条文本

原始研究
丙型肝炎病毒参考强调有效的抗体反应和多样化的病毒中和抗体的功能交互
  1. 多萝西娅Bankwitz1,
  2. 阿卡什巴哈教徒2,
  3. 莫里斯Labuhn1,
  4. 曼迪Doepke1,
  5. 科琳Ginkel1,
  6. Tanvi Khera1,
  7. 丹尼尔·托德1,3,
  8. 路易莎J Stroh4,
  9. 利昂娜Dold5,
  10. Florian克莱因5,6,
  11. 弗兰克Klawonn7,8,
  12. 托马斯·克雷4,9,10,11,12,
  13. 帕特里克·贝伦特1,13,
  14. 马库斯Cornberg13,14,
  15. 爱丽丝C McHardy2,13,
  16. 托马斯Pietschmann1,13
  1. 1实验病毒学,TWINCORE感染实验和临床研究的中心,汉诺威、德国
  2. 2计算生物学的感染的研究,亥姆霍兹感染研究中心,布伦瑞克、德国
  3. 3分子和医学病毒学,Ruhr-Universitat波鸿,波鸿、德国
  4. 4病毒学研究所汉诺威医学院,汉诺威、德国
  5. 5实验室实验免疫学、病毒学研究所,科隆大学医院,科隆、德国
  6. 6合作伙伴网站科隆-波恩,德国感染研究中心,布伦瑞克、德国
  7. 7生物统计学,亥姆霍兹感染研究中心,布伦瑞克、德国
  8. 8信息工程研究所,Ostfalia应用科学大学,沃芬比特、德国
  9. 9中心的结构和细胞生物学在医学、生物化学研究所Luebeck大学,Luebeck、德国
  10. 10德国感染研究中心(DZIF),合作伙伴网站Hamburg-Lubeck-Borstel-Riems、德国
  11. 11结构系统生物学中心(CSSB),汉堡、德国
  12. 12集群卓越的抵抗(EXC 2155),汉诺威医学院,汉诺威、德国
  13. 13合作伙伴网站Hannover-Braunschweig,德国感染研究中心,布伦瑞克、德国
  14. 14美国胃肠病学、肝病和内分泌学,汉诺威医学院,汉诺威、德国
  1. 对应到爱丽丝教授C McHardy;Alice.McHardy在{}helmholtz-hzi.de;教授托马斯•Pietschmann实验病毒学,TWINCORE感染实验和临床研究中心,30625年汉诺威,德国;thomas.pietschmann在{}twincore.de

文摘

客观的中和抗体是关键的侵染诱导和诱发的免疫效应器。量化抗体的广度和强度对理解至关重要的保护机制和优先级的疫苗。在这里,我们使用一个独特的人类标本收集开发丙肝病毒和丙肝病毒株的量化参考病毒中和抗体,并调查病毒功能的多样性。

设计我们异形中和效力多克隆免疫球蛋白的104名患者感染丙肝病毒基因型(GT) 1 - 6在13代表五个病毒GTs丙肝病毒株。使用公制多维标度,我们绘制丙肝病毒中和中和地图上。我们使用k - means聚类指导病毒集群和选择具有代表性的菌株。

结果病毒中和灵敏度有很大程度的不同,与卫星(GT2a)最耐药和SA13 (GT5a)是最敏感的。他们映射到六个不同的中和集群,从不同的GTs在病毒的组成部分。没有病毒中和之间的相关性和遗传距离,指示功能中和集群不同于基于集群。校准参考病毒代表这些集群对纯化抗体从496例感染GT1位于病毒容易识别个体的强大和广泛中和抗体。它显示类似的抗体cross-neutralisation标本来自不同病毒GTs之间和多样性,证实平衡报告的丙肝病毒cross-neutralisation高度多样化的人类样本。

结论代表隔离从六个中和集群广泛的重建功能丙肝病毒中和空间。他们使高分辨率分析丙肝病毒中和可能反映了病毒功能和抗原性质丙肝病毒疫苗设计的重要考虑。

  • 丙型肝炎
  • 丙肝病毒
  • 基因型
  • 免疫学在肝脏病学

数据可用性声明

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来自Altmetric.com的统计

本研究的意义

已经知道这个问题是什么?

  • 体液和细胞反应是防止慢性丙肝病毒感染的关键。

  • 丙肝病毒是高度的遗传多样性。

  • 用来测量不同的化验病毒体外中和。

有什么新发现吗?

  • 六个参考病毒代表六个功能不同的病毒中和集群重建功能性丙肝病毒中和空间。

  • 病毒序列不预测这些功能映射到集群。

  • 功能多样性与遗传多样性。

它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

  • 这些引用病毒促进抗体的作用的描述在丙肝病毒候选疫苗的保护和优先级。

  • 候选疫苗解决病毒功能的多样性,而不是遗传多样性可能诱发保护性免疫。

视频摘要

介绍

丙肝病毒慢性感染了全世界估计有7100万人,因此一个全球卫生问题。1那些感染了艾滋病,50% - -80%发展为慢性,风险发展肝硬化和肝细胞癌。

高效的出现直接的抗病毒药物(DAAs)病人护理有了翻天覆地的变化。2然而,所有的病人提供DAAs全球仍然是一项重大的公共卫生挑战。此外,在极少数情况下,治疗失败由于resistance-associated变体3和丙肝病毒再感染treatment-induced治愈后是可能的。4个5因此,预防性疫苗对丙肝病毒疾病负担的控制很重要。疫苗开发利用的一种方法诱导广泛中和抗体(bnab)针对信封E1和E2糖蛋白。多项研究自发性丙肝病毒的中和抗体支持一个重要的角色。6 - 9此外,被动immune-prophylaxis动物研究证实感染丙型肝炎病毒抗体的保护的重要性。10 - 12

丙肝病毒是非常变量和病毒分离株分为八个基因型(GTs)和多个亚型。13信封中和抗体的蛋白质是目标,代表了大多数变量病毒的蛋白质。对成功的疫苗设计来说,这是至关重要的引起cross-protective抗体多样的丙肝病毒变异,和最近的疫苗接种方法考虑这个要求。然而,使用不同的实验系统量化的抗体反应比较复杂的疫苗功效。通常,要么基于逆转录病毒感染检测丙肝病毒pseudoparticles (HCVpp)或细胞而丙肝病毒抗体(HCVcc)粒子是用来量化效果。近年来,几个面板HCVpp或HCVcc发达。14在某种程度上,这些电池板包括大量不同E1-E2蛋白质。15然而,在某些情况下,这些电池板只包含GT1-derived糖蛋白。16日17目前还不清楚如果这些GT-selective板充分报告整个全球的功能多样性采样丙肝病毒,包括GT 1到7株。在其他情况下,病毒与E1-E2基因携带细胞culture-adaptive变化,这可能会影响病毒抗体中和,是包括在内。18此外,细胞功能之间的差异也是显而易见的条目HCVpp HCVcc,包括对输入因素的依赖19并对膜融合抑制剂的敏感性。20 21虽然有研究证明一个好HCVpp之间的一致性和HCVcc中和,14HCVpp往往比HCVcc中和敏感,17日22和上述的差异可以使评估的重要的决定因素和病毒抗体相互作用的特点。因此,我们旨在建立一个严格的和平衡的量化参考面板的病毒的广度和效力的丙肝病毒抗体的多样性在全球范围内抽样丙肝病毒菌株。

材料和方法

人类的样本

我们获得病人血清丙肝病毒研究英国生物库和波恩大学诊所接受治疗的患者,科隆和汉诺威医学院。

患者或公众没有参与设计,或行为,或报告或传播我们的研究计划。

Cross-neutralisation指数

广度和中和抗体的能力是重要的特征。因此,我们引入了一个新颖的得分,“cross-neutralisation指数”(CNI),考虑强度和广度的中和抗体。我们定义的中和病毒株的%中和50%以上以固定抗体的浓度制备(即500µg /毫升的多克隆抗体serum-derived)。据报道平均丙肝病毒中和抗体效价(%)在所有病毒株用于试验。应用下面的公式计算有限公司获得了强劲的多克隆抗体中和在大多数菌株在抗体中和这种只针对一小部分菌株:参股了=(平均中和* N) + 1) / 100。这里N是%的病毒中和50%以上。

多维标度

我们有104×13中和对,与单个值代表的残余传染性病毒在一个固定的浓度(500µg /毫升)patient-derived抗体的特定virus-patient-antibody对。从这些数据中,我们创建了一个中和地图反映的功效方面的多克隆抗体patient-derived缓解13的中和病毒使用公制多维标度(MDS)。23MDS已经使用以前创建流感病毒的抗原地图。24剩余传染性相似距离措施(相似/不同),不一定欧几里得距离,但是它可以假设这些亲近就像测量距离。25MDS试图找到一个空间配置病毒和血清的n维(通常是两个或三维)空间,笛卡尔这些输入亲近最佳匹配点之间的距离。地图上的距离的差异(d)和实际的接近性(D)被称为压力。这压力损失函数,目的是减少这些压力(压力majorisation)。度量MDS的成本函数是所有对压力的总和,也就是说,残差平方和的双:

嵌入式图像

在哪里嵌入式图像 对应于一个加权项,这通常被设置为嵌入式图像 virus-serum对j,分别。压力由梯度下降majorisation可以逐步完成26或迭代majorisation。27我们使用迭代实现majorisation SMACOF(扩展优化复杂的函数)的一揽子R。27

找到最好的数据的低维表示,我们尝试不同数量的低维度(2、3、4、12),正常化(缩放在血清,在病毒,没有扩展)和加权方案(1)嵌入式图像 )中和矩阵。当我们发现精英缓冲器更感兴趣,我们选择嵌入式图像 应力函数中的权重,确保良好的中和对,也就是说,那些小的值嵌入式图像 优化的距离时,给出的重要性嵌入式图像 每一次迭代。检查MDS的健壮性地图,分析(厕所)进行测试,至少给厕所错误选择的方法来选择最后的MDS地图。在厕所的测试中,我们离开一对中和在每个迭代和画完整的MDS剩下的地图(13×104 - 1)值。洗手间然后决定错误的比率之间的距离忽略时病毒中和试验多克隆免疫球蛋白(猪)在地图上和原来的距离(在中立状态矩阵相同的一对。我们重复这个直到每一对中和到底留了一次,然后报告最后厕所误差平均所有13×104次迭代:

嵌入式图像

最后的地图,没有正常化嵌入式图像 重量和N = 2被选为方法(表1),这厕所的错误。所有的代码和脚本的方法是可用的https://github.com/hzi-bifo/hcv-mds

表1

压力值和厕所错误获得不同的权重和正常化中和矩阵的方法

聚类

施工后的二维(2 d)中和地图,类似中和被确定为13种血清型病毒k——集群的二维坐标图。28聚集在一起的病毒有相似的反应分析patient-derived多克隆免疫球蛋白(猪)。我们尝试不同的值k =4、5、6和获得k为每个值集群。病毒接近集群的重心被选为代表病毒集群。选择的最终价值k,我们绘制了MDS地图,地图和只考虑中和MDS 4、5、6分别代表病毒k= 4、5、6和选择的值,我们获得的最健壮的地图(至少厕所错误)。我们选择k =6的最终值k和获得6个集群的病毒在MDS地图。关键数据描述总结了集群表1

结果

描述HCVcc筛选面板使用患者免疫球蛋白

评估范围和效力的丙肝病毒的中和抗体,我们生成13 Renilla荧光素酶记者代表五丙肝病毒GTs和九个不同的亚型(图1 a, B在线补充表S1)。基因库加入数字和额外的信息可以在网上访问材料和方法。尽管这个小组并不完全包含绝大丙肝病毒的遗传多样性,它可能提供了一个广泛的概述丙肝病毒的多样性。我们不包括先前发表GT6a (HK6a)病毒嵌合体,因为它包含在E1和E2适应性突变18这可能会影响与抗体的相互作用。我们最初包括七个病毒组成GT2-derived信封蛋白质测试假设如果病毒属于同一GT中和相似的配置文件。所有13个记者病毒有效地产生感染性病毒与记者信号至少10倍试验背景在一个中等规模的96 -分析格式(图1 c)。我们收获记者病毒粒子的三个代表48岁,72和96小时后电穿孔的构造和验证一个非常一致的传染性(在线补充图S1A)以及中和行为(在线补充图印地)的个别批次。深度测序从上层清液中提取病毒RNA的收获后48和96小时电穿孔证明没有E1-E2显性变异的基因可能影响中和表型(GT2r在线就是S1C补充数据)。因此,我们得出这样的结论:病毒库存收集到96小时后转染非常适合病毒中和试验。长期通过记者病毒,然而,不推荐,因为这可能导致转基因的删除。

图1

遗传关系和传染性的细胞而丙肝病毒(HCVcc)记者病毒。(一)E1E2氨基酸序列的系统发育树。基因型是颜色编码。树与大型构造使用最大似然方法。(B)嵌合的示意图,JFH1-based HCVcc记者结构。E1-E2基因的基因型为代表的面前,代表这些基因的菌株名称在括号中给出。(C)给定HCVcc记者的传染性病毒通过荧光素酶报告基因分析量化。平均值(n = 12复制和SD。

探索我们的病毒的序列多样性面板在结构层面上,我们映射序列差异这些13病毒到ectodomain E2蛋白的晶体结构。正如所料,守恒的残留物是分布在整个表面的糖蛋白,与大守恒的补丁CD81-binding面对分子(图2 f)。

" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
图2

13中HCV基因型之间的氨基酸保护大型病毒面板。差异是根据保护氨基酸的化学属性映射到E2 ectodomain结构。(A)的卡通表示HCV E2 ectodomain结晶在复杂和HEPC3 HEPC46晶圆厂(PDB 6 mej)。为简单起见,氨基部分(aa 405 - 413) E2不是所示(一)- (F)。组成的复合研究结合位点抗原决定基我(aa412 - 423;绿色)、抗原决定基二世(aa428 - 446;橙色)和CD81-binding循环(aa518 - 542;蓝色),突出显示和HVR2 (aa459 - 486)是黑色的。(B)的表面表示HCV E2 ectodomain与HCV基因型之间的映射氨基酸保护面板包含在大病毒。(C)腻子的卡通表示E2 ectodomain对齐与氨基酸由管厚度和颜色编码根据下面的酒吧类似于色素根据氨基酸(B)的保护。(D) - (F)表示的E2(一)——(C),分别,沿水平轴转约90度。 (E) The epitope contact residues of HC84.26 (PDB 5ERW) is mapped to identify its epitope, which is mapped onto the E2 surface (black contour). (G) Radar plots of individual neutralisation capacities of a panel of 8 well-known human monoclonal antibodies using all 13 cell culture-derived HCV (HCVcc) reporter viruses.

接下来我们异形记者病毒面板通过中和化验的著名人类单克隆抗体(图2 g)。正如预期的那样,我们观察到高度多样化的应变和锁定病毒中和证实这种病毒面板包含广泛的序列,结构和功能的多样性。值得注意的是,一些抗体,尽管针对守恒的抗原表位,导致巨大差异之间的中和病毒(如HC84.26)表明之外的多态残留在感染的抗原表位抗原决定基识别有太大影响。叠加的晶体结构表位肽包裹着HC84.26工厂(PDB 5一并到E2晶体结构确定E2抗体的足迹(黑色的轮廓图2 e)。接触残留组成氨基酸与不同程度的保护(即完全守恒Y443(灰色),守恒F442越少(黄色)和职位几乎守恒的残留444年和446年)。

确定这些病毒抗原之间的关系,我们进行了中和化验与多克隆免疫球蛋白(猪)纯化从104例慢性感染丙肝病毒GT 1到6的病毒。我们有类似GT 1到4的数量受感染的病人,而只有少数样本源自个体感染GT 5和6病毒(图3一)。我们使用纯化抗体,以避免干扰引起的血清组件。我们13日记者在对中和病毒表现出巨大差异,与GT2a(卫星)是最耐和GT5a (SA13)最敏感的病毒(图3 b, C)。没有传染性的13个分离株之间的相关性及其中和敏感性(图1 c和3 c,在线补充图S2A)。此外,绑定patient-derived E1-E2抗体蛋白质提取GT5a病毒转染细胞与中和差相关,表明中和并不直接与绑定E1-E2蛋白质从细胞中提取在线补充图开通)。104年与我们的试验配置,100病人猪中和GT5a (SA13) 50%以上显示,基本上所有的病人山丙肝病毒中和抗体。

图3

分析的记者病毒中和多克隆免疫球蛋白(猪)从104年被GT1位于病毒感染的患者。(A)的慢性感染患者HCV基因型分布队列。(B)的热图猪中和数据与有效的病毒中和在蓝色红色和低效的中和。穿过白色的长方形,数据不可用。(C) Rank-ordered表示细胞而丙肝病毒(HCVcc)病毒根据其易感性patient-derived猪中和。小提琴的轮廓数量成正比的血清中和能力,固体蓝色栏覆盖所有数据的50%,也就是说,第二个和第三个四分位数,中间的灰色圆点表示中位数和“+”的意思。

归类HCVcc面板分为病毒组具有类似中和表型,我们执行度量MDS,预测病毒的中和数据patient-pIg双成二维中和地图有一个广场在中和地图上对应于10%的单位中残留的传染性中和矩阵方法;图4 a, B)。之间的距离在地图上每个patient-derived猪和每个病毒中和效率成正比,与一个小的距离代表非常有效中和(低残余传染性),和一个大的距离反映低效的中立状态(高残留传染性)。注意,每个位置考虑中和病毒和猪样本由其他病毒和猪样品提供一个全面的制图。在这张地图上,HCVcc菌株区分为六个不同的中和集群。注意,在少数情况下,病毒和猪样本之间的距离超过100%。这是由于我们的称重法,在每个迭代优化整个地图最适合和在此猪病毒为重点对较低的剩余距离。

图4

度量中和数据的多维标度(104多克隆免疫球蛋白(猪)和13个病毒样本)。(一)二维地图中和(没有正常化和1 /Dij重量)。病毒是引起彩色圆圈,猪彩色方块。(B)中央集群的放大。(C)表示,只有病毒显示映射到六中和集群。集群是枚举在顺时针方向,并给出参考病毒每个集群。(D) E1E2氨基酸序列的系统发育树细胞而丙肝病毒筛查(HCVcc)病毒。树枝上的颜色是根据病毒基因型。云在病毒株是彩色根据中和集群。

值得注意的是,基于中和集群配置文件没有与系统发育关系的病毒(图4 c, D)。例如,七个GT 2隔离属于四个不同的中和服务器集群和集群包含四个不同的GTs的隔离(图4 c)。一方面,这一发现驳斥了上述假设病毒属于同一个GT中和行为相似。另一方面,MDS建议GT1病毒感染抗体与病人共同中和行为,因为这些抗体集群更紧密与抗体来源于GT2相比,3或4感染者。

CNI和病毒的选择参考

许可证有效、平衡的评估能力和广度的中和抗体,我们下一个检查如果参考病毒的一个子集重建整个病毒的丙肝病毒中和空间面板。为此,我们选择一个丙肝病毒隔离,而每个中和高病毒滴定度集群,从而减少隔离的数量从13 - 6 (图4 c和5)。与之前的研究成果,传播他们的板根据遗传多样性,这六个病毒面板主要反映了丙肝病毒功能抗原多样性而不是序列多样性。

图5

丙肝病毒参考面板忠实地再现了大病毒的面板数据。(A) Rank-ordered表示patient-derived多克隆免疫球蛋白(猪)基于cross-neutralisation值对所有13细胞而丙肝病毒(HCVcc)菌株。(B) Rank-ordered表示patient-derived猪病毒基于六cross-neutralisation参考。实心矩形是第二和第三四分位数的数据范围,虚线表示第一和第四象限的日期范围,“+”表示的意思是cross-neutralisation和个人点外的胡须是离群值。(C)相关性patient-derived猪排名基于13 HCVcc菌株和6参考HCVcc菌株。

宽度和力量都是抗体反应的重要特征。因此,我们引入了一个“cross-neutralisation指数”(CNI)报告的效率病毒cross-neutralisation量化这两个特性(详情,请参阅材料和方法部分)。本质上,CNI报告平均中和除以所有病毒株菌株的比例超过50%被中和。使用这种方法,与广泛而有效的中和抗体青睐在抗体用精致的效力,但选择性只有几株。

排序根据他们的病人血清CNI测量与13-virus面板(图5一个)或6-virus面板(图5 b)显示一个很高的两板之间的一致性。CNI Spearmann的相关分析显示,结果与6-virus面板非常相似的完整13-virus面板(Spearmann r = 0.95;p < 0.0001;图5 c)。6-virus面板和13-virus面板之间的关系也是非常好的当使用平均中和(Spearmann r = 0.89;为报告cross-neutralisation (p < 0.0001)在线补充图S3)。因此,减少数量的菌株不妥协的精度得分广度和中和抗体的效价。

我们测试了,如果我们还可以使用最耐药病毒的面板(GT2a[卫星])为一个单一的病毒筛查。然而,13-er面板之间的相关性和JcR-2a温和(斯皮尔曼的r = 0.44, p < 0.0001) (在线补充图S4A)。在所有病毒在我们的小组中,中和的GT2r (2 r)记者病毒最好与CNI整个13-er面板(斯皮尔曼的r = 0.83, p < 0.0001),表明试销只有这种病毒可能是一个性价比不错的备用方案(在线补充图S4B)。

有冲突的报道患者的抗体是否感染了一个特定的病毒基因型将优先中和测试病毒的同源基因型。14为了验证这一点,我们使用的数据完整13-virus小组反对104年参考猪相比,同源的参股了病毒感染这些病毒基因型和CNI从所有不同的基因型。我们专注于多克隆抗体GT1标本(33)或GT2标本(21)感染者,因为三13病毒属于GT1七13 GT2的病毒。我们策划有限公司之间的比率的同源感染GT的另一个GTs对每个抗体制备和等级要求的标本根据全球有限公司价值整个13-virus面板(在线补充图S5)。大多数抗体制剂来源于GT1-infected个人显示有限公司比率大于1,表明适度的偏好对cross-neutralisation测试病毒从GT1 non-GT1测试病毒。相比之下,除了一个标本,所有抗体制剂GT2-infected个人显示CNI比率小于1。最后,我们没有观察到一个相关性CNI比率和全球公司。

精英缓冲器和验证筛选面板的识别

来验证我们的性能6-virus HCVcc筛选面板中,我们评估cross-neutralisation多克隆免疫球蛋白准备从病毒感染GT 392例1 - 5 (图6)。我们rank-ordered patient-pIg基于CNI 6-virus面板和选择前2%多克隆免疫球蛋白作为顶级缓冲器(ie,猪从九个病人)(图6 a, B)。证明我们的筛选与6-virus面板识别患者全谱cross-neutralisation功效,我们测试了中和在12-virus HCVcc压力。事实上,所有精英缓冲器cross-neutralising抗体抑制感染这些病毒的50%以上(图6 b)。这是一个强烈的迹象表明我们的筛选方法是可靠的。接下来,我们使用整个数据集包括所有patient-pIg(从GT1 496患者330,从GT2 36,及至80年,从清32,从位于4从力学和2)验证和性能的平衡6-virus面板。投射的中和数据virus-patient免疫球蛋白对二维地图,我们观察到一个密集的云样本病人感染不同GTs相互混合,表明缺乏genotype-dependent subclustering患者样本(图7)。对于每个猪标本,我们计算了加权距离中心点的同源基因型(图7 b)。使用这种方法,我们注意到几乎相同的标本的质心之间的平均距离同源GT集群内的二维地图,显示一个非常相似的多克隆抗体的多样性反应患者感染不同的GTs。最后,我们研究了多克隆抗体的平均参股GT1-GT6-infected患者对6-virus面板。GT1-GT4-infected个体表现出类似的样本平均参股了介于7 - 25 (在线补充图S6)。由于较低的样品数量,我们不能让位于新界力学严谨的语句。标本GT2-infected个人最高平均CNI是明显高于GT1 (p = 0.0039)和清(p = 0.0006)。尽管适度的GT的依赖关系的,这个校准建议6-virus面板报告丙肝病毒中和在一个非常平衡的方式在高度多样化的人体标本。

图6

识别精英缓冲器使用六个参考病毒。在392年(A)的热图的病毒中和patient-derived多克隆病毒免疫球蛋白(猪)对六个参考。(B)确认2%的最佳patient-derived猪样本有效地中和12种不同细胞而丙肝病毒(HCVcc)菌株。

图7

度量中和数据的多维标度(496多克隆免疫球蛋白(猪)样品和6引用病毒)。(一)二维地图中和(没有正常化和1 /Dij重量)。病毒是引起彩色圆圈,猪彩色方块。(B)每个猪标本中央点的距离(即重心)猪群的同源基因型。感染病毒的同源基因型是指基因型病人的样本来自。盒子覆盖50%的数据范围内,也就是说,第二个和第三个四分位数,胡须表示完整的数据从第一到第四个四分位数,厚厚的黑条表明中值和“+”的意思。外的点胡须是离群值。

讨论

几项研究描述了使用丙肝病毒筛查面板描述丙肝病毒的抗体。在大多数情况下,HCVpp被使用,14和筛选面板完全关注GT1-derived E1-E2序列16这个GT或有强烈的偏爱。22此外,一些HCVcc面板存在,29 30但研究使用这些电池板评估人类跨多个捐赠者多克隆抗体的多样性和病毒基因型是缺乏。最后,这些前面板是基于病毒的亲缘关系,而不是功能抗原性质。目前,丙肝病毒中和试验之间存在大量的变异使用,使标准化测量病毒cross-neutralisation和对比研究。这是特别有问题的,因为体内的免疫能力模型的评估缺乏诱发的保护。这种限制增强预测为例在体外实验中需要优先考虑候选疫苗病毒cross-neutralisation基于量化措施。

这里,我们旨在建立一个健壮的方法严谨、平衡和比较量化的强度和广度的人类anti-HCV抗体反应跨不同人类的捐助者。为此,我们创建了一个小组HCVcc记者包括13株病毒。这些病毒代表五个七GTs和九个独立的子类型,因此涵盖了大部分丙肝病毒遗传多样性。虽然这些记者病毒绝对不同病毒生产效率100倍(图1 c),每个产生足够高的滴定度中吞吐量96年建立筛选化验。与先前建立HCVpp面板,22我们没有观察到病毒传染性和易感性之间的相关性中和在13-er面板中,排除干扰,由于微分病毒传染性(在线补充图S2A)。

判断这部小说HCVcc筛选面板的性能,我们异形病毒中和在纯化猪从104年慢性感染患者(GT1(33例)、GT2(21例)、g3(25例)、清(21例)、力学(2例),位于新界(2例)。这显示病人标本和之间的巨大差异,病毒中和病毒易感性中和(图3)。排序的所有病毒中和敏感度显示面板包括一个广泛的中和磁化率和均匀分布的谱。值得注意的是,基本上所有的病人(大约96%)安装检测到中和抗体,虽然他们的广度和效力是变量。病毒中和猪不与绑定E1-E2蛋白质从细胞中提取(在线补充图开通),表明抗体绑定的网站等其他因素确定中和。因为使用了多克隆抗体,它可能存在non-neutralising抗体中和试验从而导致这种差异的影响。有一些争论是否感染病毒基因型倾斜不同的中和对更有效地中和测试病毒的同源基因型。14因此,我们研究了如果从GT1猪或GT2感染病毒的病人优先中和测试病毒的这些GTs其他剩余的GTs。这是理由的GT1但不是GT2-derived样本(在线补充图S5)。我们不知道这些GT1和GT2的样本之间的差异的原因。一种可能性是,菌株的选择在我们的13-virus面板与GT2-derived病毒的占了一大部分。量化的整体丙肝病毒cross-neutralising活动CNI不或多或少与cognate-genotype-centric中和。换句话说,既不同源感染GT的偏好也不缺乏这样一个偏好排除了广泛而有效的中和。

发现有关抗体中和病毒之间的功能差异,我们使用公制MDS投射的完整中和数据virus-patient免疫球蛋白对二维地图。使用这种方法,我们做了两个重要的观察结果。首先,病毒映射到六个不同的中和集群代表不同的病毒生物型与他们相互作用与hcv感染猪的病人。这个分析使减少我们的大型13-virus面板更加紧凑筛查系统包含一个引用代表每个六中和病毒集群。第二,MDS透露收紧集群的猪从GT1-infected患者相比其他GTs (图4 a, B)。这种差异也明显在分析猪的平均距离标本重心各自的基因型(即距离GT1猪样本质心的GT1集群,等等;在线补充图S7A)。在一起,这表明猪GT1患者更比其他GTs彼此相关。我们不知道这样做的原因,但怀疑一个偏见13-virus面板的病毒与某些功能性质可能占:13-virus小组代表的四个病毒中和集群1,和三个集群4,而所有剩余集群只由两个或两个一个病毒(图4 c)。值得注意的是,MDS的完整数据集包括所有496 patient-derived猪分析6-virus面板,每个中和集群是由单个病毒并不再显示异常密集的集群GT1-derived猪标本(图7 a, B)。此外,MDS 104中和数据的分析样品,只有6-reference病毒改变GT1样本的平均质心的距离,使其紧密匹配的其他GTs (在线补充图S7B)。因此,尽管大型13-virus集群和紧凑6-virus集群提供一致的结果(图5),我们相信6-virus集群丙肝病毒cross-neutralisation报道一个更加平衡的方式。此外,我们表明,392样本的筛选与6-virus面板容易识别精英缓冲器有效cross-neutralised广泛的压力。综上所述,这些研究结果证明使用这组六个参考病毒作为一个健壮的、高效的和平衡的方法得分丙肝病毒中和。

我们观察到一些猪的平均强度和广度差异取决于GT病人被感染(在线补充图S6)。给定的样本数量有限,我们不能对力学做出严格的语句或GT6-derived标本。然而,GT1清,样本容量相对较大,我们观察到在cross-neutralisation部分显著差异:猪样本GT2-infected患者施加很大的cross-neutralisation比GT1或清。这样做的原因是未知的。一种可能性是,事实上GT2病毒可能诱发更强大的抗体反应。这可能与特定功能的GT2-derived信封GT2病毒的蛋白质或其他特性。另外,这些适度的差异可能反映了适度的偏见在我们筛选面板。额外的研究涉及更多的病毒株和病人猪将有助于解决这个问题。这将是有用的这些额外的数据集成到当前丙肝病毒中和地图找出如果额外病毒中和集群存在。最后,这将是非常有趣的探索,如果这六个功能中和集群代表不同的病毒抗原集群。 If this was the case, vaccination approaches aiming at induction of broad neutralising antibodies may benefit from combining glycoproteins from viruses representing these clusters.

近500的高分辨率分析patient-derived猪标本允许我们开发、校准和验证一个新颖的筛查方法,定量比较丙肝病毒的抗体反应。扫描系统由六个参考病毒应该大大促进标准化评价丙肝病毒中和在不同的实验室。六个功能明显的发现病毒中和集群的存在表明不同的病毒生物型的相互作用与中和抗体。MDS-based评价对不同病毒抗体反应开门深表现型丙肝病毒感染,诱发的抗体。这将有助于疫苗诱导丙肝病毒发展的保护性抗体。

数据可用性声明

数据共享不适用任何数据集生成和/或分析研究。合理的请求数据。所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。记者病毒序列提交NCBI数据库基因库。

伦理语句

病人同意出版

伦理批准

英国的丙肝病毒研究,研究协议批准的国家服务(nr)研究伦理委员会东米德兰兹(参考11 / EM / 0323)。使用血清的科隆,波恩和汉诺威当地伦理委员会批准的(道德017/16投票,波恩内科我;道德投票11 - 312,科隆的病毒学;道德投票2148 - 2014年汉诺威医学院)。

引用

补充材料

脚注

  • DB和AB是共同第一作者。

  • ACM和TP联合高级作者。

  • DB和AB型同样起到了推波助澜的作用。

  • 贡献者构思和设计实验:DB、TP。进行实验:DB, MD, CG TKh,毫升。分析了数据:DB, AB, DT,毫升,TP。造成试剂/材料/分析工具:PB, MC, LD,颗,LS, TKh。手稿中写道:DB, AB, TP。实验设计:计算。

  • 资金Twincore是汉诺威医学院的合资企业和Helmholtz-Centre感染的研究。TP,我和TK是由德意志Forschungsgemeinschaft(脱硫、德国研究基金会)在德国的卓越战略——EXC 2155“抵抗”——项目ID 39087428。他们也得到支持通过德国中心的感染丙肝病毒疫苗研究项目将(TTU 05.808)。TP也是由Helmholtz-Alberta传染病研究计划(HAI-IDR)。lj由德意志Forschungsgemeinschaft - Projektnummer 158989968 SFB 900,项目B10。资助机构没有参与研究设计、数据的收集,分析和解释,本文的写作和提交文章出版的决定。

  • 相互竞争的利益从Abbvie MC报告个人费用,个人费用从基列科学,从Janssen-Cilag个人费用,个人费用从默克公司,医学博士,个人费用从生原体,福尔克的个人费用基础上,个人费用从西门子、个人费用从春天银行,葛兰素史克的个人费用,在提交工作。

  • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

  • 补充材料此内容已由作者(年代)。尚未审查由BMJ出版集团有限公司(BMJ)和可能没有被同行评议。任何意见或建议讨论仅代表作者(年代)和不了BMJ的支持。和责任起源于BMJ概不负责任何依赖的内容。内容包括任何翻译材料,BMJ并不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南,术语,药物名称和药物剂量),和不负责任何错误或遗漏引起的翻译和改编或否则。

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