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客观的最近的研究提供了洞察肠道微生物群在自闭症谱系障碍(ASD);然而,这些研究被限制在单一阶段由于有限的抽样的童年。这里,我们旨在揭示肠道微生物群的发育特征自闭症群体的主题结合个人间因素影响肠道微生物群。
设计群体的773例患者(16个月至19岁),429年正常(NT)发展对象(11月15岁)emolyed确定动力学改变肠道微生物群在不同年龄使用16 s rRNA测序。
结果在自闭症题材,我们观察到一个不同的但是进步发展的偏差肠道微生物群的特点是持续降低α多样性,早期的不可持续的不成熟的微生物群,改变aboudance 20操作分类单元(辣子鸡),减少分类单元检出率和325年解除微生物代谢功能与年龄相关性模式。我们进一步揭示微生物关系改变了广泛自闭症在3岁之前,与行为的严重程度相关,自闭症群体的睡眠和消化系统症状。这一分析表明,一个签名的结合2辣子鸡,韦永氏球菌属和肠杆菌科,17个微生物代谢功能有效地歧视ASD从NT主题的发现(曲线下的面积(AUC) = 0.86),和验证1 (AUC = 0.78), 2 (AUC = 0.82)和3 (AUC = 0.67)。
结论大群结合临床症状分析突出了肠道微生物群的关键调节器在自闭症的发病机制和强调监测的重要性,针对肠道微生物在未来自闭症的临床应用。
- 肠道微生物群
- 自闭症谱系障碍
- 正常
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
增加证据提供了洞察肠道微生物群在自闭症谱系障碍(ASD);然而,这些研究被限制由于小样本大小或限制在单一阶段抽样的童年。
自闭症儿童肠道微生物组发展的动态特性与临床症状仍然未知。
有什么新发现吗?
我们第一次报道,显示ASD患儿肠道微生物群的发展进步的偏差与正常组相比基于群体的粪便样本。
在自闭症题材,ASD倾斜发展表现为持续降低α多样性,早期的不可持续的和不成熟的微生物群,困难或阻碍共同基础的殖民细菌组在生命早期阶段和改变微生物的关系。
我们得出的结论是,一些细菌类群,细菌代谢功能和变更的微生物关系与行为的严重程度有关,在ASD患儿睡眠和消化系统症状。
Microbiota-based疾病诊断模型显示年龄和地区的效率。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
我们的研究结果提供欣赏可见和可翻译的microbiota-based疾病的预防和治疗ASD诊断模型。
介绍
自闭症谱系障碍(ASD)是一组神经发育障碍的特点是重复的行为和社会沟通和互动的障碍。1Leo Kanner以来第一次描述了早期自闭症临床,2ASD的全球发病率增加,0.75%之间不等3和1.85%,4并持续增长。积累的证据表明,这两个基因(如罕见的遗传性和新创变种)5和环境因素(如围产期事件)6ASD的潜在诱因。7最近一个令人鼓舞的假说提出,肠道微生物群可能是一个重要的因素在很广的范围的神经系统和精神障碍和疾病。8尽管最近的研究提供了洞察ASD的肠道微生物群,其中大部分研究限制由于小样本大小或限制在单一阶段抽样的童年。9日10因此,是否有一个真正的区别之间的肠道微生物群的健康个体和ASD患者的质疑。11
共生微生物群影响主机通过多种形式在不同宿主神经系统发展生命阶段,如通过孕产妇内脏免疫轴无菌胎儿时期12日13或参与宿主肠道微生物群microbiota-brain轴在产后发展。14最近,哈克。等报道,肠道微生物群的健康儿童成熟以及类似的轨迹速度不同,和个人的肠道微生物群可能表明敏感的点在生命早期肠道微生物群的发展。15进一步探索自闭症儿童的肠道微生物群的概要文件,我们使用一个大的1222名被试确定动力学改变肠道微生物群在不同年龄的。我们首次发现多种因素的影响,包括年龄、地区、性别、临床并发症,围产期事件和其他因素对肠道微生物群的群。然后,用我们multiregional大型队列和临床的元数据,我们exmined全民和个人间的影响因素对肠道微生物群,确定是否改变肠道微生物群影响自闭症的病理生理状态。
方法
队列描述和研究对象
toal,来自中国25个省份的1222名参与者(主要来自湖南、山东、浙江和广东)包括773名参与者与临床定义ASD(16个月至19岁)和429名正常(NT)儿童(11个月至15岁)和20无关的健康成人(24岁)招募了(在线补充表S1, S2)。知情同意是获得所有参与者的监护人的粪便样本和试验信息的集合。表1列出了一个详细的人口和年龄分布为所有样本在ASD和NT组。其他两组的详细信息和验证队列1 - 310 16所示在线补充方法1。抗生素的使用在过去的3个月前取样详细记录(在线补充表S1)。详细的临床评价标准所示在线补充表S3。总结的年龄、人口统计学、临床和地区特点提供了在线补充表S2和S4。
16 s rRNA基因测序
PCR扩增细菌16 s rRNA V4地区的基因。Sample-specific paired-end 6 bp条形码被纳入TrueSeq适配器多元排序;2×150个基点pair-end测序进行使用Illlumina NovoSeq6000平台在古河信息科技(杭州)。
生物信息学和统计分析
详细的标准序列滤波器在线补充方法1。合成清洁读取被炮轰,dereplicated、集群和嵌合体检测使用VSEARCH (V.2.4.4)针对SILVA138数据库。17序列相似度≥97%被组装成操作分类单位(OTU)使用定量见解微生物生态学(QIIME2 V.2020.6)管道。微生物功能预测的PICRUSt(系统发育调查社区重建的未被注意的状态)。输出文件进一步分析了利用宏基因组资料的统计分析软件包V.2.1.3(邮票)。主机多因子的影响肠道微生物群被EnvFit评估基于nmd Bray-Curtis不同。MaAslin218被用来确定多变量关联通过微生物的相对丰度之间的广义线性回归签名和元数据。
随机森林分析区别不同群体样本使用R包randomForest的1000棵树和所有默认设置。19日20使用10倍交叉验证一般化误差估计。夏普利添加剂解释(世鹏科技电子)值评估根据统一的斯科特·m . Lundberg和Su-In Lee提出的框架21解释的宿主因素影响所选择的特性。决策树是视觉效果使用treeheatrR包。22
定义30年龄歧视的细菌类群
年龄歧视细菌类群列表包含功能重要性得到使用随机森林萨勃拉曼尼亚提出的机器学习算法等。23那时辣子鸡的相对丰度退化对自己的生理年龄使用随机森林回归(默认参数),提取最30类群映射肠道微生物群的发展谱系ASD和NT。
深层神经网络对微生物群年龄量化
微生物群年龄是量化使用神经网络方法类似于由Galkin描述等。24深层神经网络(款)都是使用Python实现V.3.6 Keras Tensorflow后端库。细节描述的模式建设的过程在线补充方法1。
分类单元检测率分析
分类单元至少有10个样本被输送到检测率分析。每个分类单元的检测率被定义为:
NT的检出率和ASD组使用确切概率法计算和比较。
绝对微生物丰度变化分析
绝对的微生物丰度变化进行了分析后,以前的方法。25错误发现率(罗斯福)q值< 0.05被用来过滤显著改变类群。
结果
肠道微生物群的一般特征和临床信息的队列
描述了肠道微生物群在ASD跨年龄,我们招收了773名受试者临床诊断自闭症(16个月至19岁),429元对象(11月15岁)(图1 a和B和在线补充表S1-S4)。20个成年人观察队列,主要用于监控α多样性和肠道微生物群的发展时代。
肠道微生物群的一般特征和临床信息的军团。(一)地理特征的住宅群进行了研究。自闭症题材(n = 773)来自中国25个省份,虽然NT科目(包括n = 449, 20个成年人)是来自中国的14个省。(B)的总结性分布直方图显示根据年龄和性别分组对象。(C)未加权的PCA OTU水平(PC1、PC2和生物)显示,自闭症的肠道微生物组成对象分开,NT和健康的成年人。每组之间的p值测试使用突变多元方差分析(阿多尼斯)。(D) Phylum-level肠道微生物群的分布在ASD, NT和健康的成年人。每组(E)的香农多样性指数和年龄类别。的平均值±SEM绘制。* * *单向方差分析,p < 0.0001。 (F) Diverging bar chart of absolute microbial abundance changes by Analysis of Compositions of Microbiomes with Bias Correction (ANCOM-BC) between NT and ASD. (G) Horizontal bars indicate the impact (R2)的每个主机因素在人类肠道微生物群的变化。受试者分为两组(组1:≤3岁或组2:> 3岁),以及每个主机的影响因素是由EnvFit(素食)。因素大致分类根据元数据类别,和有重大影响的因素是籼和星号(罗斯福调整p值,* * * p < 0.05和p < 0.01)。(H)自闭症谱系障碍的严重程度与GI的严重程度呈显著相关(Wilcoxon符号秩,p = 8.274 e-06),睡眠障碍(Wilcoxon符号秩检验,p = 0.0001537)和过敏(Wilcoxon符号秩检验,p = 0.03008)。自闭症、孤独症谱系障碍;元,正常;ns,不重要;OTU操作分类单位;电脑,主成分;主成分分析,主成分分析。
与之前的研究一致,9 10 16尽管自闭症题材是分开NT和健康成人(图1 c),明显的微生物组成的变化仍发现个体在同一组(图1 c和D)。在门级,厚壁菌门,拟杆菌门,变形菌门和放线菌在不同的分组(占主导地位图1 d)。肠道微生物群的α多样性ASD组相比明显下降与NT和成人组(图1 e和在线补充表S5);18岁至17属显示升高或降低自闭症群体的绝对丰度相对于NT组,分别为(图1 f)。肠道微生物组报道受到多种因素的影响,如年龄、地区、食物、性别、临床疾病和围产期因素。27 28因此,我们进一步分析了这些因素对肠道微生物群的影响目前的队列。总共有12个宿主因素明显影响肠道微生物群的发现3岁以下儿童(≤3年)或/和超过3岁(> 3年)(图1 g和在线补充表S6)。不出所料,地区差异提供了最大的贡献(≤3年,R2= 0.0544;> 3年,R2= 0.0295)的肠道微生物群的变化在所有因素没有显著性差异(图1 g)。符合最近的孤独症患儿肠道微生物群的分析,29日时代给予第二高方差在ASD肠道微生物群,虽然效果下降3岁后(图1 g)。年龄从0.0384的协方差(≤3年)到0.0283(> 3年)可以归因于肠道微生物群的发展从一个高度混乱的多变的状态到一个相对成熟的状态,另外,我们指出,食物过敏或不耐受的临床条件下的个体显著影响肠道微生物群只有在人/ 3岁(图1 g)。在这个年龄段,他们的饮食,通常从一个饮食基于乳制品专注于更少的食物类型和变得多样化,可以很大程度上受到食品易感性的影响。在目前的群体,与自闭症相关的并发症的发病率(S1和S7在线补充表)尤其是胃肠道问题,大约6倍ASD组(63.9%)高于NT组(10.7%)(在线补充表S7)。令人印象深刻的是,礼物的ASD患儿严重胃肠道(分数> 3),睡眠(分数> 1)和过敏问题(分数> 1)显示更严重的自闭症症状(图1 h)。调查在ASD细菌与胃肠道问题相关联,我们进一步鉴别细菌相比ASD患者之间有/没有胃肠道问题。我们发现,12属显示重要的微分之间的相对丰度ASD /没有胃肠道问题,最常见的疾病,也就是说,胃肠道问题与微分细菌呈现显著正相关,如梭状芽胞杆菌Vadin BB60集团,UBA1819和Erysopelatoclostridium(在线补充图S1A)。此外,少量的微分属有关社会发育迟缓,语言发育迟缓和ASD评分(在线补充图印地)。分析了肠道微生物群之间的交互和其他宿主因素在自闭症谱系障碍的病理过程。
倾斜发展多样性和微生物ASD组肠道微生物群的关系
探讨年龄对肠道微生物群的影响,我们进一步跟踪主成分光谱随着年龄的增长,同时描述了两个不同起源进化的时间组织的肠道微生物群(图2)。Age-mediated改变肠道微生物群主要贡献的第一轴taxonomy-based主要组件,和自闭症的诊断导致了第二个和第三个轴(图2一个)。其他跟踪方法根据重要的肠道微生物群的影响因素没有显示出潜在的规则(在线补充图S2A-R)。肠道微生物群的发展是主导的替代细菌,30 31和功能细菌的时空错位团体表示不成熟。23日32使用随机森林的机器学习算法,23我们发现27个类群的相对多度的前30名年龄歧视细菌类群,相对一致的ASD和NT组(图2 b)。不像那些孩子不成熟或阻碍肠道微生物群,23日33只有类群ratti韦永氏球菌属(OTU 359954),梭状芽胞杆菌(OTU 3203801)肠杆菌属(OTU 2119418)自闭症儿童明显干扰(特别是在主题> 3岁)(图2 b和在线补充图S3A-C)。值得注意的是带有更高的年龄歧视类群丰富人更可能分布接近轴的末端PC1 (在线补充图S4A-C),这是一致的与年龄相关的主题分布PCA (图2一个)。
倾斜发展自闭症儿童肠道微生物群的频谱。(A)的三维图未加权主成分分析基于OTU-level Bray-Curtis不同。每个样本块染色根据自己的生理年龄梯度。箭与梯度颜色显示肠道微生物群落的发展趋势在ASD(红色)和NT(蓝色)从年轻到老。(B)热图显示平均相对丰度变化(10-based对数)30年龄歧视的细菌类群在受试者的生理年龄。(C)的预测微生物群年龄在ASD, NT和成人受试者(上图)。每个圆圈代表一个单独的粪便样本,微生物群之间的曲线平滑线性符合年龄和生理年龄。生理年龄的值减去(−)预测微生物群的年龄每组和microbiota-for-age Z分数(玛斯)的受试者自闭症图2 c下图所示。平均值±SEM所示。随着年龄的增长(D)香农多样性指数。 (E) The taxon detection rate difference between NT and ASD remained constant with age. The detection rate curves of双歧杆菌属,韦永氏球菌属,Faecalibacterium,毛螺菌属和Blautia突出显示。箭头表示一个特定的时间点的细菌异常波动的检出率。自闭症、孤独症谱系障碍;玛斯,microbiota-for-age Z分数;元,正常;OTU操作分类单位;电脑,主成分;主成分分析,主成分分析。
倾斜发展微生物孤独症患儿的关系。(一)改变微生物群落网络3岁前NT和自闭症之间。(B)改变微生物群落网络3岁后NT和自闭症之间。(C)箱线图剖面监测(PM)分数NT和自闭症之间在不同的年龄。点分数,即微生物关系改变,显著降低在NT主题和ASD患儿3岁后相比,3岁以下儿童(Wilcoxon符号秩检验,p < 2.2 e-16)。(D, E)等距log-ratio改变了丰富的散点图Fenollaria和叶绿体3岁前后,分别。觉得中国的关系这两个类群之间显著改变NT和ASD组3岁以下。这种差异消失在NT主题和ASD患儿3岁后。(F)扩大改变微生物群落的关系增加ASD得分。边缘宽度成正比线性斜率的回归点分数自闭症症状严重程度。(G)的确认点分数54所示改变属关系图3 f自闭症,这增加了严重性。(H-K)等距log-ratio改变了丰富的散点图(瘤胃球菌属)_gauvreauii_group和Coprobacillus在不同的自闭症症状严重程度组。微生物群落改变网络的A、B和F使用PM2RA派生。边缘宽度代表点分数之间的交互。节点的大小代表了相对丰度的变化,以及节点的标签指定的分类归属。红色节点代表在ASD分类单元数量的增加,和绿色的节点表示减少。* * * p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001 * * *和* * * * p < 0.0001。自闭症、孤独症谱系障碍;元,正常。
不同年龄组自闭症群体的分类和微生物代谢签名。(一)列图说明平均20个类群的相对丰度显著的丰度变化在不同年龄方括号ASD和NT包括成年人(20)之间的关系。唯一拥有大量丰富的列在一个特定的年龄变化环绕在他们的顶面(基于克鲁斯卡尔-沃利斯检验,p值详细在线补充表向。(B)热量地图跨年龄微生物代谢功能的显著变化。功能标注为“绿带运动”(左)或生物环的成员(METACYC吧)展出(基于克鲁斯卡尔-沃利斯检验,p值所示在线补充表S14系列和S15)。(汉英)微生物类群/函数和临床表型之间的关系。呈现相关性与p < 0.05基于斯皮尔曼相关系数。圆的大小代表分组方案用于计算相关性和重要性的程度(只在两个大圆圈)。从左到右,两个大圆圈表示分组方案≤3年或3年>,和小圆圈表示年龄方括号根据轴心时代图3一。显著改变微生物属之间的相关性和预测微生物群的年龄从所有科目(C),显示“绿带运动”和表型之间的关系更直观,功能和表型之间显著的相关性(四个ASD-related表型)科目≤3岁或> 3岁或≥4个人细分括号是观想(D)。METACYC和表型之间的相关性显示为圆(E)。ρ值和每个类群的p值/ GMB METACYC每个表型所示在线补充表S16-S18。自闭症、孤独症谱系障碍;“绿带运动”,肠脑模块;元,正常。
进一步评估肠道微生物群和年龄之间的关系,我们进行了量化款基于肠道微生物群的生理年龄(见“方法”部分)。线性拟合预测微生物群年龄的生理年龄,与R2在NT组和R = 0.043732在ASD组(= 0.08405图2 c上面板)。根据由萨勃拉曼尼亚的方法等,23发育障碍及肠道微生物群的两个维度:(1)之间的偏差预测微生物群的年龄和生理年龄和(2)microbiota-for-age Z分数与ASD(玛斯)的每一个主题。不管预测微生物群年龄是将自己或与NT (ASD组只和玛斯计算),只有早期的不可持续的不成熟(18 - 20、20 - 22、22 - 24、代谢途径和28 - 30个月)发现自闭症题材的肠道微生物群(图2 c,底部面板和在线补充表S8)。验证队列1显示出类似的在发展中遇到的肠道微生物群(巢族和36-47个月)(在线补充图S4D)。由于自闭症和NT组之间的不一致的年龄分布,特别是缺乏样本的年龄,验证队列2没有显示类似的变化相比,当前队列和验证队列1 (在线补充图S4E)。
α多样性NT组迅速增加从新生儿到2 - 3岁,进入相对稳定的阶段(图2 d),与在最近的纵向出生队列的发现一致。15然而,ASD组显示大多持续降低细菌α多样性(尤其是香农多样性指数)(图2 d,在线补充表S5)。跨时代的α多样性分析,属检出率随年龄总是ASD组低于NT组,和NT group-enriched属的检出率Blautia和Faecalibacterium波动(图2 e,在线的S9、S10补充表)。属的检出率在ASD和NT组3岁之前与利率相关3岁(在线补充图S5A)。因此,不同属的检出率NT和ASD组之间保持不变与年龄(图2 e,在线补充图S5B),在线补充表S10)。直方图呈现绝对微生物丰度变化的变化表明,肠道微生物组的患者显示部分恢复3岁后(在线补充图S5C,在线补充表S11)。结果提出的挑战或障碍的共同基础的殖民自闭症细菌组受试者在人生的早期阶段。
诊断肠道微生物群的潜力在当前和验证集。(A)微生物分类和代谢标记检测受试者自闭症从random-forest识别分类器基于属,“绿带运动”和METACYC。轴表示的意思是世鹏科技电子值(平均对模型输出的影响程度)特性的模型预测在每个测试(见“方法”部分)。列表示的长度总世鹏科技电子的一个特定的标记值求和的世鹏科技电子价值ASD(红色)和NT(蓝色)。(B)决策树预测热图主题是否被诊断为自闭症谱系障碍(紫色)或NT(黄色)。热图颜色显示样品的价值相对于其他组为每个特性。(C)分类器的性能在当前使用auc(固体红线)和验证(蓝线)集。在不同的预测组(D) AUC值。(E) AUC值的所有功能和排名前20位的特性在当前群体在年龄方括号。AUC,曲线下的面积; ASD, autism spectrum disorder; GBM, gut-brain modules; NT, neurotypical; OTU, operational taxonomic unit.
一些研究表明,肠道微生物群的演化成人成分在出生后2 - 3年。34 35揭示肠道微生物群的关系变更(RA)团体之间的主题提供了额外的生态视角。36 37揭示两组之间的微生物RA随着年龄的增长,使用我们的新开发分析工具称为PM2RA,26我们之间的量化RA ASD和NT组3岁,之前和之后分别。所示图3一之间,RAs ASD和NT组显示复杂的变化在3岁之前;然而,在3岁的时候,拉两组之间是显著降低,只有少数RAs发生(图3 b)。此外,微生物共生网络显示类似的改变微生物网络观察PM2RA方法(在线补充图S6A-B)。符合这些结果,我们观察到得分点的量化总RAs NT和自闭症之间3岁后也显著降低了与之前相比3岁(图3 c,在线补充表S12)。例如,类风湿性关节炎叶绿体和Fenollaria自闭症NT主题和主题之间的3岁以下后大大高于3岁(图3 d和E)。RAs元组之间的前后3岁自闭症群体之间不太复杂的比之前和之后的3岁(在线补充图S6C-D),这表明自闭症群体的微生物之间的关系是随着年龄的增长大大改变。例如,RA之间脱磷孤菌属和Ezakiella仍然几乎不变NT组3岁(之前和之后在线补充图S6E),然而,两者之间的RA微生物提供了极大的改变,和点得分显著高于NT (在线补充图S6F)。考虑到韦永氏球菌属随着年龄的增长表现出不同的动态变化在ASD和NT (在线补充图S7A),我们进一步比较之间的关系韦永氏球菌属和其他微生物在ASD和NT组。符合整个关系随着年龄的变化,之间的相关性韦永氏球菌属和其他细菌在NT组显示简单的微生物网络随着年龄(在线补充图S7B-C),然而,ASD显示明显更复杂的微生物网络随着年龄(在线补充图S7D-E),这意味着韦永氏球菌属部分导致了微生物群自闭症群体的不成熟和微生物群的发展发挥了重要作用。
进一步识别自闭症与RA的临床症状的相关性,我们比较RA在ASD组与不同的临床症状,并观察到微生物关系的变更增加自闭症谱系障碍的严重程度(图3 f)。值得注意的是,54岁的总得分点配对微生物关系逐渐增加与临床自闭症症状的加重(图3 g和在线补充表S12)。例如,RA的得分点(真细菌)_siraeum和Lactonifactor从0.00提高到0。36、增加自闭症评分(图3 h-k)。
总之,以上分析表明,自闭症和NT组在肠道微生物群的发展并不同步。此外,我们指出,自闭症肠道微生物群的发展主题偏离了NT发展的细菌多样性,殖民和微生物的关系。
重要的微生物类群的变化在年龄和代谢功能
接下来,我们解构的签名是否肠道微生物群在两组之间年龄依赖的方式。在结果中,我们观察到20微生物类群之间显示显著不同丰富时代ASD和NT组(图4)。这20个微生物类群的总丰度在不同年龄方括号远程NT组33.41%和65.90%出发,自闭症群体的35.69%和62.41%,占主要比例的肠道微生物群(在线补充表向)。的肠杆菌科的家庭,双歧杆菌属属和Lachnospiraceae NK4A136集团大幅波动在不同年龄方括号(图4一)。虽然韦永氏球菌属仅显示非统计性大量增加括号7和8岁(图4一),它的严重程度呈正相关,自闭症在主题> 4岁(图4 c,在线补充图S8A)。令人印象深刻的是,丰富的变化韦永氏球菌属ASD和NT组之间显著负相关的临床诊断和年龄(在线补充图S9A)。同意其报告的刺激神经组织的潜力,38Faecalibacterium自闭症是负相关程度(主要是在对象> 3年),而胃肠道和睡眠问题是随着年龄显著相关(在线补充图S9A)。与之前报道的自闭症儿童益生菌的损失,39的相对丰度双歧杆菌属夷为平地岁前3年在两组之间,显著增加ASD组4 - 5岁(图4一和在线补充表向)。
进一步研究潜在微生物新陈代谢功能在ASD跨支架时代,我们比较ASD的微分微生物功能和NT组。因此,我们发现了325个微生物代谢功能,39功能注解为肠脑模块(GBM)和286年的函数作为成员生物环(METACYC),与跨时代的一个重大转变(图4 b)。与动态变化的分类单元相比,微生物功能的变化表现出更明显的年龄依赖性(图4 b)。儿童早期对肠道微生物的影响函数的转换主要是归因于饮食结构从母乳或配方奶补充食物。40相应地,在目前的队列,代数余子式的转变生物合成和碳水化合物代谢途径不同年龄方括号的丰富3 - 9年(图4 b和在线补充表S14-S15)。此外,我们发现肠道微生物类群的丰度的变化,如韦永氏球菌属,Faecalibacterium和Blautia,以及功能,比如mgb - 004, mgb - 027, PWY 7374−PWY 7254−CODH−PWY,这明显与受试者的胃肠道和睡眠问题(在线补充表S16-S18)。
虽然中等复杂,相关的网络微生物功能和表型之间更紧密地与自闭症的临床表现(互联在线补充图S8B)。例如,谷氨酸退化我(mgb - 050)临床表现的严重程度呈正相关,在3岁之前图4 d和在线补充表肌力)。相比之下,谷氨酸退化二世(mgb - 051)呈负相关,ASD严重性试在3岁。从一个更高层次的功能注释,函数(METACYC)与自闭症谱系障碍的严重程度相关,与意义主要在氨基酸代谢,芳香族化合物代谢和代数余子式生物合成(图4 e)。aboudance MGB-56,此外,变化mgb - 004, pwy pwy - 5188 - 5189和X1CMET2-PWY-N10两组之间表现出显著的协会与自闭症的临床条件(在线补充图S9B和S9C)。总之,分析进一步表明,肠道微生物可能涉及自闭症谱系障碍的病理过程通过放松管制的各种代谢活动。
肠道微生物群作为ASD和NT的生物标志物
定义ASD-associated微生物或代谢途径标记,我们设计了一个随机森林模型关联ASD和NT肠道微生物群数据辣子鸡,属,“绿带运动”和METACYC水平在当前和验证军团。一个统一的框架来解释预测,即世鹏科技电子,进行(见“方法”部分)。鉴于微生物生态系统显著不同科目3岁前后,我们首先定义两组标记为≤3岁的儿童和> 3岁,分别为(在线补充图S10A-D)。组的预测精度≤或> 3岁AUC是0.83和0.86,分别。提供所有儿童临床适用性的预测工具,我们选择最高的20个高级特性模型的价值和重要性最低内部子类的偏见重新建立预测模型。所有20特性显示没有组间特异性,在某种程度上,改变aboudance两组之间保持一致的验证组(图5一个和在线补充图S11A-C)。每个特性有一个平等的重要性ASD(红色)或NT(蓝色),受试者的年龄的贡献是在中间级(图5一个)。
创建一个可判断的决策模型更实用的临床价值,我们得到一个典型的决策树(图5 b)使用treeheatr(见“方法”部分)。丙酸合成的代谢途径III (mgb - 055号9)显示,显著增加丰富的变化ASD组(年龄方括号3、6和9)(图4 b和在线补充表S14系列),放置在顶部的树和标记的截止值(丰度,41119.31)(图5 b)。其他功能也分布在树的叶节点和分支与特定的截止值。mgb - 055丰度值> 119.31 41杰出更多患有自闭症的科目,在左边的树,符合该发现在动物研究表明丙酸可能导致老鼠autism-like行为。41几乎所有科目与异常丰富的mgb - 055, mgb - 044和pwy - 5088带注释的肠道微生物的代谢活动是写给ASD组(图5 b)。
因为大多数微生物的特征是年龄相关性,我们把个人生理年龄到性能验证。在OTU层面,我们的模型显示,56% -79%的准确率在当前和验证集,分别为(图5 c-5d,在线补充图S10E-J)。该模型基于属水平略低,-72%的准确率为62%。“绿带运动”的准确性和METACYC模型在区分ASD和NT达到81% (GBM模型在当前设置),64% - -82% (GBM模型验证集),85% (METACYC模型在当前组)和62% (METACYC模型验证集)的-90%。然后我们混合所有功能和评估他们的检测效率。所有功能的精度达到了85%和82%在当前和验证组2,分别。前20名的最METACYC特性属于氨基酸代谢,芳香族化合物代谢和碳水化合物代谢(在线S18补充表S15和美国)。但出乎意料的是,排名前20位的精度特性略提高(86%)相比,所有功能(85%)在当前当前队列和维护在验证集1(78%)、2(82%)和3 (67%)(图5 c和D)。解构的AUC从随机与森林有关的模型在不同年龄方括号,我们发现所有功能和效率的功能模型波动(前20名图5 e)。令人印象深刻的是,在6岁之前,我们的前20名的诊断效率特性是明显的,特别是在3 - 6年的年龄方括号(AUC 0.93 - -0.97) (图5 e)。
简而言之,结果表明,预测模型基于这些发现生物标志物显示钦佩预测ASD状态判别能力。
讨论
基于我们基于multiregional肠道微生物群的结果,我们表明,肠道微生物群的发展明显倾斜,在ASD患儿不可持续的不成熟,考虑微生物组成、功能和配置文件的价格相比NT主题的关系。我们进一步探索和确认诊断潜在的大规模人类肠道微生物群的群,表明肠道微生物组可以被认为是一种非侵入性方法自闭症的早期预警。除了行为症状、并发症如胃肠道功能障碍、睡眠障碍、自闭症儿童食物过敏经常报道。42-44相应地,我们说明的丰度和功能微生物类群明显提到相关并发症与ASD科目。
我们确定了重大变化在孤独症患者微生物的关系,特别是在3岁之前,和改变的程度与自闭症谱系障碍的严重程度的关系,表明改变微生物关系发生在ASD患儿微生物发展的早期阶段,这是符合节点当孤独症患儿的行为缺陷发生。越来越多的证据表明,肠道微生物群中发挥着关键作用在生物和生理特点潜在的神经发育。45早期社会的分析进一步结合,建立微生物之间的关系可能影响儿童的神经发育。
与增长缓慢造成的严重的儿科病理条件下,如严重急性营养不良23日32囊性纤维化,46只有短暂的发育不良的肠道微生物群ASD患儿中可观察到在当前队列;然而,早期主要的分遣队的细菌,如韦永氏球菌属,被推迟。哈克。等最近报道,韦永氏球菌属和梭状芽胞杆菌显示动态变化在健康儿童的早期发展阶段类似于观察目前的军团。15然而,辣子鸡ASD患儿明显干扰,表明两个辣子鸡发挥重要作用在肠道微生态系统的建立在生命的早期阶段。
在ASD最扰乱微生物功能属于“绿带运动”,氨基酸代谢和芳香族化合物代谢。先前的研究已经表明,这些功能参与个体神经系统发育、神经递质合成和神经元响应规定。47例如,我们观察到细菌为色氨酸代谢途径,包括神经保护犬尿酸的生产(犬尿氨酸合成,mgb - 004)和神经毒性喹啉酸(色氨酸合成、mgb - 055),与自闭症谱系障碍的严重程度显著相关。所示相似的相关性也丙酸和多巴胺代谢,参与代谢网络的神经递质。我们的研究结果强调肠道微生物群可能深刻地影响神经发育通过调节神经递质代谢。
大多数以前的研究,建立肠道microbiota-based诊断模型通常描述的零件清单,列举组件成员和模型的效率,9 48 49从而限制肠道微生物群特性的解释和实际应用在人类疾病进展。在当前的研究中,我们得到的决策过程模型,揭示了群特异性的因素在我们的模型中使用treeheatr22世鹏科技电子。21因此,决策过程被分布呈现每个因素树的叶节点和分支与特定的截止值。此外,我们的模型表明特定的截止值和最后的判决结果的一个因素,它可以为一个独立的个体提供实际可用的索引在临床警告或治疗以及潜在的致病因素的科学探索。
总之,进步发展的偏差的肠道微生物群的主题与ASD强调年龄的影响肠道微生物群的组成,这表明,孤独症患者应该在同一生理年龄与健康对照组相比,排除“年龄歧视”功能,为临床应用和科学研究。的建设基于粪便微生物群移植动物模型,研究人员应该考虑之间的转换和年龄匹配的人类粪便供体和受体的老鼠。在未来,通过构建纵向群ASD患儿和NT和集成宏基因组和代谢组学分析,我们可以精确地识别潜在发展窗口中肠道微生物群对ASD发展可能特别敏感,并进一步提供关键线索揭示肠道微生物群如何参与自闭症的发病机制通过调节代谢途径。
数据可用性声明
合理的请求数据。所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。所有16 s rRNA原始数据提交给中国国家数据库资源库,CNGBdb(加入号码,CNP0001512)。
伦理语句
病人同意出版
伦理批准
本研究涉及人类参与者和湖南省的研究伦理委员会批准孕产妇和儿童卫生保健医院(没有:2019 - s017)和山东大学齐鲁医院(没有:2018 - 179)。参与者给知情同意参与这项研究之前的部分。
确认
我们要感谢Editage (www.editage.com)英语编辑和审稿人的建议。
引用
脚注
毫升,AC, CJ公里同样起到了推波助澜的作用。
贡献者YW, XL, GJ, AC和ML的构思和设计研究。CJ,公里,ZZ, XP, ZL,金桥,求出和XL执行数据分析和数据。XL、ZZ和CJ起草了手稿。ML, AC, YW, XX、平方、HL、YL、LC和XQ主题进行招聘和收集临床样本和数据。YN, GJ, x,古银和YJ协助安排样品收集和数据。XL, GJ, JL YW监督研究和修订后的手稿。所有作者的解释和确认这些数据和手稿。
资金这项工作是由湖南卫生委员会的科学研究项目(项目号YW 20200891)。国家自然科学基金委资助81671983和81671983 XL和启动资金NJMU肠道微生物群的团队研究(XL)。
相互竞争的利益没有宣布。
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