这项研究是进行符合赫尔辛基宣言。所有的病人提供书面知情同意。在我们之前的研究中,所述 10COVID-19患者招募的威尔士亲王在香港和美国基督教医院2020年2月到5月之间。这些病人被定量逆转录PCR实验室确诊SARS-CoV-2积极(RT-qPCR)鼻咽拭子进行收集的医院工作人员。 13Non-COVID-19受试者招募前COVID-19作为香港人口的一部分,肠道微生物调查被广告 14从结肠镜检查或十几控制试验, 15即受试者正常结肠镜检查(前几天收集的粪便肠准备)。COVID-19被分为四个严重性组患者根据症状的报道 等。 16简单地说,患者分为轻度如果没有射线肺炎的迹象,温和如果发烧肺炎和呼吸道症状被发现,严重如果呼吸速率≥30每分钟呼吸,氧饱和度≤93%时呼吸空气或PaO2 /供给≤300毫米汞柱,关键如果呼吸衰竭需要机械通气或器官衰竭需要重症监护。收集的血液和粪便从住院病人医院工作人员而出院患者提供凳子天随访或self-sampled在家。大便在收集管收集含防腐剂媒体(猫。63700年,一起Biotek集团、加拿大安大略省)和存储在−80°C到处理。之前我们已经表明,肠道微生物群组成来自粪便收集在这个防腐剂中相当的结果立即冻结在−80°C。 17

左中描述的详细方法 等。 10短暂、DNA提取0.1 g的单一化粪便样本使用麦克斯韦RSC PureFood转基因和身份验证工具和麦克斯韦RSC仪器核酸提取平台(美国威斯康辛州Promega)根据制造商的指示。DNA测序图书馆准备从提取使用Flex Nextera DNA库准备工具包(美国加州Illumina公司)和测序的Illumina公司NovaSeq 6000系统(2×150个基点)肠道微生物群的研究中心,香港中文大学。原始序列数据生成的这项研究在加入BioProject PRJNA650244下的序列读取存档。

原始序列数据质量筛选使用Trimmomatic V.39移除适配器和劣质序列。这后,微生物群组成资料推断从过滤站使用MetaPhlAn2向前读 18V.2.7.7 V.20数据库。网站的物种数量和相对丰度表输入R 19V.3.5.1进行统计分析。主成分分析(PCA)的主教任命被用来想象集群基于成分的物种水平的样本资料。肠道社区之间的联系组成和病人的参数评估使用置换多元方差分析普罗克汝斯忒斯(PERMANOVA)和分析。关联的特定微生物物种和病人参数被确定使用线性判别分析效应大小(LEfSe)和多元线性模型的分析(MaAsLin)统计框架中实现Huttenhower实验室星系实例( http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)。PCA PERMANOVA普罗克汝斯忒斯和分析素食R包中实现 20.V.2.4-6。

通过RT-qPCR SARS-CoV-2病毒负荷测量如左所示 等。 10RNA提取从0.1 g单一化凳子使用QIAamp病毒RNA迷你包(试剂盒,希尔登德国)制造商的指示。SARS-CoV-2引物和探针序列是由美国疾病控制和预防中心(2019 - ncov_n1 f: 5“-GACCCCAAAATCAGC GAAAT-3’, 2019 - ncov_n1 r: 5“-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3”和2019 - ncov_n1 p: 5“-FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1-3”)。每一步RT-qPCR反应包含10µL提取RNA, 4µL TaqMan快速病毒互译大师混合(美国马萨诸塞州热费希尔科学)在最后20µL反应体积。引物和探针浓度µMµM 0.5和0.125,分别。循环条件25°C 2分钟,15分钟50°C, 95°C 2分钟,其次是45 95°C的周期为15和55°C 30年代。热循环是StepOnePlus实时PCR系统上执行(热费希尔科学)。循环阈值(Ct)值是根据标准曲线转化为病毒RNA复制准备从串行稀释10倍已知的含有全N基因质粒的副本(2019 - ncov_n_positive控制,集成DNA技术,美国)。样品被认为是消极如果Ct值超过39.9周期。检出限是347拷贝/毫升。

全血样品收集在anticoagulant-treated管离心机在2000 g×10分钟,上层的收集。细胞因子和趋化因子的浓度测量使用MILLIPLEX映射人类细胞因子/趋化因子磁珠Panel-Immunology多元分析(美国马萨诸塞州默克密理博)Bio-Plex 200系统(美国加州Bio-Rad实验室)。N-terminal-pro-brain利钠肽的浓度(中位数水平以上病人)是人类中位数水平以上病人用ELISA试剂盒(Abcam,剑桥,英国)。

患者或公众没有参与设计、实施、报告或传播本研究计划。

2020年2月到5月之间,我们收集了100例患者的血液和粪便样本与COVID-19证实了积极SARS-CoV-2 RT-qPCR。这些患者的人口统计学和临床特点和non-COVID-19控制招募了78名成年人COVID-19报道在之前在香港 表1。有47个女,53岁男性患者COVID-19与平均数±标准差为36.4±18.7岁。关键,严重,中度和轻度疾病 16在3.0%,5.0%,分别为45.0%和47.0%的患者。相比之下,non-COVID-19队列由45岁女性,33岁男性平均±标准差45.5±13.3年。COVID-19队列的并发症包括高血压,hyperlipidaemia,糖尿病和心脏病,虽然有少于五个病人每个除了高血压有11个。non-COVID-19队列,高血压是唯一主要并发症11个人。的100患者COVID-19, 41提供多个粪便样本在他们住院的时间和/或出院后随访;分别为34岁和46名患者接受抗生素和抗病毒药物,凳子前集合。

总共274份粪便样本测序产生平均6.8英镑每样例(47 386 950读)。首先,我们比较肠道微生物群组成的第一个粪便样本的每个病人COVID-19住院期间收集的(n = 87;13的100患者COVID-19只提供凳子后恢复)(40女性47人,35.6±18.8岁(平均±SD))与non-COVID-19科目(45岁妇女33人,45.5±17.4岁(平均±SD))来评估肠道微生物群组成是否改变COVID-19队列。门级别的成员 拟杆菌门更有相对丰富的患者相比non-COVID-19 COVID-19个人(23.9%比12.8%,p < 0.001, Mann-Whitney测试),而 放线菌更有相对丰富的non-COVID-19个人(26.1%比19.0%,p < 0.05, Mann-Whitney测试)( 图1一个)。在物种水平,我们确定重大关联与疾病(COVID-19 vs non-COVID-19)和抗生素( 图1 bPERMANOVA) (p < 0.05),但不是凳子SARS-CoV-2负载、抗病毒(lopinavir /例如利巴韦林或奥司他韦的39 87名患者),皮质类固醇和质子泵抑制剂使用( 在线补充表S1)。没有使用抗生素的控制,组成物质的不同的肠道微生物群COVID-19主要是由浓缩的物种,包括 瘤胃球菌属gnavus, 瘤胃球菌属扭矩和 拟杆菌dorei和损耗 双歧杆菌adolescentis, Faecalibacterium prausnitzii和 真细菌rectale(p < 0.05, LEfSe) ( 表2, 在线补充表S2)。抗生素效果检查时,群体之间的差异主要是与浓缩等类群 Parabacteroides, Sutterella wadsworthensis和 拟杆菌caccae和损耗 Adlercreutzia equolifaciens, Dorea formicigenerans和 leptum梭状芽胞杆菌COVID-19相对于non-COVID-19 (p < 0.05, MaAsLin) ( 在线补充表S3),尽管大多数涉及类群组成这些样本的平均相对丰度不到0.1%。在整个肠道微生物群组成87 COVID-19和78 non-COVID-19之间不同的主题,没有明显差异的物种丰富度和香农多样性(p > 0.05,曼惠特尼测试)( 在线补充图S1)。COVID-19队列中,肠道微生物群组成采样期间住院(n = 87)是最重要的与疾病严重程度(轻度、中度、重度,关键)其次是抗生素与下行的规模效应(p < 0.05, PERMANOVA) ( 在线补充表S1)。识别微生物物种与疾病严重程度有关,我们发现 f . prausnitzii和 双歧杆菌bifidum与严重程度负相关调整后抗生素使用和患者的年龄(p < 0.05,序数回归)。其他微生物物种的相对含量,通常在人类肠道包括丰富 b . adolescentis和 大肠rectale还显示减少与增加疾病严重程度虽然这些没有统计学意义( 在线补充表S4)。

COVID-19感染,免疫系统产生炎性细胞因子在应对病毒感染。在某些情况下,炎症反应可能是过于放肆的(即“细胞因子风暴”),导致广泛的组织损伤,感染性休克和多器官功能衰竭。 1基于这样的观察:COVID-19患者改变肠道微生物群 图1)和关联的几个物种与疾病严重程度( 在线补充表S4),我们假设,这些成分的变化中发挥作用加剧导致失调疾病的免疫反应。PCA可视化的肠道微生物群组成的87例住院期间COVID-19显示连续沿温和,温和,严重和重要疾病严重程度组( 图2),表明分层的肠道微生物群组成与疾病严重程度有关。然后安装等离子体浓度的细胞因子(入学;粪便样本中位数2天前)和炎症标记到PCA和观察到C-X-C图案配体10 (CXCL10), il - 10,肿瘤坏死factor-α(TNF-α)、天冬氨酸转氨酶(AST)、gamma-glutamyl转移酶(GGT)、c反应蛋白、LDH、中位数水平以上病人和红细胞沉降率显著相关的微生物群组成( 图2普罗克汝斯忒斯)(p < 0.05,分析)。值得注意的是,这些测量增加伴随微生物群组成代表了更严重的疾病。CXCL10以来,il - 10、TNF-αAST、GGT、CRP、LDH和中位数水平以上病人通常在更严重的COVID-19升高, 2研讨会这些结果表明,肠道微生物群组成与免疫反应的大小COVID-19和随后的组织损伤,从而可能发挥作用在调节疾病严重程度。然后我们评估哪些特定物种富集或贫化COVID-19与患者细胞因子浓度。从列表中大部分相对丰富的物种 表2,六个物种枯竭COVID-19队列CXCL10呈负相关,与TNF-α五与il - 10和两个碳碳图案配体2 (CCL2) ( 图3模拟)(p < 0.05,斯皮尔曼相关)。这些措施包括 b . adolescentis, 大肠rectale和 f . prausnitzii发挥免疫调节作用在人体胃肠道系统。 24 - 26日相反,两个物种丰富COVID-19队列 b . dorei和 Akkermansia muciniphila与IL-1β呈正相关,il - 6和C-X-C图案配体8 (CXCL8) ( 图3比)。相关性与其他相对较少的丰富的肠道细菌所示 在线补充表S5)。

一些患者COVID-19报告持续复苏后症状和/或随后开发多系统炎症, 27我们提出dysbiotic肠道微生物群中看到COVID-19持续复苏后患者,可能导致这些条件。评估从COVID-19复苏后肠道微生物群组成,42收集粪便样本来自27个病人(13女性14人,45.6±17.6岁(平均±SD)) 30天(平均6天,差14天)后鼻咽吸入或通过RT-qPCR棉签SARS-CoV-2检测呈阴性。与non-COVID-19受试者相比,肠道微生物群组成的27恢复患者仍显著不同的不管他们是否收到了抗生素(p < 0.05, PERMANOVA)(14收到抗生素,13没有),虽然在病人接受抗生素成分比病人更不同的相对于non-COVID-19科目没有( 图4)。恢复患者的肠道微生物群的丰富物种包括 双歧杆菌dentium和 乳酸菌ruminis不管他们是否收到了抗生素和枯竭 大肠rectale, r . bromii, f . prausnitzii和 双歧杆菌longum(p < 0.05, LEfSe) ( 表3; 在线补充表S6)。确定抗生素与改善COVID-19患者疾病预后有关,我们对其使用的温和的疾病群患者的数量/没有收到抗生素相当(21 45温和的疾病患者接受抗生素)。表示在其他疾病不平衡( 表1)。我们没有发现不同的天数从COVID-19发作症状直到出院有或没有抗生素(p > 0.05, Mann-Whitney测试)。此外,菌血症或没有记录以来的45例血培养,除了人原降钙素< 0.2 ng / mL入学期间,这些发现表明,抗生素不太可能与改善病人状况假设没有细菌合并感染,但相比之下可能会加剧和延长人类肠道微生物群失调患者COVID-19。