这项前瞻性研究涉及与实验室确认15 COVID-19住院患者SARS-CoV-2感染( 表1)。SARS-CoV-2感染证实了两个连续的rt - pcr测试针对不同地区RdRp基因由当地医院和公共卫生实验室服务(中国香港)。所有患者COVID-19获准进入威尔士亲王医院或美国基督教医院,香港,2020年2月5日至2020年3月17日。他们跟着,直到出院或直到2020年4月4日。所有病人提供知情同意参加本研究,同意发表的研究结果。数据包括人口统计学、流行病学、临床和实验室研究结果从电子医疗记录中提取在香港医院管理局临床管理系统。收集患者的粪便样本COVID-19连续放电。

病毒核酸提取从粪便样本,使用豆类MiniBEST病毒RNA / DNA提取工具包(豆类、日本)制造商的指示。然后提取总RNA病毒核酸提纯了清洁和集中器包(美国加州Zymo研究)获得病毒RNA。质量控制程序通过量子位2.0后,琼脂糖凝胶电泳和安捷伦2100测试,合格的RNA是受到图书馆准备使用KAPA RNA HyperPrep工具包(美国Illumina公司)。图书馆准备然后测序Illumina公司NextSeq 550平台(150 bp成对结束)。

原始序列读取被过滤,使用Trimmomatic quality-trimmed V.0.36 14如下:1)减少劣质基地(质量分数< 20);2)删除读取短于50个基点;3)追踪和切断测序适配器。污染人类读取过滤使用Kneaddata V.0.5.1(参考数据库:GRChg38)默认参数。

共有1666个完整基因组从SAS-CoV-2基因组库下载在国家生物技术信息中心2020年4月20日。清理粪便病毒宏基因组读取查询对定制SARS-CoV-2参考基因组BBMap V.38.81。 15映射读取手动检查,尤其是那些映射到3 ' SARS-CoV-2基因组,读了多聚腺苷酸被丢弃。

3 '末端SARS-CoV-2基因组基因区域被定义为从000年25核苷酸基础通过SARS-CoV-2基因组的完整的结束(~ 29 9000核苷酸基础),而其余基因组区域(0-25 000核苷酸基础)被认为是5 ' SARS-CoV-2基因组。测序覆盖的数量被定义为猎枪读取映射到给定的基因组区域(每100个核苷酸SARS-CoV-2基因组的基础)。测序密度定义为在给定的基因组测序网站的频率区域SARS-CoV-2基因组(宏基因组的数量每500核苷酸SARS-CoV-2基地)。

约0.1克粪便样本与1毫升ddH水洗₂O和颗粒状的离心13 000×g 1分钟。粪便DNA随后从颗粒中提取使用麦克斯韦RSC PureFood转基因和认证工具包(Promega,麦迪逊,威斯康辛州,美国)制造商的指示。短暂,粪便颗粒添加1毫升cetyltrimethylammonium溴铵(CTAB)缓冲区和涡30年代,然后加热5分钟的示例在95°C。之后,样本用珠子彻底涡在最大速度为15分钟。然后40µL蛋白酶K和20µL核糖核酸酶添加到样本和混合是在70°C的环境中为10分钟。当时上层清液通过离心法在000×13 g 5分钟和添加了麦克斯韦RSC机进行DNA提取。提取DNA受到DNA库建设,通过流程最终修复完成,添加一个尾巴,净化和PCR扩增,使用Flex Nextera DNA库准备工具包(Illumina公司)。库随后被测序在我们内部音序器Illumina公司NextSeq 550 (150 bp paired-end)在微生物群研究中心,香港中文大学。人类阅读的比例在粪便metagenome生成从调整读取到参考基因组(人类释放32,GRCh38。p13,从Gencode)领结下载2。 16

原始序列读取被过滤,使用Trimmomatic quality-trimmed V.0.36 14如下:(1)减少低质量的基础(质量分数< 20);(2)删除读取短于50个基点;3)删除测序适配器。使用Kneaddata污染人类读取过滤(参考数据库:GRCh38.p13)使用默认参数。分类分析粪便细菌社区进行使用MetaPhlAn2 (2.9 V)通过映射读取clade-specific标记。 17功能分析粪便细菌使用HUMAnN2.0社区进行。 18鉴别细菌物种之间粪便SARS-CoV-2高传染性和粪便low-to-none SARS-CoV-2传染性被确定在所有时间点凳子LefSE对应各自COVID-19患者。只有物种线性判别分析(LDA)效果> 2和错误发现率(罗斯福)—p值< 0.05绘制。高SARS-CoV-2传染性被定义为高3 '和5 '结束在粪便病毒RNA metagenome SARS-CoV-2基因组的报道。Low-to-none SARS-CoV-2传染性被定义为类似3’,5’端覆盖或没有覆盖在粪便病毒RNA metagenome SARS-CoV-2基因组。

与实验室确认15住院患者COVID-19 SARS-CoV-2感染是招募和跟踪( 图1, 表1)。15例,7是男性。COVID-19住院患者的中位年龄是55岁(IQR: 44 - 67)。十一已经严重COVID-19和两个重要疾病的患者进入重症监护室。所有患者出现呼吸道症状,但只有一个并发胃肠道症状腹泻的表现(病人5)。没有一个发达胃肠道症状的患者在住院期间。连续收集粪便样本从每个病人到鼻咽或咽喉拭子测试呈阴性病人出院的连续两个样品。平均住院时间是21±2.4天(平均±SE)。

SARS-CoV-2基因组的大小~ 29.9 kb核苷酸( 图2一个)。 19日20进入宿主细胞后,完整的基因组RNA也作为信使RNA,翻译ORF1a和ORF1b(5 '末端SARS-CoV-2基因组)。除了完整的基因组RNA, 9个主要subgenomic RNA (sgRNAs),编码结构蛋白,年代,E, M和N,生产(3 '末端SARS-CoV-2基因组)。 20.最近的一项研究表明,积极的病毒复制和转录的SARS-CoV-2导致更高的测序的报道3 '末端和5 '末端SARS-CoV-2基因组的感染细胞模型通过高通量转录组测序(维洛细胞)。 20.如此高的转录表达3 '端sgRNAs签名SARS-CoV-2活跃复制和感染的宿主细胞。

基于这些转录组复制SARS-CoV-2模式,我们提出三个潜在存在的场景SARS-CoV-2病毒在人类肠道和粪便病毒RNA的检测宏基因组(转录组):(i)场景1:如果SARS-CoV-2并不存在于肠道,其RNA基因组不能通过宏基因组测序发现;(2)场景2:如果自由SARS-CoV-2病毒粒子穿过肠道没有感染宿主细胞,全身病毒RNA基因组应该同样由宏基因组读取;(3)场景3:如果SARS-CoV-2病毒存在于肠道感染宿主细胞,3 '末端的病毒RNA基因组区域应该高度覆盖超过5 '端基因组区域通过宏基因组读取( 图2 b)。

描述的病毒转录活动SARS-CoV-2 COVID-19患者肠道,我们进行粪便病毒RNA猎枪宏基因组测序时间系列的粪便样本。因此,我们得到了18 773 883±420 617(平均±SE)从串口读取平均粪便病毒RNA准备15 COVID-19患者。7例检测到阳性SARS-CoV-2粪便在基线(抽样日期后的第一个凳子住院),通过宏基因组测序( 图3),表明存在肠道SARS-CoV-2 COVID-19患者的一个子集。这些受试者胃肠道症状。宏基因组测序并没有其他检测粪便中SARS-CoV-2 8例( 在线补充图1)。虽然我们序列深度不允许我们识别SARS-CoV-2全长基因组的粪便样本,有趣的是我们发现所有七个病人(SARS-CoV-2 metagenome积极)显示更高的覆盖率和密度的3 '末端区域比5 '末端区域SARS-CoV-2基因组,在基线(分别p = 0.0261和0.0094, 图3 d)。病人12温和COVID-19和病人15轻度COVID-19(正常胸部发现)没有显示胃肠道症状,然而均显示一致的3 '末端覆盖粪便SARS-CoV-2基因组的病毒metagenome在所有时间点在疾病过程中( 图3 a和C)。这些发现表明持续存在SARS-CoV-2病人的肠道。鉴于高3 '端和5 '端覆盖SARS-CoV-2基因是一个活跃的病毒复制和转录的签名(感染)在宿主细胞, 20.数据凸显持续活跃SARS-CoV-2感染患者的肠道内COVID-19尽管没有胃肠道症状和轻微COVID-19。相比之下,患者3和7失去了这个签名的活跃的病毒感染,1天之后和鼻咽SARS-CoV-2结关前10天,分别是( 图3 b),建议的时间表冲突消除肠道和呼吸道感染SARS-CoV-2 COVID-19患者在疾病过程。

令人惊讶的是,病人的粪便病毒RNA metagenome 4、11和15继续显示活跃的病毒感染签名(高3”vs 5 '端SARS-CoV-2基因组覆盖率和密度)( 图3 c在时间点),从1到6天后从咽喉拭子SARS-CoV-2结关。11日和15日,患者的覆盖率和密度5 '末端类似的3 '粪便中的病毒metagenome结束,后咽喉拭子变成负数(例证在患者11天1和6,第二天病人15, 图3 c)。这些观察结果表明逐渐失去活性病毒感染(从场景3转向场景2)后患者的内脏间隙的SARS-CoV-2气道。我们的数据表明,SARS-CoV-2病毒传染性的持续检测和继续显示特征的人类肠道尽管间隙SARS-CoV-2气道但其转录活性和传染性可能逐步下降。这样长期存在活跃的SARS-CoV-2粪便的病人没有肠参与潜力以及恢复患者突出粪口传播。

然后我们研究肠道微生物组粪便样本之间的差异与高SARS-CoV-2传染性的签名和签名的low-to-none SARS-CoV-2传染性,获得洞察SARS-CoV-2之间的相互作用,微生物和宿主。我们进行粪便微生物宏基因组测序和比较之间的细菌微生物组成粪便SARS-CoV-2高传染性和low-to-none SARS-CoV-2传染性,在所有时间点15 COVID-19患者。我们发现粪便样本SARS-CoV-2高传染性细菌物种丰度较高 Collinsella aerofaciens, Collinsella tanakaei, 链球菌对象, 摩根氏菌属morganii与样品相比,low-to-none SARS-CoV-2传染性(LefSE分析,LDA效果> 2,罗斯福p值< 0.05, 图4一)。在这些物种中, c . aerofaciens和 m . morganii已经与机会主义的人类感染有关。 21日22 美国的对象是一个丰富的殖民者在上呼吸道和口腔。 23主机(人类)在粪便DNA比metagenome粪便没有差异SARS-CoV-2高传染性和low-to-none SARS-CoV-2传染性( 在线辅助图2)。这些一起tdata表明SARS-CoV-2积极感染肠道和主机可能带来额外的威胁。

相比之下,粪便样本与low-to-none SARS-CoV-2传染性的丰度更高 Parabacteroides merdae, 拟杆菌stercoris, Alistipes onderdonkii和 Lachnspiraceae细菌1 _1_57faa,相比之下,那些高SARS-CoV-2传染性(LefSE分析,LDA效果> 2,罗斯福p值< 0.05, 图4一)。细菌成员 Parabacteroides, 拟杆菌和 Lachnospiraceae已知的短链脂肪酸(特别是丁酸),在促进宿主免疫起着至关重要的作用。 24 - 27日 Alistipes物种是吲哚阳性,参与5 -羟色胺的前体色氨酸代谢和维持肠道免疫内稳态。 28 29此外,大量的高 b . stercoris也略微相关SARS-CoV-2粪便量较低的病毒(斯皮尔曼相关系数ρ=−0.26,p = 0.06)。我们的数据突出显示一个潜在的有益作用的这些intestine-resident有益的细菌在打击SARS-CoV-2肠道感染。

我们进一步探讨粪便微生物功能的差异之间的粪便SARS-CoV-2高传染性的签名和签名的low-to-none SARS-CoV-2传染性。我们发现粪便样本SARS-CoV-2传染性有较高丰度高的功能通路参与核苷酸代谢(superpathway腺苷的核苷酸从头合成,嘌呤核糖核苷降解,superpathway腺苷二核苷酸从头合成,superpathway鸟嘌呤核苷的核苷酸从头合成二世,腺苷脱氧核苷酸从头合成二世和鸟苷脱氧核苷酸从头合成II),碳水化合物代谢(糖酵解II fructose-6-phosphate)和氨基酸生物合成(赖氨酸生物合成二世和superpathway L-serine和甘氨酸生物起源),与样品相比low-to-none SARS-CoV-2传染性(LefSE分析,LDA效果> 2,罗斯福p值< 0.05, 图4 b)。核苷酸和氨基酸生物合成的增加肠道微生物功能显示潜在的增强细菌细胞大分子的构建块的生产,而乙醇活动增加表明增强能源提取细菌,肠道细菌免疫病理条件下的所有重要的生命活动。这种改变微生物的功能与SARS-CoV-2传染性可能COVID-19发病和疾病过程的基础,虽然原因与结果的关系值得进一步调查。

然后我们研究纵向粪便微生物的变化与间隙的活跃复制SARS-CoV-2病毒的粪便。我们跟着病人3和7,串行凳子显示正到负粪便SARS-CoV-2传染性,和病人11日曾连续12和15日大便经常显示一个签名的高传染性病毒。总的来说,所有的病人显示大量粪便微生物组成的变化无论粪便的病毒性传染性( 图5),表明一个不稳定的肠道微生物组COVID-19疾病过程中。SARS-CoV-2传染性签名后的粪便变成负数,病人3有一个扩张的有益的细菌, Parabacteroides distasonis和 拟杆菌均匀化细菌和炎症反应的收缩, 瘤胃球菌属gnavus粪便微生物。然而,病人7增加了瞬态 p . distasonis伴随着大量扩张的细菌病原体, 肺炎克雷伯菌, 枸橼酸杆菌属koseri和 双歧杆菌dentium感染性SARS-CoV-2结关后,病毒的粪便。肠道炎症和院内infection-associated细菌, r . gnavus, hathewayi梭状芽胞杆菌和 肠球菌鸟结核,在病人的粪便是普遍居高不下SARS-CoV-2传染性( 图5)。我们的数据表明,尽管COVID-19可能改善患者肠道微生物生态失调SARS-CoV-2传染性粪便间隙后,二次入侵的细菌病原体可能成为疾病过程和临床监测期间最重要的可能是必要的。