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胰腺
原始研究
在人类胰管中发现一种新的ΔNp63-expressing基底细胞类型，并进行3D成像，与疾病有关
  1. Sandrina Martens1，
  2. 凯蒂Coolens1，
  3. Mathias Van Bulck1，
  4. Tatjana Arsenijevic2，3.，
  5. 琼Casamitjana4，5，
  6. 安吉尔·费尔南德斯·鲁伊斯4，5，
  7. Abdessamad El Kaoutari6，7，
  8. Jaime Martinez de Villareal8，
  9. Hediel Madhloum1，
  10. 法扎德Esni9，
  11. 伊夫Heremans10，
  12. Gunter Leuckx10，
  13. 哈利Heimberg,10，
  14. Luc Bouwens11，
  15. 帕特里克Jacquemin12，
  16. Diedert Luc De Paep13，
  17. 彼得在维尔德13，
  18. 尼基D 'Haene14，
  19. Christelle Bouchart15，
  20. 纳尔逊Dusetti6，
  21. Jean-Luc Van Laethem2，3.，
  22. Wim Waelput16，17，
  23. 皮埃尔Lefesvre16，17，
  24. 弗朗西斯科X雷亚尔8，
  25. Meritxell·罗维拉4，5，
  26. 伊尔丝Rooman1
  1. 1医学与分子肿瘤学实验室“，，布鲁塞尔自由大学，布鲁塞尔、比利时
  2. 2实验消化病学实验室“，，Université布鲁塞尔自由，布鲁塞尔、比利时
  3. 3.医院消化、肝、胰脏、肿瘤及消化科，布鲁塞尔、比利时
  4. 4生理科学系，巴塞罗那大学(UB)医学院，L 'Hospitalet de Llobregat、西班牙
  5. 5胰腺再生:胰腺祖细胞及其生态位群，再生医学项目，P-CMR[C]，研究所'Investigació Biomèdica，L 'Hospitalet de Llobregat、西班牙
  6. 6马赛研究中心Cancérologie - CRCM, INSERM UMR1068，CRCM，马赛、法国
  7. 7混合涂料单位，马赛研究中心Cancérologie，马赛、法国
  8. 8上皮癌变组，西班牙国家癌症研究中心，马德里、西班牙
  9. 9儿科普通胸外科，匹兹堡大学外科，匹兹堡，宾西法尼亚美国
  10. 10β细胞新生实验室，布鲁塞尔自由大学，布鲁塞尔、比利时
  11. 11细胞分化实验室，布鲁塞尔自由大学，布鲁塞尔、比利时
  12. 12迪夫研究所，Université鲁汶天主教，Louvain-la-Neuve、比利时
  13. 13糖尿病研究中心，布鲁塞尔自由大学，布鲁塞尔、比利时
  14. 14病理科，友谊医院Erasme，布鲁塞尔、比利时
  15. 15放射肿瘤科，朱尔斯·博尔特研究所，布鲁塞尔、比利时
  16. 16病理科，是乌斯布鲁塞尔，布鲁塞尔、比利时
  17. 17病理科，布鲁塞尔自由大学，布鲁塞尔、比利时
  1. 对应到Ilse Rooman博士，布鲁塞尔自由大学医学和分子肿瘤学实验室，比利时布鲁塞尔;irooman在{}vub.be

摘要

客观的侵袭性基底样分子亚型胰腺导管腺癌(PDAC)具有ΔNp63 (p40)基因表达特征，使人联想到基底细胞型。与其他基底肿瘤上皮细胞不同，ΔNp63+据报道，正常胰腺中不存在基底细胞。

设计我们评估了ΔNp63在人胰腺、慢性胰腺炎(CP)和PDAC中的表达。我们进一步深入研究了非癌组织，并开发了一种三维(3D)成像方案(FLIP-IT，荧光薄片显微成像石蜡包埋或完整组织)，以单细胞分辨率研究福尔马林固定石蜡包埋样品。对相关小鼠模型和HPDE细胞进行分析。

结果在正常人胰腺中，罕见ΔNp63+细胞存在于导管中，而在CP和PDAC的一个子集中，它们的患病率增加。在非癌症组织中，ΔNp63+细胞为非典型KRT19+这些导管细胞总体上缺乏SOX9表达，但它们确实表达典型的基础标记物，并且属于表达胃肠道干细胞标记物的细胞生态位。三维视图显示，正常中大型导管基底细胞锚定在基底膜上，而CP中基底细胞以多层圆顶状结构存在。在小鼠中，ΔNp63不在成年胰腺中，也不在选定的CP或PDAC模型中，但它在较大的Sox9类器官中被诱导低导管。在HPDE中，ΔNp63以牺牲经典的导管细胞分化程序为代价支持基底细胞表型。

结论在较大的人胰管中存在基底细胞。ΔNp63抑制导管细胞身份。这些细胞可能在胰腺疾病中发挥重要作用，包括PDAC的个体发生，但在小鼠模型中不存在。

  • 胰腺
  • 干细胞
  • 癌症
  • 发展基因
  • 成像

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2020-322874

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    视频摘要

    免责声明:本视频总结了由BMJ出版集团有限公司(BMJ)发表的一篇科学文章。本视频内容未经同行评审，不构成医疗建议。本文仅代表作者个人观点。观众应该注意，该领域的专业人士可能会有不同的意见。BMJ不赞同任何表达的意见或讨论的建议。观众不得将视频内容作为任何医疗的依据。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • ΔNp63在确定胰腺导管腺癌的基底样亚型中具有核心作用。

    • 据报道，与其他基底癌组织不同，正常胰腺不含基底细胞(ΔNp63-expressing)。

    • 目前的基于标记的识别和三维(3D)成像的方案，个体(罕见)细胞在人类档案胰腺样本面临严重的限制。

    新的发现是什么?

    • 我们报告一个罕见的非典型胰管细胞，表达ΔNp63，其他基底细胞标志物和一些g.i.干细胞标志物。

    • 这些ΔNp63+细胞在慢性胰腺炎中更为常见。

    • 除了将培养基培养为大型导管作为类器官外，我们未能检测到ΔNp63+小鼠实验性胰腺模型中的细胞。

    • ΔNp63有利于基底细胞分化，而限制经典导管细胞分化标记。

    • 我们提供了一种易于实现的方案，用于对(新鲜或福尔马林固定和石蜡包埋的)人类胰腺或整个小鼠胰腺的大样本进行3D清理和高分辨率成像。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 从其他器官的知识推断，胰腺中的基底细胞可能具有干细胞/祖细胞作用，包括在基底样或鳞状胰腺癌等疾病中。

    • 应用改进的三维成像方案，档案临床标本将允许在胰腺组织病理学前所未有的见解。

    • 对于上述疾病，我们提醒在实验小鼠模型中的发现可能不能(完全)概括病因。

    简介

    胰导管腺癌(PDAC)是一种高度未满足需求的癌症。在几个PDAC队列中，已经确定了一个经典和一个碱性分子亚型，后者预后最差。1基样亚型的特征2和驱动3.基底细胞转录因子ΔNp63是肿瘤蛋白P63的一种亚型(TP63)．3 4Notta等通过显示基底细胞标志物最高的A亚型，包括TP63，但明显的基底样B亚型预后最差。5这说明了我们对……的认识不足TP63以及胰腺中的其他基底细胞标记物。1

    ΔNp63+基底细胞可能是其他组织中癌症的起源细胞6 7但是对于正常的胰腺来说，这种表达是可以接受的TP63不在。3 8 - 10这与支气管、前列腺、唾液腺、皮肤、乳房和胎盘形成对比，9其中ΔNp63由位于基底膜上的正常导管中的特定细胞群表达，并由细胞角蛋白(KRT) 5和14等特定标记物区分。11此外，ΔNp63是一种在分层上皮细胞发育过程中得到充分研究的关键分子，也是一种细胞分化抑制剂，对干细胞更新至关重要。12日13因此，基底细胞是发育、组织稳态和再生的祖细胞。11 14 15因此，我们重新评估了ΔNp63表达和其他基底细胞标志物，重点是健康的人类胰腺和慢性胰腺炎(CP)，这是PDAC的一个危险因素。16

    在相当大的胰腺样本中，研究单细胞水平的三维(3D)空间组织需要组织清理、荧光标记和3D成像。17 18然而，当涉及到临床标本通常是福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)时，这种方法面临一些限制。应用大脑研究的方法，如CUBIC, CLARITY和DISCO，这些方法主要用于研究宏观变化，19对胰腺的检测结果不理想，特别是在使用荧光显微镜时。除了基底细胞标志物的二维(2D)评估外，我们还必须优化3D方法的方案。

    在这里，我们报告了胰腺中一种新的罕见细胞群，表达ΔNp63和其他基底细胞标志物。与人类相反，我们未能在成年小鼠胰腺中检测到这种细胞群。然而，ΔNp63可以在导管类器官中诱导，ΔNp63抑制经典的导管细胞分化程序。这一发现提出了关于它们的发育起源、命运和在再生和疾病中的作用的重要概念问题，包括基型PDAC。

    所有相关信息在补充部分提供。

    结果

    正常人类胰管中有一个罕见的ΔNp63+在CP和PDAC的一个子集中变得更加普遍的细胞群

    我们首先评估了ΔNp63在无胰腺疾病史的器官捐赠者中的表达。在大约一半(53/113)的供体中，当评估一个随机切片(67.2±6.8 mm²)时，我们检测到导管中强烈但罕见的ΔNp63表达(图1一个)．ΔNp63的RNA原位杂交和使用抗p63抗体检测所有亚型的免疫荧光染色证实了这一点(在线补充图1)．在正常组织中，来自头部或尾部区域，ΔNp63+在导管基底层检测到单个细胞，在导管周围检测到小簇细胞，它们的组合或极少检测到单个细胞(在线补充图2A-D)，尽管这些观察受到解释2D切片的限制。

    Normal human pancreatic ducts harbour a rare ΔNp63+ cell population that becomes more prevalent in CP and in a subset of PDAC. (A) ΔNp63 staining in one representative section of NHP (n=114): Three ductal areas are shown, of which one (a’) contains a limited number of positive cells, and two other areas (a” and a’’’) are negative. (B) ΔNp63 staining in one representative section of human CP (n=11). Three ductal areas are shown, of which two (b’ and b’’) contain a high number of positive cells, and one area (b’’’) is negative. An inset is shown in (b’). (C–F) Representative images of the stainings in a PDAC cohort (n=141), displaying four different tumour groups: (C) negative tumour, (D) partially positive tumour, showing basal cells in one duct, (E) positive tumour and (F) adenosquamous tumour. (G) Quantification of the percentage of ΔNp63+ cells in whole tissue sections from NHP, CP and PDAC. *p<0.05, ****p<0.0001. (H) Quantification of the number of ΔNp63+ cells in ΔNp63+ ducts from NHP and CP. ***p<0.0001. (I) ΔNp63 expression in basal-like (n=37) versus classical subtype (n=7) PDAC cell lines (Error bars indicate SD). *p<0.05. CP, chronic pancreatitis; NHP, normal human pancreas; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    正常人类胰管中有一个罕见的ΔNp63+在CP和PDAC的一个子集中变得更加普遍的细胞群。(A) NHP代表性切片ΔNp63染色(n=114):显示三个导管区域，其中一个(A’)含有有限数量的阳性细胞，另外两个区域(A’和A’)为阴性。(B)人类CP的一个代表切片ΔNp63染色(n=11)。显示三个导管区域，其中两个(b '和b ' ')含有大量的阳性细胞，一个区域(b ' ')是阴性细胞。插图显示在(b ')中。(C - F) PDAC队列(n=141)染色的代表性图像，显示四种不同的肿瘤组:(C)阴性肿瘤，(D)部分阳性肿瘤，显示一根导管中的基底细胞，(E)阳性肿瘤和(F)腺鳞肿瘤。(G)量化ΔNp63的百分比+NHP、CP和PDAC的全组织切片细胞。* * * * p < 0.05, p < 0.0001。(H)量化ΔNp63的数量+在ΔNp63+管道来自NHP和CP。***p<0.0001。(I)碱性样(n=37)与经典亚型(n=7) PDAC细胞株的ΔNp63表达(误差条表示SD)。* p < 0.05。CP，慢性胰腺炎;NHP，正常人胰腺;PDAC，胰腺导管腺癌。

    在定量时，0.006%的所有细胞为ΔNp63+（图1 g)，相当于导管内所有细胞的1.6% (在线补充图2E)．对于ΔNp63-positive样本，我们发现年龄、性别、重症监护时间、身体质量指数(BMI) (在线补充图2F-I)和组织固定方案(未显示)。供体特征在ΔNp63-positive和ΔNp63-negative样本之间也没有差异(在线补充图2J-M)．当分析多个FFPE块(n=4个捐赠者，2到10个FFPE块)时，至少有一个块包含ΔNp63+细胞。总之，这表明，如果对足够的材料进行分析，在任何供体的胰腺中都可能发现ΔNp63细胞。

    接下来，我们评估了CP，这是一种伴有导管扩张的疾病，也是PDAC的既定危险因素。16在分析每位患者(228.3±17 mm²)的切片时，大多数CP(9/11)呈阳性(图1 b)，细胞通常聚集在导管和囊肿附近(图1 b)．ΔNp63的出现+细胞数量显著增加(占总细胞的0.17% (图1 g)和4%的导管细胞(在线补充图2E)与健康对照组相比。对于相同尺寸的管道，数量为ΔNp63+细胞也明显增加，与正常相比(图1 h)．ΔNp63仅为2.26%±2.11%+Ki67标记的细胞表明它们CP的增加不是由于增殖。

    最后，我们评估了一个PDAC队列(在线补充表1)，在一段(癌症和邻近的非癌症)中，平均0.36%的所有细胞呈ΔNp63阳性(图1 c g)．我们没有发现癌细胞和邻近组织中ΔNp63表达之间的直接相关性(未显示)。三分之一的肿瘤，包括腺鳞肿瘤(在线补充图3A,B)，阳性面积较大，染色强度最强。癌细胞中ΔNp63的h -评分与肿瘤分化相关(p=0.03)。ΔNp63与低分化肿瘤显著相关(p=0.00078, post hoc Bonferroni)。

    与基础基因表达特征的预后价值相比，2 3 20ΔNp63作为独立的蛋白质标记与总生存率无关(在线补充图3C)，证实先前有关n=422 PDAC的报告。10此外，the Cancer Genome Atlas (TCGA)数据集(n=150)显示与乳腺癌患者无生存相关性TP63信使RNA (mRNA) (log rank=0.15)，而其他基底细胞标记物则是如此KRT14而且S100A2(log rank=0.004, log rank=0.008) (https://app.gebican.fr/pdac-survival/)．

    为了进一步评估ΔNp63表达与基样签名的相关性，我们利用n=44个PDAC细胞株，21可以直接评估肿瘤的上皮成分。所有其他转录组研究TP63(ENSG00000073282)，而在这里我们特别区分了ΔN-isoform (ENST00000354600)。当使用胰腺腺癌分子梯度(PAMG)时，它逐渐反映了从最基本的到最经典的分子亚型，22我们证实了与ΔNp63(皮尔森系数R=−0.34,p=0.023)的负相关(在线补充图3D)．此外，在PurIST二元分类中，与经典PDAC相比，基础PDAC的ΔNp63表达水平显著更高(p=0.036)，但有趣的是，一部分类基础PDAC不表达任何ΔNp63 (图1我而且在线补充图3D)．

    因此，我们首次报道了在正常人类胰管中罕见的ΔNp63-expressing细胞的发生。在CP和PDAC的一个子集中，它们的存在显著更高。ΔNp63亚型与PDAC中的基样基因表达特征相关，但不能用作还原论(预后)标记物。

    ΔNp63+细胞不同于正常的胰管细胞，显示典型的基底细胞标记

    为了确定ΔNp63-expressing细胞的身份，我们分析了上皮标记物(E-cadherin)、典型胰管细胞标记物(KRT19、CA19.9、SOX9、HNF1β、KRT7)和胰管腺体标记物(MUC6)的表达，这是一种建议的干细胞生态位。23此外，我们还分析了基底细胞标志物(KRT5、KRT14和S100A2)。11 24 25以及基底位置，细胞质和细胞核苍白。26在乳房中，肌上皮细胞表达ΔNp63以及肌源性标记物。27因此，我们还分析了钙钙蛋白和α平滑肌肌动蛋白(aSMA)。下面显示的所有结果都是在CP上进行的，因为有更多ΔNp63+但所描述的染色模式在罕见的ΔNp63中总体上没有差异+正常胰腺细胞(在线补充表2)．

    P63+细胞中e -钙粘蛋白呈阳性(在线补充图4)及KRT19 (图2一个)，但不适用于CA19.9 (图2 b)．SOX9和HNF1B核表达罕见，而邻近的P63均有表达- - - - - -导管细胞染色呈阳性(图2 c, D)．P63+细胞也缺乏导管KRT7 (图2 e)．

    ΔNp63+ cells are distinct from normal pancreatic duct cells and display typical basal cell markers. (A) IF for KRT19 (white) and P63 (red), showing co-expression; (B) IHC for ΔNp63 (brown) and CA19.9 (red). CA19.9 expression is absent in ΔNp63+ cells and weaker in the duct lumen (see inset); (C) IF for SOX9 (white) and P63 (red). SOX9+ cells are indicated with an orange arrow, while P63+ cells are indicated with a white arrow; (D) IF for HNF1B (white) and P63 (red). HNF1B+ cells are indicated with an orange arrow, while P63+ cells are indicated with a white arrow; (E) IF for KRT7 (white) and P63 (red). White arrow indicates a P63+ cell, while the orange arrow indicates a KRT7+ cell; (F) IF for P63 (red) and KRT5 (white). White arrow indicates a P63+ cell, orange arrow indicates a P63– cell; (G) IF for P63 (red) and KRT14 (white). Solid white arrow indicates a P63+KRT14+ cell, dotted white arrow indicates a P63+KRT14– cell. Orange arrow indicates a P63– cell; (H) IF for S100A2 (white) and P63 (red). Solid white arrow indicates a P63+S100A2+ cell, dotted white arrow indicates a P63+S100A2– cell. Orange arrow indicates a P63– cell. IF, immunofluorescence; IHC, immunohistochemistry.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    ΔNp63+细胞不同于正常的胰管细胞，显示典型的基底细胞标记。(A) KRT19(白色)和P63(红色)的IF，共表达;(B) ΔNp63(棕色)和CA19.9(红色)的免疫组化。ΔNp63中没有CA19.9表达+导管内的细胞和较弱的细胞(见插图);(C) SOX9(白色)和P63(红色)的IF。SOX9+细胞用橙色箭头表示，而P63+单元格用白色箭头表示;(D) HNF1B(白色)和P63(红色)的IF。HNF1B+细胞用橙色箭头表示，而P63+单元格用白色箭头表示;(E) KRT7(白色)和P63(红色)的IF。白色箭头表示P63+单元，而橙色箭头表示KRT7+细胞;(F) IF为P63(红色)和KRT5(白色)。白色箭头表示P63+单元格中，橙色箭头表示P63- - - - - -细胞;(G) P63(红色)和KRT14(白色)的IF。白色实线箭头表示P63+KRT14+单元格中，白色虚线箭头表示P63+KRT14- - - - - -细胞。橙色箭头表示P63- - - - - -细胞;(H) S100A2(白色)和P63(红色)的IF。白色实线箭头表示P63+S100A2+单元格中，白色虚线箭头表示P63+S100A2- - - - - -细胞。橙色箭头表示P63- - - - - -细胞。如果,免疫荧光;包含IHC,免疫组织化学。

    苏木精-伊红藏红花(HES)染色(在线补充图5A-D), P63+与P63相比，P63细胞常呈基底位置，细胞质和细胞核颜色较浅- - - - - -细胞。所有的P63+细胞强烈表达KRT5 (图2 f)，而一个子集表示KRT14 (图2 g)．一个较大的子集是S100A2+，是ΔNp63的直接转录靶点28（图2 h)，类似于前列腺和气道基底细胞。24日25日胰腺P63+细胞不表达MUC6 (在线补充图5E,F)和MUC6与其他基础标记KRT5 (在线补充图5G)．此外，细胞aSMA和钙钙素阴性(在线补充图5H-K)．

    综上所述，胰腺ΔNp63+细胞显示的表型让人联想到来自其他组织的典型基底细胞，并代表非典型导管细胞群。

    管道包含ΔNp63+细胞表达胃肠干细胞标记物

    在其他上皮细胞中，基底细胞被认为是祖细胞。因此，我们研究了胃肠道(GI)干细胞标志物，包括DCLK1、CD142和OLFM429-31除了更一般的多能干细胞标志物(NANOG, OCT4)。

    大多数基础P63+细胞为DCLK1+（图3一)．奇异DCLK1+P63- - - - - -还观察到了细胞，证实了之前在胰腺中的报道32 33（图3 b)．基底细胞和一些邻近的管腔细胞，特别是含有P63的导管+细胞中CD142表达，而在缺乏P63的导管中未发现CD142+细胞(图3 c, D)．P63中OLFM4缺失+细胞，很少在邻近细胞中表达(图3 e)．然而，我们发现它只存在于含有P63的导管管腔中+细胞(图3 e, F)，并可以将其丢弃为胆汁(未显示)。与阳性对照样品相比，细胞不表达NANOG或OCT4 (在线补充图6)．

    Ducts containing ΔNp63+ cells express gastrointestinal stem cell markers. (A) IF for DCLK1 (white) and P63 (red). P63+ cells express DCLK1 but are not like tuft cells (B) that are solitary cells with apical microvilli and devoid of P63; (C) IF for P63 (red) and CD142 (white). P63+ cells and the cells located at the apical side of P63+ cells express CD142, unlike ducts without P63+ cells (D); (E) IF for P63 (red) and OLFM4 (white). Ducts that contain P63+ cells secrete OLFM4 into their lumen (indicated with asterisk) and rarely contain OLFM4+ cells, unlike ducts that do not contain P63+ cells (F). IF, immunofluorescence.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    管道包含ΔNp63+细胞表达胃肠干细胞标记物。(A) IF为DCLK1(白色)和P63(红色)。P63+细胞表达DCLK1，但不像簇状细胞(B)，簇状细胞是具有顶端微绒毛的孤立细胞，不含P63;(C) IF为P63(红色)和CD142(白色)。P63+细胞和位于P63顶端侧的细胞+细胞表达CD142，不像导管没有P63+细胞(D);(E) IF为P63(红色)和OLFM4(白色)。含有P63的管道+细胞分泌OLFM4到它们的腔内(星号表示)，很少含有OLFM4+不像导管不含P63+细胞(F)。IF，免疫荧光。

    综上所述，含有胰腺基底细胞的导管在基底细胞中、并置细胞中或同时表达了一些GI干细胞标记物，提示基底细胞属于干细胞生态位。

    FLIP-IT允许在档案FFPE组织中对胰腺基底细胞进行3D可视化

    基底细胞的另一个显著特征和功能是固定在基底膜上。34为了使其可视化，需要使用高放大倍率和高数值孔径物镜进行3D成像，同时需要高度清除的样品和保持荧光强度。到目前为止，只有长时间共聚焦或双光子显微镜才能实现高倍倍率(≥20倍)的成像，从而限制了扫描能力，增加了扫描时间，并导致了广泛的光漂白。35 36

    因此，我们开发了一种基于十二烷基硫酸钠溶解缓冲液优化渗透和溶解的石蜡包被或完整组织(FLIP-IT)荧光薄片显微成像方案。对于折射率匹配，我们使用了CUBIC- r (CUBIC)和肉桂酸乙酯(ECi)的互补效应。FLIP-IT使我们能够评估FFPE和患者和小鼠的完整(新鲜)组织(图4一，在线补充图7和11)，从清理到成像的过程在不到2周的时间内完成，比已发表的方法快得多19(见也在线补充方法)．ECi还能将荧光信号保存数月。

    FLIP-IT allows 3D visualisation of pancreatic basal cells in archival FFPE tissue. (A) Overview of the FLIP-IT protocol for processing of human archival FFPE samples; (B) Overview 3D volume rendering of a large duct system (cyan) with P63+ cells (pink) in normal human pancreas. Objective 20×, zoom 0.36. Scale bar corresponds to 100 µm; (C) Z-plane clipping of B with KRT19 (cyan), P63 (pink) and laminin (green). Asterisk indicates reference structure in B. Objective 20×, zoom 0.36. Scale bar corresponds to 100 µm; (D) Overview 3D volume rendering of a dome positive for P63 (pink) in CP. Objective 20×, zoom 1. Scale bar corresponds to 100 µm. (D’) Inset from D. Yellow arrows indicate P63+ (pink) cells in contact with the basal membrane (orange). White arrows indicate P63+ cells not in contact with the basal membrane. Objective 20×, zoom 1. Scale bar corresponds to 20 µm. n≥2. CR-ECi, CUBIC-R-ethyl cinnamate; FFPE, formalin-fixed and paraffin-embedded; FLIP-IT, Fluorescence Light sheet microscopic Imaging of Paraffin-embedded or Intact Tissue; RI, Refractive Index; 3D, three-dimensional.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    FLIP-IT允许在档案FFPE组织中对胰腺基底细胞进行3D可视化。(A)用于处理人类档案FFPE样本的FLIP-IT协议概述;(B) P63大风管系统(青色)三维体绘制概览+正常人胰腺细胞(粉红色)。目标20倍，缩放0.36。比例尺对应100µm;(C)用KRT19(青色)、P63(粉红色)和层粘连蛋白(绿色)对B的z平面剪切。星号表示b中的参考结构。Objective 20×， zoom 0.36。比例尺对应100µm;(D) CP中呈P63阳性(粉红色)的圆顶三维体绘制概览。物镜20×，缩放1。比例尺对应100µm。(D’)从D插入黄色箭头表示P63+(粉红色)与基膜(橙色)接触的细胞。白色箭头表示P63+细胞不与基底膜接触。物镜20×，放大1。比例尺对应20µm。n≥2。CR-ECi, CUBIC-R-ethyl cinnamate;FFPE，福尔马林固定和石蜡包埋;石蜡包埋或完整组织的荧光薄片显微成像RI，折射率;3 d三维。

    罕见的P63+细胞可以在最小直径为20微米的导管内或以簇状附着在导管上(图4 b)．孤独的P63+细胞位于基板与大导管和P63的管腔细胞之间+簇也与基底层有关(图4 c)．相反，在CP中，KRT19+内腔周围形成多层细胞的圆顶，其中只有基本的P63+细胞接触基底膜(图4 D, D ')．

    由于P63和KRT5有重叠(图2 f)以及KRT5和KRT7的互斥表达，KRT5和KRT7都是细胞骨架标记，可以很好地欣赏细胞形态，3D图像渲染用于直接识别KRT5+KRT7- - - - - -基底细胞(在线补充视频1而且图5一个)．正常胰腺中圆形基底细胞的小团簇(n=4，每团1个)聚集在一个小管腔周围(图5 C, C ')．CP (n=2，各两拳)(在线补充视频1而且图5 b)，与囊管相关的大型圆顶状簇，在KRT5的3D总览渲染中已经很明显+细胞位于圆顶和KRT7的外侧+内腔内的细胞(图5 D, D ')．单细胞水平的三维球形度和体积测量表明，圆丘由更扁平的细胞组成，KRT5的细胞体积+细胞的CP (在线补充图8)．

    补充视频

    3D imaging of KRT5-positive basal cells in NHP and expansion as dome-like structures in CP. (A) Overview 3D rendering of NHP and (B) CP from FFPE blocks stained for KRT5 (pink) and KRT7 (cyan). Arrows indicate magnified regions in (C) and (D). Objective 20×, zoom 0.36. Scale bar corresponds to 500 µm; (C) HR-LSFM of a KRT5+ (pink) dome on a large KRT7+ (cyan) duct with lumen diameter 120 µm at its widest point in normal pancreas. Asterisk indicates lumen. Objective 20×, zoom 2.5. Scale bar corresponds to 20 µm; (D) HR-LSFM of dome wall showing its constitution in CP. Objective 20×, zoom 2.5. Scale bar corresponds to 20 µm; (C’) inset from C showing in detail the cellular structure of KRT5+ (pink) cells in NHP. Objective 20×, zoom 2.5. Scale bar corresponds to 5 µm; (D’) HR-LSFM of dome wall showing flat KRT5+ (pink) and KRT7+ (cyan) cells intercalated (yellow arrow) and KRT5+ (pink) cells lining the exterior of the dome wall. Asterisk indicates lumen. Objective 20×, zoom 2.5. Scale bar corresponds to 5 µm. n≥2. 3D, three-dimensionalCP, chronic pancreatitis; FFPE, formalin-fixed and paraffin-embedded; HR-LSFM, high-resolution light sheet fluorescence microscopy; NHP, normal human pancreas.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    NHP中KRT5阳性基底细胞的3D成像，CP中扩张为圆顶状结构。(A) NHP和(B) CP的3D渲染概述，来自KRT5(粉红色)和KRT7(青色)染色的FFPE块。箭头表示(C)和(D)中的放大区域。物镜20倍，放大0.36。比例尺对应500µm;(C) KRT5的HR-LSFM+大型KRT7上的圆顶(粉红色)+(青色)正常胰腺最宽处管腔直径120µm的导管。星号表示腔。物镜20倍，放大2.5。比例尺对应20µm;(D)穹顶墙的HR-LSFM在CP中显示其构成。物镜20×，放大2.5。比例尺对应20µm;(C’)来自C的插图，详细显示KRT5的细胞结构+(粉红色)NHP细胞。物镜20倍，放大2.5。比例尺对应5µm;(D’)圆顶墙的HR-LSFM显示平坦的KRT5+(粉色)和KRT7+(青色)细胞插层(黄色箭头)和KRT5+(粉红色)的细胞排列在圆顶墙的外部。星号表示腔。物镜20倍，放大2.5。比例尺对应5µm。n≥2。三维、三维cp、慢性胰腺炎;FFPE，福尔马林固定和石蜡包埋;HR-LSFM，高分辨率光片荧光显微镜;NHP，正常人胰腺。

    因此，利用一种广泛适用的新型成像方案FLIP-IT，我们在正常胰腺和CP中建立了导管树中单个胰腺基底细胞的空间分布和形态特征。

    ΔNp63表达在常用的胰腺疾病小鼠模型中检测不到，但可由SOX9的一个子集获得低管细胞

    我们重新评估了ΔNp63在成年小鼠胰腺中的表达，因为单细胞RNA测序研究没有提供其表达的证据(在线补充表3)．与小鼠乳腺和皮肤相比(在线补充图9)，即使在4×10上进行评估，胰腺中也检测不到ΔNp636人工智能(AI)辅助识别导管细胞，包括较大的导管，如主胰管和胆总管(在线补充图10)．ΔNp63数量的95% CI+每个样品的细胞范围从0到最大3.633031e-06年(元分析)或1.215163e-07年(Clopper-Pearson)。因此，我们没有理由假设ΔNp63+细胞存在于成年小鼠的胰腺中。如果是这样，它们的出现也非常有限，除非在分析非常大的样本量之后，否则无法推导出有意义的信息。同样，我们也没有找到ΔNp63+孕鼠、产后鼠、新生鼠及老年鼠的胰腺细胞(图6)．我们还分析了CP的实验模型，即青紫素治疗(治疗长达8周，治疗后分析长达14周)或导管结扎喀斯特WT小鼠和青色素治疗喀斯特G12D(KC)老鼠。37ΔNp63在这里和肿瘤中都无法检测到喀斯特而且Trp53突变KPC小鼠。37所有这些样本也均为KRT5和KRT14阴性(未显示)。整个小鼠胰腺的3D成像，包括主管(在线补充图11)证实KRT5不存在+细胞。此外,Krt14-eGFP小鼠通过GFP或KRT14染色未显示KRT14(皮肤呈阳性，未显示)。成年大鼠(n=7)和猪胰腺(n=3)均为阴性。

    ΔNp63 is induced in mouse pancreatic organoids but is undetectable in normal mouse pancreas and in mouse pancreatic disease models. (A) Table summarising mouse models used to investigate ΔNp63 expression using immunohistochemistry staining for ΔNp63, Krt14 and Krt5. Background strain is indicated for each separate mouse model. Number of mice analysed, and sections analysed per sample are indicated. (B) Representative flow cytometry plot of ductal cells isolated from Sox9:eGFP reporter mice, showing different levels of Sox9:eGFP expression that inversely correlate with the size of the ducts. (C) Bar plot indicates ΔNp63 mRNA levels normalised to Hprt of mouse ducts of different sizes (BD, big duct; MD, medium duct; SM, small duct) and organoids derived of the aforementioned ducts (organoids derived from BO, big ducts; MO, medium ducts; SO, small ducts). Error bars indicate SD of three independent experiments. (D) Representative immunofluorescence staining of p63 (green) and Sox9 (blue) of organoids derived from big to medium sized ducts. Nuclei are stained grey (DAPI). Scale bar=200 µm. mRNA, messenger RNA; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    ΔNp63在小鼠胰腺类器官中诱导，但在正常小鼠胰腺和小鼠胰腺疾病模型中检测不到。(A)使用免疫组化染色研究ΔNp63、Krt14和Krt5表达的小鼠模型的表摘要。背景应变指示为每个单独的小鼠模型。所分析的小鼠数量，以及每个样品所分析的切片。(B)分离的导管细胞的代表性流式细胞术图Sox9:eGFP报告小鼠，显示不同水平的Sox9:eGFP表达量与导管大小成反比。(C)柱状图表示ΔNp63mRNA水平正常化到产生Hprt不同大小的小鼠导管(BD，大导管;MD，中型风管;SM，小导管)和上述导管衍生的类器官(来自BO，大导管;MO，介质管道;所以，小管道)。误差条表示三个独立实验的标准差。(D)来自大到中型导管的类器官p63(绿色)和Sox9(蓝色)的代表性免疫荧光染色。细胞核呈灰色(DAPI)。比例尺=200µm。信使RNA; WT, wild type.

    我们接下来研究了有利于祖细胞样表型的类器官培养。我们使用导管细胞消化Sox9-eGFP报告小鼠。38这些制剂表现出内在的非均匀性SOX9表达，较大的导管表达较低(图6 b)．根据eGFP的表达量，与导管大小相对应，生成细胞片段。新分离的细胞片段都没有显示出来ΔNp63实时定量PCR表达(图6 c)，证实我们的组织学分析(图6)．类器官培养，SOX9细胞低中至大尺寸导管的血管内皮细胞表达上调ΔNp63（图6 c)，以及Krt5而且Krt14mRNA(未显示)基因表达。类器官全mount染色证实p63蛋白表达呈异质性，与SOX9最低水平或接近缺失相关(图6 d而且在线补充视频2)，让人联想到人类胰腺的研究结果。P63+5-乙基-2 ' -脱氧尿苷(EdU)标记(在线补充图12)．与p63不同，Krt5和14未检测到。因此，来自较大导管的类器官激活基础标记，但不完全获得基础表型。

    补充视频

    综上所述，正常成年小鼠胰腺和常用的CP、PDAC模型均未显示基底细胞。从较大的胰管中建立的类器官培养可以获得ΔNp63表达，表明胰管细胞分化具有可塑性。

    ΔNp63支持基础分化状态，同时抑制经典导管细胞身份

    HPDE细胞，从较大的人类胰管细胞中获得，39快递ΔNp63 (在线补充图13A,C)，至今未有报导。TAp63也有表达，但表达水平较低(未显示)。因此，HPDE细胞为破译ΔNp63在胰管细胞中的作用提供了一个有用的代理。四种不同的小干扰rna (siRNAs)对ΔNp63 (在线补充图13B)，其中针对ΔN亚型的抗体在蛋白质水平上得到验证(在线补充图13C)．KD实验RNAseq分析显示1593个差异表达基因(在线补充表4)．其中,TP63另有748个基因下调，844个基因上调(图7)．顶部上调基因的特征MUC1而且PADI2，已知胰管细胞基因，40还有一些内分泌基因。KEGG通路“细胞周期”和“Hippo信号通路”的下调基因富集，与报道的ΔNp63和基底细胞的作用一致，4 41 42而上调基因的特征是“细胞因子-细胞因子受体相互作用”和“代谢途径”。旁边MUC1、其他导管细胞基因等SOX9出现上调而基底细胞基因下调(图7 c, D)，免疫荧光染色和qRT-PCR证实了这一点，并验证了其他siRNAs (图7 e, F而且在线补充图13D)．小鼠导管类器官中ΔNp63的KD证实了SOX9、HNF1B和KRT19在一定程度上的上调，特别是在中型导管类器官中(在线补充图13E)．最后，为了确认ΔNp63与基础基因表达和“经典”导管细胞基因抑制的关系，我们评估了PAMG评分。结果表明，ΔNp63 KD后，细胞从基底样表型转变为经典表型(图7 g)．这些发现强调了ΔNp63在PDAC中所描述的作用3.也适用于正常的导管细胞。

    ΔNp63 maintains a basal cell differentiation state while repressing duct cell identity. (A) Volcano plot and (B) KEGG pathway analysis of differentially expressed genes after KD of ΔNp63+ in HPDE cells (n=3, p<0.01 and FDR<0.01). In orange, the pathways represented by downregulated genes, in purple those from the upregulated genes. (C) Volcano plot of basal and (D) of ductal markers in the same RNAseq data. (E) Confirmation of basal (P63 and KRT5) and classical ductal marker KRT19 by immunofluorescence staining and (F) quantitative RT-PCR (*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001). (G) Correlation of PAMG scores in ΔNp63 KD (purple) and control (orange) HPDE samples (R =–0,95, p=0.0032). FDR, false discovery rate; KD, knockdown; PAMG, Pancreatic Adenocarcinoma Molecular Gradient.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    ΔNp63维持基底细胞分化状态，同时抑制导管细胞同一性。(A) ΔNp63 KD后差异表达基因的火山图和(B) KEGG通路分析+(n=3, p<0.01, FDR<0.01)。橙色为下调基因表达的通路，紫色为上调基因表达的通路。(C)同一RNAseq资料下基底火山图和(D)导管标记火山图。(E)通过免疫荧光染色和(F)定量RT-PCR确认基础(P63和KRT5)和经典导管标记KRT19 (*p<0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001)。(G) ΔNp63 KD(紫色)和对照(橙色)HPDE样本中PAMG评分的相关性(R = - 0,95, p=0.0032)。FDR，错误发现率;KD,击倒; PAMG, Pancreatic Adenocarcinoma Molecular Gradient.

    我们得出结论，ΔNp63在抑制上皮细胞分化的已知主调节功能的同时，也抑制了胰管细胞分化，有利于基础分化程序。

    讨论

    尽管人们一致认为PDAC存在一个由ΔNp63驱动的类碱基分子亚型，3.人们普遍认为ΔNp63-expressing细胞不存在于健康的人类和小鼠胰腺中。3月8日在这里，我们提供了令人信服的证据ΔNp63+无胰腺疾病史的个体胰腺细胞群。缺乏与社会人口学和临床参数的关联表明，这种细胞命运是正常胰腺分化的组成特征。

    ΔNp63的位置+KRT5、KRT14和S100A2的表达表明它们是其他上皮组织基底细胞的对应物。与气道基底细胞一样，它们要么是KRT14+或KRT14- - - - - -，而他们都是KRT5+．43KRT5和KRT14在人类胰腺中有报道44少于5%的导管细胞，与我们的发现相一致。使用透射电子显微镜的研究报告了人类和大鼠胰腺中基本定位的细胞类型，这被认为是新的导管细胞的来源。45 46以往的研究可能由于缺乏大量正常胰腺标本而受到限制。总而言之，我们的研究结果要求重新评估经典组织学教科书中确立的胰管是均匀的“简单上皮细胞”的概念。

    的ΔNp63+胰腺基底细胞位于导管树，表达KRT1944-47但CA19.9、SOX9和HNF1B的整体缺失表明这些细胞是一种新的胰管细胞类型。单细胞RNA测序(scRNAseq)未能提供证据。最近一篇关于人类导管细胞异质性的论文48未报告基底细胞特征，可能是因为只有ALK3+对基底细胞进行了分析，ALK3本身在基底细胞中未见报道。24人胰腺的其他碎屑49个50也没有收到(ΔN)p63。ΔNp63的稀有性+细胞，它们沿导管树的限制性分布和当前scRNAseq的浅层可能解释了这一点。在一个数据集中，我们检测到罕见的ΔNp63+2型糖尿病患者的细胞，51重申他们在疾病方面的存在有所增加。

    我们建立了一个3D成像管道，第一次允许评估立方毫米的临床样本或整个小鼠胰腺。使用档案样本的FLIP-IT，我们可视化了导管树，并确认了导管中存在罕见的基底细胞，最小直径为20µm。在CP中，这些细胞以不同的方式组织为更大的多层圆顶结构，可以达到立方毫米级的尺寸。因此，FLIP-IT允许前所未有的3D细胞染色的选择标记，赋予研究人员关于(胰腺)组织病理学的丰富信息。我们设想，这种新方法也可以告知确切的定位，例如，基质细胞类型与肿瘤上皮。

    与人类组织相反，我们未能在成年小鼠胰腺中检测到任何基底细胞，包括其他器官激活基底细胞群的几种疾病模型。52 53考虑到Sox9在人类胰腺基底细胞中是罕见的，我们根据小鼠胰管细胞可变的Sox9表达来评估它们。的确，只有在培养Sox9的时候低在干细胞有利的类器官条件下，导管细胞ΔNp63表达被诱导。这说明了导管细胞的内在潜力，以打开基底细胞表型。然而，我们的数据表明，在使用小鼠组织时，已发表的工作可能遗漏了这种重要的细胞类型。如果基底细胞存在于小鼠体内，使用Sox9而且Hnf1b因为cree -drivers可能不是足够的模型。Krt19-Cre可能更适合，因为所有的胰腺基底细胞，至少在人类中，都表达KRT19。

    我们的发现为研究胰腺基底细胞在稳态和疾病中的作用提供了依据。胰腺干细胞一直存在争议，并且主要是在β细胞再生的背景下进行研究。只有在大量组织损伤后，(兼性)干细胞才会被激活。54可以想象，基底细胞将是一种不同的“最后手段”干细胞，类似于皮肤和肠道，不同类型的干细胞居住在有限的生态位中。在胰腺中，这个小生境似乎表达GI干细胞的标记。对于这些细胞来说，通常在正常的生理条件下，它们的全部潜能不会被充分发挥出来，只有在特定的条件下，它们才能被吸收。55类器官培养条件可能会引起这种反应。有趣的是,SOX9- - - - - -导管树中的细胞似乎有助于产生新的β细胞56sox9剂量效应调节成人导管细胞的身份。57我们发现在HPDE中ΔNp63调节的导管细胞可塑性更广泛，其中ΔNp63以牺牲分化的导管细胞标记物为代价，支持基底细胞命运，包括但不限于抑制SOX9。ΔNp63在HPDE中的表达是否由于细胞起源是基底细胞或通过细胞的永生化和失活而获得仍然是推测的TP53．

    我们证明胰腺基底细胞在CP中更丰富，这表明它对其发病机制有积极的贡献。由于增殖率非常低，并且意识到上面讨论的导管细胞可塑性，我们的数据表明，这种增加是由于细胞分化的改变，而不是先前存在的基底细胞的增殖。疾病的早期样本将有助于这种研究，但缺乏。在没有小鼠模型的情况下，开发人体模型系统，例如使用从成人胰腺纯化的基底细胞，将非常有价值。

    一个明显的知识鸿沟是PDAC亚型的发展。它们的个体发育和可塑性可能是由致癌突变和环境压力驱动的，但也可能是细胞的起源。小鼠胰腺腺泡和导管细胞可产生肿瘤1 58不同的PDAC表型与起源细胞共享特征，其中导管细胞的epi遗传特征保留在更具侵袭性的基础亚型中。59 60我们的研究结果要求考虑基底细胞的作用。ΔNp63与SOX9表达的负相关也让我们想起了我们之前的工作，基础亚型的SOX9表达最低。61我们现在添加了ΔNp63不能取代基础基因表达签名，这与Notta的研究一致，其中ΔNp63和其他基底细胞标记物仅限于与不良预后无关的基底样a肿瘤的较小子集。更好地了解基底细胞可能会在这个问题上提供关键的见解。Chan-Seng-Yue5和Miyabayashi等62指出了一些经典PDAC演化为基础表型。人们可以推测，由基底细胞产生或包含基底细胞的肿瘤比由已分化的细胞产生的肿瘤具有更大的从经典细胞向基底细胞转变的分化潜力。

    鉴于我们对胰腺基底细胞的发现、在其他组织中已确定的基底细胞作用以及在常用小鼠实验模型中不存在基底细胞，我们的观察迫使我们重新解释胰腺疾病的细胞发病机制。

    数据可用性声明

    如有合理要求，可提供资料。所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。所有相关资料可联系通讯作者索取。

    伦理语句

    患者发表同意书

    伦理批准

    细胞分化实验室的小鼠实验获得了伦理批准(16-277-1 (LA1230277))。根据ID 2019/UCL/MD/005，德杜夫研究所的小鼠实验获得了伦理批准。匹兹堡大学医学中心的小鼠实验获得了ID 18022411的伦理批准。

    致谢

    我们要感谢VIB-UGent的炎症研究中心提供的转基因小鼠胰腺模型，细胞分化实验室提供的新生小鼠切片及其抗体的使用，β细胞新生实验室提供的PDL小鼠切片以及生殖和遗传学实验室使用的抗体。我们感谢贝塔细胞银行和布鲁塞尔UZ中央生物银行提供的人体样本。通过VIB Nucleomics Core (www.nucleomics.be)进行测序和分析。我们感谢Suzanne Blotwijk的高级统计分析。

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    补充材料

    脚注

    • SM、KC和MVB是共同第一作者。

    • 推特@SamadELKA, @TxellRovira

    • SM、KC和MVB的贡献相当。

    • JC和AFR的贡献相当。

    • 贡献者本研究由SM、KC、MVB、MR和IR概念化和设计。SM、KC、MVB、TA、AFR、JC、AEK、HM、YH、GL、DLDP、ND’h、CB、MR进行实验、数据收集和解释。FE、HH、LB、PJ、PiV、ND、J-LVL、WW、PL、FXR和MR提供了智力输入和重要样本。SM, KC和IR撰写了手稿，所有作者都编辑了手稿。KC、SM和MVB对本文的贡献相同。JC和AFR对本文也有同样的贡献。

    • 资金LMMO实验室的工作得到了Stichting tegen Kanker转化和临床研究基金2018 #2092的支持。IR是佛兰德斯研究基金会(FWO)奥德修斯I奖学金的获得者。MVB由布鲁塞尔自由大学癌症研究肿瘤中心资助，由已故Esther Desmedt女士和Irma女士Noëand和布鲁塞尔UZ的Wetenschappelijk Fonds Willy Gepts的遗赠资助。KC是FWO博士奖学金(授予号1157221N)的获得者。FXR实验室的工作部分得到了来自Ministerio de Ciencia e Innovación(西班牙马德里)(由ERDF-EU共同资助)的RTI2018-101071-B-I00赠款的支持。CNIO由Ministerio de Ciencia, Innovación和Universidades作为Severo Ochoa SEV-2015-0510卓越中心支持。M.R、A.F和J.C研究得到了RYC-2017-21950 (AEI/EFS,UE)和SAF2015-73226-JIN (AEI/FEDER, UE)的支持。我们感谢CIBER-BBN和CERCA计划/ Generalitat de Catalunya对IDIBELL的机构支持。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。

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