条文本
文摘
客观的的anti-α4β7整合素抗体vedolizumab管理以固定剂量治疗炎症性肠病。这就导致了广泛的患者的血清浓度和此前的研究表明有最高暴露水平与临床反应不佳有关。我们旨在确定这些非线性机制exposure-efficacy vedolizumab的特征。
设计我们描述超过500样本超过300例。我们研究vedolizumab绑定的T细胞,研究了动态粘附功能的影响,轮回,体内肠道自导和自由结合位点。采用单细胞RNA序列,我们描述α4β7 integrin-expressing T细胞数量“耐”vedolizumab和验证我们的发现在体外和样本vedolizumab-treated IBD患者。我们也将我们的发现与双子座II和III的因果分析的研究。
结果调节性T (T注册)细胞表现出右移vedolizumab绑定配置文件与效应T (TEff)细胞。一直,在一定浓度范围内,剩余附着力,轮回,和可用性的功能性α4β7 T的归航注册细胞体内高于/ TEff细胞。我们确定了vedolizumab——“抗”α4β7-expressingβ1+PI16+T注册细胞具有明显的监管属性子集的基质效应。我们的观察与exposure-efficacy双子座II和III试验的数据。
结论完全阻断TEff细胞与vedolizumab贩卖,同时允许残留归航的T注册细胞在一个最佳的治疗窗的基于目标的暴露水平可能是一个策略来优化IBD患者的治疗结果。
- 炎症性肠病
- 粘附分子
- T淋巴细胞
这是一个开放的分布式条依照创作共用署名非商业性(4.0 CC通过数控)许可证,允许别人分发,混音,适应,建立这个工作非商业化,和许可他们的衍生产品在不同的协议,提供了最初的工作是正确地引用,给出合适的信用,任何更改表示,非商业使用。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/。
来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
anti-α4β7抗体vedolizumab块肠道归航调节性T (T注册T (T)和效应Eff)细胞和批准用于治疗克罗恩病和溃疡性结肠炎。
T注册炎症性肠病的炎症细胞抵消活跃。
固定剂量的vedolizumab在炎症性肠病的治疗会导致大范围的血清药物水平观察的病人。
vedolizumab提出了一个非线性的二期实验的剂量反应关系暴露在高水平。
有什么新发现吗?
关于T Vedolizumab有右移exposure-efficacy概要文件注册相比之下,TEff细胞在体外和体内。
单细胞RNA序列标识一个α4+β7+T注册细胞整合素表达子集β1和PI16不绑定vedolizumab。
α4β7-expressingβ1+PI16+T注册细胞是“耐”vedolizumab IBD患者。
微分exposure-efficacy T的概要文件注册和TEff细胞与克罗恩病III期试验结果。
它对临床实践的影响在可预见的未来会如何?
实现最优的血清药物水平个性化用药策略可能增加vedolizumab疗法的功效。
介绍
炎症性肠病的主要实体克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)的特点是慢性复发的胃肠道炎症。1全球ibd的发病率和患病率不断增长,2但确切的发病机制仍不完全清楚。然而,洞察机制推动这些疾病增加,促进新的治疗策略的发展。3 4更新的治疗选择之一是anti-α4β7整合素抗体vedolizumab, 2014年被批准用于治疗炎症性肠病。通过绑定到α4β7整合素异质二聚体表面表达几个白细胞数量,抗体抑制α4β7的互动整合素及其配体粘膜addressin细胞粘附分子(MAdCAM) 1表示高内皮小静脉的肠道。5导致的结果是,公司α4β7-expressing细胞粘附的内皮和后续步骤的溢出过程称为归航受阻。6 7认为,通过干扰肠道归航,vedolizumab减少了免疫细胞的数量招募小肠和炎症不断变弱。特别是,vedolizumab的T细胞被认为是一个重要的目标。8 9有趣的是,vedolizumab块α4β7-mediated肠道归航的促炎效应T (TEff)以及抗炎调节性T (T注册)细胞,10提高问题,后者的效果是否会限制抗体的功效。然而,vedolizumab在临床试验中显示了令人信服的疗效和安全性配置文件以及在现实世界大量的研究11 - 15号近年来,但由于迄今为止未知的原因只有一个vedolizumab达到缓解患者的一部分。
已经提出,血清药物水平可能vedolizumab解释情况说明的一部分,由于固定剂量方案导致广泛的个体患者的血清浓度。11日12一致,一些药物监测研究可以证明实现某些最低trough-level vedolizumab血清浓度是必要的(但不是足够的)前提进入缓解期16和几个作者所描述的改进结果随着vedolizumab暴露在一个宽的浓度范围。17-21然而,两个独立的二期试验22日23日报道严重临床结果与中剂量组相比,最高的暗示非线性exposure-efficacy相关性较高的一系列药物水平。
因此,这项工作的目的是探讨剂量反应vedolizumab在细胞层面上的特征。我们表明,更高的vedolizumab浓度是必要阻止α4β7整合素在T注册相比之下,TEff细胞。这个功能转化为微分附着力,轮回,体内肠道自导和α4β7可用性。从力学上看,我们确定一个β1+PI16+T注册细胞与强大的监管功能子集,是“耐”vedolizumab和丰富的成功治疗患者的肠道的假定的中介效应。双子座II和III的因果分析试验,观察到的巧合与exposure-efficacy数据的影响。
方法
在这一节中列出的关键方法。进一步的方法是可用的在线补充文件1。
人类的血液样本
确定vedolizumab体外的剂量反应特点,外围EDTA-anticoagulated血液收集健康的捐赠者和UC患者或CD与vedolizumab不接受治疗。评估体内绑定vedolizumab, EDTA-anticoagulated IBD患者全血和血清样本年龄在18 - 75,没有收集相关并发症发生vedolizumab疗法。这些材料得到的IBD门诊医学系的埃尔兰根大学医院的1,德国。研究对象的特点和CD,加州大学和控制归纳了捐助者在线补充表1。fluorescence-activated细胞T的排序(流式细胞仪)的隔离注册和TEff的细胞,白细胞锥得到输血医学和Haemostaseology埃朗根大学医院。总的来说,571年358例样本进行分析(包括59白细胞锥)。
流式细胞术
流式细胞术进行根据标准协议使用以下fluorochrome-conjugated细胞外抗体:CD3 (VioGreen、REA613 Miltenyi研究),CD4 (FITC / VioBlue VioGreen / APC-Vio770 VIT4, Miltenyi研究),CD45RO (BV510, UCHL1 Biolegend)、CD25 (PE / Cy7, BC96 Biolegend) CD127 (APC-Vio770 / VioBright FITC, REA614, Miltenyi研究;APC、A019D5 Biolegend)、CD49d (VioBlue / FITC MZ18-24A9, Miltenyi研究;PE / Cy7 9 f10 Biolegend),整合素β7 (PerCP / Cy5.5 /聚乙烯、FIB27 Biolegend;BV605 FIB504, BD生物科学),整合素β1 / CD29 (PE / PerCP / Cy5.5, TS2/16 Biolegend), PI16 (PE / VioBright FITC, REA699, Miltenyi研究),GITR (Biolegend APC, 108 - 17日),CD8 (PerCP / Cy5.5, RPA-T8 Biolegend)、CD19 (VioBlue, Miltenyi研究),CD16 (APC / Cy7 3 g8, Biolegend), CD14 (AF488, HCD14 Biolegend)、CD56 (PE-Vio770、REA196 Miltenyi研究)、CCR3 (FITC 5 e8 Biolegend) Siglec 8 (PE-Dazzle594 7 c9 Biolegend)。表示,vedolizumab (Entyvio,武田)和MAdCAM-1 (rh Fc嵌合体蛋白质、研发系统)使用Alexa萤石抗体标记标签工具(AF674 / AF488,生活技术)根据制造商的指示和用于染色。
细胞内染色,Foxp3 /转录因子染色缓冲区设置(eBioscience)结合特定fluorochrome-conjugated抗体针对人类Foxp3 (PE / AF700 / APC, 236 / E7,英杰公司)或白介素10 (il - 10) (PE、JES3-19F1、Biolegend)使用。
量化的免费vedolizumab结合位点,人类外周血单核细胞(PBMCs)与未标记的孵化vedolizumab在不同浓度(0,2、10、50和110年µg /毫升)为1小时37°C,然后收获和彩色如上所述fluorochrome-conjugated细胞外抗体以及50µg /毫升的荧光标签vedolizumab。
数据是LSR Fortessa (BD生物科学),MACSQuant 10和MACSQuant 16 (Miltenyi研究)工具。数据分析与FlowJo单细胞分析软件V.7.6.5和V.10.06.1恒星(树)。
Vedolizumab ELISA
分析了从患者接受治疗血清vedolizumab使用vedolizumab vedolizumab浓度药物水平ELISA (ImmunDiagnostics)根据制造商的指示。光密度测定使用NOVOstar板读者(BMG Labtech)。
动态粘附MAdCAM-1化验
量化的能力坚持MAdCAM-1细胞与不同浓度的vedolizumab孵化后,FACS-isolated T注册细胞被沾CellTrace CFSE和TEff细胞CellTrace远(两种表达载体)15分钟在37°C。矩形微型毛细血管(CM科学)被涂上一层5µg /毫升rh MAdCAM-1 Fc嵌合体(研发系统)在涂料缓冲区(150毫米氯化钠+ 1毫米4 - (2-hydroxyethyl) 1-piperazineethanesulfonic酸),然后用5% BSA阻塞或10%胎牛血清的边后卫在磷酸缓冲盐(PBS)。细胞混合在一个1:1比例和治疗有或没有10或50µg /毫升vedolizumab 1小时在37°C。接下来,细胞在浓度为1.5 resuspended绪细胞粘附缓冲/毫升(150毫米氯化钠,CaCl 1毫米21毫米MgCl2MnCl)与1毫米2然后通过MAdCAM-1-coated毛细血管灌注3分钟10µL /分钟的速度使用蠕动泵(Schenchen)。毛细血管是冲洗5分钟50µL /分钟的速度和贴壁细胞毛细血管使用共焦显微镜成像(莱卡)。数据分析和量化了使用斐济(美国国立卫生研究院)。
单细胞RNA序列
磁激活细胞sorting-purified CD4+T细胞被染色的死细胞可以解决的可行性染料(种)efluor780(表达载体)和以下fluorochrome-conjugated细胞外抗体:CD4 (FITC、VIT4 Miltenyi研究),CD45RO (BV510, UCHL1 Biolegend) CD49d (VioBlue、MZ18-24A9 Miltenyi研究),整合素β7 (PE、FIB27、Biolegend)和10µg /毫升AF647-labelled vedolizumab。种Vedolizumab-negative−CD4+CD45RO+CD49d+β7+VDZ−)和vedolizumab-positive种−CD4+CD45RO+CD49d+β7+VDZ+)内存CD4+T细胞被流式细胞仪进行排序。纯化细胞被洗、清点和生存能力被台盼蓝染色法进行评估。细胞被resuspended年产量细胞/毫升的浓度在PBS + 2%的边后卫。单细胞RNA序列进行下一代测序核心设施的使用铬埃尔兰根大学的平台(10×基因组学)。细胞受到10×铬单细胞3′解v3图书馆准备根据制造商的指示。库测序进行Illumina公司HiSeq 2500音序器的深度2亿读。从细胞读取被转换为使用mkfastq FASTQ格式Ranger 3.0.1(10×基因组学)。读取被对齐人类参考基因组v3.0.0(10×基因组学,GRCh38运用注释版本93)。对齐方式是使用从细胞计数命令执行管理员v3.0.1(10×基因组学)与标准参数。
因果分析vedolizumab III期试验的患者CD(双子座II / III)
研究exposure-efficacy相关性双子座II和III试验中,我们提交了一份科学Vivli请求。批准后,这种分析是基于研究使用的数据通过Vivli武田已经可用。Vivli并未导致或批准,不以任何方式负责这个刊物的内容。评估vedolizumab槽水平之间的关系和临床缓解在星期6,我们确定的二进制结果的临床缓解期第6周考虑自变量的血清水平在6周的R-package mgcv (在线补充文件2)。24血清水平组被定义基于我们体外结果和数据来自我们自己的病人队列。临床缓解期定义为克罗恩病活动指数评分≤150点。临床缓解期的相对频率计算使用Excel 2010(微软)。统计分析与棱镜进行8。
结果
微分优惠绑定vedolizumab T注册和TEff细胞在不同浓度
去探索,是否非线性exposure-efficacy相关性vedolizumab可能是因为α4β7-expressing vedolizumab免疫细胞不绑定,我们分析了α4的频率+β7+VDZ−使用荧光标记vedolizumab的免疫细胞,流式细胞术。我们选择10µg /毫升的浓度,这是在槽水平与最优二期试验结果相关联。22虽然α4的分数+β7+在CD4细胞是最高的+T细胞和嗜酸性粒细胞,CD4的很大一部分+α4+β7+T细胞并没有绑定vedolizumab (在线补充图1和在线补充表12)。因此,我们决定进一步关注CD4的子集+T细胞。
阐明,无论是vedolizumab绑定到T注册和TEff细胞在不同浓度不同,我们用荧光标记的vedolizumab和流式细胞术分析执行PBMCs来自UC患者、CD和健康对照组。我们封闭在CD4+CD127低CD25高Foxp3+T注册细胞和CD4+CD127高CD25低TEff共同表达细胞整合素α4和整合素β7和量化的部分细胞荧光标记vedolizumab (在线补充图2)。在这里,我们使用的浓度高达50µg vedolizumab /毫升、槽水平与次优的结果在第二阶段的审判。22
的部分α4+β7+在T细胞明显更高Eff相比之下,T注册细胞和加州大学之间的可比性,CD和健康对照组(在线补充图3和在线补充表13),而α4的表达和β7每个细胞(以平均荧光强度(MFI))在T同等或更高注册相比之下,TEff细胞(在线补充图3 b)。
的部分VDZ+细胞在α4+β7+CD4+T T细胞之间是相似的注册和TEff从健康的捐赠者和更高的T细胞注册比TEff加州大学和CD患者细胞接触后0.4µg /毫升vedolizumab。然而,VDZ的分数+TEffT细胞明显高于与之相比注册细胞健康的捐赠者与2µg /毫升vedolizumab曝光后,在所有实体10µg /毫升vedolizumab个体差异。与50µg /毫升vedolizumab曝光之后,几乎100%的α4+β7+T注册和TEff细胞阳性vedolizumab (图1 a, B)。在一个额外的一系列实验中,我们试图确认这些差异并不是由于α4β7低幼稚T细胞的人口。然而,我们可以复制我们的发现,当另外浇注CD45RO专门选择记忆T细胞(图3 c在线补充)。
此外,FACS-isolated T的微观分析注册和TEff细胞染色,其间anti-β7抗体与不同浓度的孵化vedolizumab证实,T注册比TEff细胞结合vedolizumab 10µg /毫升的浓度,并没有在细胞暴露于50 vedolizumabµg /毫升(图1 c,在线补充图3 d)。
我们进一步探讨,无论细胞的激活状态和相关的差异α4β7整合蛋白构象可能相关的微分绑定模式。然而,我们也能繁殖T的右移绑定配置文件注册细胞与MnCl刺激后2,phorbol-12-myristat-13-acetat / ionomycine和anti-CD3 / CD28 (在线补充图4,在线补充表14),这表明情况并非如此。
在简介,我们的数据显示,阻塞α4β7整合素与vedolizumab T注册细胞需要更高浓度的抗体相比,TEff细胞。这意味着临床疗效vedolizumab至少在一定程度上可能是由于残余T注册已经完全阻断T细胞的浓度Eff细胞归巢。
微分vedolizumab绑定到T注册和TEff细胞导致微分附着力存在剂量依赖的相关性和轮回的概要文件
探索的功能相关性研究,我们分析了FACS-purified CD4细胞+CD127低CD25高T注册和CD4+CD127高CD25低TEff细胞功能检测体外。排序的纯度> 99%的细胞,细胞是可行的和T注册细胞表现出明显的抑制能力,当培养TEff细胞(在线补充图5)。
我们分析了影响体外治疗与vedolizumab动态T的附着力注册和TEff细胞MAdCAM-1 (图2一个)。我们专注于10µg /毫升和50µg /毫升最临床相关的浓度。25符合α4β7整合素表达,附着力显著提高了未经处理的TEff与未经处理的T注册细胞(图2 b, C)。要么治疗导致减少的动态粘附的细胞类型。然而,抑制T的附着力注册细胞与T相比显著降低Eff细胞治疗后10 vedolizumabµg /毫升,而几乎完全抑制粘附和T之间没有区别注册和TEff细胞可以观察治疗后50µg /毫升vedolizumab (图2 d)。
在第二个方法中,我们研究了不同浓度的影响的vedolizumab MAdCAM-1-dependent T的轮回注册和TEff细胞在体外。T细胞是左向CCL25轮回在MAdCAM-1-coated transwell板3µm毛孔vedolizumab浓度的不同。治疗所有的浓度vedolizumab导致细胞的一个重要和类似的减少轮回加州大学和CD患者以及健康对照组。然而,(T)的比率注册TEff细胞治疗后更高的10µg / 50毫升vedolizumab而µg /毫升(图2比)。
综上所述,这些数据支持这样的观点:微分绑定vedolizumab T注册和TEff细胞功能影响T细胞粘附和轮回。
微分vedolizumab绑定到T注册和TEff细胞会导致体内发炎的肠道微分归航
我们下一个目的地址,是否我们可以检测体内类似的效果。为此,我们利用先前描述的人性化的小鼠模型T细胞归巢到肠道发炎(图3一),我们早先显示T的类似的减少甚至更高注册治疗后细胞归巢肠道vedolizumab浓度高。10基于上述发现,我们现在调查了10µg /毫升vedolizumab治疗的效果。活体的共焦显微镜显示活跃交易的转移细胞(图3 b)。正如预期的那样,更多的未经处理的TEffT细胞有效肠道与未经处理的注册细胞。有趣的是,治疗10µg /毫升vedolizumab导致大幅减少T的归航EffT细胞,而注册细胞归巢没有明显影响评估通过流式细胞术和lightsheet荧光显微镜(图3 c, D)。这些观察结果进一步支持我们的T细胞反应差的概念vedolizumab子集。
微分vedolizumab绑定到T注册和TEff细胞与体内α4β7最大的可用性
我们推断体内行动vedolizumab IBD患者,自由α4β7分子在一定的剩余的可用性接触是至关重要的。因此,理解,不同浓度vedolizumab如何影响可用α4β7整合素,我们暴露PBMCs提升剂vedolizumab体外,随后贴上自由结合位点。当我们观察到T的比率无显著差异注册和TEff细胞与自由vedolizumab结合位点2µg /毫升的浓度,显著提高的一部分T注册相比之下,TEff细胞后免费α4β7分子表面与10到50µg /毫升vedolizumab孵化。110µg /毫升的浓度vedolizumab(范围内最高的血清水平观察的病人25),大量的细胞与免费绑定网站相似(图4 a, B,在线补充图6 a, B),进一步支持右移的概念T注册vedolizumab细胞反应。
去探索,这是否也拥有真正的体内,我们确定血清水平槽IBD患者接受vedolizumab治疗2和6周,同时确定自由结合位点。在一个探索性的分析中,我们观察到一个最佳的比例的T注册和TEff细胞与自由α4β7分子中可用的范围40到55µg /毫升vedolizumab槽在更高水平和比例显著降低血清水平(图4 c,图6 c在线补充)。
总之,这些数据表明,某些vedolizumab暴露水平沿着剩余可用性较高的功能性α4β7整合素在T注册相比之下,TEff细胞在炎症性肠病的患者体内。
单细胞RNA序列标识一个ITGB1+PI16+T注册细胞“耐”vedolizumab子集
进一步解剖机制我们的观察,我们决定使用单细胞RNA序列。为此,我们FACS-purified CD4细胞+CD45RO+α4+β7+细胞荧光标签的绑定vedolizumab (VDZ+)不(VDZ−在10µg /毫升的浓度。细胞的重新排序确认所有选定的细胞表达了整合蛋白α4和β7 (在线补充图7)。此外,我们发现绝大多数α4+β7+VDZ−细胞也呈阳性荧光标记MAdCAM-1 (在线补充图7 b)和动态观察CD4细胞的粘附+CD45RO+α4+β7+VDZ−细胞MAdCAM-1确凿,α4β7整合素表达在细胞不绑定vedolizumab功能(在线补充图7 c)。
单细胞测序后,VDZ−和VDZ+合并样本进行比较分析。聚类分析使用独特的分子标识符1确定11的分辨率不同的集群(图5一个)。使用八个不同标记基因(在线补充图8 a, B),确定集群9和10 T注册细胞群(图5 b)。
我们与我们之前的数据,进一步分析显示一致的T注册细胞在VDZ更高−与VDZ相比+样品(图5 b)。有趣的是,VDZ−T注册T细胞也表达了注册比VDZ标记基因在更高的程度上+T注册细胞(在线补充图8 c)。当比较VDZ- - - - - -和VDZ+T注册和TEff细胞,我们确定了特定签名的差异表达基因,其中许多是与粘附,溢出和趋化性(图5 c)。我们旨在描述α4β7-expressing T注册细胞不具有约束力vedolizumab,我们进一步关注VDZ−与VDZ相比+T注册细胞。考虑微分基因表达和细胞表达相关基因的一部分,我们发现了一个独特的T注册细胞群表达ITGB1,PI16和CCR10,但不会表达CCR9和CD38这是在VDZ主导−VDZ样本和几乎完全消失+样品(图5 d,在线补充表16)。
β1+PI16+T注册细胞减少vedolizumab绑定在体外和体内
来验证我们的发现,我们染色PBMCs从健康对照组抗体上面的不同的分子识别。我们确认一个明显高于T的一部分注册细胞不绑定VDZ 10µg /毫升表示PI16和β1整合素与vedolizumab-binding T注册细胞(图6)。亦然,VDZ的丰度+细胞低α4β7-expressing T注册细胞阳性PI16或β1 (图6 b)。一致,co-expressionβ1 VDZ整合素和观察PI16多得多- - - - - -相比之下,VDZ+细胞和vedolizumabβ1绑定+PI16+细胞明显低于β1−PI16−细胞(图6 c)。
接下来,我们获得PBMCs与vedolizumab IBD患者接受临床治疗和评估自由vedolizumab结合位点(BS) T注册细胞连同上面的标记物的表达。我们观察到,在T注册细胞表达α4β7 vedolizumab与自由结合位点整合素,细胞表达β1 PI16明显比在T更丰富注册细胞与vedolizumab已经饱和的(图6 d)。此外,在β1+PI16+T注册细胞,细胞已经免费vedolizumab绑定网站可用性大大超过β1之一−PI16−T注册细胞(图6 e)。
这些数据证实了我们在网上发现和建议β1+PI16+T注册细胞基质的子集微分vedolizumab绑定到T注册和TEff细胞。
Vedolizumab——β1“耐药”+PI16+T注册细胞表现出明显的监管表型
接下来,我们旨在进一步描述这个T的函数注册细胞的子集。转录水平在我们的单细胞数据集显示,T注册细胞不具有约束力vedolizumab表达高水平的监管指标,因此可能特别抑制的细胞群(在线补充图8 c)。
因此,我们进行CD4的流式细胞术+CD25高CD127低α4+β7+T注册共同表达细胞整合素β1 PI16或不是。我们观察到的高表达CD25β1每个细胞+PI16+比β1−PI16−gut-homing T注册细胞(图7)。此外,更多的β1+PI16+T注册细胞表达Foxp3 GITR和还在更高程度上(图7 b, C)。功能上,体外刺激后,大量高β1的一部分+PI16+T注册细胞比β1−PI16−T注册细胞产生抑制细胞因子il - 10 (图7 d)。这些观察结果也可以复制使用PBMCs IBD患者(在线补充图9,在线补充表15)。最后,使用体外共培养抑制化验,VDZ- - - - - -,但不是VDZ+T注册T细胞明显抑制Eff细胞增殖(图7 e)。
在下一步中,我们旨在阐明,子集确定是否也出现在肠道炎症性肠病的患者。因此,我们在网上进行分析与CD45的公开可用的单细胞RNA序列数据集+细胞从11 UC患者的直肠(GSE162335)。我们确定T注册细胞和比较β1之间的几个关键调控基因的表达+PI16+和其他T注册细胞。符合我们的单细胞外周血的数据,我们发现这些基因表达的β1一个更大的部分+PI16+在这些细胞(细胞或上级图8 a, B)。确认这些转录组数据,我们孤立的固有层单核细胞(LPMCs)肠活检的IBD患者CD4和分析+CD25高CD127低Foxp3+β7+T注册共同表达细胞整合素β1和PI16或不使用流式细胞仪(在线补充图10)。β1+PI16+T注册细胞表现出明显的高表达CD25每个细胞(如由MFI)与β1相比−PI16−T注册细胞(图8 c)。此外,在体外刺激LPMCsβ1导致更高的部分+PI16+比β1−PI16−T注册细胞产生il - 10 (图8 d)。
总的来说,这些数据强烈支持这样的观点:vedolizumab——β1“耐药”+PI16+gut-homing T注册在外周血细胞有一个强大的管理功能以及肠道,可能抵消肠道炎症。
β1+PI16+T注册细胞是“耐”vedolizumab体内肠道和丰富的IBD患者应对vedolizumab疗法
在下一步,我们旨在研究中,是否vedolizumab“阻力”α4β7-expressingβ1+PI16+T注册细胞也可以观察到体内。为此,我们量化的血清水平槽IBD患者接受vedolizumab治疗并确定免费vedolizumab绑定网站的可用性在这些细胞。正如所料,T的一部分Eff与非针对性α4β7细胞整合素表面减少剂量依赖性的方式。然而,这并非如此α4β7-expressingβ1+PI16+T注册细胞,而α4β7-expressingβ1−PI16−T注册细胞表现出剂量依赖性降低类似TEff细胞(图9)。
因为这些数据进一步表明,残余T注册细胞归巢可能最重要的是有助于临床疗效vedolizumab,我们从反应彩色结肠活检vedolizumab治疗开始之前,在获得vedolizumab CD4和具体治疗。虽然没有整体CD4数量差异+T细胞,在治疗之前,Foxp3的一部分+CD4+细胞显著增加患者积极治疗与治疗前相比图9 b)。有趣的是,进一步染色显示,更加具体+细胞出现在患者的结肠vedolizumab co-stainedβ1比治疗前(图9 c)。又在组织层面上,这是一致的想法残留肠道β1归航+T注册细胞在vedolizumab疗法。
最后,我们进行了因果分析的第三阶段的数据的双子座II和III试验vedolizumab CD患者临床结果与我们的观察。我们确定的主要疗效端点(缓解率在第6周)根据相应vedolizumab槽水平。有趣的是,当作为分层为血清浓度在我们的群体中,缓解率的范围从40到55µg /毫升vedolizumab明显高于上方和下方。汇总分析,40到55岁之间的差异µg /毫升和上面的55µg /毫升组显著(图9 d, E)。总之,这些观察和非线性可调和的剂量反应特征由于β1残余归航+PI16+T注册细胞。
讨论
Vedolizumab成功用于治疗炎症性肠病和应用作为一种固定剂量。26日27日在临床试验和实际军团产生广泛的血清药物水平已经观察到,11日12日19表明个人药物动力学明显不同。同时,vedolizumab只在部分病人和高效优化药物水平已被建议作为一个策略来改善结果,但有待进一步研究和发展。16 28在这里,我们表明,α4β7-expressing T注册细胞表现出右移响应vedolizumab相比,TEff细胞和识别β1+PI16+T注册细胞子集的基质效应。从临床的角度来看,我们的数据支持最优利用残余T的一个概念注册针对高细胞归巢,但避免过高血清浓度。这将意味着vedolizumab暴露会增加在绝大多数,但有限的一小部分患者,可以通过治疗药物监测和应用个人剂量的抗体。
多个证据表明vedolizumab药物达到一定水平的先决条件或至少增加治疗中获益的机会。三期试验的早期历史数据分析表明,槽中值水平临床缓解期患者高于病人没有。此外,下面一个槽的17µg /毫升加州大学和16µg CD /毫升,缓解率没有显著不同于安慰剂。17双子座的我的另一个最近的分析数据为加州大学确定目标水平槽> 37.1µg /毫升,> 18.4µg /毫升和12.7µg /毫升数周6、14和维护实现临床缓解。29日类似的观察了在实际群对不同的端点:Dreesen等确定了槽> 24µg /毫升和> 14µg /毫升在星期6和14中,分别与有效性在14 - 22周。28在一个队列被雅库巴等在第6周,槽水平显然是更高的患者1年内实现粘膜愈合。30.另一个前瞻性研究发现血清槽水平在星期2(中位数24.8µg /毫升20µg vs /毫升)和6(平均25µg /毫升vs 17.3µg /毫升)与长期内窥镜在52周的缓解。31日法国回顾性队列研究能够链接vedolizumab血清水平较高与较高的组织学愈合。32和群Ungaro等水平槽的,病人> 11.5µg /毫升超过两倍患者低于这个阈值进入前者内窥镜缓解后1年。33尽管所有这些数据点到同一个方向,描述的军团,端点评估和槽水平确定的时间点是异质的。始终,治疗管理基于槽水平监测到目前为止还没有进入临床实践。
第一个观点,这些现实世界的研究似乎矛盾的假定非线性exposure-efficacy vedolizumab在高浓度的相关性。然而,必须承认,实际上只有很少的病人达到药物的水平,我们观察到抑制残余T注册细胞归巢和减少在双子座II和III功效。因此,这类病人可能会“消失”在病人人口与最佳药物接触,尤其是提到的很多研究都是基于四分位数的槽水平。17 32此外,两个独立dose-ranging二期试验报告非线性相关性高的曝光范围22日23日和第二阶段试验anti-β7整合素抗体etrolizumab透露类似的相关性。34
因此,我们的数据不仅是重要的提供一种机械的解释的效力vedolizumab最佳药物水平范围内通过残留肠道T的归航注册细胞,但也强调“治疗窗口”的这种效应可能存在丢失在非常高的浓度。显然,这个窗口的范围观察略有不同取决于所使用的实验技术(例如,绑定自由结合位点的分析和分析)。然而,这并不奇怪关于使用的不同方法和家里的重叠仍然是实质性的和一致的同样的效果。我们的数据不同于早些时候数据报告一个欧共体50绑定的vedolizumab 0.042µg /毫升的T细胞。35然而,这也可以解释为不同的方法;重要的是流仪读出是基于MFI的分数而不是在我们的例子中细胞阳性染色。
特别是,我们表明一个α4β7-expressingβ1+PI16+T注册细胞子集是vedolizumab“耐药”。在将来的研究中没有回答的一个问题是,是什么驱使这些细胞。趋化因子受体在该人群的具体表达谱提出了问题,是否趋化因子的信号36 37可能引起的特定构象α4β7整合素可能更好或更糟vedolizumab访问。同样,微分的转录后修饰α4β7整合素可能调节可访问性。在老鼠身上,38高表达的β1整合素已报道干扰的功能α4β7整合素。
更重要的是,也在更广泛的背景下,β1+PI16+T注册细胞我们确定了似乎是一个子集功能明显不同的细胞群,我们表明,这些细胞有明显的监管表型predesignating他们强大的抗炎细胞能够抵消肠道炎症。由T PI16表达式注册细胞已经在2010年首次被描述。39完全符合我们描述的子集,后来研究了第一个暗示特定PI16的迁移特性+T注册细胞通过识别增强迁移CCL17 CCL20。40此外,最近的一项研究描述PI16+vs PI16−T注册表型的细胞,提供了第一次看到我们的子集通过描述表达ITBG1增加和PI16建议增强功能性+T注册细胞。41
重要的是,我们的数据没有提供正式证明T注册细胞β1等+PI16+子集,我们确认是有因果联系的临床疗效vedolizumab和我们不能绝对排除,类似的功能适用于其他小细胞子集。然而,除了这一事实几乎不可能提供这样的证据,尽管vedolizumab对先天免疫细胞的影响最近被提出42和干扰α4β7-dependent归航的非经典的单核细胞已被证明,43T细胞仍认为是vedolizumab治疗的主要目标。8 9 44
然而,当想象我们的发现转化为临床实践,我们的数据提供了一个清晰的理由进行前瞻性研究,应该(1)描述T注册细胞群在vedolizumab疗法,(2)定义最优目标槽水平在预先确定的时间点,(3)和(4)的时间点干预纠正偏离这些暴露目标。
总之,我们表明,β1+PI16+T注册细胞显示“阻力”子集vedolizumab曲线右移绑定可以解释有效性的vedolizumab和定义一个最优的治疗窗与随机临床试验的数据一致。我们的数据支持进一步优化vedolizumab裁剪体内药物暴露疗法的个性化的方法。
伦理语句
病人同意出版
伦理批准
所有样品都收集了参与者的知情的书面同意后,所有程序都是经伦理委员会批准的,埃尔兰根Friedrich-Alexander-University德国(40 _16b 249 _13b 135 _20b)。
确认
深圳的研究、RA、IA最惠国待遇得到了跨学科中心临床研究(IZKF)和锐气,埃尔兰根大学计划Fritz-Bender-Stiftung,恩斯特Jung-Stiftung,别的Kroner-Fresenius-Stiftung, Thyssen-Stiftung,德国克罗恩氏和结肠炎基金会(DCCV),微生物群DFG主题项目,新兴领域行动,643年DFG合作研究中心,796年,1181年和TRR241 Rainin基金会和Litwin IBD先锋计划美国克罗恩氏和结肠炎基金会(制造商)。安·利希滕贝格由大众基金会奖学金支持,柏林Helath研究所临床科学家格兰特和德国研究基金会(DFG-TRR241-A05)。作者感谢j . Derdau d . Dziony j . Marcks舒斯特尔和m . Slawik无价的技术援助。此外,我们感谢核心单元细胞排序和免疫监视和核心单元的下一代测序Friedrich-Alexander埃尔兰根大学的优秀的技术支持。出版的部分是基于研究使用的数据通过Vivli武田已经可用。Vivli并未导致或批准,不以任何方式负责,这个刊物的内容。
引用
补充材料
脚注
调整通知本文已经被修正,因为它第一次在网上发布。资助声明已被添加。
贡献者EB和执行实验。EB和深圳设计的研究。EB兆瓦,为k, RA、IA TMM,简历,安,阵线,最惠国和深圳提供临床样本,协议或试剂;安倍和MD执行和RNA序列分析;CG、EB和深圳进行第三阶段数据的统计分析;EB博士兆瓦,最惠国,深圳分析和解释数据。EB和深圳的帮助下起草的手稿最惠国;所有作者至关重要的知识内容的修订后的手稿。
资金其他Kroner-Fresenius Stiftung (2016 _a182),欧洲克罗恩氏和结肠炎组织(出版),德国研究基金会(祖茂堂377/4-1)。
相互竞争的利益最惠国宾得担任顾问,朱利安尼,默沙东,Abbvie,詹森,武田和勃林格。深圳收到武田的谢礼,罗氏,詹森。最惠国深圳收到武田的研究支持,夏尔(武田的一部分)和罗氏。其他作者声明没有利益冲突。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。
补充材料此内容已由作者(年代)。尚未审查由BMJ出版集团有限公司(BMJ)和可能没有被同行评议。任何意见或建议讨论仅代表作者(年代)和不了BMJ的支持。和责任起源于BMJ概不负责任何依赖的内容。内容包括任何翻译材料,BMJ并不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南,术语,药物名称和药物剂量),和不负责任何错误或遗漏引起的翻译和改编或否则。