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摘要gydF4y2Ba
客观的gydF4y2Ba瘤内异质性驱动癌症进展和治疗耐药性。然而，还没有确定癌症细胞的亚群是否和如何相互作用，以及这种相互作用如何影响肿瘤。gydF4y2Ba
设计gydF4y2Ba我们研究了细胞外囊泡(EVs)在癌症细胞亚群之间的自发流动:癌症干细胞(CSC)和非干细胞(NSCC)。为了确定最常见的交流途径的生物学意义，我们使用了胰腺导管腺癌(PDAC)原位模型、患者来源的异种移植(PDXs)和基因工程小鼠模型(GEMMs)。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba我们证明了PDAC肿瘤使用EVs(称为EVNet)在肿瘤细胞亚群之间建立了一个有组织的通信网络。EVNet是塑料的，可以根据环境进行调整。EVNet内的通信优先发生在CSC到NSCC之间。在原位异位造影、GEMMs和PDXs中，通过损害Rab27a功能来抑制这一通信路线足以阻碍肿瘤生长，并在整个肿瘤中复制通信抑制。从机制上，我们提供了证据，CSC ev使用agin蛋白通过LDL受体相关蛋白4 (LRP-4)促进Yes1相关转录调控因子(YAP)的激活。体外抗agrin处理PDXs显著损害增殖和降低激活的YAP水平。gydF4y2Ba
高水平agin和低活性YAP的患者无病生存期较差。此外，循环agrin数量较高的患者gydF4y2Ba+gydF4y2Baev显示疾病进展风险显著增加。gydF4y2Ba
结论gydF4y2BaPDAC肿瘤建立了一个由CSC和agrin领导的EVs介导的合作网络，使肿瘤适应并茁壮成长。靶向agrin可以使PDAC患者的靶向治疗成为可能，并对CSC有显著影响，CSC为肿瘤提供营养，是治疗耐药的中心。gydF4y2Ba
- 胰腺癌gydF4y2Ba
- 细胞生物学gydF4y2Ba
- 致癌作用gydF4y2Ba
- 分子致癌作用gydF4y2Ba
数据可用性声明gydF4y2Ba
数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE保存到ProteomeXchange联盟gydF4y2Ba84年,85年gydF4y2Ba使用数据集标识符PXD023529和10.6019/PXD023529的伙伴存储库。所有重新生成数据对齐和统计分析的代码都可以在GitHub仓库(GitHub, RRID:SCR_002630，gydF4y2Bahttps://github.com/fjcamlab/exonet_MSgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
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来自Altmetric.com的统计gydF4y2Ba
本研究的意义gydF4y2Ba
关于这个问题，我们已经知道了什么?gydF4y2Ba
肿瘤内异质性是胰腺导管腺癌(PDAC)肿瘤的一个特征，导致其预后不佳。gydF4y2Ba
癌细胞亚群之间的合作被认为可以促进疾病进展和治疗耐药性。gydF4y2Ba
癌细胞通过ev与肿瘤微环境细胞和远处器官进行通信，支持肿瘤的进展。gydF4y2Ba
新的发现是什么?gydF4y2Ba
来自PDAC细胞亚群的ev建立了一个有组织的通信网络，胰腺癌干细胞的细胞外囊泡领导了一个瘤内通信网络(EVNet)，这赋予了肿瘤的可塑性，并支持肿瘤的发展。gydF4y2Ba
从癌症干细胞(CSC)到非干细胞的通信激活PDAC肿瘤中的YAP，并推动疾病进展。从机制上，我们发现CSC EVs中的agrin通过LRP-4受体激活PDAC肿瘤中的YAP。gydF4y2Ba
通过Rab27a或agrin抑制靶向EVNet和CSC EVs会损害PDAC肿瘤的生长。gydF4y2Ba
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?gydF4y2Ba
循环的agin阳性ev是确定治疗反应和PDAC进展风险的潜在生物标志物。gydF4y2Ba
我们的研究结果表明，抗agrin治疗可以靶向CSC，从而显著影响肿瘤进展和治疗耐药性，从而为PDAC患者提供靶向治疗的可能性。gydF4y2Ba
简介gydF4y2Ba
肿瘤内异质性被认为是胰腺导管腺癌(PDAC)进展和治疗耐药的主要驱动因素之一。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba基因组、非基因组和功能细胞状态的异质性导致了不同的癌细胞行为，是癌症治疗的主要障碍之一。PDAC异质性的证据表明，不同细胞表面分子的存在定义了具有不同致瘤能力的癌细胞亚群。gydF4y2Ba2 3gydF4y2Ba特别是，胰腺癌干细胞(CSC)以特异性表面标记的表达为特征，并与PDAC的不良预后相关。gydF4y2Ba4个5gydF4y2BaCD24、CD44、CD133和EpCAM鉴定了胰腺癌中具有明显致瘤能力的亚群。gydF4y2Ba2 3gydF4y2Ba据推测，肿瘤细胞亚群之间的合作对于维持异质性和增强肿瘤促进功能至关重要。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba然而，这种合作是如何进行的尚不清楚。gydF4y2Ba
细胞外囊泡(EVs)是细胞间通讯的中心介质。gydF4y2Ba7 8gydF4y2Baev由所有类型的细胞分泌，可在所有体液中找到。gydF4y2Ba9gydF4y2Baev利用其基因和分子载体对受体细胞进行重编程。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba特别是癌症ev促进癌症相关成纤维细胞(CAFs)的分化，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba增强血管生成,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba调节抗肿瘤免疫反应gydF4y2Ba13gydF4y2Ba建立转移前利基gydF4y2Ba14日15gydF4y2Ba并赋予非转移性癌细胞转移性。gydF4y2Ba16日17gydF4y2Ba然而，ev在具有不同表型和肿瘤形成能力的肿瘤细胞亚群之间的交换尚未得到解决。gydF4y2Ba
我们的报告首次揭示了由CSC ev主导的有组织的通信网络，并展示了它在肿瘤生物学中的意义。我们发现，这种沟通是肿瘤内部合作的一个基本过程，并有助于其可塑性和对治疗的耐药性。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
PDAC细胞的亚群利用ev形成一个有组织的通信网络，即EVNet，优先的通信路径发生在CSC到NSCC之间gydF4y2Ba
为了确定癌症ev是否以及如何在PDAC细胞亚群之间流动，我们开发了一种跟踪系统，使用带有不同荧光报告器的ev标记。在人PDAC细胞系(MIA PaCa-2)中建立了与报告蛋白(turboGFP, tdTomato, eYFP和mPlum)融合的荧光标记稳定克隆文库，表达EVs中高度表达的标记(CD63, CD81, CD82或Rab5)。gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)．利用成像流式细胞术，我们证明了从人胰腺癌细胞系分离的EVs，包括MIA PaCa-2，对CD63, CD81, CD82和Rab5 (gydF4y2Ba在线补充图1AgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
PDAC EVNet中最频繁的通信路由发生在CSC到NSCC之间。(A)方法示意图:表达不同荧光标记标记的MIA PaCa-2克隆按照亲代细胞系中发现的百分比进行培养，并通过流式细胞术进行分析，以跟踪ev在亚群中的流动。共分析了7个颜色编码亚群体的混合，对应于5个不同的混合。亚种群:CD24gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba指CD24gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD133gydF4y2Ba−gydF4y2BaEpCAMgydF4y2Ba−gydF4y2Ba；CD133 +指的是CD133gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD24gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba−gydF4y2BaEpCAMgydF4y2Ba−gydF4y2Ba；CD24gydF4y2Ba-gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba指CD24gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD133gydF4y2Ba−gydF4y2BaEpCAMgydF4y2Ba−gydF4y2Ba；4N指CD24gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD133gydF4y2Ba−gydF4y2BaEpCAMgydF4y2Ba−gydF4y2Ba．(B)培养72小时MIA PaCa-2彩色编码亚群(CD133gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD63-GFP, CD24gydF4y2Ba+gydF4y2Ba44gydF4y2Ba+gydF4y2BaRab5-mPlum, CD24gydF4y2Ba-gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD82-eYFP和4N CD81-tdTomato)。右图:未检测到ev摄取的细胞的代表性图像(单阳性)，从一个不同亚群体接收ev的细胞(双阳性)，从另外两个亚群体接收ev的细胞(三阳性)或从所有四个亚群体接收ev的细胞(四阳性)。比例条从左到右分别为20、10、10µm。(C)点图表示共培养中单阳性、双阳性、三阳性和四阳性细胞的百分比(n=7, Mann-Whitney检验***p<0.001)。(D)定量从CD133获得ev的细胞百分比gydF4y2Ba+gydF4y2Ba, CD24gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba, CD24gydF4y2Ba−gydF4y2Ba44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和4N个亚群体(n=7，单因素方差分析(ANOVA) *p<0.05， **p<0.01， ****p<0.0001)。(E)从CSC或NSCC接收ev的不同亚群细胞的量化(上图突出显示)。折叠变化是根据在每个共培养中发现的最小交流百分比计算的(n=7)。(F)接受ev的细胞百分比的量化(左)和EVNet中从CSC到NSCC的最频繁通信路线的示意图表示(右，CSC阳性的NSCC ev和NSCC阳性的CSC ev的比较;n=7，曼-惠特尼检验，*p=0.0379)。数据意味着±SEM。CSC，癌症干细胞;电动汽车,细胞外囊泡;EVNet:胰腺癌干细胞胞外囊泡引导肿瘤内通讯网络NSCC，非干细胞; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma.
基于细胞表面标记，我们已经在PDAC细胞系(n=4)、患者来源的异种移植(PDXs n=5)和基因工程小鼠模型(GEMM，gydF4y2Ba在线补充图1B-DgydF4y2Ba)．CD133gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD24gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba两个细胞都识别出两种罕见的亚群体，称为CSC。gydF4y2Ba2 3gydF4y2Ba第三和第四个亚群是CD24gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和4 n (CD133gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD24gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba−gydF4y2BaEpCAMgydF4y2Ba−gydF4y2Ba)，它们代表最丰富的亚群体，并识别NSCC。我们使用球形形成试验确认了它们的CSC和NSCC表型，结果表明CSC与NSCC相比具有显著增强的球形形成能力(gydF4y2Ba在线补充图1EgydF4y2Ba)．重要的是，在使用的不同模型中，CSC与NSCC的比例是一致的(MIA PaCa-2: CSC 3.81%和NSCC 93.08%， PDX: CSC 0.98%和NSCC 99.37%， KPC (gydF4y2BaLSL-KrasgydF4y2BaG12D / +gydF4y2Ba，gydF4y2BaLSL-Tp53gydF4y2BaR172H / +gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPdx-1-CregydF4y2Ba): CSC 2.21%， NSCC 97.49%;gydF4y2Ba在线补充图1BCDgydF4y2Ba)．此外，用于评估ev在不同亚群间流动的稳定克隆中CSC和NSCC的频率与亲代细胞系相比没有显著差异(gydF4y2Ba在线补充图1FgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
我们使用荧光激活细胞分选(FACS)分离出一个特定的细胞亚群(CD133)gydF4y2Ba+gydF4y2Ba, CD24gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba, CD24gydF4y2Ba-gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba或4N)从每个稳定的彩色编码克隆(MIA PaCa-2 CD63-GFP, CD81-tdTomato, CD82-eYFP和Rab5-mPlum;gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)．每个亚种群会分泌不同颜色的ev (gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)．为了混合亚群并追踪它们之间ev的流动，我们以在亲代细胞系中发现的相同百分比将它们重新培养在一起，总共进行了7次实验(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)．培养72小时后共聚焦成像分析(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)显示69.56%±11.92%的细胞对其他亚群的ev呈阳性，说明肿瘤ev在亚群之间自发流动(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)．大多数细胞从一个或两个其他亚群(分别为双阳性或三阳性细胞;gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在线补充图1GgydF4y2Ba)．从其他亚群(四倍阳性)接受ev的细胞稀少(6.57%±7.82%);gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在线补充图1GgydF4y2Ba)．来自CD133的ev阳性受体细胞的百分比gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD24gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba亚群(CSC)明显高于CD24 EVs阳性细胞gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和4N个亚群体(NSCC，gydF4y2Ba图1 d-fgydF4y2Ba)．这与EVs标记或用于标记这些亚群体的荧光蛋白无关。因此，与与CSC的交流相比，EVs从CSC流向NSCC构成了PDAC细胞亚群之间最频繁的交流路径，并且在两个亚群内(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
我们接下来测试了每个亚群体的EVs分泌率是否可以解释EVNet的方向性和从CSC到NSCC的通信路线的优势。为此，我们通过纳米粒子跟踪分析(NTA)对从每个亚群体中分离出来的ev进行了量化。我们证明CSC每个细胞比4N亚群体分泌更多的ev (gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)．尽管这可能在一定程度上有助于观察到从CSC到NSCC的通信路径，但值得注意的是，每个细胞分泌的ev数量的差异没有达到2.5倍的增加(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)．与此形成鲜明对比的是，cscc约占细胞总数的3.81%，而NSCC最常见(93.08%，gydF4y2Ba在线补充图1BgydF4y2Ba)．因此，每个细胞分泌的ev数量并不能解释从CSC到NSCC的ev流动的方向性。gydF4y2Ba
电动汽车网络是一种有组织的、可塑的电动汽车通信网络。(A)通过NTA测量MIA PaCa-2亚群分泌的粒子数量(n=3，单向方差分析;* p < 0.05)。(B)实验设置(左):用荧光微珠处理MIA PaCa-2亚群体，并通过流式细胞术进行分析。对吸收荧光微珠的亚种群百分比的量化(右，n=3，单因素方差分析;* * * * * p < 0.01, p < 0.001)。(C)用1,1'-二十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基碳菁高氯酸盐(DiL)标记的EVs处理CSC和NSCC的代表性延时图像(上)。图表描述了相对于0时间点的平均荧光强度的折叠变化(底部，每组n=5张图像，双向方差分析;* * p = 0.0037)。(D) MIA PaCa-2细胞和彩色编码亚群在缺氧条件下培养72小时(1% OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba左)或吉西他滨处理(1 μ M，右)。较大板上的比例尺为50 μ m，较小板上的比例尺为10 μ m。(E)缺氧条件下MIA PaCa-2培养中单阳性、双阳性、三阳性和四阳性细胞百分比的定量(1% OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba, n = 3;单向方差分析;* * * * * p < 0.01, p < 0.0001)。(F)在缺氧条件下肿瘤细胞亚群之间建立的通信网络的各自图形表示。从CSC到NSCC的最频繁的通信路由与EVNet中的相同路由相比具有显著性(Mann-Whitney检验，*p=0.0167)。(G)吉西他滨处理MIA PaCa-2培养物中单阳性、双阳性、三阳性和四阳性细胞百分比的定量(1 μ M, n=3)和(H)吉西他滨处理下肿瘤细胞亚群之间建立的通信网络的分别图形表示。与EVNet中相同的通信路线相比，NSCC的两个亚种群之间的通信路线最为频繁(Mann-Whitney检验，*p=0.0333)。数据意味着±SEM。方差分析，方差分析;CSC，癌症干细胞; EVs, extracellular vesicles; EVNet, Extracellular Vesicles from Pancreatic Cancer Stem Cells Lead an Intratumor Communication Network; FACS, fluorescence activated cell sorting; NSCC, non-stem cancer cell; NTA, nanoparticle tracking analysis.
然后，我们试图确定观察到的交流途径是否依赖于每个亚群体对内吞乳糖ev的内在能力。我们用荧光聚苯乙烯羧基功能化微珠(平均直径100 nm，gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)．流式细胞术分析表明，CSC亚群体的纳米颗粒吸收率高于NSCC (gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)．这表明所观察到的EVNet也不依赖于每个亚群体的内源性内吞能力。此外，利用延时显微镜，我们证明了NSCC处理的ev降解速率明显快于CSC (gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)．因此，观察到的通信路径也不太可能依赖于CSC和NSCC对ev降解速率的差异。gydF4y2Ba
综合来看，我们的数据表明不同的PDAC亚群体使用电动汽车建立了一个有组织的通信网络，即EVNet。在EVNet中，CSC和NSCC之间的交流更为频繁。EVNet中的通信途径不取决于分泌ev的数量、它们在受体细胞中的降解率或PDAC细胞各亚群的内吞能力，因此，这表明这是一个受调控的过程。gydF4y2Ba
EVNet是塑料的，支持癌细胞适应微环境的变化gydF4y2Ba
异质性在肿瘤的可塑性中起着关键作用，这在肿瘤对微环境变化的响应和治疗中至关重要。我们试图确定EVNet是否可以构成一种机制，通过这种机制，肿瘤可以迅速有效地适应其环境的变化，如缺氧(常见于PDAC)gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)和化疗。我们发现，缺氧显著增加了癌细胞之间的交流(gydF4y2Ba图2 d, EgydF4y2Ba)．单株阳性细胞(未接受ev的细胞，30.44±11.92% ~ 4.72±5.37%)明显减少，四株阳性细胞数量明显增加(6.57%±7.82% ~ 66.04±10.64%);gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba)与EVNet比较。这种交流的增加可能是由于EV的分泌增强，这可以通过暴露于缺氧后EV制剂中EV标记CD81、CD9和syntenin-1水平的增加来证明(gydF4y2Ba在线补充图2AgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
随着整体通信的增加，CSC - NSCC仍然是最主要的通信轴，参与这一通信路线的电动汽车数量显著增加(gydF4y2Ba图2 fgydF4y2Ba)．相反，尽管吉西他滨对交换ev的癌细胞的百分比没有产生显著的改变(gydF4y2Ba图2 d、GgydF4y2Ba)， EVNet经历了重塑，现在最频繁的通信路线发生在NSCC的亚群之间(CD24)gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和4N)，与EVNet中的相同路由相比，频率显著增加(gydF4y2Ba图2 hgydF4y2Ba)．此外，吉西他滨处理的细胞占用更多的珠粒(gydF4y2Ba在线补充图2BgydF4y2Ba)，这表明细胞的渗透性更强。因此，通信路由可以不那么具体。gydF4y2Ba
为了进一步了解EVNet在适应微环境变化中的作用，我们建立了表达强力环素诱导(Tet-On)短发夹的MIA PaCa-2细胞系的稳定克隆，该发夹靶向Rab27a。Rab27a是一个小的GTPase，参与了内体起源的囊泡的胞吐。gydF4y2Ba19gydF4y2BaWestern blot验证了Rab27a的下调，使用了Tet-On系统(gydF4y2Ba在线补充图2CgydF4y2Ba)．与之前的报告一致，gydF4y2Ba20 21gydF4y2BaNTA分析表明，下调Rab27a (gydF4y2Ba在线补充图2DgydF4y2Ba)．在我们的模型中，为了控制Rab27a下调与囊泡无关的成分分泌的影响，我们使用细胞因子阵列来评估42种蛋白质的分泌水平。我们观察到，在Rab27a下调的情况下，分析的42种蛋白质没有显著差异(gydF4y2Ba在线补充图2EgydF4y2Ba)．为了确定ev在癌细胞适应缺氧和吉西他滨治疗中的可能作用，我们在两种条件下的细胞中进行了Rab27a敲除，并检查了细胞死亡。我们证明，Rab27a敲低和ev分泌受损的癌细胞对这两种情况明显更加敏感，这反映在细胞死亡的显著增加上。这表明ev有助于癌细胞的适应和潜在的治疗耐药性(gydF4y2Ba在线补充图2FGgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
综上所述，我们提供了EVNet在癌症中的证据，并确定了从CSC到NSCC的通信路径是PDAC中最常见的。最重要的是，我们证明了EVNet是可塑的，当面临不同的环境挑战时，它可以改变通信速率或其路由。gydF4y2Ba
抑制Rab27A会损害PDAC的进展gydF4y2Ba
我们接下来的目标是了解EVNet在PDAC中的生物学意义。为此，将MIA PaCa-2 Tet-On shRab27a细胞原位植入免疫缺陷小鼠(Rag2gydF4y2Ba−−/gydF4y2BaIl2rggydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba)和多西环素在食物颗粒中(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)．经多西环素治疗的小鼠(n=8)显示肿瘤生长明显下降，超声监测到这一点，与对照组相比，肝脏大转移的数量显著减少(n=7;gydF4y2Ba图3 b, CgydF4y2Ba,gydF4y2Ba在线补充图3gydF4y2Ba)．我们没有观察到两组肿瘤在组织学上的差异，组织学上证实了肝转移(gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba)．通过免疫组化(IHC)，我们证实了强力环素喂养的MIA PaCa-2 Tet-On shRab27a小鼠的肿瘤有明显的Rab27a下调(gydF4y2Ba在线补充图3BgydF4y2Ba)．为了控制我们分析中多西环素的潜在影响，我们在免疫缺陷小鼠的胰腺中原位植入MIA PaCa-2 Tet-On shScramble细胞(对照组n=6，多西环素组n=6)，并证明多西环素不影响肿瘤生长和转移能力，从而证实我们的结果与多西环素无关(gydF4y2Ba在线补充图3CDgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
在PDAC原位、GEMM和PDX模型中，EVNet的损伤阻碍了肿瘤的生长。(A)实验布局:为了破坏肿瘤EVs的分泌，将强力环素诱导的抗Rab27A shRNA转染到MIA PaCa-2细胞中，然后将其原位植入Rag2的胰腺中gydF4y2Ba−−/gydF4y2BaIl2rggydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠。(B)多西环素治疗的MIA PaCa-2 Tet-On shRab27a肿瘤(n=8)和对照组(n= 7，双向方差分析;* * * p < 0.001)。(C)多西环素处理的MIA PaCa-2 Tet-On shRab27a模型(n=8)和对照组(n=7)肝脏大转移定量和代表性照片(Mann-Whitney检验，*p<0.05)。(D)原位MIA PaCa-2 Tet-On shRab27a肿瘤(左，放大插图)和肝转移瘤(右，虚线)经多西环素治疗和对照组的代表性H&E染色。(E)在16周龄时，当肿瘤成熟并在人道终点处死时，用Nexinhib20 (20 mg/kg)或二甲亚砜(DMSO)(5%)治疗的KPC小鼠的实验大纲。每周两次腹腔内注射治疗。(F) Nexinhib20治疗的KPC小鼠(n=4)与DMSO 5% (n=6)的总生存率Kaplan-Meier曲线(log-rank mantell - cox检验，*p=0.0217)。(G)小鼠胰腺原位注射与Nexinhib20 (20 mg/kg)或DMSO(5%)处理的PDX的实验布局，每周两次。在肿瘤植入后7.5周开始治疗，4周后，在肿瘤植入后11.5周处死小鼠。 (H) Tumour growth curve of PDX pancreas orthotopic tumours measured by ultrasound treated with Nexinhib20 (n=6) or DMSO 5% (n=6) and representative photos of tumours at the time of euthanasia (two-way ANOVA; **p<0.01, ****p<0.0001). Arrows depict timepoints where treatment was started (7.5 weeks). Scale bar: 10 mm. Data are mean±SEM. ANOVA, analysis of variance; EVs, extracellular vesicles; EVNet, Extracellular Vesicles from Pancreatic Cancer Stem Cells Lead an Intratumor Communication Network; GEMM, genetically engineered mouse model; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; PDX, patient-derived xenograft; TRE, tetracycline response element.
接下来，我们在PDAC GEMM KPC中破坏ev的分泌，它忠实地再现了人类疾病的组织病理学，在一个原位PDX模型(gydF4y2Ba图3 e, GgydF4y2Ba)．两种模型均用Rab27a的特异性小分子抑制剂Nexinhib20处理。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba与对照组(DMSO 5%， n=6;gydF4y2Ba图3 fgydF4y2Ba)．重要的是，与对照组相比，Nexinhib20治疗原位PDXs也显著降低了肿瘤生长(DMSO 5%， n=6;gydF4y2Ba图3 hgydF4y2Ba)．原位植入PDXs上的抗人类MUC1的组织学分析和免疫组化证实它们是人类起源的PDAC肿瘤(gydF4y2Ba在线补充图4AgydF4y2Ba左面板)。来自小鼠Panc02胰腺癌细胞系的肿瘤被用作阴性对照(gydF4y2Ba在线补充图4AgydF4y2Ba右面板)。重要的是，从5个PDXs和2个PDAC GEMMs分离的Nexinhib20对癌细胞的体外治疗作用(KPC和KPPC:gydF4y2BaLSL-KrasgydF4y2BaG12D / +gydF4y2Ba，gydF4y2BaLSL-Tp53gydF4y2BaR172H / R172HgydF4y2Ba，gydF4y2BaPdx-1-CregydF4y2Ba)导致分泌ev的数目显著减少(gydF4y2Ba在线补充图4BgydF4y2Ba)．Nexinhib20处理的MIA PaCa-2细胞中分泌的ev下调也表现为EVs标记CD63的降低gydF4y2Ba23gydF4y2Baβ-肌动蛋白(EVs中富含的细胞骨架蛋白，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba在线补充图4C,DgydF4y2Ba)．细胞色素C和乙酰胆碱酯酶只在细胞裂解液中检测到，表明我们制备的ev未受到污染(gydF4y2Ba在线补充图4EgydF4y2Ba)．使用的Nexinhib20的浓度是通过甲基噻唑二苯基溴化四唑(MTT)法测定的，该方法确定了不影响PDAC细胞活力的最大浓度(gydF4y2Ba在线补充图4FgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
总之，我们证明，在原位、GEMM和PDX模型中，Rab27a敲除会破坏ev介导的交流，从而破坏疾病的进展。gydF4y2Ba
CSC中Rab27A的抑制足以损害PDAC的生长gydF4y2Ba
由于EVNet中最频繁的通信路径发生在CSC到NSCC之间，我们开始确定它在肿瘤生物学中的作用。为了特异性抑制CSC的交流，我们对MIA PaCa-2 Tet-On shRab27a中的CSC和MIA PaCa2 Tet-On shScramble细胞中的NSCC进行了分类。它们被一起原位植入，在免疫缺陷小鼠的亲代细胞系中发现相同的比例(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba多西环素喂养的小鼠(n=8)与对照组(n=8)相比，在肿瘤检测前的周数中，疾病发病明显延迟。gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)．此外，与对照组相比，多西环素组的肿瘤生长和体重显著下降(gydF4y2Ba图4 c, DgydF4y2Ba)．相反，通过敲除Rab27a (gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba，实验2)没有显示任何明显的疾病发生变化(gydF4y2Ba在线补充图5AgydF4y2Ba)或与对照组相比的肿瘤生长和体重(gydF4y2Ba在线补充图5BCgydF4y2Ba)．两组肿瘤组织学相似(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在线补充图5CgydF4y2Ba)．因此，我们的数据表明，Rab27a在CSC中(它抑制了它们的交流能力)而在nsscc中没有被敲除足以损害肿瘤的生长。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
在PDAC原位模型、GEMM模型和PDX模型中，源于CSC的ev的通信障碍足以阻碍肿瘤的生长。(A)使用MIA PaCa-2 Tet-On系统破坏PDAC正交模型中ev介导的特定通信路径的实验计划。(B) Kaplan-Meier曲线表示CSC正常(CSC Tet-On shRab27a对照n=8)和CSC EV分泌受损(CSC Tet-On shRab27a强力霉素n=8)小鼠的肿瘤检测周数;配对t检验;* p < 0.05)。(C)用超声测量CSC正常(CSC Tet-On shRab27a对照n=8)和EV分泌受损(CSC Tet-On shRab27a强力霉素n=8)小鼠的肿瘤生长曲线;双向方差分析;* * p < 0.01)。(D) (B,C)中描述的组的肿瘤重量。右边是安乐死时肿瘤的代表性照片和各自的h&e(下，Wilcoxon检验; **p<0.01). Scale bar: 10 mm. (E) Experimental layout to impair communication by CSC using a PDAC GEMM. Of note, as shown before (在线补充图1DgydF4y2Ba)， EpCAM阳性的亚群体(EpCAMgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)已被纳入“知识基础规划”(KPC)，并列入“国家科学与科学研究中心”(NSCC)。(F) CSC EV分泌正常小鼠的总体生存Kaplan-Meier曲线(CSC从未治疗的KPC iRab27a肿瘤中分类gydF4y2BaFrt / FrtgydF4y2Ba小鼠，对照组n=7)和EV分泌受损的CSC (CSC来自他莫昔芬处理过的KPC iRab27a)gydF4y2BaFrt / FrtgydF4y2Ba小鼠，他莫昔芬n=5, log-rank Mantel-Cox检验;* p = 0.0278)。(G)对照组和他莫西芬组肿瘤的代表性H&E染色。(H)在PDX模型中影响CSC电动汽车通信的实验布局。(I)具有EV分泌能力的CSC的肿瘤发生率(CSC从PDX肿瘤中分离出来，体外用5% DMSO处理，并注射与NSCC对应物)，CSC的EV分泌受损(CSC从PDX肿瘤中分离出来，体外用Nexinhib20(1µM)处理，然后注射与NSCC对应物)。DMSO 5% n=6, Nexinhib20 n=5 (Fisher确切检验*p=0.0152)。(J) (H,I)所述各组小鼠安乐死时的肿瘤体积和肿瘤代表性照片以及各自的H&ES。DMSO 5% n=6, Nexinhib20 n=5(排列检验，*p=0.0123)。(K)来自未处理的PDX细胞、DMSO 5%处理或Nexinhib20处理的活癌细胞的代表性流式细胞术分析。数据意味着±SEM。 CSC, cancer stem cell; EVs, extracellular vesicles; GEMM, genetically engineered mouse model; NSCC, non-stem cancer cell; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; PDX, patient-derived xenograft.
为了进一步确认CSC EVs在PDAC进展中的作用，我们开发了一种GEMM，允许通过flippase重组介导的诱导和条件敲除Rab27a (gydF4y2BaRab27agydF4y2BaFrt / FrtgydF4y2Ba)．我们走过gydF4y2BaRab27agydF4y2BaFrt / FrtgydF4y2Ba而且gydF4y2BaR26gydF4y2BaLSL-FLPOERT2 / +gydF4y2Ba等位基因gydF4y2Ba24gydF4y2BaKPC。最终模型自发发展PDAC (gydF4y2BaLSL-KrasgydF4y2BaG12D / +gydF4y2Ba，gydF4y2BaLSL-Tp53gydF4y2BaR172H / +gydF4y2Ba，gydF4y2BaPdx-1-CregydF4y2Ba，gydF4y2BaR26gydF4y2BaLSL-FLPoERT2 / +gydF4y2Ba，gydF4y2BaRab27agydF4y2BaFrt / FrtgydF4y2Ba，以下简称为KPC iRab27agydF4y2BaFrt / FrtgydF4y2Ba)．经PCR证实，出生时经哺乳治疗他莫西芬后，胰腺Rab27a等位基因重组(gydF4y2Ba在线补充图5DgydF4y2Ba)．KPC iRab27agydF4y2BaFrt / FrtgydF4y2Ba出生时接受他莫西芬治疗的患者总生存率有增加的趋势(gydF4y2Ba在线补充图5E,FgydF4y2Ba)．与对照组一样，小鼠也发生了肝和肺的转移(gydF4y2Ba在线补充图5G,HgydF4y2Ba)．我们使用这种GEMM从KPC iRab27a的肿瘤中筛选出CSCgydF4y2BaFrt / FrtgydF4y2Ba他莫昔芬处理小鼠(Rab27a敲除)和NSCC均来自对照组小鼠(KPC iRab27agydF4y2BaFrt / FrtgydF4y2Ba未处理或KPC Rab27agydF4y2BaFrt / FrtgydF4y2Ba没有gydF4y2BaR26gydF4y2BaLSL-FLPOERT2 / +gydF4y2Ba它莫西芬处理过的等位基因)。这些细胞被原位植入野生型(C57BL/6)小鼠(n=23)体内，其比例与原始肿瘤(gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba)．对照组小鼠原位植入Rab27a的CSC和NSCCgydF4y2BaWTgydF4y2Ba肿瘤(n = 23日gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba)．与对照组相比，CSC EVs分泌受损的肿瘤小鼠的总生存率显著增加(gydF4y2Ba图4 fgydF4y2Ba)．两组肿瘤在组织学上无显著差异(gydF4y2Ba图4 ggydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
我们在PDX模型中进一步验证了我们的发现。CSC从PDX肿瘤中分离出来，体外用Nexinhib20或载体(DMSO 5%)处理4小时。这些细胞被原位植入免疫缺陷小鼠(Rag2gydF4y2Ba−−/gydF4y2BaIL2rggydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba)和从相同的PDX中分离出的NSCC，在PDX肿瘤中发现的比例相同(gydF4y2Ba图4 hgydF4y2Ba)．抑制Rab27a的功能和由此导致的CSC EVs分泌障碍可以消除肿瘤和转移的发生(gydF4y2Ba图4 i, JgydF4y2Ba,gydF4y2Ba在线补充图6ABgydF4y2Ba)．对照动物组织学证实肿瘤和转移(gydF4y2Ba图4 jgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在线补充图6ABgydF4y2Ba)．重要的是，我们发现Nexinhib20治疗后的癌细胞活力与对照组(DMSO 5%或未治疗，gydF4y2Ba图4 kgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
我们提供的证据表明，Rab27a敲低对CSC EVs的抑制足以损害PDAC的生长。考虑到这一点，我们下一步着手识别CSC ev的货物，并调查观察到的表型的潜在原因。gydF4y2Ba
CSC的胞外囊泡具有独特的蛋白质载体，富含agringydF4y2Ba
为了确定确定的癌症细胞亚群及其各自ev的蛋白质组成，我们使用了四种人PDAC细胞系(BxPC-3, PANC-1, T3M4和MIA PaCa-2)，并用FACS分离确定的亚群。从每个亚群中，用差示超离心法分离evgydF4y2Ba25gydF4y2Ba（gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba)．NTA对纯化囊泡的生物物理特性分析表明，分离的囊泡在小ev的预期尺寸范围内(124.1±4.5 nm;gydF4y2Ba在线补充图7AgydF4y2Ba)．利用透射电子显微镜(TEM)，我们证实ev呈现出杯状形态和脂质双分子层(gydF4y2Ba在线补充图7BgydF4y2Ba)．我们采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC/ ESI-MS /MS)来表征ev及其起源细胞亚群的蛋白质含量(gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba)．总的来说，多肽的对齐和筛选共产生6185个蛋白质(gydF4y2Ba在线补充图7CgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在线补充表1gydF4y2Ba)．无监督分层聚类揭示了两个蛋白质簇，它们将主要在ev或细胞中检测到的蛋白质分组，以及在两个组分中检测到的蛋白质簇(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba，gydF4y2Ba在线补充图7DgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在线补充表2gydF4y2Ba)．利用反应组通路数据库进行的基因本体论分析显示，每个蛋白质簇都参与不同的生物功能(gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在线补充表3gydF4y2Ba)．这表明ev的货物是在特定的生物通路中富集的，而不是模仿细胞蛋白质组的功能。主要在EVs中发现的蛋白质簇在细胞外基质(ECM)-蛋白多糖和整合素细胞表面相互作用途径中显著富集(gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)．这可能表明这些蛋白质参与了ev的特定摄取，从而建立了特定的通信路线。正如预期的那样，EVs中识别的蛋白的亚细胞位置主要对应于细胞质、质膜、囊泡和内质网(gydF4y2Ba在线补充图7EgydF4y2Ba)．我们在CSC ev中发现了545个在NSCC ev中未检测到的蛋白质(gydF4y2Ba图5 dgydF4y2Ba)．功能富集分析表明，仅在CSC ev中检测到的蛋白质与仅在NSCC ev中检测到的蛋白质属于不同的生物途径，因此具有不同的表型结果(gydF4y2Ba图5 egydF4y2Ba)．仅在CSC EVs中，轴突引导通路是高度丰富和显著的通路(p值=1.46815E-27;gydF4y2Ba图5 egydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在线补充表4gydF4y2Ba)．轴突引导通路在PDAC中异常突变，并增强胰腺癌的发生。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba为了确定某些生物类别的蛋白质浓度是否存在显著的全球差异，我们基于CSC和NSCC ev之间归一化的蛋白质计数差异进行了基因集富集分析(GSEA)。同样，GSEA显示CSC EVs中对应79个蛋白的轴突引导通路显著富集(调整后的p值=0.001，gydF4y2Ba图5 fgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在线补充表5gydF4y2Ba)．最重要的是，GSEA分析证实了轴突引导通路中的蛋白质可以区分CSC ev和NSCC ev (gydF4y2Ba图5 fgydF4y2Ba)．在这79个蛋白质中，我们发现其中14个存在于所有4个细胞系的CSC ev中(gydF4y2Ba图5克gydF4y2Ba)．agin因其先前描述的在癌症中，特别是在PDAC中的作用而脱颖而出。gydF4y2Ba-gydF4y2Ba研究发现，agin在PDAC中上调，其过表达促进了上皮-间质转化，导致转移，以及患者整体生存期较差。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba此外，先前对PDAC细胞外基质的蛋白质组学分析显示，肿瘤中存在的agrin不是基质来源;相反，它是专门从癌细胞中提取的。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba我们已经通过FACS验证了agin在MIA PaCa-2 CSC EVs中的富集，证明agin的膜锚定亚型存在于EVs中(gydF4y2Ba图5 hgydF4y2Ba)．此外，我们对MIA PaCa-2 ev进行了大小排除色谱分析，并通过western blot证实，EVs组分(SEC F7-10)和非囊泡组分(SEC F11-25)中均存在agrin，gydF4y2Ba在线补充图7FgydF4y2Ba)，因为agrin具有膜结合和分泌的异构体。gydF4y2Ba31gydF4y2Bawestern blot检测alix和syntenin-1表达的EV片段，流式细胞术检测CD9、CD63和CD81表达的EV片段(gydF4y2Ba在线补充图7FGgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba23日25 32gydF4y2Ba以类似的方式，我们进行了Optiprep梯度，并证明了egin存在于EVs和非泡状部分(F1-6和F7-12;gydF4y2Ba在线补充图7HgydF4y2Ba)．EVs部分以CD81、syntenin-1和alix的表达为特征，非泡状部分以HSP90和组蛋白H3的表达为特征(gydF4y2Ba在线补充图7HgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba23日25 32gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
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agin在CSC ev中富集。(A)在细胞亚群和各自EVs中进行LC/ ESI-MS /MS的实验方法(CD24gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba, CD133gydF4y2Ba+gydF4y2Ba, CD24gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba， 4N和EpCAMgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)在四种人PDAC细胞系(BxPC3, PANC-1, T3M4和MIA PaCa-2)中共38个样本(MIA PaCa-2细胞为EpCAMgydF4y2Ba−gydF4y2Ba)．(B)热图描述了存在于PDAC亚群和四个细胞系中各自ev中的蛋白质簇。树状图显示无监督的分级聚类，显示三种蛋白质簇:ev、细胞和细胞+ ev。完整的热图显示在gydF4y2Ba在线补充图7DgydF4y2Ba．(C)蛋白质簇的功能富集分析。点图表示每个簇中反应组富集的前6个通路(调整后的p值<0.05)。基因比对应于每个蛋白质簇中每个通路的相对大小。(D)从四种PDAC细胞系分离的CSC和NSCC EVs中检测到的总蛋白维恩图。边表示只在CSC或NSCC ev中检测到的蛋白质数量，交集表示两个亚群共有的蛋白质数量。(E)在CSC、NSCC和EVs两个亚群中富集的前5条反应组通路(调整后的p值<0.05)。(F)基因集富集分析表明gydF4y2Ba轴突的指导gydF4y2Ba通路将CSC ev与NSCC ev分离。(G)维恩图描述了在CSC EVs中发现的蛋白质在四种PDAC细胞系之间的交叉。在所有CSC ev中共有的233个蛋白质中，79个对应于轴突引导通路的蛋白质。其中，14个基因存在于所有4个细胞系的CSC ev中。这14个是根据DESeq2归一化的平均肽计数进行排名的(右表)。(H)来自MIA PaCa-2 NSCC和CSC亚群的agin阳性EVs的FACS分析和代表性直方图(n=4, Mann-Whitney检验，*p<0.05)。数据意味着±SEM。CSC，癌症干细胞;电动汽车,细胞外囊泡;三磷酸鸟苷,Guanosine-5三磷酸; HSC, hematopoietic stem cells; IGFBP, Insulin-like growth factor binding protein; LC/ESI–MS/MS, liquid chromatography–electrospray ionisation–tandem mass spectrometry; NSCC, non-stem cancer cell; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; PKN, protein kinase N; RHO, ras homologous; ROBO, roundabout guidance receptor; SLIT, slit guidance ligand; SRP, signal recognition particle.
这些结果表明CSC ev与NSCC ev具有不同的蛋白质载体。最重要的是，我们在四种人PDAC细胞系中发现，大量专门在CSC ev中检测到的蛋白质属于与PDAC相关的生物过程，如轴突引导通路。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba在这一通路中，我们证实了在CSC ev中，agrin是最富集的蛋白质之一。gydF4y2Ba
agin阳性CSC ev促进YAP激活gydF4y2Ba
agin与PDAC进展相关，是PDAC患者预后不良的标志。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba据报道，Agrin通过结合LRP-4受体激活YAP转录因子，从而促进肝癌的发生。gydF4y2Ba28gydF4y2BaYAP是Hippo通路中的一个核心角色，而Hippo通路在癌症中经常失调。gydF4y2Ba33gydF4y2BaYAP转位到细胞核改变了细胞的转录程序，从而促进细胞增殖和存活。gydF4y2Ba34gydF4y2Ba由于agin在CSC ev中富集，我们测试了CSC agin的可能性gydF4y2Ba+gydF4y2Baev调节YAP活性，促进PDAC生长。我们从MIA PaCa-2 Tet-On shRab27a中筛选出CSC，并与从MIA PaCa-2 Tet-On shScramble中筛选出的NSCC以与亲代细胞相同的比例进行培养(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)．在多西环素治疗中，我们通过敲除Rab27a抑制CSC分泌EVs，抑制EVNet中最频繁的通信路径。我们证明，当CSC中Rab27a基因下调时，活性YAP(核YAP)水平与对照组相比显著降低(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)．使用一种检测总YAP (gydF4y2Ba在线补充图8AgydF4y2Ba)．我们进一步证实了CSC ev中agin在YAP活性中的作用。我们在MIA PaCa-2细胞系中开发了一个Tet-Off系统，通过短发夹RNA控制agrin的表达。CSC从MIA PaCa-2 Tet-Off shAgrin中分离出来，以与亲代细胞相同的比例与MIA PaCa-2 Tet-Off shScramble NSCC培养(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)．我们证明，在CSC中单独敲除agrin(没有多西环素)足以显著降低YAP核水平，这与Rab27a敲除(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)．我们证实了agin在细胞和CD133中的下调gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(CSC)来自MIA PaCa-2 Tet-Off shAgrin的ev分别通过western-blot和FACS (gydF4y2Ba在线补充图8BgydF4y2Ba)．我们还证明了这一机制是针对CSC的，因为从MIA PaCa-2 Tet-Off shAgrin与从MIA PaCa-2 Tet-Off shScramble共培养的NSCC (NSCC中agrin的敲除)并不会降低YAP的激活(gydF4y2Ba在线补充图8CgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
agin阳性CSC ev促进YAP核定位。(A)实验布局(上、左):分别从MIA PaCa-2 Tet-On shRab27a或shScramble中筛选出CSC和NSCC，以亲代细胞中发现的相同比例进行培养，以评估在这些条件下YAP的活性。MIA PaCa-2 Tet-On shRab27a与MIA PaCa-2 Tet-On shScramble中的NSCC(培养比例与MIA PaCa-2 Tet-On shRab27a相同)培养的CSC的代表性共聚焦显微镜图片。活性YAP(绿色)，phalloidin(红色)和核(蓝色)(右)。YAP核水平定量(每个细胞平均强度)(n=1，每组6张图像，无配对t检验;* * p < 0.01),左)。数据从最小到最大。比例尺:10µm。小提琴图中的虚线表示中值。(B)实验布局(左上):为了评估agrin在CSC EVs中的作用，我们将强力环素诱导的抗agrin shRNA转染到MIA PaCa-2细胞中。 CSC were sorted from Tet-Off shAgrin MIA PaCa-2 cells and cultured at the same proportions found in parental cells with MIA PaCa-2 Tet-Off ShScramble NSCC. Representative confocal microscopy pictures of CSC from MIA PaCa-2 Tet-Off shAgrin cultured with NSCC from MIA PaCa-2 Tet-Off shScramble (cultured at the same percentages found in the MIA PaCa-2 -Tet-Off shAgrin). Active YAP (green), phalloidin (red) and nuclei (blue) (right). Graph depicts quantification of YAP nuclear levels (mean intensity per cell; n=2, six images per group, unpaired t-test; ****p<0.0001) (bottom, left). Data are min to max. Scale bar: 10 µm. Dashed lines in violin plots represent median values. (C) Representative immunohistochemistry photos and quantification of per cent nuclear YAP-positive epithelial cells in MIA PaCa-2 Tet-On shRab27a tumors. Control n=7, doxycycline n=8 (unpaired t-test,**gydF4y2Bap < 0。01)。数据意味着±SEM。(D) MIA PaCa-2 CD63-turboGFP分离的CSC EVs处理的MIA PaCa-2 NSCC中LRP-4的代表性免疫荧光(紫色)。代表性正交视图YZ(中面板)。箭头标识CD63-turboGFP CSC ev和LRP-4之间的共定位。规模酒吧10µm。(E) qPCR分析转染siSCR并经CSC EVs处理的MIA PaCa-2型ncscc(红色)、转染siLRP-4的MIA PaCa-2型ncscc(灰色)、转染siLRP-4并经CSC EVs处理的MIA PaCa-2型ncscc(蓝色)与转染siSCR的ncscc(基线，1)比较AREG、CXCL5、STAT3、CYR61、ALX和VIM基因表达的倍数变化。转染siLRP-4的MIA PaCa-2 nsscc的AREG CT水平未测定。以β-肌动蛋白作为内源性对照，比较CT法。转染siRNA 72小时后进行CSC EV处理(10µg)， 24小时后评估基因表达。 (F) Cell viability measured by absorbance at 570nm (MTT assay) at days 1, 4 and 6 after the beginning of the experiment in MIA PaCa-2 NSCC (dark blue), NSCC treated with CSC EVs (light blue), NSCC treated with DMSO and CSC EVs (light red) and NSCC treated with verteporfin and CSC EVs (dark red). DMSO and verteporfin (10 µg/mL) treatments were performed at days 1 and 4. CSC EVs treatments (1 µg) were performed at days 1 and 4 two-way ANOVA; *p<0.05, ****p<0.0001. CSC, cancer stem cells; DAPI,4′,6-diamidino-2-phenylindole; EVs, extracellular vesicles; NSCC, non-stem cancer cells. rtTA, reverse tetracycline-controlled transactivator; VIM, vimentin.
此外，我们通过MIA PaCa-2 CSC Tet-Off shScramble培养和亲代NSCC (gydF4y2Ba在线补充图8DgydF4y2Ba)．最重要的是，EV分泌受损的MIA PaCa-2 Tet-On shRab27a肿瘤的癌细胞中活性YAP也显著降低，从而证实EV参与了YAP的激活(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba)．综上所述，这些结果表明，在CSC表型中，agrin的下调可通过Rab27a的下调抑制CSC EVs，表明EVs相关的agrin参与了YAP的激活。gydF4y2Ba
最后，我们评估了LRP-4受体是否如前所述可以作为agin激活YAP的中介。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba我们证明，与CSC相比，LRP-4在NSCC中更丰富，这表明agin -LRP-4轴在支持EVNet最频繁的通信路由(gydF4y2Ba在线补充图9AgydF4y2Ba)．此外，我们用CSC ev(带有CD63-turboGFP标记)治疗NSCC，发现CSC ev与LRP-4共定位，并被NSCC内化(gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba)．最后，由于agrin具有膜锚定亚型，我们可以通过FACS分析在EVs中检测到，我们还发现agrin在MIA PaCa-2细胞中与LRP-4受体共定位(gydF4y2Ba在线补充图9BgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
验证CSC的有效性gydF4y2Ba+gydF4y2BaEVs通过LRP-4促进YAP激活，我们用CSC EVs治疗NSCC并调节LRP-4的表达。首先，我们证明了yap调节的基因AREG，gydF4y2Ba36gydF4y2BaCXCL5,gydF4y2Ba37gydF4y2BaSTAT3,gydF4y2Ba38gydF4y2BaCYR61,gydF4y2Ba39gydF4y2BaALXgydF4y2Ba40gydF4y2Ba和VIMgydF4y2Ba41gydF4y2Ba在CSC ev处理中过表达(gydF4y2Ba图6 egydF4y2Ba；黑条参照基线的变化倍数，1。其次，我们验证了转染siLRP-4的NSCC显示了评估基因的下调，表明LRP-4在调节YAP激活方面起着至关重要的作用(gydF4y2Ba图6 egydF4y2Ba；最后，我们证明，与基线NSCC siScramble相比，LRP-4下调的NSCC在使用CSC EVs治疗时无法恢复yap调节基因的表达(gydF4y2Ba图6 egydF4y2Ba蓝色酒吧)。gydF4y2Ba
YAP调控的基因参与了PDAC的增殖和侵袭。gydF4y2Ba42 43gydF4y2Ba我们试图评估YAP在调节EVNet的表型中所起的作用，EVNet主要通过CSC agrin发生gydF4y2Ba+gydF4y2BaEVs信号。为此，我们在存在或不存在YAP抑制剂维替泊芬(verteporfin)的情况下，使用CSC ev处理的NSCC进行了MTT试验。gydF4y2Ba44 45gydF4y2Ba首先，我们证明了用CSC ev治疗NSCC可以促进细胞增殖(gydF4y2Ba图6 fgydF4y2Ba)．其次，我们发现这种作用高度依赖于YAP，因为用维替泊芬治疗的NSCC和CSC ev对细胞增殖没有任何影响(gydF4y2Ba图6 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
我们的研究结果表明，CSC EVs和agrin促进YAP激活，从而通过LRP-4调节Hippo通路，这可能解释了它们对肿瘤生长的贡献。gydF4y2Ba
aglin是PDAC CSC潜在的治疗靶点gydF4y2Ba
在原位、GEMM和PDX模型中，通过下调Rab27a抑制CSC中EVs的分泌足以损害肿瘤生长。接下来，我们试图评估在维持来自癌症细胞亚群的通信的同时，特异性下调CSC ev中的agrin是否会对疾病进展产生同样的影响。为了回答这个问题，CSC从MIA PaCa-2 Tet-Off shAgrin中分离出来，NSCC从MIA PaCa-2 Tet-Off shScramble中分离出来，它们以相同的比例原位植入免疫缺陷小鼠(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba同样，从MIA PaCa-2 Tet-Off shAgrin细胞中筛选出NSCC，从MIA PaCa-2 Tet-Off shScramble细胞中筛选出CSC，并将其原位植入免疫缺陷小鼠(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba实验2)。在两组中，在没有多西环素治疗的情况下，agin在CSC或NSCC中分别特异性下调(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)．我们发现，与NSCC中agrin的下调相比，CSC和它们各自的EVs中agrin的下调导致肿瘤生长明显放缓(n=7)。gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba)．这也反映在安乐死时肿瘤体积的显著减少(gydF4y2Ba图7 cgydF4y2Ba)．此外，当同样的组用强力霉素(正常水平的agrin表达)治疗时，我们观察到肿瘤生长没有差异(gydF4y2Ba在线补充图10A、BgydF4y2Ba)．我们还证明，在CSC组中，agin的敲除会降低肿瘤的相对生长，而在NSCC组中则不是这样(gydF4y2Ba在线补充图10CgydF4y2Ba)．总之，这些结果证明了agin阳性CSC和相关EVs对PDAC生长的显著影响。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
CSC中的Agrin促进PDAC的进展，而阻断PDX细胞中的Agrin则损害其增殖。(A)实验布局:从MIA PaCa-2 Tet-Off shAgrin和shScramble克隆中分别筛选出CSC和NSCC，以损害特定癌细胞亚群中agrin的表达，然后原位植入Rag2的胰腺中gydF4y2Ba−−/gydF4y2BaIl2rggydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠。(B)未处理(agin kD)肿瘤的超声测量肿瘤生长曲线:来自MIA PaCa-2 Tet-Off shAgrin的CSC +来自MIA PaCa-2 Tet-Off shScramble的NSCC(以在起源细胞中发现的相同百分比注射，n=7)和来自MIA PaCa-2 Tet-Off shAgrin的NSCC与来自MIA PaCa-2 Tet-Off shScramble的CSC(以在起源细胞中发现的相同百分比注射，n=6，双因素方差分析;* p < 0.05)。(C)安乐死时肿瘤体积的量化和胰腺肿瘤代表性照片(Mann-Whitney检验，*p<0.05)。(D)在14周龄安乐死的KPC和KPAC小鼠中显示无组织学疾病的胰腺百分比、PanINs和PDAC区域的组织学评估和相应的H&E图片(KPC n=6, KPAC n=5)。(E) KPC和KPAC的YAP h评分及代表性免疫组化照片(KPC n=6, KPAC n=5) (Mann-Whitney检验，**p<0.01)。(F)人抗agrin中和抗体体外治疗PDX的示意图。用560nm吸光度法(MTT法)测定细胞活力。从第0天到第8天，每天(患者1)，或从第0天到第11天，每天(患者2)体外处理PDX细胞，用抗agrin阻断抗体(Mab5204 10 μg/mL)、IgG (10 μg/mL)或不处理(对照组)。与IgG处理的体外PDX进行比较(双向方差分析; *p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001). Arrow indicates timepoint that treatment was stopped in patient 1. (G) Quantification of YAP nuclear levels in PDX cells treated ex vivo from day 0 until day 5, every day, with antiagrin blocking antibody (Mab5204 10 μg/mL) or IgG (10 μg/mL) (top) (mean intensity per cell, n=1, six images per group, unpaired t-test; ****p<0.0001). Data are min to max. Dashed lines in violin plots represent median values. Representative confocal microscopy photos of treated PDX cells. Scale bar: 20 µm. Active YAP (green), phalloidin (red) and nuclei (blue) (bottom). Data are mean±SEM. ANOVA, analysis of variance; KD, knockdown; KPAC, agrin knockout KPC; CSC, cancer stem cells; EVs, extracellular vesicles; FACS, fluorescence activated cell sorting; MTT, methylthiazolyldiphenyl–tetrazolium bromide; NSCC, non-stem cancer cell; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; PDX, patient-derived xenograft.
为了进一步确认agin在PDAC进展中的作用，我们将KPC模型与agin -floxed小鼠交叉，生成KPC agin敲除(KPAC:gydF4y2BaLSL-KrasgydF4y2BaG12D / +gydF4y2Ba，gydF4y2BaLSL-Tp53gydF4y2BaR172H / +gydF4y2Ba，gydF4y2Ba微笑的gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba，gydF4y2BaPdx-1-CregydF4y2Ba)．KPAC自发发育PDAC, PDAC肿瘤中的agrin等位基因重组经PCR证实(gydF4y2Ba在线补充图10DgydF4y2Ba)．与KPC小鼠相比，KPAC小鼠表现出延迟的疾病进展，这在横断面研究中通过两种模型的胰腺组织病理学分析(gydF4y2Ba图7 dgydF4y2Ba)．最重要的是，我们发现KPAC肿瘤细胞中活性YAP表达显著下调(gydF4y2Ba图7 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
考虑到这一点，我们研究了两种PDXs中针对agrin的影响，使用中和抗人agrin抗体(gydF4y2Ba图7 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba28gydF4y2Ba抗agrin、IgG或不处理PDX癌细胞，用MTT法评估细胞活力(gydF4y2Ba图7 fgydF4y2Ba)．我们确定，在两种不同的PDXs中，与IgG处理或不处理相比，抗人agrin处理显著降低了细胞生长(gydF4y2Ba图7 fgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在线补充图10EgydF4y2Ba)．因此，抗人agrin处理显著降低PDX细胞中活性YAP的水平(gydF4y2Ba图7 ggydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
总之，我们的研究结果表明，CSC ev富含具有肿瘤促进作用的agrin。这进一步验证了EVNet中CSC通信轴的生物学意义。最重要的是，我们已经确定了agin作为胰腺癌治疗干预的新靶点。gydF4y2Ba
循环的agin阳性ev是疾病进展的预后标志gydF4y2Ba
为了验证我们的研究结果，我们从44名PDAC患者中纵向收集了110份血清样本。gydF4y2Ba在线补充表6gydF4y2Ba)．循环的agin阳性ev偶联到小珠(cAGRNgydF4y2Ba+gydF4y2Ba用流式细胞术检测PDAC患者血清中的EVs (gydF4y2Ba在线补充图11AgydF4y2Ba)．cAGRN的分析gydF4y2Ba+gydF4y2Ba术前和术后经FACS检测的EVs (n=19，符合手术条件的患者)显示肿瘤切除明显减少(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)．此外，我们还发现cAGRN的比例显著降低gydF4y2Ba+gydF4y2BaPDAC患者化疗后的EVs (n=24，gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba)．这只适用于接受福尔非尼诺基治疗方案的患者(gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在线补充图11BgydF4y2Ba)．这与以folfirinox为基础的PDAC治疗的疗效一致。gydF4y2Ba46gydF4y2Ba因此，我们证明了cAGRN的百分比gydF4y2Ba+gydF4y2Baev与肿瘤负担成正比。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
循环中的agin阳性ev是疾病进展的生物标志物，并可预测PDAC患者对治疗的反应。(A) PDAC患者血清中循环agin阳性EVs与珠粒结合的百分比的术前和术后分析(n=19，配对t检验;* p < 0.05)。(B,C)所有方案治疗的PDAC患者化疗前和化疗后血清中循环agin阳性EVs与小珠结合的百分比分析(B) (n=24，配对t检验;*p<0.05)和基于folfirinox的方案(C) (n=13，配对t检验;* * p < 0.01)。(D) PDAC患者血清中循环cd133阳性ev与珠粒耦合的百分比与agin阳性ev与珠粒耦合的百分比的对数10之间的相关性(n=106, Spearman r=0.6272)。(E)分析三名PDAC患者血清中循环的agin阳性ev与小珠结合的百分比。QRT，化疗，ŦAborted手术，因为肿瘤不能切除。(F)未接受手术治疗的PDAC患者血清中agin阳性(红色)、cd133阳性(蓝色)、agin阳性和cd133阳性(紫色)EVs偶联珠和CA19-9(绿色)的百分比的接受者操作曲线分析(循环中agin阳性和cd133阳性EVs偶联珠分析中n=22, CA19-9分析中n=20)。 (G) Receiver operating curve analysis for the percentage of agrin-positive (red), CD133-positive (blue), and combination of agrin-positive and CD133-positive (purple) EVs coupled to beads and CA19-9 (green) in the serum of patients with PDAC not submitted to surgery and treated with chemotherapy (n=17). In tables: a means under the non-parametric assumption and b means null hypothesis: true area=0.5. EVs, extracellular vesicles; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma.
使用106例PDAC患者的血清样本(gydF4y2Ba在线补充表7gydF4y2Ba)，我们发现cAGRN的百分比显著相关gydF4y2Ba+gydF4y2BaEVs和cCD133gydF4y2Ba+gydF4y2Ba电动汽车(循环电动汽车部分源于CSC, r=0.6272, p<0.0001;gydF4y2Ba图8 dgydF4y2Ba)．这些数据为支持大多数cAGRN的CSC起源提供了进一步的证据gydF4y2Ba+gydF4y2Ba电动汽车。cAGRN的纵向评价gydF4y2Ba+gydF4y2BaPDAC患者的EVs显示cAGRN增加gydF4y2Ba+gydF4y2Baev同时发生，甚至在化疗过程中影像学发现疾病进展之前或化疗停止后(gydF4y2Ba图8 egydF4y2Ba)．最重要的是，我们发现在没有接受手术的患者中，cAGRN增加了1%gydF4y2Ba+gydF4y2Baev的疾病进展风险增加2.94倍[OR (CI)=2.94(1.03-8.43)， p=0.045]。有趣的是，cCD133增加了1%gydF4y2Ba+gydF4y2Baev还导致PDAC进展风险显著增加[OR(CI)=1.77(1.09-2.88)， p=0.022]。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
最后，我们研究了cAGRN的性能gydF4y2Ba+gydF4y2Ba通过受试者工作特征曲线(ROC)分析，EVs可作为疾病进展的预后生物标志物。在未接受手术的患者中，循环的agin阳性ev作为疾病进展的特异性和敏感性生物标志物(AUC=0.77;p = 0.035;gydF4y2Ba图8 fgydF4y2Ba)．cCD133也观察到类似的行为gydF4y2Ba+gydF4y2Ba电动汽车(AUC = 0.85, p = 0.007;gydF4y2Ba图8 fgydF4y2Ba)．此外，结合这两种标记物可以提高预测疾病进展的性能(AUC=0.86, p=0.006)。相比之下，在同一队列患者中，我们证实CA19-9不是预测疾病进展的良好生物标志物(AUC=0.2, p=0.025;gydF4y2Ba图8 fgydF4y2Ba)．此外，在没有接受手术但接受化疗的患者中，cAGRN的百分比gydF4y2Ba+gydF4y2Ba电动汽车与cCD133gydF4y2Ba+gydF4y2Baev也是疾病进展的重要预测因子(AUC=0.875, p=0.009;gydF4y2Ba图8 ggydF4y2Ba)．总之，我们的结果表明cAGRNgydF4y2Ba+gydF4y2Ba电动汽车，单独或结合cCD133gydF4y2Ba+gydF4y2Baev构成与疾病进展风险增加相关的预后生物标志物。gydF4y2Ba
此外，我们利用癌症基因组图谱(TCGA)分析了PDAC患者中agin和YAP蛋白的表达水平。正如预期的那样，YAP蛋白表达越高，复发风险越高(OR=4.76, CI 1.91 ~ 12.60;p = 0.0007)。此外，YAP蛋白和agrin表达水平高的患者复发风险显著增加(OR=6.15, CI 1.45 ~ 26.11;p=0.01)，与低水平YAP和agrin患者相比，预后较差(gydF4y2Ba在线补充图11CgydF4y2Ba)．此外，我们发现，与低水平的agin和高水平的非活性YAP相比，高水平的agin和低水平的非活性YAP与较差的预后相关(phospho127 YAP)。gydF4y2Ba在线补充图11DgydF4y2Ba)．最重要的是，低水平的非活性YAP单独与较差的预后无关(gydF4y2Ba在线补充图11EgydF4y2Ba)，从而反映了agin在PDAC中激活YAP及相应的促瘤功能。gydF4y2Ba
因此，我们得出结论，EVNet通过CSC EVs中的agrin与疾病进展风险增加相关，可能是PDAC CSC治疗干预的新靶点(gydF4y2Ba图9gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
EVs介导的胰腺癌亚群细胞间通信、EVNet和CSC agin阳性EVs在PDAC中的作用示意图。我们的研究表明，PDAC细胞的亚群通过CSC富含agin的ev建立了一个有组织的、可塑性的通信网络，即EVNet，其中优先的通信路径是从CSC到NSCC。在原位、GEMM和PDX模型中，这一途径的特异性抑制足以损害PDAC肿瘤的生长。在PDAC人体样本中，我们已经确认cAGRNgydF4y2Ba+gydF4y2Baev是疾病进展的预后生物标志物，与治疗反应相关。CSC，癌症干细胞;电动汽车,细胞外囊泡;EVNet:胰腺癌干细胞胞外囊泡引导肿瘤内通讯网络基因工程小鼠模型GEMM;PDAC，胰导管腺癌;PDX, patient-derived异种移植。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
肿瘤是由不同的癌症细胞亚群组成的复杂实体，它们具有不同的细胞行为和生存能力，由细胞和非细胞自主变化决定。gydF4y2Ba2 3 47 48gydF4y2Ba据推测，具有不同能力的癌细胞亚群彼此之间以及来自肿瘤微环境的细胞之间相互作用，而这种交流对于癌细胞克服微环境变化并茁壮成长至关重要。gydF4y2Ba49个50gydF4y2Baev被认为是介导细胞间通讯的媒介gydF4y2Ba51gydF4y2Ba并被描述为携带货物，调节受体细胞，在附近和远处的器官，有助于肿瘤的生存，进展和转移前龛的形成。gydF4y2Ba11 13 - 15gydF4y2Ba在这里，我们证明了癌症ev在癌症细胞亚群之间进行局部交换，建立了一个非随机通信网络，即EVNet。尽管CSC是一个罕见的亚群体，但我们提供的证据表明，EVs在从CSC到NSCC的EVNet中充当频繁通信路线的中介。重要的是，我们证明了EVNet在受到缺氧或吉西他滨的挑战时发生重塑，从而支持肿瘤内亚群之间的合作。这些发现表明，EVNet可能是癌细胞适应肿瘤环境的一种机制，允许它们在恶劣的环境中生存并抵抗治疗，最终支持疾病的进展。虽然我们的实验模型允许我们评估不同亚群细胞之间的细胞间通信，但我们不能放弃存在亚群内通信的可能性。然而，这种癌细胞交换它们已经包含的同一组信息的现象的生物学意义将很难解释，并且超出了目前研究的范围。我们还需要考虑到，虽然我们确定了在四个特定的癌症细胞亚群中建立的EVNet，但肯定还有其他由不同的细胞表面标记集定义的亚群，它们也可能通过ev进行通信，这些在我们的模型中没有评估过。gydF4y2Ba
研究表明，恶性细胞释放的ev会被恶性程度较低的癌细胞吸收。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba这种信息传递增强了迁移和转移能力，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba和所谓的“变形虫”表现型gydF4y2Ba16gydF4y2Ba．我们证明，CSC ev中存在的信息转移到其他癌症细胞亚群对肿瘤生长至关重要，这表明CSC处于EVNet对PDAC的生物学影响的中心。转录组学研究已经确定了两类主要的PDAC细胞:“经典”和“基样”。gydF4y2Ba52 53gydF4y2Ba这些癌细胞亚型在肿瘤中共存，决定了肿瘤的分化状态，以及对治疗的反应。gydF4y2Ba54gydF4y2Ba这突出了PDAC的可塑性，它不仅受遗传和表观遗传线索的驱动，也受肿瘤微环境的细胞外信号的驱动。gydF4y2Ba54gydF4y2Ba考虑到我们的数据，CSC(致瘤性更高)与NSCC(致瘤性更低)之间的通信，我们可以推测ev也可以决定细胞亚型和PDAC的命运。gydF4y2Ba
为了研究CSC对NSCC通信轴的生物学意义，我们通过靶向Rab27a来限制EVs的释放，Rab27a是一种已知参与EVs生物发生后期的GTPase。gydF4y2Ba19日21 55gydF4y2BaRab27a除了在EVs释放中起作用外，也被描述为调节非泡性成分的分泌，这可能是我们研究的一个局限性。gydF4y2Ba20 21gydF4y2Ba然而，我们的数据显示，在我们的模型中，Rab27a下调会损害EVs的释放，而不会干扰42种研究分泌蛋白的胞外分泌。最重要的是，使用CSC ev的治疗可以重现我们的表型，即YAP激活、YAP靶基因过表达和NSCC增殖增加。因此，我们可以证明CSC ev在PDAC生物学中的作用。与我们的发现一致的是，先前的研究表明Rab27a的高表达预示着PDAC患者的生存期较差，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba其在小鼠PDAC细胞系中的下调会抑制转移。gydF4y2Ba57gydF4y2Ba
我们发现，在CSC ev和非囊泡部分中，agrin显著富集，这是意料之中的，因为它的膜锚定和分泌亚型。gydF4y2Ba58gydF4y2BaAgrin在肝细胞癌和胰腺癌中起致癌作用，与PDAC的不良预后相关。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba该蛋白多糖也被鉴定为一种在PDAC中以Kirsten ras癌基因同源物(KRAS)依赖的方式过表达的表面组蛋白，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba以及PDAC癌细胞中促进上皮到间质转变的母体体蛋白上调。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba我们证明了这一点gydF4y2Ba+gydF4y2Baev调节YAP活性。由于我们也在非囊泡组分中观察到agin，我们不能排除两种形式的agin对观察到的表型有贡献的可能性。gydF4y2Ba
YAP是PDAC中已知的致瘤驱动因子，尽管Hippo/YAP信号通路基因畸变的肿瘤很罕见，gydF4y2Ba33 59gydF4y2Ba这表明YAP激活是由非遗传机制驱动的，其中包括对Hippo激酶的抑制。gydF4y2Ba60gydF4y2Baagin与细胞表面的LRP-4和整合素结合使merlin和LATS1/2失活，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba直接磷酸化YAP，导致其细胞质滞留。gydF4y2Ba45gydF4y2Ba通过抑制agin来限制YAP的转录功能有望抑制肿瘤的发展。为了支持这一假设，我们观察到，与NSCC相比，CSC和相关EVs中agrin的下调减缓了肿瘤的生长，最重要的是抗agrin治疗损害PDX癌细胞的增殖。这些结果依赖于LRP-4和YAP的激活，因为LRP-4的下调或YAP的抑制会阻碍CSC EVs中由agrin介导的表型。此外，我们还发现了NSCC中agin -β1整合素和dag1的另外两个受体。这些都与YAP的调控有关，可能为agin对YAP活性的影响提供了替代机制。gydF4y2Ba61 62gydF4y2Ba总之，我们的结果证明了PDAC中agin - yap信号的影响，至少部分由CSC ev促进。YAP的激活不仅负责细胞增殖，还在成纤维细胞转化为CAFs中发挥作用gydF4y2Ba63gydF4y2Ba以及t细胞功能的抑制。gydF4y2Ba64gydF4y2Ba因为我们证明了CSCgydF4y2Ba+gydF4y2Baev调节NSCC中的YAP活性，也有可能这些囊泡参与了肿瘤微环境的重编程，这也是先前认为的癌症ev的作用。gydF4y2Ba13 65 66gydF4y2Ba尽管我们的数据支持agin和hippo通路在PDAC发病机制中作为从CSC到NSCC的evc介导的通信的调节和效应器的作用，但总可以认为这些分子在CSC生物学中有额外的多效作用。为了支持我们的结果的特异性，我们已经证明了lrp -4依赖的YAP及其下游靶点被CSC ev激活，导致NSCC增殖增加，而不调节Rab27a或agrin的表达。gydF4y2Ba
最后，一些生物标记物被描述为在诊断和监测PDAC中有用，但缺乏生物标记物来告知PDAC肿瘤的治疗和表型特征。gydF4y2Ba67 - 69gydF4y2Ba我们展示了cAGRNgydF4y2Ba+gydF4y2BaEVs与CSC标记CD133阳性的循环EVs水平相关。这进一步证实了EVs中存在的agrin主要来源于CSC，这也得到了其在手术中显著降低的支持。cAGRN显著降低gydF4y2Ba+gydF4y2Ba与其他方案相比，folfirinox在PDAC中的治疗效果与基于folfirinox的治疗效果一致。gydF4y2Ba70 71gydF4y2Ba此外，我们观察到cAGRN水平升高gydF4y2Ba+gydF4y2Baev意味着疾病进展风险增加三倍。我们的研究结果突出了cAGRN的潜力gydF4y2Ba+gydF4y2BaEVs作为患者肿瘤中CSC含量的间接衡量指标，因此与不良预后和治疗耐药性相关。cAGRN含量增加的观察结果进一步支持了这一观点gydF4y2Ba+gydF4y2BaEVs先于影像学检查进展。最后，我们的数据表明，抗agrin治疗可以靶向PDAC中的CSC，这在克服治疗耐药性和防止癌症进展方面具有很大的潜力。gydF4y2Ba
最后，我们首次对EVNet进行了描述。我们发现，这种有组织的通信网络具有可塑性，使癌细胞能够适应恶劣的环境，从CSC到NSCC的通信路径对肿瘤的进展至关重要。我们发现agin是CSC EVs的重要载体，促进受体细胞中YAP的活性，进而导致PDAC的进展。最后，我们提供了cAGRNgydF4y2Ba+gydF4y2BaEVs可作为PDAC的预后生物标志物。我们的结果可能具有深远的临床意义，因为我们证明了在PDAC中，agrin是损害CSC功能的潜在靶点。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
“源数据”文件包含所有与稿件相关的源数据，存放在gydF4y2BaFigshare数据复位器gydF4y2Bay。gydF4y2Ba72gydF4y2Ba
细胞培养gydF4y2Ba
在我们的研究中使用了以下细胞系:人类PDAC细胞系:MIA PaCa-2 (ATCC Cat# CRL-1420, RRID:CVCL_0428);PANC-1 (ATCC Cat# CRL-1469, RRID:CVCL_0480)， BxPC-3 (ATCC Cat# CRL-1687, RRID:CVCL_0186);和T3M4 (RCB Cat# RCB1021, RRID:CVCL_4056，由Christoph Kahlert博士提供，德国德德斯顿卡尔古斯塔夫卡鲁斯工业大学)和293T (ATCC Cat# CRL-3216, RRID:CVCL_0063)细胞。在我们的研究中，所有的细胞都被检测支原体，所有的细胞都是STR型。gydF4y2Ba73gydF4y2Ba所有细胞在添加10% (v/v)胎牛血清(FBS, Gibco)、100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素(Gibco)的RPMI-1640培养基(Gibco)中培养。所有来自上述细胞系的稳定克隆和亚群都在相同的条件下培养。人PDAC肿瘤PDXs的原代培养物在添加20% (v/v) FBS 100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素的rmi -1640培养基中培养。所有细胞株保存在5%的CO中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在潮湿的空气中37°C。gydF4y2Ba
转染和慢病毒转导gydF4y2Ba
为了培养表达彩色编码EVs的MIA PaCa-2细胞系的稳定克隆，通过EcoRI-XhoI位点通过PCR方法将以下质粒插入pLVX Puro主干(RRID:Addgene_66604): CD63-turboGFP (Origene RG217238)、YFP-CD82 (RRID:Addgene_1819)和tdTomato-CD81-10 (RRID:Addgene_58078)。通过NheI-BamHI位点将Rab5B编码区(分子云OHu20962)克隆到pmPlum质粒(RRID:Addgene_54629)中，最终通过PCR方法将得到的Rab5B- mplum序列通过EcoRI-XhoI位点插入pLVX Puro骨干中，生成Rab5-mPlum质粒。gydF4y2Ba
为了转译MIA PaCa-2，通过使用Lipofectamine 2000 (ThermoFisher 11 668-019)将前面提到的表达质粒加上psPAX2包装质粒(RRID:Addgene_12260)和VSV/G包膜质粒(RRID:Addgene_8454)转染293 T细胞产生慢病毒颗粒。转染72小时后收集培养基，在MIA PaCa-2细胞转导前使用0.2 μ m过滤器(Whatman)过滤。添加聚苯乙烯可提高病毒感染效率(10µg/mL)。感染后用嘌呤霉素(1 μg/mL Sigma-Aldrich P8833)，根据荧光蛋白的表达进行荧光激活细胞分选(FACS)，获得稳定的克隆。gydF4y2Ba
在下调实验中，分别通过PCR法和GenScript ClonEZ法通过agi - ecori位点将Rab27A shRNA(5’-CCCAGTGTACTTTACCAATATA-3’)和scramble shRNA(5’-CAACAAGATGAAGAGCACCAA-3’)(Mission shRNA Sigma-Aldrich)克隆到pLKO-Tet-ON (RRID:Addgene_21915)中。另外，前面提到的Agrin shRNA(5’- cgacgugugcugugaagaatt -”)和scramble shRNA通过NheI/XcmI位点通过PCR方法克隆到pCW57.1-MAT2a (RRID:Addgene_100521)中。如前所述，产生慢病毒颗粒。用Blasticidin (VWR A3784.0010)选择agin shRNA克隆。gydF4y2Ba
流式细胞术gydF4y2Ba
染色前，将PDAC细胞系的单细胞悬浮液用阻断缓冲液(FBS 10%在磷酸盐缓冲盐水(PBS) 1×)在冰上阻断15分钟。接下来，细胞以每分钟1200转(RPM)的速度离心5分钟，并与染色缓冲液中的抗体混合物(FBS 2% in PBS 1×)在冰上孵育30分钟，以确定本研究中使用的癌症亚群:CD24gydF4y2Ba+gydF4y2Ba44gydF4y2Ba+gydF4y2BaEPCAMgydF4y2Ba−gydF4y2BaCD133gydF4y2Ba−gydF4y2Ba, CD24gydF4y2Ba−gydF4y2Ba44gydF4y2Ba+gydF4y2BaEPCAMgydF4y2Ba−gydF4y2BaCD133gydF4y2Ba−gydF4y2Ba, CD133gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD24gydF4y2Ba−gydF4y2Ba44gydF4y2Ba−gydF4y2BaEPCAMgydF4y2Ba−gydF4y2Ba, EPCAMgydF4y2Ba+gydF4y2BaCD133gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD24gydF4y2Ba−gydF4y2Ba44gydF4y2Ba−gydF4y2Ba和CD24gydF4y2Ba−gydF4y2Ba44gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD133gydF4y2Ba−gydF4y2BaEPCAMgydF4y2Ba−gydF4y2Ba(4 n)。使用的抗体为CD24-PE 1:8 (BD Biosciences Cat# 555428, RRID: ab_2650822)、CD44-APC 1:40 (BD Biosciences Cat# 560890, RRID:AB_2033959)、CD133-PE Vio770 1:4 (Miltenyi Biotec Cat# 130-102-891, RRID:AB_2660071)、CD133-PE- cy7 1:62.5 (BioLegend Cat# 372810, RRID:AB_2686968)、epcam -异硫氰酸荧光素(FITC) 1:16 (Sigma-Aldrich Cat# SAB4700424, RRID:AB_10896600)、EPCAM-FITC 1:8 (Abcam, Cat# ab8666, RRID:AB_306701)和EPCAM-PerCP-Cy5 1:32 (BioLegend Cat# 369803, RRID:AB_2650899)。随后，细胞用PBS 1×洗涤两次，并通过35 μ m细胞滤网过滤，然后在BDFACS Aria II细胞分选机上进行细胞分选(BD Biosciences)。gydF4y2Ba
来自PDAC GEMMs和PDXs的肿瘤被切碎并在消化缓冲液(0012% disase II Sigma-Aldrich D4693, 0012% Collagenase Sigma-Aldrich C7657 in HBSS 1×)中消化20分钟，37°C，缓慢搅拌。然后，在HBSS 1×中加入阻断缓冲液(FBS 10%)停止消化，600离心gydF4y2BaggydF4y2Ba然后，细胞通过70 μ m的过滤器(Falcon)过滤，与红细胞裂解缓冲液在室温下孵育5分钟。过量添加HBSS 1×以停止反应，并按前面描述的方法将细胞离心以获得单细胞悬浮液。不同PDAC亚群的染色方案和随后的细胞分选与先前描述的PDAC细胞系相同。用于分离小鼠PDAC亚群的抗体为CD133-APC 1:40 00 (Thermo Fisher Scientific Cat# 17-1331-81, RRID:AB_823120)、CD24-FITC 1:3000 (BD Biosciences Cat# 553261, RRID:AB_394740)、CD44-PerCP-Cy5.5 1:50 00 (BD Biosciences Cat# 560570, RRID:AB_1727486)和EPCAM-PE 1:350 (BD Biosciences Cat# 563477, RRID:AB_2738233)。此外，一种活性染料被用来排除死细胞(固定活性染料eFluor 780 1:10 000 eBioscience 65-0865-14)。gydF4y2Ba
为了通过流式细胞术评估Agrin ev的存在，请访问5×10gydF4y2Ba9gydF4y2Baev用醛/硫酸盐4µm珠旋转孵育45 min。加入1 M甘氨酸，室温下旋转孵育1小时。12 000 RPM离心2分钟后，丢弃上清，珠粒重悬于10%的牛血清白蛋白(BSA)中，旋转孵育45分钟。接下来，珠粒被重悬在20 μ L的2% BSA中。10微升用于一抗和二抗体孵育，另外10µL用于只与二抗体孵育(对照)。抗agrin抗体孵育在4°C和轮流进行(1:25 Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-374117, RRID:AB_10947251)。第二天，使用2%的牛血清白蛋白洗涤步骤。接下来，用二抗在室温下孵育30分钟(Donkey anti - ouse IgG Alexa 488 1:100 Molecular Probes Cat# A-21202, RRID:AB_141607)。在BDFACS第二章(BD生物科学)的FACS分析之前，使用2%的BSA进行洗涤步骤。作为门控策略，第一个珠在正向散点高度(FSC-H)和侧散点高度(SSC-H)图中被识别。 Finally, single beads were analysed for FITC signal. Gate is selected at 103.gydF4y2Ba对于控制样品和激光功率调整，直到在控制中检测到1%的阳性。完全相同的样本，但包含感兴趣的抗体(实验样本)是具有完全相同设置的符文。对于每个样本，都要重复这个过程。分析cAGRNgydF4y2Ba+gydF4y2BaEVs和cCD133gydF4y2Ba+gydF4y2Ba对血清患者样本进行EVs盲法。gydF4y2Ba
球体形成分析gydF4y2Ba
对MIA PaCa-2亚种群进行排序(门控策略gydF4y2Ba在线补充图1BgydF4y2Ba)在DMEM-F12(康宁Cat# 10 - 090 CV)中添加1µg/mL氢化可的松、4 ng/mL肝素、10 ng/mL EGF和20 ng/mL FGF和1%青霉素/链霉素(Gibco)培养于超低黏附六孔板(康宁3471)中。球体在第23天用光学显微镜成像(BZ-X710, Keyence, 4×物镜)，并在斐济测量其面积(斐济，RRID:SCR_002285)。gydF4y2Ba
可行性分析gydF4y2Ba
MIA PaCa-2 Tet-On shRab27a细胞(未处理和强力霉素200 ng/mL处理)暴露于常氧(21% OgydF4y2Ba2）gydF4y2BaO /缺氧(1%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)或吉西他滨(Sigma Cat# G6423, 1 uM)/载药(细胞培养级水，康宁Cat# 25-055 CV)，持续72小时。gydF4y2Ba
根据手册说明，用FITC annexin V和7-AAD凋亡检测试剂盒(BioLegend Cat# 640922)对细胞进行胰蛋白酶化，并评估细胞活力/凋亡。作为阳性对照，活细胞(未暴露于吉西他滨或缺氧)在95°C煮5米，并加入活细胞。染色细胞用BD LSRFortessa X-20系统(RRID:SCR_019600)进行分析。李ve cells were considered as 7-aminoactinomycin D (7AAD) and annexin V negative, early apoptosis as annexin V positive, late apoptosis as annexin V and 7AAD positive and dead/necrosis as 7AAD positive.
免疫荧光分析gydF4y2Ba
培养后，去除培养基，用PBS冲洗封面。细胞用4%多聚甲醛PBS 1×室温固定10 min, PBS 1×冲洗3次。用0.03% Triton-X100在PBS 1×中渗透15分钟。用PBS 1×冲洗三次，然后在室温下用10% FBS 0.01% Triton-X100在PBS 1×中阻塞1小时。gydF4y2Ba
覆盖体与一抗在2% FBS 0.01% Triton-X100中孵育，4℃过夜。然后用PBS 1×冲洗4次，与二抗(1:40 00)和伐洛菌素(1:50 00)孵育1.5小时。用PBS 1×冲洗4次。用Hoescht (Invitrogen) 1:5000溶液在0.01% Triton-X100 PBS 1×中孵育核盖片。封面被安装在玻璃载玻片延长钻石抗褪色mount (Invitrogen)。gydF4y2Ba
对于关于gydF4y2Ba图6A和BgydF4y2Ba(两个复制),(gydF4y2Ba在线补充图5CgydF4y2Ba(2个重复)采用抗活性YAP (Abcam Cat# ab205270, RRID:AB_2813833)，浓度为1:200，抗兔Alexa 488偶联二抗为1:400 (Abcam Cat# ab150077, RRID:AB_2630356)。Alexa 568结合phalloidin (Invitrogen A12380)以1:500稀释。对实验gydF4y2Ba在线补充图5AgydF4y2Ba)(两个重复)使用抗总YAP 1:200 (Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-376830, RRID:AB_2750899)。对于关于gydF4y2Ba图5 dgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在线补充图5DgydF4y2Ba)抗lrp -4(赛默飞世尔科学猫# MA5-27674, RRID:AB_2735260)用于1:100稀释，抗agrin (Abcam猫# ab85174, RRID:AB_1860988)用于1:200稀释。为gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba，用1:20 00的抗小鼠Alexa488偶联二抗(Molecular Probes Cat# A-21202, RRID:AB_141607)标记LRP-4，用1:40 00的抗兔Alexa488偶联二抗体(Abcam Cat# ab150077, RRID:AB_2630356)标记Agrin。在gydF4y2Ba在线补充图5DgydF4y2Ba使用一种Alexa594二抗(Thermo Fisher Scientific Cat# a - 2203, RRID:AB_141633)标记LRP-4。gydF4y2Ba
显微成像和分析gydF4y2Ba
MIA PaCa-2彩色编码培养物被镀在Ibidi多孔板上，底部有盖，在37℃5% CO培养箱中培养72小时gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(共7个重复)。成像前，培养细胞培养基改为无酚完全RPMI培养基(Gibco)。gydF4y2Ba
采用徕卡TCS SP5倒置共焦系统，在37℃下使用HCL PL APO CS 40×/ N.A. 1.3油物镜对活细胞进行成像。采用顺序采集的方法分别获得488、514、561和594 nm的荧光蛋白(turboGFP、eYFP、tdtomato和mPlum)。图像采集采用平铺扫描。在图像分析之前，使用LAS AF软件(徕卡应用套件X, RRID:SCR_013673)中的通道染料分离工具校正通道串扰，其中手动选择每个通道的参考。在斐济手动分割单个细胞(斐济，RRID:SCR_002285)，使用脚本将getHistogram函数应用到添加到ROI管理器的单细胞感兴趣区域(ROI)，获得单细胞256 bin直方图。在低氧条件下，采用基于边缘检测和Sobel滤波的图像自动分割。gydF4y2Ba
通过在没有细胞存在的aROI中测量像素强度，手动确定每个通道(或荧光报告器)的背景水平。在MATLAB V.R2016A (MATLAB, RRID:SCR_001622)中进行如下分析:通过对每个信道的背景级以上像素频率求和来确定原始小区信道，包括相应的子种群，其中最大的和值被认为是原始信道。通信速率由像素的存在与否决定，其强度高于每个通道的阈值水平。通过测量每个通道/荧光报告器阳性细胞的强度范围来确定阈值。像素超过阈值的单元格被分类为“1”，而像素为正数的单元格被分类为“0”。对每个通道进行分类，并计算每个报告器的接收单元的百分比。在斐济(斐济，RRID:SCR_002285)对呈现的图像进行裁剪和对比度优化。gydF4y2Ba
Tet-On和Tet-Off共培养物被镀成10毫米的盖片，置于24孔板中，在37°C、5% CO培养箱中培养72小时gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．用莱卡TCS SP5倒置共聚焦系统，HCL PL APO CS 63 x/N.A.获得YAP-1染色培养物(二抗体Alexa 488)图像1.40油目的。每个条件下获取6张具有5个z堆栈的图像。在斐济(斐济，RRID:SCR_002285)获得的z最大投影图像中进行量化。利用Hoescht信号分割细胞核，在cell Profiler V.3.1.9 (CellProfiler Image Analysis Software, RRID:SCR_007358)中测量YAP-1单细胞核强度。gydF4y2Ba
使用HCL PL APO CS 63 x/N.A.，在徕卡TCS SP5倒置共聚焦系统中获取经CSC-CD63-turboGFP EVs处理的LRP-4、Agrin和LRP-4染色的nsscc Z-stack图像1.40油物镜和光学变焦。在斐济(斐济，RRID:SCR_002285)，呈现的图像进行了最大z投影、裁剪和对比度优化。gydF4y2Ba
荧光微吸收gydF4y2Ba
将MIA PaCa-2细胞与带有-COOH官能团的绿色荧光聚苯乙烯微球(100 nm EPRUI纳米颗粒&微球公司，EPRUI- gf - 100c)按每个细胞10 000个微球的比例孵育24小时(实验三次重复)。第二天，获得单细胞悬液，如前所述，进行染色方案，以确定癌细胞亚群CD24gydF4y2Ba+gydF4y2Ba44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba, CD24gydF4y2Ba−gydF4y2Ba44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba, CD133gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和4 n。所用抗体为CD24-PE 1:8 (BD Biosciences Cat# 555428, RRID:AB_395822)、CD44-APC 1:40 (BD Biosciences Cat# 560890, RRID:AB_2033959)、CD133-PE-Cy7 1:62.5 (BioLegend Cat# 372810, RRID:AB_2686968)和EPCAM-PerCP-Cy5 1:32 (BioLegend Cat# 369803, RRID:AB_2650899)。随后，在BDFACS第二章(BD生物科学)中进行FACS分析。gydF4y2Ba
如前所述，用吉西他滨(Sigma Cat# G6423, 1 uM)或载体(细胞培养级水，康宁Cat# 25-055 CV)处理3天的MIA PaCa-2细胞与绿色聚苯乙烯微珠孵育。次日，在BD LSRFortessa X-20系统RRID:SCR_019600中检测Alexa 488阳性细胞的百分比。gydF4y2Ba
老鼠gydF4y2Ba
C57BL/6 (IMSR Cat# JAX:000664, RRID:IMSR_JAX:000664)和Rag2gydF4y2Ba−−/gydF4y2BaIlrg2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba(IMSR Cat# JAX:014593, RRID:IMSR_JAX:014593)小鼠的胰腺原位注射来自PDAC细胞系、PDAC GEMMs或PDAC PDXs的细胞。通过皮下植入性别匹配的Rag2胰腺活检材料建立PDAC PDXsgydF4y2Ba−−/gydF4y2BaIlrg2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba(IMSR Cat# JAX:014593, RRID:IMSR_JAX:014593)小鼠。对于胰腺，采用消化肿瘤的原位注射细胞。使用的细胞数量根据实验的不同而不同。简单地说，在驯化约3天后，s小鼠被腹腔内给药氯胺酮/羟嗪溶液(12.5 mg/kg, 12.5 mg/kg)麻醉，然后皮下给药丁丙诺啡溶液(0.08 mg/kg)。在左腹部做一个小切口，将胰腺暴露在无菌纱布上，纱布包埋氯化钠0.9%。使用汉密尔顿注射器，我们将细胞缓慢地注入老鼠的胰腺。然后，用PGA缝合线(Surgicryl PGA 6-0)依次闭合腹膜和皮肤层。之后，通过皮下给药阿替帕咪唑溶液(2.5 mg/kg)逆转麻醉效果。用于Mia PaCa-2 Tet-ON shRab27A或Mia PaCa-2 Tet-OFF shAgrin克隆相关实验的小鼠，分别饲喂添加强力霉素的饲粮(+625 mg/kg强力霉素720 ppm羟酸强力霉素，ssnif)或标准饲粮作为对照。超声监测肿瘤生长(Micro超声Vevo 2100, RRID:SCR_015816)。 Mice were euthanised when the tumour reached 1500 mm3.gydF4y2Ba或者出现严重症状时gydF4y2Ba
Rag2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠是Nuno Alves博士，i3S，波尔图，葡萄牙和Ilrg2送的礼物gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠是法国巴黎巴斯德研究所的詹姆斯·迪·桑托博士好心送的礼物。gydF4y2Ba74gydF4y2BaC57BL/6小鼠来自i3S动物设施。gydF4y2Ba
KPC (gydF4y2BaPdx1-CregydF4y2Ba，gydF4y2BaLSL-KrasgydF4y2BaG12D / +gydF4y2Ba，gydF4y2BaLSL-Trp53gydF4y2BaR172H / +gydF4y2Ba)等位基因购自Jackson实验室:B6.FVB-Tg(Pdx1-cre)6Tuv/J (gydF4y2BaIMSR猫# JAX: 014647gydF4y2Ba，gydF4y2BaRRID: IMSR_JAX: 014647gydF4y2Ba）;B6.129S4-Krastm4Tyj/J (IMSR Cat# JAX:008179, RRID:IMSR_JAX:008179);129S-Trp53tm2Tyj/J (IMSR Cat# JAX:008652, RRID:IMSR_JAX:008652)，以及aglin floxed等位基因B6;129- agntm1rwb /J (IMSR Cat# JAX:031788, RRID:IMSR_JAX:031788)。gydF4y2Ba
Rab27AgydF4y2BaFrt / FrtgydF4y2Ba等位基因是与Cyagen公司合作开发的。Rab27A基因外显子4被选为条件敲除(cKO)区域。cKO区域首先在3 '端被验证过的Rox-neomycin-Rox-Frt3盒和在5 '端被单个Frt3位点包围。以C57BL/6J文库中BAC克隆RP23-10I10和RP23-336J19为模板，PCR生成同源臂和cKO区。3 '通过融合酶克隆到基本载体中，基本载体来源于AflII/ indiii的消化产物。随后通过诊断PCR、酶切酶切和测序证实其为正确的靶向载体。5 '区和cKO区用In-Fusion酶克隆，最终载体来自PmeI/AsisI的消化产物。随后通过诊断PCR、酶切酶切和测序证实其为正确的靶向载体。然后，该质粒与NotI线性化，用于ES细胞电穿孔(C57BL/6)。对新霉素进行药物筛选，获得366个耐药克隆。 PCR screening confirmed six potentially targeted clones and all of them were confirmed correct by Southern blotting. Afterwards, selected ES cells were used for blastocyst injection, followed by chimaera production. Neo cassette flanked by Rox sites was self-deleted during germline transmission and is not present in the final construct.
R26赛车gydF4y2BaLSL-FLPoERT2 / +gydF4y2Ba由美国水牛城罗斯威尔帕克癌症研究所的大卫·古德里奇博士提供。gydF4y2Ba
KPC iRab27AgydF4y2BaFrt / FrtgydF4y2Ba（gydF4y2BaPdx1-Cre;LSL-KrasgydF4y2BaG12D / +gydF4y2Ba，gydF4y2BaLSL-Trp53gydF4y2BaR172H / +gydF4y2Ba, R26gydF4y2BaLSL-FLPoERT2 / +gydF4y2Ba, Rab27AgydF4y2BaFrt / FrtgydF4y2Ba)以与KPC小鼠相似的方式发展自发的PDAC肿瘤。在产后0、1、2、4天，母犬灌胃6 mg玉米油稀释他莫西芬(20 mg/mL Sigma-Aldrich T5648)，哺乳后给予他莫西芬诱导重组。gydF4y2Ba
多名研究人员在PDAC GEMMs和PDAC PDXs中进行了Nexinhib20 (Sigma-Aldrich SML1919)治疗(未进行非盲注射)。KPC小鼠从16周龄开始，每周治疗两次(腹腔注射，20 mg/kg)。DMSO 5%，对照。当出现严重的症状，如身体成分低，黄疸和腹水时，对小鼠实施安乐死。Rag2gydF4y2Ba−−/gydF4y2BaIlrg2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba使用IBM SPSS V.25和V.26中实现的随机函数将注射了PDAC PDX细胞的小鼠随机分配到治疗组，Nexinhib20或DMSO 5%，检测到肿瘤块(平均183mm)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)对所有实验动物进行超声检查。小鼠每周治疗两次(腹腔注射，20mg /kg)，持续4周，最后一次治疗后安乐死。gydF4y2Ba
在PDAC PDXs中也进行了Nexinhib20的体外处理。CSC (CD133gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD24gydF4y2Ba+gydF4y2Ba44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)从PDAC PDXs中分离出来，用1µM Nexinhib20处理4小时，NSCC (CD24gydF4y2Ba−gydF4y2Ba44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和4N)未处理。对照组对应于用DMSO (vehicle)治疗的CSC和未治疗的NSCC。随后，将CSC和NSCC原位注入胰腺(在PDX肿瘤中发现的比例相同)，如前所述。gydF4y2Ba
对于在体内的表现gydF4y2Ba图4和7gydF4y2Ba对MIA PaCa-2 Tet-On shRab27A/Scramble和Tet-Off shAgrin/Scramble亚群体进行分类、混合并成对注射(对照组和强力霉素)。对于每个复制(对)，执行独立的排序。gydF4y2Ba
在研究之前，通过幂次分析估计样本量(显著性0.05，幂次80%)。gydF4y2Ba
患者血清和组织收集gydF4y2Ba
PDAC患者的血清样本来自葡萄牙葡京Beatriz医院Ângelo，以及葡萄牙波尔图Centro医院de São João (CHSJ)的PDAC患者。从两家医院纳入本研究的所有患者中获得知情同意。2016年10月至2019年1月在CHSJ进行了一项横断面研究，包括62例PDAC患者。所有PDAC患者在内镜超声(EUS)引导下进行组织采集，然后采集血液样本。临床资料包括年龄、性别和肿瘤分期。排除标准包括年龄小于18岁、怀孕/哺乳、无法进行内镜手术或造影剂注射、CT或MRI禁忌症、凝血功能障碍(凝血酶原时间>为对照组的50%，活化部分凝血活酶时间(aPTT) > 50s或国际标准化比值(INR) >1.5)、正在接受慢性抗凝治疗和血小板计数低于50x10的患者gydF4y2Ba9gydF4y2Ba/ L。从PDAC患者收集的组织被皮下植入免疫缺陷小鼠Rag2gydF4y2Ba−−/gydF4y2BaIlrg2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba，以建立PDXs。成功的植入物在小鼠体内最多通过6个通道，实验在胰腺原位进行。gydF4y2Ba
2017年10月至2019年10月在Beatriz Ângelo医院进行了一项纵向研究，包括44名PDAC患者。所有患者在随访期间的不同时间点进行血样采集。临床信息包括年龄、性别、肿瘤分期、手术时间、治疗方案和各自的时间表和CA19.9水平。本队列中的患者在Beatriz Ângelo医院或da Luz医院接受随访，在本研究前未接受手术和/或化疗。gydF4y2Ba
采集的血液样本于2000年离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C放置10分钟，收集上清(血清)，速冻。血清样品保存在−20°C。gydF4y2Ba
失明与我们的研究无关。gydF4y2Ba
EVs隔离gydF4y2Ba
PDAC细胞的ev是从细胞上清液中获得的。细胞在添加无ev胎牛血清的RPMI培养基中培养72小时。接下来，培养基在2500转/分离心10分钟，然后在4000转/分离心5分钟，以清除细胞碎片。然后，使用200 nm过滤器(GE Healthcare)过滤培养基，并在10万温度下超离心gydF4y2BaggydF4y2Ba一夜之间在4°C。次日，弃上清，将EVs颗粒重悬于8M/2.5%十二烷基硫酸钠(SDS) -尿素(Sigma Aldrich)溶液中进行LC-MS/MS，或100 μ L PBS 1×进行FACS、TEM或Image Stream。对每个样品进行NanoSight NS300 (NTA, RRID:SCR_014239)分析。gydF4y2Ba
对于来自PDAC GEMMs或PDXs肿瘤的细胞分泌的ev数量的体外评估，如前所述获得单细胞悬液，并在处理和对照条件下镀上相同数量的细胞。然后，细胞用1µM Nexinhib20在添加ev - depletion FBS的RPMI培养基中处理72小时。以DMSO作为相应体积的对照。72小时后，收集细胞培养基，并使用总外泌体分离试剂(来自细胞培养基)(赛默飞世尔科学，4478359)分离ev。gydF4y2Ba
从人血清样本中分离EV。血清(200µL)在10 000 RPM下离心2 min，然后用1× PBS(400µL)稀释，用200 nm滤镜过滤。接下来，样品在10万温度下进行超离心gydF4y2BaggydF4y2Ba一夜之间在4°C。次日，将EV颗粒重悬于300 μ L PBS 1×中，用于NanoSight NS300 (NTA, RRID:SCR_014239)分析。gydF4y2Ba
凝胶排阻层析法gydF4y2Ba
通过超离心(如前所述)分离的MIA PaCa-2 ev根据Kugeratski中描述的方法进一步纯化gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba75gydF4y2Ba简单地说，qEV原柱为35 nm (Izon SP5)，从500 μL的25个馏分中分离500 μL的ev制剂(1 ~ 6馏分被丢弃)。在下游分析中，馏分7-10和馏分11-25被聚集在一起，并通过超离心(10万gydF4y2BaggydF4y2Ba3小时)。用预制聚丙烯酰胺梯度凝胶(Bolt 4%-12% Bis Tris Plus, Invitrogen)进行western blot分析，并用半干系统(Trans-Bolt turbo, Biorad)转移到甲醇活化的聚偏二氟乙烯(PDVF Transblot turbo, Biorad)膜上。用抗兔辣根过氧化酶(HRP) (1:5000 CST Cat# 7074S RRID:AB_2099233)和抗鼠辣根过氧化酶(1:2000 R&D Cat# HAF007 RRID:AB_357234)二抗分别检测EVs标记syntenin-1 (1:5000, Abcam Cat# ab133267,RRID:AB_11160262)和Alix (1:1000 CST Cat# 2171, RRID:AB_2299455)的表达。gydF4y2Ba
根据Kugeratski中描述的方法，将EV与醛/硫酸盐珠(Invitrogen, Cat# A37304)耦合，实现EV跨膜标记CD9、CD81和CD63的表达gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba75gydF4y2Ba采用抗cd9 (Sigma-Aldrich, Cat# SAB4700092 RRID:AB_10900636)、抗cd63 (BD, Cat# 556019 RRID:AB_396297)、抗cd81 (BD, Cat# 555675 RRID:AB_396297)以及二抗抗小鼠Alexa 488 (Invitrogen Cat# a212202, RRID:AB_141607)检测这些EV标记。gydF4y2Ba
Optiprep密度梯度gydF4y2Ba
MIA PaCa-2 EV制剂(如前所述，通过超离心分离)底部加载到Kugeratski中描述的Optiprep密度梯度中gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba75gydF4y2Ba简单地说，将500 μL的EVs制剂以36%的浓度(终体积2.5 mL)混合到Optiprep (Sigma, Cat# D1556)中，装入超离心管中。接下来，依次将30%、24%、18%和12% Optiprep浓度(2.5 mL)的2.5 mL分层在顶部。梯度在12万离心15小时gydF4y2BaggydF4y2Ba(无断，SW41转子，贝克曼coulter)。然后，收集1 mL的12个馏分，重悬在11 mL PBS 1×中，在12万离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4小时。每段球粒重悬于40 μL裂解缓冲液(8 M尿素，2.5% SDS, cComplete 1× (Roche)和PhosphoSTOP 1× (Roche))中。gydF4y2Ba
如前面所述，对CD81 (1;5000 Santa Cruz Cat# sc-166029, RRID:AB_2275892) syntenin-1 (1:5000, Abcam Cat# ab133267, RRID:AB_11160262)， Alix (1:1000 CST Cat# 2171, RRID:AB_2299455)和非ev标记HSP90 (1:1000 CST Cat# 4877S, RRID:AB_2233307)和组蛋白H3 (1:1000, Abcam Cat# ab201456, RRID:AB_2650560)进行western blot分析。gydF4y2Ba
为了进行agrin检测(1:20 00 Abcam Cat# ab85174, RRID:AB_1860988)，在湿转移系统(Biorad)中转移到0.45 μ m PDVF甲醇激活膜(Immobilion Cat# IPVH00010，默克)。gydF4y2Ba
Antirabbit-HRP (1:20 00, AbcamgydF4y2Ba猫#gydF4y2Baab16284, RRID:AB_955387)检测Alix、HSP90、组蛋白H3和agrin;antirabbit-HRP (1:5000 CST Cat# 7074S RRID:AB_2099233)用于检测syntenin-1;和抗小鼠hrp(1:2000研发gydF4y2Ba猫#gydF4y2Ba用HAF007 RRID:AB_357234)检测CD81。gydF4y2Ba
细胞暴露于缺氧或吉西他滨的EV特征gydF4y2Ba
MIA PaCa-2细胞(三倍)暴露于缺氧(1%OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba) / normoxia(21%啊gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)或吉西他滨(1µM)/载具(细胞培养级水)培养72小时，并在RPMI培养基中添加evs耗尽的FBS。如前所述收集ev，并将球粒重悬于100 μ L PBS 1×中。western blot取各条件下的EV制剂20µL装入凝胶中。使用CD81 (1:5000 Santa Cruz Cat# sc-166029, RRID:AB_2275892)、syntenin-1 (1:5000, Abcam Cat# ab133267, RRID:AB_11160262)和CD9 (1:1000, Abcam Cat# ab263019)检测ev。gydF4y2Ba
anti- rabbit- hrp 1:5000 (CST Cat# 7074S, RRID:AB_2099233)用于syntenin-1, anti- rabbit- hrp 1:2000 (Abcam, Cat# ab16284, RRID:AB_955387)用于CD9, anti-mouse-HRP (1:2000 R&D Cat# HAF007, RRID:AB_357234)用于CD81。gydF4y2Ba
EV特征来自于暴露于Nexinhib20的细胞gydF4y2Ba
MIA PaCa-2细胞在RPMI培养基中添加无ev的FBS培养72小时，DMSO(5%)或Nexinhib20(1µM)存在。之后，根据Crescitelli的说法，电动汽车被分离出来gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba76gydF4y2Ba
简单地说，细胞碎片通过300℃的离心被清除gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟，2000度离心gydF4y2BaggydF4y2Ba上清于16 500离心gydF4y2BaggydF4y2Ba20分钟去除大泡，然后118000次gydF4y2BaggydF4y2Ba离心2.5小时，收集小泡。所有离心均在4°C下进行。gydF4y2Ba
western blot取各条件下的EV制剂20µL装入凝胶中。采用CD63 (1:50 00, BD Biosciences Cat# 556019, RRID:AB_396297)和β-actin (Sigma-Aldrich Cat# A3854, RRID:AB_262011)检测ev。使用乙酰胆碱酯酶(1:50 00,Abcam Cat# ab31276, RRID:AB_722529)和细胞色素C (1:20 00, Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-7159, RRID:AB_2090474)来确认分离的小EVs的纯度。gydF4y2Ba
透射电子显微镜法gydF4y2Ba
用透射电镜对EV进行表征，如之前在Théry中所述gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba77gydF4y2Ba
图像流gydF4y2Ba
从50 mL MIA PaCa-2细胞上清中收集ev，在RPMI培养基中添加ev耗尽的FBS培养72小时。按前面所述进行EV分离。然后将EV颗粒重悬于100 μ L PBS 1×中，分为4个条件进行CD63、CD81、CD82和Rab5的分析。在ImageStream中检测之前，使用与流式细胞术分析Evs相似的协议gydF4y2BaxgydF4y2BaMarkII成像流式细胞仪(Luminex Amnis多光谱成像流式细胞仪，RRID:SCR_018589)。使用的初抗为抗cd63 1:40 00 (Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-15363, RRID:AB_648179)、抗cd81 1:40 00 (Abcam Cat# ab109201, RRID:AB_10866464)、抗cd82 1:40 00 (Abcam Cat# ab59509, RRID:AB_2076398)和抗rab5 1:40 00 (Cell Signalling Technology Cat# 46449, RRID:AB_2799303)。使用的二抗是驴抗鼠IgG Alexa Fluor 488 1:50 00(分子探针猫# A-21202, RRID:AB_141607)和山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488 1:50 00(赛默飞世尔科学猫# A-11034, RRID:AB_2576217)。对于每个样本，对照指的是只与二抗孵育的ev。gydF4y2Ba
液相色谱-电喷雾电离-串联质谱gydF4y2Ba
蛋白质消化gydF4y2Ba
样品用含有8.4 M尿素(USB公司，Cleveland, Ohio, USA)， 2.4 M硫脲(Sigma-Aldrich)， 2.5% SDS (Sigma-Aldrich)， 5 mM三(2-羧基乙基)磷酸(TCEP) (Sigma-Aldrich)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich)的朝向裂解缓冲液溶解，并在冰上孵育15分钟。在超声波浴Branson 2510 (Marshall Scientific, New Hampshire, USA)上超声5分钟，使颗粒均匀化。匀浆在20 000×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃孵育10分钟，取含有溶解蛋白的上清液进行进一步分析。然后，20µg的蛋白质用甲醇/氯仿法沉淀，再悬浮在20µL的多朝性样品溶液UTT缓冲液(7 M尿素，2 M硫脲，100 mM TEAB (Sigma-Aldrich))中。gydF4y2Ba
重悬样品用2µL的50 mM TCEP, pH 8.0，在37℃下还原60分钟，然后加入1µL的200 mM半胱氨酸阻断试剂MMTS (SCIEX, Foster City, California, USA)，室温下还原10分钟。样品用25 mM碳酸氢三乙胺(TEAB)稀释至140 μ L以降低尿素浓度。最后，在每个样品中加入1µg Pierce ms级胰蛋白酶(thermofisher Scientific)，以1:20 (w/w)的比例进行消化，然后在37°C的摇床上孵育过夜。样品消化在真空浓缩器中蒸发至干燥。gydF4y2Ba
液相色谱和质谱分析gydF4y2Ba
使用Stage-Tips和Empore 3M C18圆盘(Sigma-Aldrich)对消化样品进行清理/脱盐。使用纳米液相色谱系统(Eksigent Technologies nanoLC Ultra 1D Plus, SCIEX)耦合高速TripleTOF 5600质谱计(SCIEX TripleTOF 5600+质谱系统，RRID:SCR_018053)和Nanospray III源对每个消化样品的1µg进行1D-纳米LC esi - mms分析。分析柱为硅基反相Acquity UPLC m - class Peptide BEH C18柱，75µm×150 mm, 1.7µm粒径，130µÅ孔径(Waters)。捕集柱为C18 Acclaim PepMapTM 100 (Thermo Scientific)， 100 μ m×2 cm, 5 μ m粒径，100 μ Å孔径，与分析柱在线切换。加载泵以2µL/min的速度输送0.1%的甲酸水溶液。纳米泵的流速为250 nL/min，并在梯度洗脱条件下操作。使用250分钟的梯度从2%到90%流动相B(流动相a: 2%乙腈，0.1%甲酸;流动相B: 100%乙腈，0.1%甲酸)。注射量为5µL。gydF4y2Ba
数据采集采用TripleTOF 5600系统(SCIEX)。数据采集采用离子喷雾浮动电压2300 V，幕气35，界面加热器温度150C，离子源气体1为25C，聚束电位(DP) 100 V。所有数据采用信息依赖采集(IDA)模式，使用AnalystTF 1.7软件(SCIEX, AnalystTF software, RRID:SCR_015785)获取。对于IDA参数，在质量范围为350 - 1250 Da的0.25 s MS调查扫描之后，在质量范围为100 - 1800的质量范围内进行35次MS/MS扫描(总循环时间:4 s)。切换标准设置为离子大于质荷比(m/z) 350，小于m/z 1250，电荷状态为2-5，丰度阈值大于90次(cps)。原靶离子被排除15 s。利用IDA滚动碰撞能量(CE)参数脚本实现了对CE的自动控制。gydF4y2Ba
原始数据对齐和过滤器gydF4y2Ba
使用PeakView V.2.2软件(SCIEX, PeakView Software, RRID:SCR_015786)对获得的质谱数据进行处理。原始数据文件转换工具生成Mascot General Format (.mgf)文件，对EMBL-EBI参考蛋白质组库(基于UniProt release 2020_02、ensemble bl release 98和ensemble bl Genome release 45的2020_02版本的2020_02版本的Homo sapiens蛋白质数据库进行自定义数据库检索，包含20 596个蛋白质编码基因;(2)从cRAP库(版本日期为2019_03_04，gydF4y2Bahttps://www.thegpm.org/crap/gydF4y2Ba) (cRAP蛋白序列，RRID:SCR_018187)。MS-GF +软件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(release v2020_03_14) (Innovative Research Cat# IR-MS-GF, RRID:AB_1501658)被用作搜索引擎。搜索参数设置为:氨基甲酯c为固定修饰，Gln为焦糖-Glu (n项Q)、Glu为焦糖-Glu (n项E)、氧化(M)为变量修饰。多肽质量公差设置为±25ppm，允许两次漏切。生成相应的mzIdentML (.mzid)文件并加载到R环境中进行进一步的统计分析。gydF4y2Ba
每个样品定义质量测量误差±10ppm和MS-GF +光谱水平e值<1e-10阈值。gydF4y2Ba78gydF4y2Ba然后，应用Nelder-Mead优化，使假发现率(FDR)≤1%的肽水平下的鉴定数量最大化(gydF4y2BamSnIDgydF4y2BaR包)。匹配污染物的蛋白质(cRAP库)、角蛋白和血清白蛋白也被去除，总共保留6185个蛋白质和38个生物样本。除EpCAM外，每个亚群体都在四个细胞系中复制gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在MIA PaCa-2细胞系中没有检测到。gydF4y2Ba
数据分析gydF4y2Ba
为了聚类蛋白质集并将它们与一组样本相关联，分层聚类(Ward的最小方差法)和k-means聚类都实现于gydF4y2BaComplexHeatmapgydF4y2Ba对6185个蛋白的二元基质(1=检测蛋白，0=未检测蛋白)进行R包处理。12个初始蛋白质簇被分为4个主要簇(“未定义”、“细胞”、“ev”和“细胞& ev”)，这取决于蛋白质与哪组样本相关。gydF4y2Ba
对于样本组间的差异分析(CSC vs NSCC)，所有样本的肽谱匹配PSM水平的总结和量化到蛋白质计数(gydF4y2BamSnbasegydF4y2BaR包,gydF4y2Ba79gydF4y2Ba“求和”的方法)。输入每种蛋白质的肽计数gydF4y2BaDESeq2gydF4y2BaR包,gydF4y2Ba80gydF4y2BaWald’s检验用于发现和排序CSC和NSCC之间的差异蛋白质丰度。FDR为显著差异表达蛋白定义了5%的阈值。此外，GSEA使用反应堆组(ReactomePA R包gydF4y2Ba81gydF4y2Ba)作为数据库，以蛋白DESeq2 logFCs为输入。gydF4y2Ba
亚细胞定位数据取自人类蛋白质图谱gydF4y2Ba82gydF4y2Ba数据库(日期为2020年5月)(HPA, RRID:SCR_006710)，并分配给检测到的蛋白质(只考虑“主位置”字段)。用简单线性模型回归计算细胞和EVs样品中亚细胞间室的富集程度。gydF4y2Ba
数据可用性gydF4y2Ba
质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE保存到ProteomeXchange联盟gydF4y2Ba83 84gydF4y2Ba使用数据集标识符PXD023529和10.6019/PXD023529的伙伴存储库。gydF4y2Ba85gydF4y2Ba
所有重新生成数据对齐和统计分析的代码都可以在GitHub存储库(GitHub, RRID:SCR_002630，gydF4y2Bahttps://github.com/fjcamlab/EVNet_MSgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
免疫组化和组织学分析gydF4y2Ba
在石蜡包埋前，组织样本在10%福尔马林中固定至少24小时。然后，使用Microm HM335E切片机(赛默飞世尔科学公司)切割4个μ m切片。对于免疫组化，在热介导抗原提取前，使用柠檬酸缓冲ph6溶液(Vector Laboratories)进行Rab27A染色，或使用TRIS-EDTA ph9溶液进行YAP染色，将切片脱蜡并水化40分钟。在室温下，用稀释甲醇的0.3%过氧化氢溶液(Sigma-Aldrich)孵育15分钟。为了抑制非特异性染色，切片在室温下用蛋白阻断剂(DAKO)阻断30分钟。与一抗在4°C孵育过夜(抗rab27a 1:2000 Sigma-Aldrich Cat# HPA001333, RRID:AB_1079730，抗yap 1:2000 Abcam Cat# ab205270, RRID:AB_2813833)。次日，用HRP兔/小鼠二抗(DAKO, RRID:AB_2888627)室温孵育30 min, DAB显色剂(DAKO)显色。Rab27A h评分如前所述。gydF4y2Ba86gydF4y2Ba简单地说，h评分评估，在×400放大倍数下随机选择5个字段。测定Rab27A的细胞质染色强度。0、1、2、3分分别对应阴性、弱、中、强染色的存在。确定每种染色强度下的细胞数和每个场的细胞总数。h评分按以下公式计算:gydF4y2Ba
H-score=(在强度1×1下染色的细胞百分比)+(在强度2×2下染色的细胞百分比)+(在强度3×3下染色的细胞百分比)。当100%的细胞在染色类别3(强)染色时，可获得300分的最大值。gydF4y2Ba
用核YAP百分比的平均值量化YAP染色gydF4y2Ba+gydF4y2Ba五个随机字段中的单元格(×400)。gydF4y2Ba
为了进行组织学分析，切片被脱蜡和水化，在H&E中孵育1分钟。gydF4y2Ba
组织病理学分析gydF4y2Ba
对h&e染色的胰腺切片进行评估，以确定每个疾病阶段的存在:无组织学疾病、PanIN和PDAC。在×40扩增处评估胰腺切片，并确定每只小鼠各阶段的百分比。gydF4y2Ba
细胞增殖实验gydF4y2Ba
为了评估Nexinhib20的毒性，将Mia PaCa-2细胞用增加浓度的Nexihib20处理，进行MTT (Sigma-Aldrich M5655)试验。在96孔的培养皿中，5000个细胞被分成四份。Nexinhib20的µM分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1.0和5.0。处理72小时，以相应体积的DMSO作为对照。72h后，每孔加入10µL的MTT (5 mg/mL NaCl 0,9%)， 37°C孵育3小时。然后，去除培养基，每孔加入100µL的DMSO，然后在室温搅拌孵育5分钟。最后，在微板阅读器(680 Bio-Rad型)中摇5 s后，在560 nm处读取吸光度。gydF4y2Ba
MTT法检测经抗人agin中和抗体处理的PDX细胞。在96孔板中，每一种条件下，7000个细胞被分成四份。抗人agrin中和抗体(10µg/mL, Millipore猫# MAB5204, RRID:AB_2225272)， IgG(10µg/mL, Jackson免疫研究实验室猫# 115-005-003,RRID:AB_2338447)或不处理，连续7天，停止处理后，细胞再保存5天不处理。如前所述，在第1、3、5、7、9和12天进行MTT评估。同时，MTT法检测MIA PaCa-2 NSCC (CD24gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和4N)用CSC EVs (1 μg)和YAP抑制剂维替泊芬(Sigma, Cat# SML0534 10 μg/mL，从1 mg/mL原液中稀释)或DMSO (1:100 (v/v))处理。分选后的NSCC(3000个细胞)在96孔板上镀三份，并在分选后第1天和第4天处理(用EVs和维替泊芬/DMSO)。对于本实验，在570 nm处用微板读取器(flustar Omega, BMG Labtech)读取吸光度gydF4y2Ba
EV降解试验gydF4y2Ba
从MIA PaCa-2细胞获得的ev，如前所述(1×10gydF4y2Ba12gydF4y2Ba用NTA测定)重悬于1 mL PBS 1×，与4 μL CM-Dil (Invitrogen, Cat# C7001，在DMSO中1:8稀释)混合，37℃孵育1小时。使用总外泌体分离试剂盒(来自细胞培养基，Invitrogen)根据说明书收集染色的ev。颗粒重悬于200 μL的RPMI完全培养基中。之前镀CSC (CD24gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD133gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)和NSCC (CD24gydF4y2Ba-gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba用100 μL dil染色ev处理48孔(5000个细胞)和4N)。对于每种条件，使用×20物镜采集5个场，每30米成像24小时(Olympus IX81 RRID:SCR_020341和Slidebook 42软件，在四甲基罗达明(TRITC)通道中检测DiL)。在斐济(RRID:SCR_002285)量化了各场加时TRITC通道的平均灰色值。gydF4y2Ba
聚合酶链反应gydF4y2Ba
胰腺片段在56°C的热振荡器上消化2小时，裂解缓冲液(10 mM Tris (pH 7.5)， 400 mM NaCl, 2mm EDTA (pH 8.0) (pH 0.3 - 7.5)， 20% SDS(默克428018)和20 μ L的20 mg/mL蛋白酶(Ambion RNA by Life Technologies AM2548)。然后，在提取液中加入6 M NaCl;将样品充分混合，旋涡10 s，然后以14 000 RPM离心15 min，以沉淀残留的细胞碎片。将上清转移到清洁的epppendorf管中，每个样品中加入100%乙醇，旋动10 s充分混合，在14 000 RPM下离心5 min，使DNA成粒。用70%乙醇洗涤DNA球，然后以14 000 RPM离心5分钟。球完全风干，在无核酸酶的无菌水中重悬。gydF4y2Ba
对于常规PCR，我们使用的是商业主混合物2× My Taq HS mix (Bioline Bio-25046)。PCR扩增在T-100热循环仪(Biorad)中进行。所有检测均包括两个阳性对照样品和一个无模板对照(包含除基因组DNA外的所有反应组分)。用于确认agrin或Rab27A重组的寡核苷酸序列gydF4y2Ba
Agrin外显子6向前:CGGACACACATATGCTAGTGA。gydF4y2Ba
Agrin外显子34反转:CAAAGTGGTTGCTCTGCAGCG。gydF4y2Ba
Rab27A转发:CCAGGGCACTTCCTAAAGATAAG。gydF4y2Ba
Rab27A反向1:CACGCTGCTTCAATGAATAAGGTG。gydF4y2Ba
Rab27A反向2:CATCCACAAAGCTCCAGATTCCAC。gydF4y2Ba
扩增方案包括95°C初始变性和酶活化5分钟，然后在95°C变性30秒，56°C退火90秒，72°C延伸30秒，最后在60°C延伸10分钟，循环30次。gydF4y2Ba
定量一gydF4y2Ba
MIA PaCa2 NSCC (CD24gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和4N)被镀至24孔，使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen)按照说明书使用siLPR4的siScramble (Thermo Fisher Cat# 202503, 15 pmol)转染。转染后第3天，用CSC EVs (10 μg/孔)处理NSCC (siScramble/siLRP-4)， 24小时后用TRIzol (Invitrogen)重悬。使用的寡核苷酸序列为:gydF4y2Ba
CXCL5转发:TCTGCAAGTGTTCGCCATAGgydF4y2Ba
CXCL5相反:TGTCTTCCCTGGGTTCAGAGgydF4y2Ba
STAT3转发:GGCATTCGGGAAGTATTGTCGgydF4y2Ba
STAT3相反:GGTAGGCGCCTCAGTCGTATCgydF4y2Ba
CYR61转发:GAGTGGGTCTGTGACGAGGATgydF4y2Ba
CYR61相反:GGTTGTATAGGATGCGAGGCTgydF4y2Ba
ALX转发:GTTTGGAGCTGTGATGGAAGGCgydF4y2Ba
ALX相反:CGCTTCACTCAGGAAATCCTCCgydF4y2Ba
VIM转发:AGGCAAAGCAGGAGTCCACTGAgydF4y2Ba
VIM相反:ATCTGGCGTTCCAGGGACTCATgydF4y2Ba
沙土荒漠转发:GCACCTGGAAGCAGTAACATGCgydF4y2Ba
沙土荒漠相反:GGCAGCTATGGCTGCTAATGCAgydF4y2Ba
ACTB转发:GAGCACAGAGCCTCGCCTTTgydF4y2Ba
ACTB相反:ACATGCCGGAGCCGTTGTCgydF4y2Ba
RNA从TRIzol (Invitrogen细胞颗粒)中分离，如手册中所述。1 μg RNA用大容量cDNA反转录试剂盒(Life Technologies, Cat# 4374966)根据说明书进行cDNA合成。采用Power SYBR绿色PCR主混合物(Applied Biosystems)进行定量PCR。以下引物用于量化表达水平。gydF4y2Ba
免疫印迹gydF4y2Ba
细胞蛋白提取使用RIPA裂解缓冲液(VWR)，同时添加cComplete (Roche)和苯甲基磺酰氟(Sigma)，在冰上30分钟，然后在17000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟去除DNA。蛋白(30µg)用直流蛋白法(Bio-Rad)定量后进行western blot分析。在评估CSC和NSCC中LRP-4水平的实验中，将MIA PaCa-2中相同数量的CSC和NSCC直接排序到蛋白提取缓冲液中。所有体积(来自相同数量细胞的总蛋白)用于进行western blot。gydF4y2Ba
样品在SDS-PAGE凝胶中运行，然后使用tris -甘氨酸转移缓冲液转移到0.2 μ m的硝化纤维素膜(GE HealthCare)上。接下来，用5%的牛奶/ 0.1%的pbs -吐温溶液在室温下阻塞硝化纤维素膜1小时。与一抗孵育在4℃下(抗agrin 1:20 00 Abcam猫# ab85174, RRID:AB_1860988，抗rab27a 1:50 00 Abnova猫# H00005873-M02, RRID:AB_519010，抗lrp -4 1:1000, Thermo Fisher科学猫# MA5-27675, RRID:AB_2735261)过夜。第二天，在0.1%的PBS-Tween溶液中洗涤膜，并与相应的hrp偶联二抗以1:5000稀释在室温下孵育1小时(抗兔IgG HRP-linked antibody Cell signals Technology Cat# 7074, RRID:AB_2099233，抗小鼠IgG HRP-linked antibody Advansta Cat# R-05 071-500, RRID:AB_10718209)。然后，在0.1%的pbs -吐温溶液中洗涤膜，使用Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad)检测抗体特异性信号。β-actin (Sigma-Aldrich Cat# A3854, RRID:AB_262011)和vimentin (Sigma-Aldrich Cat# V5255, RRID:AB_47762)分别作为Rab27A和agrin分析的加载对照。gydF4y2Ba
人类细胞因子数组gydF4y2Ba
MIA PaCa-2 Tet-On shRab27a细胞在多西环素存在或不存在的情况下培养24小时。然后，在多西环素存在或不存在的情况下，对细胞进行额外的48小时的清洗和培养。收集条件培养基并使用人细胞因子阵列C3 (RayBiotech Cat# AAH-CYT-3-2, RRID:AB_2753199)分析细胞的分泌组。按照制造商的要求执行协议。gydF4y2Ba
信号强度量化使用斐济(斐济，RRID:SCR_002285)，蛋白质阵列分析仪。gydF4y2Ba87 88gydF4y2Ba
TCGA分析gydF4y2Ba
作为一个验证队列，我们从TCGA (gydF4y2Bahttps://cancergenome.nih.gov/gydF4y2Ba)，由176名患者的基因表达数据，量化为每千碱基百万的片段。我们还下载了TCGA提供的临床信息，即验证了8例神经内分泌类型的癌症;这8个病例被从大多数分析中删除，我们只验证了我们获得的总体生存率与人类蛋白质图谱网站上显示的结果相同(包括整个队列，gydF4y2Bahttps://www.proteinatlas.org/gydF4y2Ba)．通过挖掘TCGA联盟提供的蛋白表达数据，我们验证了在我们的研究中分析的基因，在113例中检测了YAP蛋白，并通过两种抗体(来自兔子)进行评估:Phospho-YAP (Ser127) Antibody #4911 (Cell signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA)设计为YAP_pS127;YAP抗体(H-125) sc-15407 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EUA)。生存信息从临床文件中提取，复发信息从cbiopportal从Cancer Genomics (gydF4y2Bahttps://www.cbioportal.org/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
Kaplan-Meier法用于计算无病生存期(到第一次复发事件的时间;没有复发信息的死亡个体从分析中删除)和总生存期(从任何原因死亡的时间)。这些图是用“生存”和“调查者”包在R中获得的。最好的分离切断方法，也被蛋白质图谱所采用，被用于将个体聚类到“高”和“低”基因/蛋白质表达组中。这个临界值指的是在第二四分位数内，在组间比较中产生最低的log-rank p值的值。对于基因或基因-蛋白质的成对组合，使用单独估计的截止值。gydF4y2Ba
基因表达或基因蛋白表达之间的Pearson相关性使用' cor。按照Tukey’s方法去除表达异常值，添加1.5倍IQR(第三个四分位数)或减去1.5倍IQR(第一个四分位数)，分别建立上异常值和下异常值切断。在R的“ggplot2”包中生成图形。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
所有分析均在p<0.05*、p<0.01**、p<0.001**和p<0.0001****处确定显著性，表示条件间显著性。所有分析，除非另有说明，均在GraphPad Prism (GraphPad Prism, RRID:SCR_002798)或SPSS Statistics V27 Release 27.0.1.0中进行。(IBM, RRID: SCR_019096)。gydF4y2Ba
数据可用性声明gydF4y2Ba
数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE保存到ProteomeXchange联盟gydF4y2Ba84年,85年gydF4y2Ba使用数据集标识符PXD023529和10.6019/PXD023529的伙伴存储库。所有重新生成数据对齐和统计分析的代码都可以在GitHub仓库(GitHub, RRID:SCR_002630，gydF4y2Bahttps://github.com/fjcamlab/exonet_MSgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
伦理语句gydF4y2Ba
病人同意发表gydF4y2Ba
伦理批准gydF4y2Ba
本研究涉及人类参与者，并通过了来自葡萄牙里斯本Beatriz医院Ângelo和葡萄牙波尔图Centro医院São João (CHSJ)的胰腺导管腺癌患者的血清样本。从两家医院纳入本研究的所有患者中获得知情同意。血清收集得到了葡萄牙波尔图CHSJ伦理委员会(身份证号CES 327-15)和葡萄牙里斯本Beatriz医院Ângelo(身份证号1372/2015_CMOEB)的批准。参与者在参与研究前给予知情同意。所有小鼠都被安置在i3S动物设施的标准住房条件下，所有动物程序都由i3S动物福利和伦理机构审查和批准。动物协议由Direção Geral de Alimentação e Veterinária (ID 015225)批准。建立PDAC的PDX模型获得了CHSJ伦理委员会的同意。人体研究是根据《赫尔辛基宣言》的伦理准则进行的。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
我们感谢Sofia Quintas、Patricia F Vieira和Joana Martins提供的技术支持，以及Celso Reis提供的抗人MUC1抗体。gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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补充材料gydF4y2Ba
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补充数据gydF4y2Ba
这个网络仅文件已由BMJ出版集团从作者提供的电子文件生产(s)，并没有编辑的内容。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
CFR和NB贡献相等。gydF4y2Ba
贡献者gydF4y2Ba概念化:SAM与CFR方法:CFR、NB、SAM;形式分析:CFR、NB、CD、FC-L、HO、BC、LP;考察:CFR、NB、IB、BA、AC-P、SS、SC;资源:CAM、PM-R、BM、DG、TK、GM、RM、FC、MC、RK、JLC、SAM;数据整理:CFR、NB、IB、CD、CAM、FC-L、PM-R、BM、SS、BC、LP;撰写、初稿:CFR、NB、SAM;编写、评审、编辑:SAC、CAM、JCM、SAM;可视化:英国航空公司;监督:山姆; funding acquisition: SAM; Guarantor:SAM.
资金gydF4y2Ba根据《葡萄牙2020伙伴关系协议》，这项工作得到了Norte -01 - 0145-联邦-000029、北葡萄牙区域计划(Norte 2020)的支持，通过欧洲区域发展基金和通过fct科学技术基金会(pci -01 - 0145-联邦-32189提供的国家基金。由欧洲区域发展基金在“波尔图综合癌症中心”项目下联合资助的“北部地区业务方案”，参考文献Norte -01-0145- feder-072678 - Consórcio波尔图。CCC -波尔图。Comprehensive Cancer Center. CFR is supported by FCT (SFRH/BD/131461/2017), NB by (SFRH/BD/130801/2017), IB by FCT (SFRH/BD/144854/2019), and BA by FCT (PD/BD/135546/2018). DG’s contribution was supported by the NCI (R21 CA179907). We acknowledge the support of the i3S Scientific Platforms: Translational Cytometry, Animal Facility, Bioimaging and Histology and Electron Microscopy are members of the national infrastructure PPBI - Portuguese Platform of Bioimaging (PPBI-POCI-01–0145-FEDER-022122). Proteomics was performed at the Proteomics Facility of The Spanish National Center for Biotechnology (CNB-CSIC), ProteoRed, PRB3-ISCIII, supported by grant PT17/0019.
相互竞争的利益gydF4y2BaSAM在外泌体生物学领域拥有专利。TK是Abcam plc和Storm Therapeutics的创始人，也是Foghorn Therapeutics的科学顾问委员会成员。RK拥有外泌体生物学领域的专利，并授权给Codiak Biosciences, Inc.。RK是Codiak生物科学公司的股东。RK是Codiak生物科学公司的顾问和科学顾问。其他作者声明没有潜在的利益冲突。gydF4y2Ba
来源和同行评审gydF4y2Ba不是委托;外部同行评议。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba本内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是那些作者(s)和不被BMJ认可。BMJ放弃从放在内容上的任何依赖产生的所有责任和责任。如果内容包含任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且不对翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。gydF4y2Ba