在同种异体组中，保留的β细胞功能的特点是粪便减少 Roseburia intestinalis和UMP生物合成途径的减少(这恰好与 普氏菌1和 2)和CD86和CCL18表达的降低，在基线时应答者的CD86和CCL18表达均较高，随后下降。CD86和CCL18基因依次与 r . intestinalis，而CCL18与UMP生物合成途径呈正相关( 图6 c)．最后，在临床应答者中，保留的β细胞功能以十二指肠减少为特征 普氏菌1， 普氏菌2,粪便 c·卡图斯代谢产物EPL-GPE，途径脂肪酸和β氧化和CD4+ CXCR3+ T细胞s，而 d .猪增加( 在线补充图S12)．

许多针对T细胞的研究表明，T1D中β细胞功能的延迟丧失。 1 3-5 34 35我们的研究强调，宿主结肠微生态移植后的β细胞保存是T细胞介导的，因为12个月时应答者的CD4+ CXCR3+和CD8+ CXCR3+ T细胞有差异地减少。已知β细胞通过产生与CXCR3结合的配体(即CXCL9、10和11)来吸引自身反应性T细胞。 36-38此外，已知假定的免疫变化不是发生在周围，而是局部发生在胰腺和引流淋巴结、小肠粘膜或肠引流淋巴结。 39事实上，改变生活在小肠粘膜中的调节性T细胞的色调可以预防T1D。 40 41此外，我们发现小肠中CCL22的基线表达是临床反应的一个强有力的预测因子。之前已经发表过，与对照组相比，T1D受试者的小肠CCL22表达更高， 17CCL22之前被认为是T1D的新治疗策略，例如，通过激活和招募调节性T细胞并减少CD8+ T细胞的数量来保护NOD小鼠的自身免疫。 42 43在我们的应答者中，CCL4的表达也更高，而在NOD小鼠中，CCL4通过中和IL-16来保护T1D 44T细胞也需要il -4介导的T1D保护。 45此外，在我们的临床应答者中，CD86的小表达高于无应答者，这是有趣的，因为CD86是T细胞完全激活所必需的，也是Abatacept的一个靶标，它可以延缓T1D受试者β细胞功能的下降。 4 46

与之前的文献一致， 47我们建议 d .猪通过T1D抑制自身免疫 等离子体1-arachidonoyl-GPC从而影响CXCR3+ T细胞。预测模型显示，基线粪便微生物群分类和代谢途径准确预测了12个月时的反应。然而，已鉴定的微生物(例如， b . caccae和 c·卡图斯)与我们的任何相关免疫参数、小肠基因或血浆代谢物无关。这表明，粪便微生物群组成是与反应相关的宿主免疫特征的结果，而不是原因。唯一的例外是 d .猪这是一种硫酸盐还原菌株，以前被证明可以塑造肠道菌群对饮食的个体反应。 48它的有益作用可能是由其产生的硫化氢介导的，硫化氢是一种被发现具有神经刺激作用的分子 49影响调节性T细胞和免疫稳态。 50此外，我们发现 d .猪作为FMT处理组分配的突出粪便微生物预测因子。有趣的是，这种小肠细菌菌株也与FMT上刺激的C肽反应的变化有益相关，其丰度在自体组和整体应答者中增加。有趣的是, d .猪与血浆1-花生四烯醛- gpc水平呈正相关( 图3我)，它是我们的主要代谢物之一，也与改善C肽的产生有关。此外, d .猪这种代谢物与CD4+ CXCR3+和CD8+ CXCR3+ T细胞呈负相关，这与之前关于小鼠T1D的报道一致。 51总之, d .猪可能是抑制自身免疫的一个强有力的候选者，通过产生a - gpc来抑制这些细胞，例如通过免疫细胞的突出树突摄取到肠腔中。 52有趣的是, d .猪最近从人类肠道中培养出来，能够在人类T1D中测试这种细菌菌株。 53在治疗组之间，十二指肠中其他最好区分的细菌种类是两种未命名的 普氏菌spp和S。 oralis．在这方面，粪便 8但不是十二指肠 普氏菌此前曾与T1D联系在一起。我们对多组学分析的探索性整合随后表明这些 普氏菌spp和 美国oralis与我们的关键有益代谢产物MA-GPC呈负相关，这是一种甘油磷脂。在这方面，其他磷脂先前与新发病T1D的β细胞功能有关。 26 b . stercoris正相关 d .猪A-GPC和负相关 美国oralis和CCL22，但与C肽无正相关。有趣的是, b . stercoris最近发现znt8活性CD8+ T细胞可以交叉识别。 19最后，在 r . bromii(自体FMT组)和 r . intestinalis(异基因FMT组)与C肽的变化呈负相关，尽管这两种菌株通常被认为是有益微生物，在富含纤维的饮食中茁壮成长，产生SCFAs并促进肠道完整性。

首先，该探索性随机对照试验在达到计算样本量之前停止入组。该研究样本量有限，且未针对A1c等次要临床终点进行研究。然而，这为更大规模的研究来证实我们的发现铺平了道路。虽然目前尚不清楚新发T1D患者FMT治疗疗效的基线肠道菌群组成的驱动因素，但我们推测临床缓解水平可能是由FMT中的肠道微生物菌株组成(与供体来源无关)以及自身免疫张力等宿主因素共同驱动的。添加标准饮食干预是否能与与宿主免疫更匹配的FMT供体协同工作，以优化临床代谢和免疫反应，尚需进一步研究。其次，我们试图通过在基线和6个月后(即在积极FMT干预期间)进行十二指肠粘膜活检来接近干预的局部效果。然而，大多数相关的免疫效应预计发生在胰腺和胰腺淋巴结，这是无法在活体T1D患者中取样的隔室。第三，我们最早的生物样本是在第一次FMT后2个月采集的。因此，可能发生得更快但已经减弱的变化可能已经被忽略了。第四，我们的人群只包括发病较慢的成年受试者，这可能与发病较早的青少年T1D在免疫上不同。 54尽管我们还在等待一项针对成年T1D患者的大型RCT试点试验的确认，但我们的研究也支持在年轻T1D患者中应用FMT的试验。第五，尽管胰岛素抵抗在T1D中起着一定的作用，但我们在本研究中没有对其进行量化。正如之前的研究表明，胰岛素敏感性可以同时提高 23日24和减少 25通过供体FMT。尽管在β细胞衰竭和绝对胰岛素缺乏的状态下不太可能，但可以想象，FMT增加了胰岛素敏感性，从而抵消了C肽释放的增加，并模糊了可观察到的益处。最后，在未来的研究中，我们应该纳入一个真正的安慰剂对照组(例如，灌洗和十二指肠管放置而不使用FMT)，以比较自体FMT输注与新发T1D β细胞功能下降的“自然”过程。