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胰腺和肝脏
组蛋白H3K27 demethylase KDM6A是一种表观遗传看门人mTORC1信号的癌症
  1. Steffie Revia1,
  2. 阿格涅斯卡Seretny1,
  3. 莉娜Wendler1,
  4. 安娜Banito2,
  5. 克里斯托弗埃克特1,
  6. Kersten布鲁尔3,
  7. Anand Mayakonda3,
  8. Pavlo Lutsik3,
  9. 马提亚翻转4,
  10. 西尔维亚Ribback5,
  11. Suchira Gallage6,
  12. Ismaiel Chikh Bakri7,
  13. Kai Breuhahn7,
  14. 彼得Schirmacher7,
  15. Stefan海因里希8,
  16. 马提亚M Gaida9,10,11,12,
  17. 马赛厄斯Heikenwalder6,
  18. 迭戈F Calvisi4,
  19. Christoph布特就3,
  20. Scott W劳13,14,
  21. Darjus F Tschaharganeh1
  1. 1Helmholtz-University集团“细胞可塑性和表观遗传改造”,德国癌症研究中心(DKFZ) &病理学研究所大学医院,海德堡、德国
  2. 2小儿软组织肉瘤的研究小组,德国癌症研究中心(DKFZ),海德堡、德国
  3. 3部门的癌症表观基因组学,德国癌症研究中心(DKFZ),海德堡、德国
  4. 4病理研究所,雷根斯堡大学,雷根斯堡、德国
  5. 5病理研究所,格赖夫斯瓦尔德大学医院,格赖夫斯瓦尔德、德国
  6. 6的慢性炎症和癌症,德国癌症研究中心(DKFZ),海德堡、德国
  7. 7病理研究所,海德堡大学医院,海德堡、德国
  8. 8外科学系,美因茨大学医学中心,JGU-Mainz,美因茨、德国
  9. 9病理研究所,美因茨大学医学中心,JGU-Mainz,美因茨、德国
  10. 10免疫治疗研究中心,美因茨大学医学中心,JGU-Mainz,美因茨、德国
  11. 11联合单位免疫病理、病理学院,大学医学中心,JGU-Mainz,美因茨、德国
  12. 12特隆,平移肿瘤学,大学医学中心,JGU-Mainz,美因茨、德国
  13. 13癌症生物学和遗传学,斯隆凯特林研究所,纪念斯隆凯特林癌症中心,纽约,纽约美国
  14. 14霍华德休斯医学研究所,切维蔡斯,医学博士美国
  1. 对应到Darjus F Tschaharganeh博士,德国癌症研究中心,海德堡,巴登-符腾堡州,德国;d.tschaharganeh在{}dkfz.de

文摘

客观的大规模基因组测序工作的人类肿瘤识别表观遗传修饰符的类最常见的突变基因在人类癌症。然而,这些突变如何驱动肿瘤发展和肿瘤进展在很大程度上是未知的。在这里,我们调查的功能组蛋白demethylase KDM6A在胃肠道癌症,如肝癌、胰腺癌。

设计基因改变以及表达分析KDM6A患者进行肝癌。基因小鼠模型的肝脏和胰脏癌加上Kdm6a-deficiency调查,转录组和表观遗传分析进行体内和体外进行药物治疗。

结果KDM6A表达失去了30%的肝癌患者。Kdm6a删除显著加速肿瘤小鼠肝脏和胰腺癌模型的发展。Kdm6a-deficient肿瘤显示hyperactivation mTORC1信号,而内生Kdm6a表达,诱导rna干扰在建立Kdm6a-deficient肿瘤减少mTORC1活动导致减毒肿瘤进展。全基因组转录和表观遗传分析显示直接绑定mTORC1 Kdm6a至关重要-监管机构,如Deptor和随后的转录激活后生改造。此外,在体外和体内基因上位实验说明Deptor的关键功能和mTORC1 Kdm6a-dependent肿瘤抑制。重要的是,KDM6A表达在人类肿瘤与mTORC1活动和KDM6A-deficient mTORC1抑制肿瘤表现出更加敏感。

结论KDM6A是一个重要的肿瘤抑制胃肠道癌症和行为作为mTORC1表观遗传开关信号。KDM6A-deficient肿瘤患者可能受益的靶向治疗关注mTORC1抑制。

  • 胃肠道癌症
  • 肝胆的癌症
  • 肝细胞癌
  • 分子致癌作用

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2021 - 325405

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    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 下一代大规模癌症基因组测序的努力始终显示,参与建立和解释表观遗传的基因改变景观是人类tumourigenesis最频繁的事件之一。尽管如此流行,机械的见解如何这些突变功能有助于癌症发展和交叉与其他途径参与tumourigenesis在很大程度上仍未知。

    有什么新发现吗?

    • 通过整合基因组、基因和临床前数据识别组蛋白demethylase KDM6A作为一种有效的肿瘤抑制基因在肝脏和胰脏癌,提供一个机械的解释如何KDM6A介导肿瘤抑制和治疗策略如何KDM6A-deficient肿瘤治疗。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 通过展示为mTORC1 KDM6A充当表观遗传开关信号,KDM6A缺乏肿瘤应对mTORC1抑制剂,我们设想实现KDM6A mTORC1集中在胃肠癌症疗法的生物标志物,因此对个性化医学的新兴领域的援助。

    介绍

    最近的全基因组测序工作的人类肿瘤编目虚拟每个癌症的突变景观类型。1这些数据显示,许多著名的司机的基因,但同时也涉及基因参与tumourigenesis小说。特别是,基因编码染色质修饰符被发现在许多不同的癌症类型改变,2 - 4这意味着他们在肿瘤发展的重要作用。然而,尽管一些研究tumourigenesis功能验证他们的贡献,5个6大部分时间还未知的基因从力学上看他们是如何参与癌症恶化。

    mixed-lineage白血病蛋白3/4 (MLL3/4)复杂与set2(指南针)中的相关的蛋白质——复杂的多组分复杂参与改造的表观遗传景观促进有效的转录激活。7号到9号这个复杂的包含KMT2C (MLL3)和KMT2D (MLL4),两组蛋白H3K4甲基转移酶,KDM6A (UTX),一个H3K27 demethylase,几个脚手架蛋白(ASH2、WDR5 RBBP5和hDPY30)也出现在其他指南针复合体,和其他蛋白质特定复杂(PTIP / PAXIP1, PA1 / PAGR1和NCOA6)。10 11重要的是,人类肿瘤的测序数据确定删除突变催化地活跃的组件KMT2C,KMT2D和KDM6A的复杂,12日至16日建议有助于tumourigenesis中断他们的活动。然而,尽管这些观察,机械的深入了解这些突变功能有助于癌症发展和交叉与其他途径参与tumourigenesis在很大程度上仍未知。

    结果

    获得的基因改变的完整概述MLL3/4 COMPASS-like复杂的成员,我们开采公开pan-cancer测序数据(www.cbioportal.org17 18)删除突变,缺失和浅删除(在线补充图1),发现的确三催化亚基显示变更频率最高(KDM6A:21%,KMT2D:15%,KMT2C:14%)。值得注意的是,这三个基因显示大量的删除突变(在线补充图1),表明肿瘤选择各自的功能蛋白质的损失。只有在考虑这些遗传事件KDM6A,KMT2D和KMT2C清楚地表明,最高的频率是观察到固体癌症(在线补充图2,在线补充图3),如胃肠道和泌尿癌症类型,而此前这些基因功能的研究重点血液学的癌症类型。19号我们进一步分析了癌症基因组图谱项目(TCGA)为肝细胞癌(HCC)的数据集,这是一个非常积极的固体肿瘤已经成为全球第四位最常见的癌症死亡原因。24肝癌通常的特点是频繁的放大,包括MYC致癌基因,突变wnt通路组件和/或灭活突变TP53和CDKN2A肿瘤抑制基因,还展品经常改变染色质修饰符。25我们的分析显示,类似于其他固体肿瘤类型KDM6A,KMT2D和KMT2C显示高频率的深和浅的删除以及删除突变(在线补充图3 b)。值得注意的是,KDM6A似乎是最常见的突变基因,占28%的患者样本。有趣的是,KDM6A位于x染色体上,和以前X-inactivation逃跑,26日27日因此作为一个公认的monoallelic肿瘤抑制基因只在男性。获得进一步的洞察的作用KDM6A在人类肝癌,我们分析KDM6A信使核糖核酸(mRNA)记录在一个队列包含76肝癌和相应的正常肝组织(在线补充表1)。从这一群人,我们发现,30%的肝癌表达mRNA水平较低相比正常肝脏(图1一个)和一些肝癌表现出更高KDM6A信使rna水平。此外,我们探索KDM6A蛋白表达在一个组织微阵列由39正常肝组织和459肝癌(在线补充表2),发现几乎所有的正常肝组织表示检测结果显示核表达KDM6A低,而KDM6A缺席大约30%的肝细胞癌(图1 b)和一小部分的肝癌病例显示KDM6A表达升高。有趣的是,我们已经观察到减少KDM6A表达发育异常的结节,肝细胞癌的诚意前体病变。因此,我们的结果表明,KDM6A迷失在30%以上的人类肝癌,这损失可能归因于基因的缺失KDM6A轨迹。

    Kdm6a disruption causes liver tumour formation in conjunction with oncogenic Myc. (A) Messenger RNA expression of KDM6A in a clinical cohort of 76 human hepatocellular carcinomas (HCCs). KDM6A expression was assessed both in the surrounding healthy liver tissue and tumour tissues. Unpaired t-test, p=0.0001. (B) Left, quantification of KDM6A expression as evaluated by immunohistochemistry in the tissue microarrays classified into normal liver tissues, cirrhotic tissues, dysplastic nodules and HCCs. Right, representative results of KDM6A staining. Image of HCC that scored 0 in the upper panel and normal liver tissue that scored 2 in the lower panel. (C) Vectors permitting transient expression of Cas9 and single guide RNAs (sgRNAs) targeting Kdm6a (top), and Sleeping Beauty transposon-based stable expression of c-myc (bottom) were used to generate Myc;sgKdm6a liver tumour via hydrodynamic gene delivery via tail vein injection. (D) Histopathology of liver tumours generated by c-myc overexpression and either Kdm6a or Tp53 knockout. Top, tumour nodules in Myc;sgTp53 and Myc;sgKdm6a injected mice visualised by dissection microscope. Middle, HE staining. Bottom, Kdm6a staining. (E) Survival of mice injected with sgRNAs targeting Kdm6a (red and blue line, each n=10), Tp53 (yellow line, n=6) or green fluorescence protein (GFP) (black line, n=3) as control. (F) Vectors for in vivo short hairpin RNA (shRNA)-mediated gene silencing in the setting of c-myc overexpression. The shRNAs targeting Kdm6a or Renilla luciferase as control, were constitutively expressed and linked to GFP expression. (G) Survival of Myc;shKdm6a mice with two independent shRNA (red and blue line, each n=10) and Myc;shRenilla mice (black line, n=10); log-rank test, **p value=0.0014 (H) Dissection microscope pictures of tumour nodules observed in Myc;shKdm6a mice, note that shRNA-expression in linked to GFP. (I) Histopathology of Myc;shKdm6a liver tumours. Left, HE staining of liver tumours depicted above. Right, Kdm6a staining of corresponding tumours. Scale bars, 50 µm.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    Kdm6a中断导致肝脏肿瘤的形成与致癌Myc。(A)的信使RNA表达KDM6A在临床的76个人类肝细胞癌(hcc)。KDM6A表达式是评估在周围健康的肝脏组织和肿瘤组织。未配对t检验,p = 0.0001。KDM6A表达的(B),量化评估的组织微阵列的免疫组织化学分为正常肝组织,肝硬化组织发育异常的结节和肝细胞癌。对的,代表KDM6A染色的结果。肝癌的形象得分0上面板和正常肝组织得分2在较低的面板。(C)向量允许瞬时表达Cas9和单指南rna (sgRNAs)目标Kdm6a(顶部)和睡美人transposon-based原癌基因的稳定表达(底部)被用来生成Myc; sgKdm6a肝脏肿瘤通过水动力通过尾静脉注射基因传递。(D)产生的肝肿瘤组织病理学原癌基因超表达和Kdm6a或Tp53淘汰赛。,肿瘤结节Myc; sgTp53 Myc; sgKdm6a注入小鼠视觉效果通过解剖显微镜。中间,他染色。底,Kdm6a染色。(E)小鼠注射sgRNAs瞄准的生存Kdm6a(红色和蓝色线,每个n = 10),Tp53(黄线,n = 6)或绿色荧光蛋白(GFP)(黑线,n = 3)控制。(F)向量体内短发卡RNA(成分)介导的基因沉默的设置原癌基因超表达。shrna瞄准Kdm6a或Renilla荧光素酶作为控制,持续表达,与GFP的表达。(G)的生存Myc; shKdm6a小鼠两个独立成分(红色和蓝色线,每个n = 10)和Myc; shRenilla老鼠(黑线,n = 10);生存率较,* * p值= 0.0014 (H)解剖显微镜下肿瘤结节中观察到的照片Myc; shKdm6a老鼠,注意shRNA-expression与GFP。(我)组织病理学Myc; shKdm6a肝脏肿瘤。离开,他染色肝肿瘤如上图所示。对,Kdm6a染色相应的肿瘤。酒吧、规模50µm。

    确定功能Kdm6a损失肝脏肿瘤发展的后果,我们利用一个强大的小鼠模型中,遗传元素可以使用水动力直接引入到成年野生型肝细胞基因传递通过尾静脉注射(HDTVi)。这个过程可以引入癌症诱发损伤肝细胞的一个子集用转座子向量允许稳定整合重组致癌互补dna(互补)(转座子向量)或通过引入质粒编码Cas9和单指南rna (sgRNAs)破坏肿瘤抑制基因在基因组编辑。28 - 30引人注目的是,C57BL / 6小鼠注射一个转座子向量表达原癌基因(Myc)与两个独立的CRISPR / Cas9结构目标Kdm6a(sgKdm6a) (图1 c)被迅速从疾病小鼠注射CRISPR / Cas9构建目标Tp53(sgTp53),而老鼠接受原癌基因和一个控制CRISPR / Cas9质粒保持健康(图1 d),如前面所描述的一样。31日Myc; sgKdm6a Myc; sgTp53注入老鼠发达诚意hcc和预期Kdm6a表达式只是缺席Myc; sgKdm6a肿瘤(图1 e)。因此,T7-endonuclease试验(图3 c在线补充)和DNA测序(在线补充图3 d)的基因组目标地区tumuor-derived细胞系透露indel突变Kdm6a这些细胞和免疫印迹分析显示亏损Kdm6a蛋白(在线补充图3 e)。此外,持续抑制由两个验证Kdm6a短发卡rna(成分)也配合Myc HDTVi产生肝癌,提供进一步的验证的肿瘤抑制作用Kdm6a使用正交方法(图1外:我,在线补充图3 f)。我们还发现人类肝癌KDM6A表达升高,我们测试的能力执行KDM6A与原癌基因超表达合作形成肝脏肿瘤。然而,动物接收转座子向量编码Kdm6a互补脱氧核糖核酸和原癌基因没有屈服于疾病(图3 g网络补充)。因此,Kdm6a损失与原癌基因合作推动肝肿瘤的发展。

    接下来,我们问持续Kdm6a抑制肿瘤维护是很重要的。为此我们C57 / Bl6小鼠注射转座子向量编码原癌基因和reverse-tetracycline反式激活因子(rtTA)和第二个转座子向量表达Tet-responsive元素(过夜)启动子调控shRNA针对Kdm6a与涡轮红色荧光蛋白(tRFP) (图2一个)。值得注意的是,这个系统允许的Kdm6a抑制细胞内接收两个向量只有当老鼠是美联储强力霉素(阿霉素)包含食物,而正常小鼠接受chow内生Kdm6a蛋白质水平表达。前一周注入老鼠Dox-chow和肿瘤发病监测通过磁共振成像(图2一个)。一旦发现了肿瘤,我们把人群分为两组:一组进一步接受Dox-food(持续Kdm6a镇压),第二组是放在正常的食物(内生Kdm6a复活)。值得注意的是,我们发现肿瘤的一个重要的生存利益轴承Dox-withdrawal老鼠(图2 b)和核磁共振分析time-courses显示肿瘤迅速发展与持续Kdm6a抑制小鼠,而肿瘤在小鼠内源性Kdm6a停滞的表达,然而他们最终在之后的时间点进展(图2 c)。如预期肿瘤on-Dox老鼠表达tRFP(因此shRNA)而tRFP缺席off-Dox肿瘤(在线补充图4)。因此,在肿瘤on-Dox Kdm6a蛋白质水平检测不到,但强大的核表达式off-Dox Kdm6a是可见的肿瘤(图2 d)。尽管两组之间肿瘤细胞增殖持平(数据未显示),我们发现了一个巨大的感应off-Dox肿瘤细胞的凋亡cleaved-caspase 3所示(c-casp3)染色(图2 d)。之前使用的主要肿瘤细胞系来源于阿霉素开关(Myc; TREshKdm6a细胞),我们观察到的Kdm6a感应mRNA (在线补充图4 b)和蛋白质含量(图2 e)对阿霉素撤军。Kdm6a re-expressing细胞形成较少的殖民地(图2 f),我们发现快速诱导细胞凋亡Kdm6a修复(图2 g)。重要的是,表达Kdm6a互补脱氧核糖核酸在Myc; sgKdm6a细胞(在线补充图5 a, B)是伴随着一个缺点在细胞竞争分析(在线补充图5 c),减少集落形成(在线补充图5 d, E)和诱导细胞凋亡(在线补充图5 f),从而反映内生Kdm6a结果的表达。总的来说,这些实验证明持续Kdm6a抑制保护从细胞凋亡和肿瘤需要维护体内和体外。

    Sustained KDM6A loss is important for tumour maintenance. (A) Schematic view of the Dox-inducible shKdm6a-mediated knockdown mice (Myc;TREshKdm6a) and MRI experimental setting. (B) Survival of Myc;TREshKdm6a mice in the presence (blue line; off-Dox, n=6 mice per group) or absence (red line; on-Dox, n=6) of KDM6A; log-rank test, **p value=0.0067. (C) Left, representative MRI scans of Myc;TREshKdm6a liver tumours (marked in red) at different time points. Right, time course quantification of lesion volume in Myc;TREshKdm6a tumour-bearing mice, (blue line, off-Dox, n=6 mice per group; red line, on-Dox, n=4) (D) Left, representative immunohistochemistry (IHC) stainings of Myc;TREshKdm6a liver tumours. scale bar, 50 µm. Right, quantification of IHC staining for cleaved caspase-3 (c-Casp3). Unpaired t-test, n=6 and 30 fields of view, *p value=0.0136. (E) Immunoblot analyses before (on-Dox) and after (off-Dox) Kdm6a restoration in Myc;TREshKdm6a cell lines expressing two independent Kdm6a shRNAs. Actin served as a loading control. Representative result of n=3. (F) Left, colony formation assay of indicated cell lines with and without Dox for 10 days. Representative result of n=3. Right, quantification of colony formation assay. Values are mean±SD, n=3. Unpaired t-test, *p value=0.022, **p value=0.0085. (G) Active caspase-3/7 labelling in Myc;TREshKdm6a cell lines grown for 6 days with or without Dox. Error bars represent mean±SD; n=3. Paired t-test **p=0.0039 *p=0.0124. Dox, doxycycline; FC, fold change; HDTVi, hydrodynamic gene delivery via tail vein injection.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    持续KDM6A损失对肿瘤的维护很重要。(A)的示意图Dox-inducible shKdm6a-mediated击倒的老鼠(Myc; TREshKdm6a)和核磁共振实验设置。(B)的生存Myc; TREshKdm6a老鼠在(蓝线;off-Dox, n = 6小鼠每组)或缺失(红线;KDM6A on-Dox, n = 6);生存率较,* * p值= 0.0067。(C),代表Myc的核磁共振扫描;TREshKdm6a肝脏肿瘤在不同的时间点(用红色标识)。对,时间进程量化Myc的损伤体积;TREshKdm6a tumour-bearing老鼠,(蓝线,off-Dox, n = 6每组小鼠;on-Dox红线,n = 4) (D),代表免疫组织化学(包含IHC)染色法Myc; TREshKdm6a肝脏肿瘤。酒吧,规模50µm。 Right, quantification of IHC staining for cleaved caspase-3 (c-Casp3). Unpaired t-test, n=6 and 30 fields of view, *p value=0.0136. (E) Immunoblot analyses before (on-Dox) and after (off-Dox) Kdm6a restoration in Myc;TREshKdm6a cell lines expressing two independent Kdm6a shRNAs. Actin served as a loading control. Representative result of n=3. (F) Left, colony formation assay of indicated cell lines with and without Dox for 10 days. Representative result of n=3. Right, quantification of colony formation assay. Values are mean±SD, n=3. Unpaired t-test, *p value=0.022, **p value=0.0085. (G) Active caspase-3/7 labelling in Myc;TREshKdm6a cell lines grown for 6 days with or without Dox. Error bars represent mean±SD; n=3. Paired t-test **p=0.0039 *p=0.0124. Dox, doxycycline; FC, fold change; HDTVi, hydrodynamic gene delivery via tail vein injection.

    Kdm6a MLL3的一部分/ MLL4 COMPASS-like复杂,epigenetically调节基因表达的影响染色质组蛋白修饰可访问性。7日11因此,询问潜在目标基因介导的肿瘤抑制活性Kdm6a,我们异形Myc基因的转录组;sgKdm6a细胞系。我们发现331基因调节(log2-fold修改<−1,p值< 0.05)和910个基因表达下调(log2-fold改变> 1,p值< 0.05)相比,Myc; sgTp53细胞系(图3一),有趣的是,创新路径分析显示upregulation EIF2信号,调节eIF4 p70S6K信号,和mTOR信号中最重要的调节通路Myc; sgKdm6a细胞(图3 b)。仔细观察mTOR通路中的表达变化的各个组件(图3 c)显示,负监管机构(Deptor, Tsc1)是在所有三个Myc;表达下调sgKdm6a细胞系,而翻译起始因子和核糖体蛋白,这是至关重要的下游mTORC1因素(在线补充图6)。定量逆转录定量PCR (RT-qPCR)分析Myc; sgKdm6a Myc; sgTp53细胞系的upregulation进行验证Deptor在Myc; sgTp53细胞系(在线补充图6 b)。此外,我们可以观察到明显的mRNA upregulationDeptor6天后内生Kdm6a Myc恢复;TREshKdm6a细胞系(图6 c在线补充),进一步表明Kdm6a表达水平之间的直接关系和转录激活的Deptor同基因的设置。

    Kdm6a loss leads to distinct transcriptional changes and hyperactivation of mTORC1 signalling. (A) Volcano plot of differentially expressed genes revealed by RNA-seq of Myc;sgKdm6a and Myc;sgTp53 liver tumour-derived cell lines, n=3 independent cell lines per group. Genes with more than twofold expression change and exceeding adjusted p value<0.05 are indicated in red. (B) Top 10 affected canonical pathways from RNA-seq data based on Ingenuity Pathway Analysis. (C) Heatmap of differentially regulated mTOR pathway genes in Myc;sgKdm6a and Myc;sgTp53 cell lines, n=3 independent cell lines per group. (D) Left, representative immunohistochemistry (IHC) images of Kdm6a and pS6RP staining in Myc;sgTp53 and Myc;sgKdm6a murine livers at endpoint of experiment. Scale bar, 50 µm. Right, quantification of IHC staining for pS6RP. Unpaired t-test, *p value=0.0103. (E) Immunoblot analyses of Myc;sgTp53 and Myc;sgAxin1 cell lines expressing either single guide RNAs targeting Kdm6a or empty vector as control; representative results of n=3. (F) Time course immunoblotting of Myc;TREshKdm6a cell line for mTOR signalling pathway in the presence (off-Dox) or absence (on-Dox) of Kdm6a; representative results of n=3. (G) Left, representative images of Kdm6a and pS6RP expression detected by IHC in murine livers at endpoint of experiment in the presence or absence of Dox. Scale bar, 50 µm. Right, quantification of IHC staining for pS6RP. Unpaired t-test, p=0.0494. Dox, doxycycline.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    Kdm6a损失会导致不同的转录变化和hyperactivation mTORC1信号。差异表达基因(A)火山的情节揭示了RNA-seq Myc; sgKdm6a Myc; sgTp53肝脏肿瘤提取细胞系,n = 3每组独立的细胞系。基因有超过两个表情变化和超过调整p值< 0.05所示红色。(B)十大影响规范途径从RNA-seq数据基于创新路径分析。(C)的热图的不同监管mTOR通路Myc基因;sgKdm6a Myc; sgTp53细胞系,n = 3每组独立的细胞系。(D),代表免疫组织化学(包含IHC)的图像Kdm6a Myc和pS6RP染色;sgTp53 Myc; sgKdm6a实验小鼠肝脏的端点。酒吧,规模50µm。对的,量化的pS6RP包含IHC染色。未配对t检验,p值= 0.0103。(E)的免疫印迹分析Myc; sgTp53 Myc; sgAxin1细胞系表达单一指南针对Kdm6a rna或空向量作为控制; representative results of n=3. (F) Time course immunoblotting of Myc;TREshKdm6a cell line for mTOR signalling pathway in the presence (off-Dox) or absence (on-Dox) of Kdm6a; representative results of n=3. (G) Left, representative images of Kdm6a and pS6RP expression detected by IHC in murine livers at endpoint of experiment in the presence or absence of Dox. Scale bar, 50 µm. Right, quantification of IHC staining for pS6RP. Unpaired t-test, p=0.0494. Dox, doxycycline.

    接下来,我们调查如果观察转录变化转化为mTORC1途径激活。免疫组织化学分析小鼠Myc; sgKdm6a肝脏肿瘤显示增加的磷酸化mTORC1下游目标S6RP (pS6RP)与Myc; sgTp53肝脏肿瘤(图3 d),指示hyperactivation mTORC1在这些肿瘤。此外,Myc Deptor蛋白质非常丰富;sgTp53细胞相比,Myc; sgKdm6a细胞(在线补充图6 d)。引人注目的是,我们观察到减少Deptor表达的同时增加S6RP磷酸化CRISPR / Cas9介导的基因敲除的Kdm6a同基因的小鼠癌症细胞系来源于Myc; sgTp53 Myc; sgAxin1肿瘤(图3 e)。此外,使用Myc; TREshKdm6a细胞作为额外的同基因的系统我们发现的蛋白表达增加Deptor以及减少内源性Kdm6a pS6RP 6天后的表达(图3 f)。此外,免疫组织化学染色pS6RP小鼠肝脏肿瘤来源于我们之前体内活化实验证实这些结果(图3 g)。因此,这些数据表明,Kdm6a可以作为表观遗传开关通过促进转录激活Deptor mTORC1的差别导致对这些信号。

    接下来,进一步识别的直接目标Kdm6a Kdm6a异形全基因组绑定。我们决定使用Myc; TREshKdm6a (off-Dox)或没有(on-Dox)内源性Kdm6a表达,直接询问Kdm6a导致的变化。乳沟在目标和发布使用核酸酶(急忙逃走)分析确定了1028个基因丰富Kdm6a绑定后6天内生Kdm6a表达(在线补充表3)。有趣的是,我们发现,大约25%的Kdm6a山峰都位于启动子附近网站(图4一),这表明Kdm6a可能允许在这些基因转录激活。进一步,我们异形组蛋白标记(H3K27me3、H3K4me1 H3K4me3和H3K27ac)在细胞(off-Dox)或没有(on-Dox)内源性Kdm6a表达和不确定这些标志着全球的变化。然而,当我们专注于染色质Kdm6a绑定的地区我们可以观察减少H3K27me3 H3K4me3并获得(图4 b),指示更改对宽容的染色质Kdm6a恢复,特别是在启动子区域(图4 c)。有趣的是,我们发现强烈Kdm6a绑定Kdm6a内部,伴随着H3K4me3增益和H3K27me3损失(图4 d)和同样的变化也观察到负mTORC1通路中的监管机构Deptor (图4 d)。因此,Kdm6a修复会导致不同的绑定Kdm6a染色质伴随着宽容的染色质的变化在启动子,在Deptor等。

    Genome-wide profiling of histone modifications and Kdm6a. (A) Binding sites of Kdm6a genome-wide based on cleavage under target and release using nuclease (CUT&RUN) profiling. (B) Profile plots of Kdm6a, H3K4me3 and H3K27me3 in the proximity of Kdm6a binding sites; n=1. (C) Global heatmaps of Kdm6a and histone modifications (H3K4me3, H3K4me1, H3K27ac, H3K27me3) from CUT&RUN signals in Myc;TREshKdm6a cell line in the presence (off-Dox) or absence (on-Dox) of Kdm6a sorted by Kdm6a signal; n=1. (D) Kdm6a, H3K27ac, H3K4me3, H3K4me1 and H3K27me3 occupancies at Kdm6a (top), and Deptor (bottom) loci in the Myc;TREshKdm6a liver tumour-derived cell line. TSS, transcriptional start site; UTR, ultranslated region.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    全基因组分析的组蛋白修饰和Kdm6a。(A)结合位点下基于乳沟Kdm6a全基因组的目标和发布使用核酸酶(急忙逃走)分析。(B)概要文件块Kdm6a, H3K4me3和H3K27me3 Kdm6a结合位点的距离;n = 1。(C)全球Kdm6a热图和组蛋白修饰(H3K4me3、H3K4me1 H3K27ac, H3K27me3)从急忙逃走Myc信号;TREshKdm6a细胞系存在(off-Dox)或没有(on-Dox) Kdm6a按Kdm6a信号;n = 1。(D) Kdm6a、H3K27ac H3K4me3, H3K4me1 H3K27me3入住率Kdm6a(上)Deptor(底部)Myc基因座;TREshKdm6a肝脏肿瘤提取细胞系。TSS、转录起始点;UTR, ultranslated地区。

    Deptor是强有力的负面mTORC1信号调节器尺码和我们确认强Kdm6a绑定以及明显的蛋白表达的变化Deptor Kdm6a恢复,我们下一个旨在剖析Deptor在中介表型的作用对Kdm6a恢复的影响。为此我们删除DeptorMyc; TREshKdm6a细胞使用CRISPR / Cas9 Kdm6a恢复后和监控这些细胞。与以前的结果一致,表达的内源性Kdm6a Myc; TREshKdm6a窝藏控制sgRNA诱导细胞凋亡,而这种凋亡反应显著降低Myc; TREshKdm6a细胞与删除Deptor(图5一个)。此外,我们还设计了一个体内实验进一步验证这种因果关系。使用水动力传递,我们给老鼠注射了一个转座子向量表达原癌基因结合CRISPR / Cas9结构目标Kdm6a和另外的转座子向量表达Deptor互补脱氧核糖核酸或控制向量。值得注意的是,我们观察到一个重要的生存受益(图5 b),并显著减少小鼠的肿瘤结节与Deptor co-expression与控制(图5 c)。此外,澄清的作用mTORC1 Kdm6a-dependent肿瘤抑制信号,我们使用水动力的一个转座子向量表达原癌基因结合CRISPR / Cas9构造目标的两倍Kdm6a和Mtor或S6K1,两个关键的下游分子mTORC1信号,同时。而老鼠接受双CRISPR / Cas9构造Kdm6a和控制指南被迅速从疾病、小鼠双CRISPR / Cas9构造编码Kdm6a Mtor或S6K1 sgRNAs显示长期生存和大规模的减少肿瘤结节(图5 d)。因此,Deptor和mTORC1 Kdm6a-dependent肿瘤抑制信号是至关重要的因素。

    Kmd6a-deficient cells and tumours are dependent on mTORC1 signalling. (A) Caspase-3/7 assay in Myc;TREshKdm6a cells expressing either single guide RNAs targeting Deptor or empty vector as control 6 days after endogenous Kdm6a restoration. Error bars represent mean±SD; n=3. Two-way analysis of variance (ANOVA) test, *p value<0.05. (B) Survival curves of Myc;sgKdm6a mice with ectopic Deptor overexpression (black line, n=7) or without ectopic Deptor expression (red line, n=6); log-rank test, *p value=0.0231 (C) Left, quantification of number of tumour nodules of Myc;sgKdm6a mice with ectopic Deptor overexpression (n=7) or without ectopic Deptor expression (n=6). Unpaired t-test, **p value=0.043. Right, representative tumour nodules visualised by dissection microscope. (D) Survival curves of in Myc;sgKdm6a mice (red line, n=6) compared with combined S6K1 knockout (blue line, n=5) or Mtor knockout (black line, n=5); log-rank test, *p value=0.0246, **p value=0.0017. (E) Dose response curve of Torin-1 and (F) Dactolisib in Myc;TREshKdm6a, Myc;sgTp53 and Myc;sgAxin1 cells as analysed by CellTiter-Blue in the presence (red line) or absence (blue line) of Kdm6a. Error bars represent mean±SD. Dose response curves are representative results of n=3 independent experiments. Differences between logIC50 values were determined with unpaired t-test for Myc;TREshKdm6a cell lines and one-way ANOVA for Myc;sgTp53 and Myc;sgAxin1 cell lines, *p value<0.0001. (G) Survival curve of Myc;sgKdm6a mice treated with mTOR inhibitor (rapamycin, red line; n=5) or vehicle (saline, black line; n=3); log-rank test, *p value=0.0274 and Myc;sgTp53 mice with rapamycin (green dotted line, n=4) or vehicle (blue dotted line, n=5); log-rank test, p value=0.8777.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    依赖于mTORC1信号Kmd6a-deficient细胞和肿瘤。(A)在Myc Caspase-3/7试验;TREshKdm6a细胞表达一种指导rna的目标Deptor或空向量控制内生Kdm6a修复后6天。误差棒表示平均数±标准差;n = 3。双向方差分析(方差分析)测试,* p值< 0.05。(B) Myc的生存曲线;sgKdm6a小鼠异位Deptor过度(黑线,n = 7)或不异位Deptor表达式(红线,n = 6);生存率较,* p值= 0.0231 (C),量化Myc的肿瘤结节数;sgKdm6a小鼠异位Deptor过度(n = 7)或不异位Deptor表达式(n = 6)。未配对t检验,* * p值= 0.043。通过解剖显微镜下呈现,代表肿瘤结节。(D)在Myc的生存曲线;sgKdm6a老鼠(红线,n = 6)而结合S6K1击倒(蓝线,n = 5)或Mtor击倒(黑线,n = 5);生存率较,* * * p值= 0.0246,p值= 0.0017。(E) Torin-1和剂量反应曲线(F) Dactolisib Myc; TREshKdm6a, Myc; sgTp53 Myc; sgAxin1 CellTiter-Blue细胞分析的存在(红色线)或Kdm6a缺席(蓝线)。误差棒表示平均数±标准差。剂量反应曲线代表n = 3独立实验的结果。logIC50差异值与未配对t检验测定Myc; TREshKdm6a细胞系Myc和单向方差分析;sgTp53 Myc; sgAxin1细胞系,* p值< 0.0001。(G) Myc的存活曲线;sgKdm6a小鼠接受mTOR抑制剂(雷帕霉素,红线;n = 5)或车辆(生理盐水,黑线;n = 3);生存率较,* p值= 0.0274和Myc; sgTp53老鼠雷帕霉素(绿色虚线,n = 4)或车辆(蓝色虚线,n = 5); log-rank test, p value=0.8777.

    mTORC1信号通路的异常表达在许多不同的癌症类型,因此有效的抑制剂的开发途径。作为我们的研究结果显示,Kdm6a-deficient肿瘤表现出高mTORC1活动,我们下一个测试他们是否对药理mTORC1抑制尤其敏感。Torin-1的确,我们观察到一个强大的敏感性,一个强有力的mTORC1抑制剂,Myc; sgKdm6a细胞系相比,Myc; sgTp53细胞(在线补充图7),而我们不能观察Dactolisib的不同反应,药物抑制PI3K (在线补充图7 b)。重要的是,我们观察到在一个同基因的设置,Myc;没有Kdm6a表达式以及Myc TREshKdm6a细胞;细胞sgTp53 Myc; sgAxin1 CRISPR / Cas9介导细胞Kdm6a击倒(sgKdm6a)展出Torin-1敏感性显著增加(图5 e),而我们不能透露Dactolisib的治疗反应差的Kdm6a状态(图5 f)。灵感来自体外观察,我们生成鼠标军团窝藏原地Myc; sgTp53或Myc; sgKdm6a肝脏肿瘤通过水动力传递和它们与雷帕霉素治疗。我们的体外实验中观察到,只有老鼠Myc; sgKdm6a肿瘤对雷帕霉素治疗,导致重大的长期生存(图5克)。因此,对mTORC1抑制剂Kdm6a-deficiency预测治疗反应。

    解决这个问题如果观察Kdm6a只适用于肝脏肿瘤的影响,只有有效的致癌原癌基因的上下文中,我们另外创建了一个Kdm6a-deficient胰腺癌的小鼠模型。利用之前建立的胰腺癌模型依赖于multiallelic胚胎干细胞,港口pancreas-specific Cre司机(p-48 Cre),有条件的Kras基因突变等位基因(LSL-KrasG12D),有条件的反向四环素反式激活因子等位基因(Caggs-LSL-rtTA3-IRES-Kate)以及一个自导盒式ColA1轨迹,我们插入TRE-promoter驱动和GFP-labelled shrna瞄准Kdm6a(shKdm6a)或Renilla荧光素酶(shRenilla)使用重组酶介导的磁带交换和生成的嵌合小鼠进行进一步实验使用(图6)。而pancreata老鼠尽管GFP表达shRenilla没有表现出宏观异常,因此shRNA表达式,pancreata shKdm6a表达小鼠显示囊性变化和宏观上扩大以及肿瘤结节(图6 b)。因此,我们观察到显著缩短小鼠的生存pancreas-specific Kdm6a抑制(图6 c)。组织学检查我们观察到诚意侵入性胰腺导管腺癌与罕见的转移扩散到肝脏shKdm6a表达小鼠,而只有胰腺上皮内瘤(PanIN)不同程度和shRenilla小鼠中发现没有侵入性肿瘤(图6 d)。如预期肿瘤显示GFP表达(指示成分表达式)和Kdm6a表达没有shKdm6a肿瘤样本(图6 d)。此外,我们生成的主要执行的这些肿瘤细胞系类似Kdm6a表达,实验前进行肝细胞系。惊人,观察肝细胞内源性Kdm6a表达,引发的表达Deptor和Tsc2因此减少的磷酸化mTORC1下游目标(图6 e, F)。此外,我们也观察到类似的转向药理mTORC1抑制剂敏感性依赖Kdm6a表达状态(图6克)。此外,我们研究了KDM6A表达状态的一个独特的病人队列由高档PanIN匹配和胰腺导管腺癌(PDAC)相同的病人(在线补充表4)。有趣的是,我们观察到的大部分高档PanINs显示仍然保留KDM6A表达式,表达式中减少PDAC进展(图6 h),暗示积极选择低KDM6A在致癌作用。因此,Kdm6a是一种有效的肿瘤抑制胰腺癌和Kdm6a-deficient胰腺腺癌显示活跃mTORC1信号类似于肝脏肿瘤。

    Loss of Kdm6a in combination with oncogenic KrasG12D leads to pancreatic ductal adenocarcinomas. (A) Schematic display of embyonic stem cell (ESC)-based PDAC mouse model generation. (B) Tumour nodules with cyst or normal pancreas observed in KrasG12D;shKdm6a and KrasG12D;shRenilla mice expressing short hairpin RNA (shRNA)-linked green fluorescent protein (GFP) and rtTA3-linked red fluorescent protein (RFP). (C) Survival of KrasG12D;shKdm6a mice (blue and red lines; n=15 for each shRNA) and KrasG12D;shRenilla (black line; n=13) mice as control; log-rank test, **p value=0.0024, ****p value<0.0001. (D) Immunohistochemical staining of HE, GFP and Kdm6a, in KrasG12D;shKdm6a and KrasG12D;shRenilla mice. Scale bar, 50 µm. (E) Quantitative PCR for Kdm6a and Deptor expression in KrasG12D;shKdm6a cell lines in the presence or absence of Dox. Representative results of n=3 independent experiments. Paired t-test, *p value<0.0482. (F) Immunoblot analyses of mTORC1 signalling in KrasG12D;shKdm6a cell line in the presence (off-Dox) or absence (on-Dox) of Kdm6a. Representative result of n=3. (G) Dose response curve of Torin-1 in KrasG12D;shKdm6a cell in the presence (red line; off-Dox) or absence (blue line; on-Dox) of Kdm6a. Error bars represent mean±SD; n=3. Differences between logIC50 values were determined with unpaired t-test, p value>0.0001. (H) Visual representation of changes in KDM6a expression over time in progression from high-grade PanINs to PDAC in clinical cohort of 90 patients. KDM6A expression was scored on the scale from 0 to 3. Size of nodes represents number of patients and size of arrows corresponds to proportional changes in KDM6a levels over time. BF, bright field.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    失去Kdm6a结合致癌KrasG12D导致胰腺导管腺癌。(一)示意图显示embyonic干细胞(ESC)的PDAC鼠标模型生成。(B)肿瘤结节和囊肿或正常胰腺中观察到KrasG12D; shKdm6a KrasG12D; shRenilla老鼠表达短发卡RNA(成分)与绿色荧光蛋白(GFP)和rtTA3-linked红色荧光蛋白(RFP)。(C)的生存KrasG12D; shKdm6a老鼠(蓝色和红色线;每个成分n = 15)和KrasG12D; shRenilla(黑线;n = 13)小鼠作为控制;生存率较,* * p值= 0.0024,* * * * p值< 0.0001。他(D)免疫组织化学染色,GFP和Kdm6a KrasG12D; shKdm6a KrasG12D; shRenilla老鼠。酒吧,规模50µm。(E)定量PCR Kdm6a KrasG12D和Deptor表达;shKdm6a细胞系在阿霉素的存在与否。 Representative results of n=3 independent experiments. Paired t-test, *p value<0.0482. (F) Immunoblot analyses of mTORC1 signalling in KrasG12D;shKdm6a cell line in the presence (off-Dox) or absence (on-Dox) of Kdm6a. Representative result of n=3. (G) Dose response curve of Torin-1 in KrasG12D;shKdm6a cell in the presence (red line; off-Dox) or absence (blue line; on-Dox) of Kdm6a. Error bars represent mean±SD; n=3. Differences between logIC50 values were determined with unpaired t-test, p value>0.0001. (H) Visual representation of changes in KDM6a expression over time in progression from high-grade PanINs to PDAC in clinical cohort of 90 patients. KDM6A expression was scored on the scale from 0 to 3. Size of nodes represents number of patients and size of arrows corresponds to proportional changes in KDM6a levels over time. BF, bright field.

    最后,我们的发现转化为人类的环境中,我们第一次的信使rna表达水平相关KDM6A和DEPTOR76年一群人类肝细胞癌和相应的正常肝样品,发现只有在肝癌样本KDM6A和DEPTOR记录显示有很强的正相关关系(R = 0.4236, p = 0.0022 vs R = 0.04983, p = 0.7311) (图7 a, B)。此外,我们使用公开可用的转录组数据(GEPIA门户),TCGA肝癌数据集和证实之间有很强的正相关关系KDM6A和DEPTOR(R = 0.32, p = 3.9 e-10年)(在线补充图8)。这种相关性不仅局限于肝癌,作为pan-cancer使用数据集(GEPIA门户)KDM6A和DEPTORmRNA表达两记录还显示显著正相关(R = 0.25, p = 9.1 e-141年)(在线补充图8 b)。此外,我们还确定免疫组织化学蛋白表达76年人类肝癌KDM6A DEPTOR pS6RP。通过分类肿瘤在低和高单个蛋白质的表达水平,我们发现显著相关的低KDM6A表达式DEPTOR表达较低,反之亦然(图7 c)。此外,较低的肿瘤KDM6A水平通常与高pS6RP水平相关联。另外,我们也做了相同的分析为一群患者胆管癌(n = 80),第二个最常见的肝癌,作为肝癌的观察也发现了相似的结果,KDM6A蛋白质含量低是伴随着低DEPTOR和高pS6RP水平(图7 d-f)。总的来说,这些数据表明,KDM6A表达式与DEPTOR表达式在人类肿瘤,并伴随着mTORC1激活。

    KDM6A expression correlates with DEPTOR expression and activation of mTORC1 in human HCC and cholangiocarcinoma (CCA). Correlation between KDM6A and DEPTOR expression in (A) HCC and (B) in normal surrounding tissue of clinical cohort consisting of 76 human HCCs. (C) Immunohistochemical staining of HE, KDM6A, DEPTOR and pS6RP in two representative patients with HCC. Scale bar represent 100 µm. The significance of the correlation between KDM6A/DEPTOR and KDM6A/pS6RP are shown in the table below using Fisher’s exact test. Correlation between KDM6A and DEPTOR expression in (D) CCA and (E) in normal surrounding tissue of clinical cohort consisting of 80 human CCAs. (F) Immunohistochemical staining of HE, KDM6A, DEPTOR and pS6RP in two representative patients with CCA. Scale bar represent 100 µm. The significance of the correlation between KDM6A/DEPTOR and KDM6A/pS6RP are shown in the table below using Fisher’s exact test. HCC, hepatocellular carcinoma; mRNA, messenger RNA.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    KDM6A表达式与DEPTOR mTORC1的表达和激活人类肝细胞癌和胆管癌(CCA)。KDM6A和DEPTOR表达之间的相关性(A)肝癌和(B)在正常周围组织的76个人类肝癌的临床队列组成。(C)免疫组织化学染色的,他KDM6A DEPTOR pS6RP在两个代表肝细胞癌患者。比例尺µm代表100人。之间的关系的重要性KDM6A / DEPTOR和KDM6A / pS6RP下表所示使用确切概率法。KDM6A和DEPTOR表达之间的相关性在CCA (D)和(E)在正常周围组织的临床队列80人组成的CCA。他(F)免疫组织化学染色,KDM6A, DEPTOR pS6RP CCA患者在两个代表。比例尺µm代表100人。之间的关系的重要性KDM6A / DEPTOR和KDM6A / pS6RP下表所示使用确切概率法。肝癌,肝细胞癌; mRNA, messenger RNA.

    讨论

    新兴技术的进步审问癌症基因组已经指出我们染色质修饰符作为tumourigenesis的重要组成部分。35 36不过,似乎掩盖这些基因在功能上是如何参与这个过程。结合强大的遗传学、基因组学和动物造型工具以及人类患者数据,我们惊讶的发现组蛋白H3K27-demethylase KDM6A作为mTORC1表观遗传开关通过转录激活的负面信号通路的监管机构固体癌症。因此,我们的研究结果链接知之甚少后生肿瘤抑制基因与人类癌症的主要信号中心。

    人类肿瘤的使用公开可用的测序数据,我们发现,特别是催化地活性成分MLL3 / MLL4 COMPASS-like复杂MLL3,MLL4和KDM6A显示高变更频率,可能导致蛋白表达减少。值得注意的是,这些分析表明,固体癌症患病率最高的这些变化,而以往的研究,功能上分析这些蛋白质在tumourigenesis关注血液学的恶性肿瘤。19日23日37我们专注于KDM6A,因为它显示变更频率最高,和被筛选大量的人类肝癌KDM6A蛋白表达是迷失在大约30%的患者。如此高的发病率可能是由于基因的位置KDM6Ax染色体上,在那里,一个等位基因丧失男性表达可能导致完全丧失。实际上,这种现象以前观察到在白血病,KDM6A作为性别肿瘤抑制基因。37

    审问KDM6A肝癌我们应用的功能强大的小鼠模型,发现KDM6A损失结合原癌基因迅速导致肝脏肿瘤,并进一步通过建立KDM6A我们表明内源激活系统持续亏损KDM6A对肝脏肿瘤的维护很重要,从而清晰地凸显KDM6A的重要性作为一个肿瘤抑制基因在肝癌。我们确定了细胞凋亡的主要肿瘤抑制的能力由Kdm6a和高架mTORC1活动Kdm6a损失。人们普遍认为异常的原癌基因表达导致凋亡反应38-41健康组织防止转换,添加一个额外的基因改变块的凋亡反应控制快速致癌转换。40 42 43有趣的是,mTROC1激活和原癌基因的协同效应是先前描述的肝脏肿瘤和淋巴瘤。44 45因此,它似乎是合理的,Kdm6a-dependent mTORC1放松管制是我们系统转换的主要驱动力。

    转录和表观遗传分析确定DeptorKdm6a作为目标基因,这是受Kdm6a epigenetically改建培养其转录激活。DEPTOR最初确定为一个关键mTOR的负面调节器32并表明减少DEPTOR mTOR表达促进细胞生长和生存。有趣的是,我们发现在遗传上位Kdm6a-dependent肿瘤抑制在很大程度上依赖Deptor实验,表明Deptor是主要Kdm6a目标协调其肿瘤抑制的能力。虽然几个基因改变导致异常mTORC1信号和癌症进展特征明显,46-48这是我们第一个研究,揭示知识一个后生组件,切换信号活动的途径。

    最后,我们能够将我们的发现癌症患者。我们发现KDM6A积极表达与肝癌样本DEPTOR表达式。引人注目的是,通过扩大我们的小鼠研究胰腺癌我们还发现Kdm6a之间的协会,Deptor mTORC1信号,表明这些观察肝癌之外都是有效的。事实上,通过挖掘人类的病人数据,我们发现KDM6A之间的正相关和DEPTOR也在其他固体癌症类型。尽管KDM6A无疑控制mTORC1之外的其他癌症相关基因和通路,我们的数据显示,KDM6A-deficient mTORC1抑制肿瘤是敏感,表明KDM6A可以作为生物标志物疗法关注mTORC1。这将是重要的决定在未来的实验中,如果这个KDM6A和mTORC1之间的关系仅仅是限制肿瘤细胞或在正常生理也很重要。有趣的是,最近表明,二甲双胍可以直接绑定到KDM6A和诱人的猜测这可能影响mTORC1信号,因此解释一些机械的作用方式的二甲双胍治疗。49一个途径解决KDM6A在正常生理功能可以从歌舞伎综合症,患者有生殖系KDM6A删除。50

    总的来说,我们的结果显示一个未预料到的表观遗传机制连接特征明显的不良变异染色质修饰符信号通路网络与癌症的一个主要角色。

    材料和方法

    分子克隆

    CRISPR / Cas9-mediated基因组编辑,sgRNAs subcloned pX330或pLentiCRISPR v2根据冯张协议。51简而言之,BbsI-digested pX330或pLentiCRISPR v2结扎退火和磷酸化sgRNA。所有结构受到Sanger测序与人类U6底漆之前研究中使用。

    shRNA克隆,有效成分被Pelossof预测使用的算法等52和克隆到MLPe向量(MSCV-LTR-miR-E-PGK-Puro-IRES-GFP)作为描述。53发簪被命令为97 - mer寡核苷酸,PCR扩增miRE-XhoI和miRE-EcoRI底漆。PCR产物被消化和EcoRI-HF XhoI前和纯化的结扎EcoRI-HF / XhoI-digested MLPe骨干。评估的可拆卸的效率shrna、目标细胞转导与感染复数(MOI) < 0.7实现单拷贝整合。嘌呤霉素选择细胞收获后进行免疫印迹。可拆卸的效率与细胞转导Renilla荧光素酶相比,一个新控件。两种最有效的成分KDM6A选择和进一步克隆为pT3-TRE-tRFP-miR-E pCol-TGM。两个质粒也消化EcoRI-HF和XhoI和结扎EcoRI-HF / XhoI-digested PCR扩增子(发夹)。所有质粒测序miR-E底漆,然后再研究中使用。寡核苷酸序列sgRNA、成分和引物中列出在线补充表5。

    对超表达质粒,pT3-EF1a-MYC-IRES-Deptor是由PCR扩增的Deptor Addgene 21 334年克隆质粒pT3-EF1a-MYC-IRES-rtTA3,是消化与摩根士丹利资本国际(MscI)和XmaI NEBuilder HiFi DNA组装(内)根据制造商的协议。

    动物实验

    个体动物实验的团体大小是决定我们的经验的基础上,与之前类似的实验。水动力尾静脉注射,8周大女C57Bl / 6动物被从Envigo购买。5µg pT3-EF1a-MYC的DNA, 20µg pX330表达表示sgRNAs CMV-SB13一起转座酶(1:5比例);20µg pT3-TRE-tRFP-shRNA 5µg pT3-myc-IRES-rtTA3和CMV-SB13;5µg pT3-EF1a-MYC-IRES-Deptor, 20µg pX330 sgRNA和CMV-SB13准备在无菌0.9%氯化钠(氯化钠)解决方案和侧尾静脉注射相应总量10%的体重在5 - 7年代之前所描述的。

    所有的动物每天监测和动物实验进行符合所有相关的伦理规范确定在动物许可证。关于安乐死,有关机关从实验小鼠视觉检查,收获和拍照。肿瘤样本被送往获得基因组DNA, RNA,蛋白质和其他孵化在4%多聚甲醛为进一步使用至少24小时。所有的动物实验是卡尔斯鲁厄董事会批准的区域,德国。

    ESC-based胰腺癌

    胚胎干细胞(ESCs)窝藏像之前描述的那样疾病诱发的等位基因是用来介绍条件KDM6A可拆卸的通过生成pCol-TGM包含成分的质粒。两个成分对KDM6A和一个控制成分对Renilla荧光素酶被克隆到pCol-TGM质粒和electroporated一起到ESCs pCAGs-FLPe调解recombinase-mediated磁带交换。ESCs电穿孔后选择潮霉素抗性,只有ESCs成功整合的目标构造ColA1a轨迹带来潮霉素抗性。选择之后,耐药克隆选择和扩展。目标被用于克隆囊胚注射(合作DKFZ转基因核心设施)来生成群嵌合体小鼠,直接用于进一步的实验。老鼠收到Dox-containing饮食4周时,因此为了激活成分表达式KDM6A可拆卸的。疾病发作每周进行触诊。

    核磁共振成像

    核磁共振成像是由我们的小动物成像的核心设施使用力量DKFZ BioSpec 1特斯拉(Ettlingen,德国)。成像,老鼠犀牛3%七氟醚在空气中。t2加权成像进行使用T2_RARE_序列轴:TE = 84毫秒,TR = 4806.1582毫秒,FOV 30×30毫米,切片厚度1毫米,平均= 4,扫描时间461.39秒,回波间隔8女士,罕见的因素10,20片,图像大小192×192,翻转角度180。如果在T2可以观察到肝脏病变,超声造影T1测量(80µl ProHance,更易与0.5公斤,Bracco,腹腔内注射)进行想象和量化肿瘤生长。肝脏肿瘤不幸没有积累的对比试剂,因此体积大小的决心与T1是不可能的。大小确定当时使用t2加权MRI图像进行。感兴趣的区域(ROI)被吸引在每一层中手动及病变的总量从个人计算ROI ParaVision软件(力量)。评估是由同一个人在整个研究。

    免疫组织化学

    样本在4%多聚甲醛固定至少72小时,嵌入在石蜡和切成2µm厚部分免疫组织化学染色(包含IHC)。

    Kdm6a和GFP小鼠组织染色,幻灯片和二甲苯deparaffinised,患者通过降序酒精系列和洗水。抗原检索,幻灯片是柠檬酸钠缓冲(pH值6.0)和高压锅煮8分钟紧随其后的是冷却在自来水下5分钟。随后幻灯片被封锁3%过氧化氢为内源性过氧化物酶活动,自来水下冲洗1分钟和两次磷酸盐(PBS)和屏蔽5%牛血清albumine (BSA)在PBS 0.05% Triton x - 100在室温1小时。幻灯片是孵化与兔单克隆anti-KDM6A一夜之间在4°C。然后洗了三次幻灯片和PBS + 0.05% Triton x - 100,孵化与ImmPRESS山羊抗兔或鼠标免疫球蛋白聚合物装备,过氧化物酶试剂(向量实验室# mp - 7451) 30分钟在室温和水洗进一步PBS + 0.05% Triton x - 100的两倍。染色是观想使用ImmPACT轻拍过氧化物酶底物工具包(向量实验室# sk - 4105)根据制造商的协议和与苏木精复染色。最后,幻灯片通过提升酒精清洗系列以二甲苯和安装Surgipath Micromount安装介质(徕卡# 3801731)。

    c-casp3和两个pS6RP染色在小鼠组织的BOND-MAX(徕卡生物系统)是用来进行自动包含IHC染色的幻灯片。抗原与BondTM检索进行了柠檬酸溶液(AR9961,徕卡)或BondTM EDTA溶液(AR9640,徕卡)。此后部分是特定抗原抗体孵育BondTM主要抗体稀释剂(AR9352,徕卡生物系统)。主要抗体接触是紧随其后的是二次抗体(徕卡生物系统)和染色使用债券聚合物改进检测设备(DS9800,徕卡生物系统)。染色的量化,幻灯片使用SCN400幻灯片扫描仪进行扫描(徕卡生物系统)20×放大。

    一夜之间,对人体组织、肝脏标本被固定在4%多聚甲醛和嵌入在石蜡。部分都是在5µm厚度。免疫组织化学染色,幻灯片在二甲苯deparaffinised,患者通过分级酒精在PBS系列和冲洗。抗原检索进行10毫米柠檬酸钠缓冲(pH值6.0)放置在微波炉高10分钟,后跟一个20分钟在室温下冷却。后阻塞与5%的山羊血清和Avidin-Biotin阻塞工具包(向量实验室,伯林盖姆,加州,美国),幻灯片主要抗体孵育过夜在4°C。幻灯片接受了3%的过氧化氢淬火内源性过氧化物酶活性和10分钟,随后,生物素共轭二次抗体应用在1:50 0稀释在室温下30分钟。免疫反应性的视觉效果与Vectastain精英ABC工具包(向量实验室)和矢量束射功率管(向量实验室)作为发色体。幻灯片和苏木精复染色。幻灯片进行评估方法通过比较每个肿瘤周边non-neoplastic,因此定义“高”和“低”的水平给定蛋白在肝癌样本与相应的non-tumourous同行相比。

    推导原发性肝脏肿瘤细胞系

    肝脏肿瘤切除了无菌器械和洗前无菌PBS消化。肿瘤组织碎和resuspended 4毫克/毫升胶原酶静脉和dispase (w / v在无菌,自由杜尔贝科的修改鹰血清培养基(DMEMσ))在37°C与温柔摇30分钟。分离肿瘤细胞被洗完全DMEM(补充了10% (v / v)青霉素和链霉素胎牛血清和1%)和镀collagen-coated板块(PurCol,电池系统;0.05毫克/毫升)。主要文化通道,直到明显脱离其他污染细胞类型。

    推导原发性胰腺肿瘤细胞系

    胰腺肿瘤与无菌切割工具,在无菌水洗汉克斯平衡盐溶液(hbs),剁碎刀片,直到块约1 - 2毫米。肿瘤组织在1毫克/毫升resuspended胶原酶V(σ)(w / V在无菌,无血清Ca哈佛商学院2 +/毫克2 +在37°C)和孵化与温柔摇30分钟。PBS的分离肿瘤细胞被洗,在0.25%胰蛋白酶和孵化resuspended 37°C 5分钟打破一些细胞外基质。胰蛋白酶是然后用完整的DMEM中和。在镀collagen-coated盘子之前,细胞进一步洗两次完整的媒介。主要文化通道,直到GFP阳性细胞> 90%。

    细胞培养

    细胞系都保持在完整的DMEM 37°C和5%的二氧化碳。肝脏和胰腺癌细胞分裂两次每周1:30-40和1:5的比例相应使用collagen-coated盘子。Myc; shKdm6a KrasG12D; shKdm6a细胞在完整的DMEM培养,与阿霉素(VWR;1µg /毫升)时适用。

    病毒生产

    慢病毒生产,HEK293T细胞被镀前1天转染成10厘米盘子和使用质粒转染几乎完全融合时达到2.5µg pMD的混合。2G,8 µg psPAX2 (Addgene plasmid #12 259 and # 12260, both were a gift from Didier Trono) and 10 µg pLenti CRISPR v2 harbouring respective guides in 1000 µl serum-free DMEM and 60 µl polyethylenimine (PEI, 1 µg/µl). The plasmid mix was then vortexed for 5 s, incubated at room temperature for 30 min incubation and added drop-wise to cells. Twenty-four hours following the transfection, medium was exchanged and lentiviral supernatant was harvested 48 hours post-transfection using 0.45 µm Cellulose Acetate Membrane filters (VWR) and stored at −80°C until use.

    逆转录病毒生产,HEK-gp-cells也播种是慢病毒生产和使用质粒转染2.5µg pMD的混合。2 g和20µg逆转录病毒质粒如MLPe向量,pSIN或1000年pMSCV-rtTA3-PGK-Puroµl血清DMEM和60µl裴(1µg /µl)。慢病毒的病毒收获。

    转导

    靶细胞在10厘米板镀和电镀后1天,细胞与病毒转导上层清液的聚凝胺(4µg /毫升)。两天post-transduction细胞选择与嘌呤霉素(2µg /毫升),杀稻瘟菌素(10µg /毫升)或G418(新霉素;1毫克/毫升)依赖于质粒。

    免疫印迹

    细胞收获和细胞溶解细胞裂解缓冲(细胞信号技术)补充与蛋白酶(完整的迷你;罗氏公司)和磷酸酶抑制剂。为了确保溶解,细胞被用在冰和随后离心5分钟在4°C 13 000 rpm收集蛋白质溶解产物。此外,蛋白质溶解产物是用BCA扳平比分的蛋白质测定(热科学),等量的蛋白质混合了Laemmli缓冲区(100 mM Tris-HCl pH值6.8、5%甘油、2%十二烷基硫酸钠(SDS), 5% 2-mercaptoethanol)在95°C,煮5分钟。蛋白质sds - page分离,转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,并使用适当的抗体检测到免疫印迹。图像检测与AlphaView软件执行(ProteinSimple)使用明确西方ECL衬底(Bio-Rad)的解决方案。抗体及其来源的列表中可以找到在线补充表6。

    突变的检测T7化验

    CRISPR / Cas9-mediated突变被发现使用T7核酸内切酶(新英格兰生物学实验室)。简而言之,基因组dna分离使用Gentra Puregene组织工具包(试剂盒)按照制造商的协议。大约700英国石油公司周边地区CRISPR / Cas9-targeted网站放大使用Q5热态启动DNA聚合酶(新英格兰生物学实验室),column-purified(试剂盒)和受到一系列的融化与退火温度和退火周期在每个连续的周期逐渐降低。T7核酸内切酶那时我添加到选择性消化heteroduplex DNA。消化2% - -3%琼脂糖凝胶产品视觉效果。

    另外,桑格核苷酸序列分析进行PCR产品使用T7引物检测突变。

    单独分析

    评估细胞生存和增殖,500个细胞在6-well盘子镀一式三份。四环素inducible-shKdm6a或Kdm6a-cDNA表达细胞生长在强力霉素的存在与否,和细胞被固定用甲醇和0.05%结晶紫染色后10天。

    量化,根据confluency的盘子,两种方法。,结晶紫的数量被细胞溶解在溶液化缓冲(50%甲醇、5%醋酸和0.1% SDS)和量化通过阅读吸收分光光度计在570 nm或ImageJ插件。54

    竞争分析

    评估的影响Kdm6a超表达在细胞增殖/可行性,Myc; sgKdm6a细胞表达rtTA3 (GFP -)混合与GFP-positive Kdm6a overexpressing或控制细胞30:70比率。GFP+/ GFP−比率进行评估与番石榴easyCyte台式流式细胞分析仪(默克密理博)随着时间的推移,在阿霉素的存在与否。

    细胞凋亡检测

    细胞凋亡在肝癌细胞株评估通过CellEvent Caspase-3/7绿色检测试剂(英杰公司)根据制造商的协议。简而言之,000细胞生长有或没有强力霉素6-well板6天,trypsinised和resuspended DMEM完成。大约有100 000个细胞被孵化2µM最终浓度CellEvent Caspase-3/7绿色检测试剂为45分钟37°C和随后与番石榴流式细胞分析仪分析。

    药物治疗和细胞生存能力分析

    评估细胞的敏感性对Torin-1(开曼化学),细胞被镀在96孔板前1天的治疗和细胞的异常与CellTiter-Blue评估(Promega) 72小时后药物治疗。试剂添加到每个1:10稀释的96孔板,孵化4小时37°C和荧光信号被记录(560前女友/ 590新兴市场)使用FLUOstarω(BMG Labtech)。

    定量逆转录聚合酶链反应

    总RNA分离使用RNeasy迷你包(试剂盒)和RNase-Free DNase组(试剂盒)按照制造商的协议。纯化RNA 1µg反向转录使用TaqMan逆转录试剂(热费希尔科学)和稀释受到qPCR前1:20。qPCR反应,混合互补脱氧核糖核酸是混合电力SYBR绿色大师(热费希尔科学)和有针对性的引物和一式三份。转录水平正常的水平微管蛋白信使rna表达和计算使用deltaCt(ΔCt)方法。qPCR使用QuantStudio 3进行实时PCR系统(应用生物系统公司)。

    人类患者量化,基因表达分析人类属下/ KDM6A # Hs00253500_m1 (ID), Deptor (Hs00961900_m1)和β-Actin (ID # 4333762 t)基因从应用生物系统公司购买(美国加州福斯特城)。每个基因的定量值计算通过使用PE生物系统分析软件(NT),表示为目标。元= 2−ΔCt,ΔCt计算每个样本的值减去目标基因的平均Ct值的平均Ct值β-Actin基因。

    RNA序列和微分表达式分析

    RNA序列,三个独立的肿瘤提取的总RNA细胞系(Myc; sgMll3 Myc; sgTp53)孤立使用RNeasy迷你包(试剂盒)QIAshredder列和RNase-Free DNase组(试剂盒)。RNA-seq图书馆建设和测序进行根据协议整合基因组学操作所使用的核心在纪念斯隆凯特林癌症中心(MSKCC)。从每个复制样品5 - 10百万读取。与Trimmomatic移除适配器序列后,55RNA-seq读取被对齐GRCh37.75 (hg19)和明星。56全基因组转录计数是由工具high-thoughput测序数据的分析(HTSeq)来生成一个碎片每百万映射每千碱基读取(FPKM)矩阵。57差异表达基因被DESeq2 (V.1.8.2、包R)和在火山策划阴谋。完整的基因表达数据集可以在NCBI综合GSE155630。

    急忙逃走

    急忙逃走被短剑的一种表现(如前所述)等。58短暂250 000 Myc; TREshKdm6a细胞生长在阿霉素的存在与否是收获和蹩脚激活伴刀豆球蛋白涂层珠子在室温下10分钟,permeabilised与0.025%洋地黄皂苷和孵化与抗体与旋转一夜之间在4°C。本研究中使用的所有的抗体稀释1:10 0急忙逃走实验和中列出在线补充表3。孵化后,细胞被孵化的pA-MNase 700 ng / mL的最终浓度为1小时4°C,清洗和消化在Ca2 +除了在0°C为30分钟。释放dna蛋白质复杂,细胞进一步孵化10分钟37°C和上层的收集。上层清液被提取的DNA片段使用自旋列(试剂盒)和库使用NEBNext超二世DNA库工具准备Illumina公司(新英格兰生物学实验室)后,制造商的协议。图书馆使用HiSeq2500测序(Illumina公司)在25个基点paired-end快速模式(图书馆flowcell浓度:12点,1% PhiX激增)和HiSeq快速SBS工具包v2(50周期;fc - 402 - 402)是用于HiSeq PE 25 R测序类型。完整的数据集可以在欧洲核苷酸存档PRJEB39876加入ID。

    急忙逃走的处理和分析

    适配器和质量调整原料使用大量的削减V.0.4.4测序读了59结合Cutadapt V.1.1460和非默认参数”——length_1 35”,和“——length_2 35”,“——配对”,“——illumina公司”。Bowtie2——非常敏感”的旗帜61年是部署到单独调整修剪读取财团老鼠基因组参考构建V.38和酿酒酵母R64参考基因组。去除PCR重复执行的皮卡德MarkDuplicates V.2.17.4。62年未成对排列以及映射与质量低于20 phr规模使用SAMtools视图V.1.5被过滤掉。63年过滤比对R64基因组数。最小酵母对齐计数观察到在所有特定抗体的图书馆目标确定。特有缩放因子计算除以最小酵母特有对齐计数的计数。跟踪报道被部署的bamCoverage功能生成deepTools V.3.1.164年使用非默认参数”——effectiveGenomeSize 2652783500”和”——ignoreForNormalization chrM chrY chrX”。此外,扩展因素包括通过“——scaleRatio”选项。峰打电话,MACS2 callpeak V.2.1.0.2014061664年使用一个错误发现率(罗斯福)截止0.05和参数——nomodel,“——格式BAMPE”,“——gsize 2652783500”,“——keep-dup”和”,广泛的组蛋白标记H3K4me1和H3K27me3国旗。数据处理程序实现为一个完全用集装箱运输管道使用通用工作流语言V.1.065年并公开。66年

    属下的山峰与最近的TSS有关使用老鼠基因模型从R / Bioconductor包TxDb.Mmusculus.UCSC.mm10注释信息。knownGene (V.3.10.0)和BSgenome.Mmusculus.UCSC。mm10 (V.1.4.0)。与功能基因模型使用包执行ChIPseeker (V.1.24.0)。67年覆盖在基因组特征总结使用bwtool套件68年R和形象地表现为阴谋和热图使用自定义代码。全球分析tss的组蛋白标记2 kb的阅读范围半径大约tss获得Gencode鼠标释放23总结使用Genomation包(V.1.12.0)。69年经验累积分布函数覆盖在tss被关闭(< 3 kb)或不接近Kdm6a峰值估计使用stats_ecdf ggplot2的功能和视觉效果。70年

    人类患者样本

    七十六肝癌和相应non-tumour周围肝组织被用于这项研究。肝组织收集格赖夫斯瓦尔德大学的(格赖夫斯瓦尔德、德国)和雷根斯堡(德国雷根斯堡)。

    胰腺癌接受手术的患者的样本收集美因茨大学医院(美因茨,德国)。研究样本包括84名患者从高档PanINs和PDAC样本可用。

    人类肝细胞癌组织微阵列

    肝癌组织微阵列用于这项研究包含720代表组织核心(直径:1毫米)分布在七个幻灯片。总共40组织学正常的肝脏,174肝硬化,14个发育不良的结节和476肝癌被发现(87×G1, 311×G2, 76×G3、G4 2×hcc)。个人评估免疫组织化学染色,KDM6A强度进行评估。染色强度得分从0到3;0 =无污点的,1 =弱,2 =适度和3 =强烈积极的。

    数据可用性声明

    数据在公共、开放访问存储库。合理的请求数据。纪念斯隆凯特林癌症中心,

    伦理语句

    病人同意出版

    伦理批准

    机构审查委员会批准了在当地医学伦理委员会格赖夫斯瓦尔德大学(批准代码:BB 67/10),雷根斯堡(批准代码17-1015-101),海德堡(S205-06),美因茨(2019 - 14390),符合《赫尔辛基宣言》。从所有个人书面知情同意了。

    确认

    我们感谢Tschaharganeh实验室的所有成员的建设性的和有用的评论这项工作。我们感谢DKFZ基因组学核心设施,DKFZ ODCF核心设施,比较病理学DKFZ中心动物实验室、中心和英国组织生物(海德堡大学医院病理研究所),优秀的技术支持。我们也承认丽莎·谢弗和优秀的技术支持露意丝Butthof。感谢Aurelio Teleman和威廉Palm批判性阅读和评论的手稿。我们也感谢史蒂文Henikof为我们提供急忙逃走试剂。

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    补充材料

    • 补充数据

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    脚注

    • 贡献者行为进行实验,分析数据和写的手稿。进行实验和分析数据。LW进行动物实验。AB为急忙逃走的分析提供了指导和协议。KB,点,PL和CP表观遗传分析数据。SH、镁、DFC,斯里兰卡,我,银行独立委员会,KB和PS提供人类患者样本。MH和SG进行组织处理,提供免疫组织化学染色及进行量化。SWL监督项目的早期阶段,提供初始资金。DFT进行实验,分析数据,设计了学习和写的手稿。所有的作者都在纸上阅读和评论。

    • 资金这项工作最初由NIH / NCI计划项目给予SWL (ca - 013106)。工作是由亥姆霍兹联合会(vh - ng - 1114),合作研究的项目B05格兰特SFB / TR 209“肝癌”——314905040德国研究基金会,克劳斯Tschira促进基金和伦理委员会授予“CrispSCNAs”开始(格兰特号码:948172)由欧洲研究委员会(DFT)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料此内容已由作者(年代)。尚未审查由BMJ出版集团有限公司(BMJ)和可能没有被同行评议。任何意见或建议讨论仅代表作者(年代)和不了BMJ的支持。和责任起源于BMJ概不负责任何依赖的内容。内容包括任何翻译材料,BMJ并不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南,术语,药物名称和药物剂量),和不负责任何错误或遗漏引起的翻译和改编或否则。