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肝脏病学
原始研究
MicroRNA-206促进CD8的募集+T细胞通过驱动库普弗细胞的M1极化
  1. 政法刘，
  2. 小梅王，
  3. 克利福德·约翰·斯蒂尔，
  4. Guisheng歌
  1. 医学系，明尼苏达大学双城分校，明尼阿波里斯市，明尼苏达州美国
  1. 对应到美国明尼苏达州明尼阿波利斯市特拉华街516号明尼苏达大学双城分校医学系宋桂生博士;gsong在}{umn.edu

摘要

客观的库普弗细胞(KCs)通过与其他免疫细胞交流来预防肝细胞癌(HCC)。然而，这一过程的潜在机制尚不完全清楚。

设计FVB/NJ小鼠水动力注射AKT/Ras和睡美人转座子诱导HCC。Mini-circle和睡美人在小鼠KCs中过表达microRNA-206。采用流式细胞术和免疫染色法评价免疫系统的变化。

结果水动力注射AKT/Ras可促进KCs的M2极化和细胞毒性T细胞(ctl)的耗竭，促进HCC的发展。KCs从m1到m2的转变破坏了microRNA-206的生物发生。通过瞄准Klf4(kruppel样因子4)，从而增强M1标记物的产生，包括C-C基元趋化因子配体2 (CCL2)， microRNA-206促进巨噬细胞的M1极化。事实上，microrna -206介导的CCL2的增加促进了CCR2在肝脏中的募集。破坏KLF4/CCL2/CCR2轴的每个组成部分会损害microRNA-206驱动巨噬细胞M1极化和招募ctl的能力。在AKT/Ras小鼠中，kc特异性表达的microRNA-206驱动KCs的M1极化和ctl的肝脏募集，完全预防HCC，而对照组小鼠100%死于HCC。破坏了microRNA-206和Klf4KCs和CD8的消耗+T细胞损害了miR-206预防HCC的能力。

结论KCs的M2极化是AKT/Ras小鼠HCC的主要因素。MicroRNA-206通过驱动KCs的M1极化，促进CD8的募集+T细胞和预防HCC，提示其作为免疫治疗方法的潜在应用。

  • 肝细胞癌
  • 枯氏细胞
  • 免疫疗法

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-324170

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    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • MiR-206在人肝细胞癌(HCC)中表达降低。

    • KLF4是NF-κB信号传导的抑制因子。

    有什么新发现?

    • AKT/Ras信号的激活使KCs的M1极化转变为M2极化，从而损害细胞毒性T细胞(ctl)在肝脏的富集。

    • AKT/Ras信号通路会损害库普弗细胞(KCs)中miR-206的生物发生，这是HCC中miR-206减少的主要原因。

    • 在AKT/Ras小鼠中，kc特异性表达miR-206完全阻止HCC，并导致晚期HCC肿瘤显著消退。

    • miR-206的kc特异性表达通过驱动KCs的M1极化来重建M1/M2 KCs的比例，从而触发肝脏中ctl的富集。

    • MiR-206通过调节KCs中的KLF4-NFκB信号传导促进CCL2的产生和释放。

    • 通过激活CCL2/CCR2轴，miR-206增强巨噬细胞与CD8的通讯+T细胞和CD8的迁移+T细胞。

    • 破坏miR-206和Klf4和CD8的消耗+T细胞损害miR-206预防HCC的能力。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 我们的数据表明miR-206是一种潜在的针对HCC的免疫治疗方法。

    介绍

    肝细胞癌(HCC)是世界上最常见和最致命的癌症之一。1尽管有了有效的抗病毒治疗方法，但HCC的发病率仍在继续增加，部分原因是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的流行。2肝细胞癌强烈的免疫介导发病机制使这种恶性肿瘤对免疫治疗特别有吸引力。具体来说，宿主对HCC免疫的各种因素都强烈倾向于免疫抑制，通过免疫编辑，伴随着肝纤维化的未解决的促炎刺激。3 4然而，HCC肿瘤微环境(TME)的复杂性强调了多种非冗余的癌症免疫抑制机制的存在，这些机制协同作用，定义了免疫治疗耐药性的重要屏障。因此，了解HCC中免疫抑制的潜在机制对于开发新的治疗药物而不产生不必要的免疫反应至关重要。

    库普弗细胞(KCs)约占肝细胞总数的15%。5个6长期以来，KCs被认为是主要的清除细胞，负责清除门静脉循环中的颗粒物质。5然而，一些研究报道了KCs在缺血再灌注损伤后和NAFLD背景下的病毒感染中的作用。5KCs表达组织相容性复合体(MHC) I类和II类，以及共刺激分子，能够启动抗原特异性免疫反应。7此外，KCs表现出不同于其他浸润性巨噬细胞的吞噬和细胞因子产生能力。8尽管KCs在HCC中的作用仍有争议，但有令人信服的证据表明，KCs是HCC的重要防线。9

    巨噬细胞可以被诱导成两种不同的极化表型:经典活化的M1和交替活化的M2。10在健康肝脏中，M1和M2 KCs之间存在平衡，它们的功能相反。在HCC中，KCs经历M1到M2的表型转变，通过抑制适应性免疫系统促进癌症生长。11M1 KCs通过消除作为适应性免疫战士的癌细胞来抑制早期HCC的肿瘤发生。10现在已经确定，KCs的极化与CD8有关+T细胞的募集和它们无法到达肿瘤细胞是免疫治疗抵抗的重要机制。

    从机制上讲，AKT激活是M2激活所必需的。12AKT/mTOR和RAS/MAPK级联的协同激活也与HCC的生物侵袭性和不良预后有关。13这种表型可以概括在活的有机体内通过流体动力转染活化形式的AKT (myr-AKT)和NRas (NRas- v12)致癌基因(AKT/Ras)到小鼠肝脏。13日14我们的初步数据显示，除了肝细胞外，流体动力递送也激活了KCs中的AKT信号，从而导致microRNA (mirna)的失调。mirna是一类小的非编码rna，可以同时微调许多途径。15日16mirna的这一特性使我们推测它们可以精确调节免疫反应，避免免疫反应过度或不足。在本研究中，我们利用AKT/Ras小鼠研究了KCs对免疫稳态和HCC的贡献，并确定了miRNA如何调节免疫途径和HCC的发展。

    材料与方法

    miR-206 kc特异性表达载体的构建

    将从小鼠基因组DNA中扩增的含有miR-206前体的400 bp片段插入到t3 - ef1 α载体中。CD68使用启动子确保kc特异性表达miR-206 (pT3-CD68p-miR-206)。为了排除质粒的非特异性影响，我们生成了miR-206错配表达载体，称为pT3-CD68p-scramble。pT3-EF1α-myr-AKT、nRasV12/pT2-CAGGS和pCMV/SB的构建细节已在我们之前的文章中描述。17将miR-206前体或scramble插入到mini-circle (MC)载体(System Biosciences, California, USA)中，称为MC- cd68p -miR-206或MC- cd68p -scramble。所有MCs都是根据制造商的说明制备的。

    AKT/Ras小鼠的建立

    8周龄FVB/NJ小鼠来自Jackson实验室(Farmington, Connecticut, USA)。如前所述进行了流体动力注射(HDI)。17为了评估miR-206对AKT/ ras诱导的HCC的影响，小鼠(n=6)水动力注射5µg pT3-EF1α-myr-AKT, 5µg NRasV12/pT2-CAGGS, 10µg pT3-CD68p-miR-206和0.8µg pCMV/SB。对照组小鼠(n=6)分别给予5µg p3 - ef1 α-myr- akt、5µg NRasV12/pT2-CAGGS、10µg p3 - cd68p -scramble和0.8µg pCMV/SB。质粒混合物用2 mL生理盐水(0.9% NaCl)稀释后，经0.22µm滤网过滤，5 ~ 7 s后注入小鼠尾侧静脉。小鼠的饲养、喂养和监测都按照明尼苏达大学动物研究委员会批准的方案进行。

    AKT/Ras治疗小鼠模型

    为了评估miR-206的治疗潜力，8周大的FVB/NJ小鼠注射AKT/Ras。17注射AKT/Ras三周后，小鼠接受MC-CD68p-miR-206或MC-CD68p-scramble治疗，剂量为每周1.5 mg/kg(静脉注射)，持续4周。

    CD8耗竭+小鼠体内的T细胞

    CD8+通过腹腔注射100µg CD8单克隆抗体(mAb) (Bio X cell, BE00223)进行T细胞消耗。6只小鼠水动力注射4µg pT3-EF1α-myr-AKT、4µg NRasV12/pT2-CAGGS、10µg pT3-CD68p-scramble和0.72µg pCMV/SB, 12只小鼠注射4µg pT3-EF1α-myr-AKT、4µg NRasV12/pT2-CAGGS、10µg pT3-CD68p-miR-206和0.72µg pCMV/SB。注射后1 d, 12只小鼠随机分为两组，分别用IgG1同型单抗(Bio X细胞，BE0088) (n=6)和CD8单抗(n=6)治疗。小鼠每2天注射一次mAb，连续7周。注射后7周，处死小鼠。

    统计分析

    使用GraphPad Prism软件进行统计分析。来自细胞系实验的数据以均数±扫描电镜表示，并通过双尾学生t检验进行评估。采用双向方差分析比较多组间的统计学差异。采用Mann-Whitney检验对小鼠实验进行统计学显著性评价。P<0.05为差异有统计学意义。

    额外的材料和方法可在在线补充材料。

    结果

    AKT/Ras信号的激活促进了KCs的M2极化

    AKT/Ras的HDI触发致死性HCC (图1一个，在线补充图1A,B)。AKT信号在肝细胞中的激活被认为是AKT/Ras小鼠发生HCC的主要原因。然而，除肝细胞外，AKT/Ras的HDI驱动AKT1在九龙区(在线补充图1C)。不幸的是，我们对KCs中AKT/Ras信号在HCC中的作用知之甚少。AKT/Ras小鼠肝癌肿瘤中KCs和浸润性巨噬细胞增加(在线补充图1D-G)。考虑到M2巨噬细胞在原肿瘤表型中的作用，18我们分析了AKT/Ras对KCs M2极化的影响。在小鼠中，AKT/Ras的HDI显著增加KCs中典型M2标记物的表达(图1 b)。相反，在AKT/Ras小鼠的KCs中，编码M1标记的基因，包括诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、CCL2、白细胞介素6 (IL-6)和肿瘤坏死因子α (tnf - α)的表达显著降低(图1 c)。为了证实这一观察结果，我们在AKT/Ras小鼠的肝脏中染色CD206(甘露糖受体C型1,M2标记)、iNOS (M1标记)和CLEC4F (C型凝集素结构域家族4成员F, KC标记)。M2 KCs (CD206+CLEC4F+)更为突出(图1 d, E，在线补充图1H)， M1 KCs (iNOS)+CLEC4F+AKT/Ras小鼠(图1 f, G，在线补充图1H)。流式细胞术分析证实，注射AKT/Ras后5周，AKT/Ras小鼠的KCs从m1到m2的转变增强(在线补充图2A-D)。注射AKT/Ras后1周，AKT/Ras小鼠中KCs的M2极化也增强(在线补充图2E)。在体外， AKT/Ras在野生型小鼠分离的KCs中过表达也会触发其M2极化(在线补充图2F)。此外，KCs中AKT信号的激活是HCC患者的一个标志(图1 h)。

    AKT/Ras activation promoted M2 polarisation of KCs. (A) Representative photos of livers of FVB/NJ mice injected with pT3-EF1α (control, n=6, 5 w.p.i.) and AKT/Ras (n=6, 5 w.p.i.). (B) mRNA levels of M2 marker genes encoding MGL2, IL-10, MGL1 and ARG1 in KCs of two groups of mice. (C) mRNA levels of M1 marker genes in KCs of two groups of mice. (D–E) Immunostaining of CD206 (M2 marker) and CLEC4F (KC marker) and the ratios of M2 KCs (CD206+CLEC4F+) in livers of two groups of mice. Scale bar: 20 μm. (F–G) Immunostaining of iNOS (M1 marker) and CLEC4F and the ratios of M1 KCs (iNOS+CLEC4F+) in livers of two groups of mice. Scale bar: 10 μm. (H) Immunostaining of CLEC4F and phosphorylated-AKT (AKT-S473) in livers of human patients. Scale bar: 50 μm. (I) Immunostaining of CD8 and CLEC4F, and the numbers of CD8+ T cells per 1000 liver cells in two groups of mice. Scale bar: 100 μm. Data represent mean±SEM. **P<0.01 and ***p<0.001 (figure 1A–G and I: Mann-Whitney U test). ARG1, arginase 1; KCs, Kupffer cells; LW, liver weight; MGL2, macrophage galactose N-acetyl-galactosamine specific lectin 2; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    AKT/Ras激活促进KCs的M2极化。(A)注射t3 - ef1 α(对照组，n= 6,5 w.p.i.)和AKT/Ras (n= 6,5 w.p.i.)后FVB/NJ小鼠肝脏代表性照片。(B)两组小鼠KCs中编码MGL2、IL-10、MGL1和ARG1的M2标记基因mRNA水平。(C)两组小鼠KCs中M1标记基因的mRNA水平。(D-E) CD206 (M2标记物)和cle4f (KC标记物)免疫染色及M2 KCs (CD206)比值+CLEC4F+)在两组小鼠的肝脏中。标尺:20 μm。(F-G) iNOS (M1标记物)和CLEC4F的免疫染色及M1 KCs (iNOS)的比值+CLEC4F+)在两组小鼠的肝脏中。标尺:10 μm。(H)人患者肝脏中CLEC4F和磷酸化akt (AKT-S473)的免疫染色。标尺:50 μm。(1) CD8、CLEC4F免疫染色及CD8数量+每1000个肝细胞中的T细胞。标尺:100 μm。数据代表平均值±SEM。**P<0.01， *** P< 0.001(图1A-G和I: Mann-Whitney U检验)。ARG1，精氨酸酶1;KCs, Kupffer细胞;LW:肝脏重量;MGL2，巨噬细胞半乳糖n -乙酰半乳糖胺特异性凝集素2;w.p.i.，注射AKT/Ras后周。

    M1 KCs是CD8化学引诱分子的重要来源+T细胞。与减少的M1 KCs一致，两者都是CD8+T细胞和ctl (CD8+伽马线暴+)在AKT/Ras小鼠HCC肿瘤中的表达减少(图1我,在线补充图2G-H)。综上所述，AKT/Ras信号的激活触发了KCs的M2转化和肝脏ctl的减少。

    kc特异性表达miR-206可预防AKT/Ras小鼠的HCC

    mirna精细调节基因表达的能力使其成为精确调节不平衡免疫系统的理想候选者。19MiRNA谱显示，microRNA-206 (miR-206)是AKT/Ras小鼠HCC肿瘤中减少最多的MiRNA之一(在线补充图3A和表1)。在不同病因的HCC患者中也观察到miR-206的降低(在线补充表2)。低水平的miR-206预测HCC患者的生存率较低(在线补充图3B)。进一步分析显示，KCs中miR-206的水平比从健康小鼠肝脏分离的肝细胞高5倍(图2一个)。HCC的发展导致KCs中miR-206降低了5倍，而AKT/Ras HCC小鼠肿瘤分离的肝细胞中miR-206仅降低了2倍(图2 b)，这表明AKT/Ras小鼠肝脏中miR-206的减少主要是由于KCs中miR-206的生物发生受损。与从健康小鼠肝脏分离的M1 KCs相比，M2 KCs中MiR-206的含量要低得多(图2 c)。

    KC-specific expression of miR-206 prevented HCC in AKT/Ras mice. (A) miR-206 levels in KCs and hepatocytes (HCs) isolated from wild-type FVB/NJ mice. (B) Levels of miR-206 in KCs and HCs from FVB/NJ mice injected with pT3-EF1α (control, n=6, 5 w.p.i.) and AKT/Ras (n=6, 5 w.p.i.). (C) miR-206 levels in M1 and M2 KCs isolated from wild-type FVB/NJ mice. (D) Kaplan-Meier survival curves of AKT/Ras mice injected with pT3-CD68p-scramble (AKT/Ras, n=6) or pT3-CD68p-miR-206 (AKT/Ras/miR-206, n=6). (E) Macroscopic and microscopic (H&E) appearance of livers from AKT/Ras/scramble (n=6, 5 w.p.i.) and AKT/Ras/miR-206 mice (n=6, 5 w.p.i.). (F) Study design to evaluate the therapeutic effect of miR-206 on HCC. (G) Kaplan-Meier survival curves of AKT/Ras mice injected with MC-CD68p-scramble (AKT/Ras, n=6) or MC-CD68p-miR-206 (AKT/Ras/miR-206, n=6). (H) Macroscopic and microscopic (H&E) appearance of livers from AKT/Ras (n=6, 3 w.p.i.), AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n=6, 7 w.p.i.) and AKT/Ras/MC-CD68p-miR-206 mice (n=6, 7 w.p.i.). Data represent mean±SEM. **P<0.01 (figure 2A–C and E: Mann-Whitney U test; figure 2D and G: log-rank test; figure 2H: two-way analysis of variance test). KCs, Kupffer cells; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    kc特异性表达miR-206可预防AKT/Ras小鼠的HCC。(A)野生型FVB/NJ小鼠分离的KCs和肝细胞(hc)中的miR-206水平。(B)注射pT3-EF1α(对照组，n= 6,5 w.p.i)和AKT/Ras (n= 6,5 w.p.i)的FVB/NJ小鼠KCs和hc中miR-206的水平。(C)野生型FVB/NJ小鼠分离的M1和M2 KCs中miR-206水平。(D) AKT/Ras小鼠注射p3 - cd68p -scramble (AKT/Ras, n=6)或p3 - cd68p -miR-206 (AKT/Ras/miR-206, n=6)后的Kaplan-Meier生存曲线。(E) AKT/Ras/scramble (n= 6,5 w.p.i.)和AKT/Ras/miR-206小鼠(n= 6,5 w.p.i.)肝脏的宏观和微观(H&E)外观。(F)评价miR-206对HCC治疗效果的研究设计。(G) AKT/Ras小鼠注射MC-CD68p-scramble (AKT/Ras, n=6)或MC-CD68p-miR-206 (AKT/Ras/miR-206, n=6)后的Kaplan-Meier生存曲线。(H) AKT/Ras (n= 6,3 w.p.i)、AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n= 6,7 w.p.i)和AKT/Ras/MC-CD68p-miR-206小鼠(n= 6,7 w.p.i)肝脏的宏观和微观(H&E)外观。数据代表平均值±SEM。 **P<0.01 (figure 2A–C and E: Mann-Whitney U test; figure 2D and G: log-rank test; figure 2H: two-way analysis of variance test). KCs, Kupffer cells; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.

    我们研究了调控miR-206对AKT/Ras小鼠KCs的影响。pT3-CD68p-miR-206的HDI导致AKT/Ras小鼠KCs中miR-206的升高，而AKT/Ras小鼠肝细胞中miR-206的变化不显著(在线补充图3C-E)。表型上，所有AKT/Ras/scramble小鼠注射后6-8周均死于HCC，而所有mir -206处理的AKT/Ras小鼠在此阶段均健康(图2 d)。解剖时，AKT/Ras/miR-206小鼠未见肿瘤结节(图2 e)。接下来，我们让AKT/Ras小鼠发展为HCC，然后用MC-CD68p-miR-206 (图2 f，在线补充图3F)。注射AKT/Ras后5-9周内，所有处理过的小鼠都死于HCC，而AKT/Ras/miR-206小鼠则表现健康(图2 g)。在解剖实验中，miR-206治疗4周后，AKT/Ras诱导的晚期HCC显著消退(图2 h)。

    MiR-206可减弱AKT/Ras小鼠中KCs的M2极化

    HDI主要在KCs中而非浸润巨噬细胞中驱动miR-206的表达(在线补充图3G)。M2 KCs抑制CD8+T细胞募集到TME。20.接下来，我们研究了kc特异性表达miR-206对KCs的M2极化和CD8的肝脏募集的影响+AKT/Ras小鼠的T细胞。AKT/Ras/miR-206小鼠肝脏中总KCs和浸润性巨噬细胞均减少(在线补充图4A,B)。免疫染色和流式细胞术显示，AKT/Ras/miR-206小鼠肝脏中M1 KCs明显增加，M2 KCs明显减少(图3 a, B，在线补充图4C-G)。然而，AKT/Ras/miR-206小鼠中未发现HCC (图2 e)。因此，我们不能排除AKT/Ras/miR-206小鼠中KCs的M2-to-M1转换是由于缺乏HCC，而不是miR-206介导的KCs的M1极化激活。为了排除这种可能性，我们分析了注射miR-206(治疗模型)前后携带肿瘤的AKT/Ras小鼠的M1/M2 KCs。同样，kc特异性表达miR-206驱动AKT/Ras小鼠肝脏中KCs的m2 - m1转换(图3 c, D，在线补充图5)。M1/M2 KCs的总体变化促使我们探索TME炎症的一般变化。AKT/Ras小鼠肿瘤中抗炎标志基因表达升高，促炎基因表达降低(在线补充图6A,B)。相反，miR-206逆转了AKT/Ras (在线补充图6A,B)。这些结果与之前的报道一致，AKT信号限制促炎和促进抗炎反应。21kc特异性表达miR-206也能使AKT/Ras小鼠细胞内氧化应激正常升高(在线补充图6C)。

    miR-206 attenuated M2 polarisation of KCs in AKT/Ras mice. (A and B) Immunostaining of iNOS, CD206 and CLEC4F (KC-specific marker) and the ratios of M1 or M2 KCs in livers of AKT/Ras mice injected with pT3-CD68p-scramble (n=6, 5 w.p.i.) or pT3-CD68p-miR-206 mice (n=6, 5 w.p.i.). (C and D) Immunostaining of iNOS, CD206 and CLEC4F and the ratios of M1 or M2 KCs in livers of AKT/Ras (n=6, 3 w.p.i.), AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n=6, 7 w.p.i.) and AKT/Ras/MC-CD68p-miR-206 (n=6, 7 w.p.i.) mice. Data represent mean±SEM. **P< 0.01 and NS (figure 3A–B: Mann-Whitney U test; figure 3C–D: two-way analysis of variance test). Scale bar: figure 3A and C: 10 μm; figure 3B and D: 20 μm. KCs, Kupffer cells; NS, no significance; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    miR-206可减弱AKT/Ras小鼠中KCs的M2极化。(A和B)注射pT3-CD68p-scramble (n= 6,5 w.p.i)或pT3-CD68p-miR-206 (n= 6,5 w.p.i)后AKT/Ras小鼠肝脏中iNOS、CD206和CLEC4F (kc特异性标志物)的免疫染色以及M1或M2 KCs的比例。(C和D) AKT/Ras (n= 6,3 w.p.i)、AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n= 6,7 w.p.i)和AKT/Ras/MC-CD68p-miR-206 (n= 6,7 w.p.i)小鼠肝脏中iNOS、CD206和CLEC4F的免疫染色以及M1或M2 KCs的比例。数据代表平均值±SEM。**P< 0.01, NS(图3A-B: Mann-Whitney U检验;图3C-D:方差检验的双向分析)。比例尺:图3A、图C: 10 μm;图3B、图D: 20 μm。KCs, Kupffer细胞;NS，无显著性; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.

    在机制上，kc特异性表达miR-206显著诱导编码M1标记的基因的表达，包括CCL2、iNOS、环氧化酶2 (COX-2)、TNFα和IL-6在kc中而不是肝细胞中(图4一，在线补充图7A)。AKT/Ras/miR-206小鼠血清中这些细胞因子水平也显著升高(图4 b)。相比之下，AKT/Ras/miR-206小鼠的M2标记基因mRNA水平及血清水平均显著降低(在线补充图7B,C)。暴露于炎性刺激包括IL-6和tnf - α时，CCL2的表达会被触发。22同时上调CCL2、TNFα和IL-6证实了miR-206在诱导KCs M1极化中的作用。CCL2以其驱动CD8趋化性的能力而闻名+T细胞和调节性T细胞(Tregs)通过CCR2 (C-C基序趋化因子受体2)。23也有报道称，CCL2在HCC中可吸引Tregs。24出乎意料的是，我们的数据库挖掘显示，与邻近正常组织相比，HCC、结肠癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌和直肠腺癌的CCL2显著降低(图4 c)。此外，低水平的CCL2和CCR2在TCGA数据库中预测HCC患者的生存率较低(在线补充图8A-C)。在HCC患者中，miR-206与CCL2、TNFα及CTL标志物呈正相关(在线补充图8D,E)。这些发现使我们推测CCL2-CCR2轴可能吸引CD8+T细胞。确实，miR-206增加了肝脏CD8+T细胞和ctl (图4 d, E，在线补充图9A-D)并促进CD8的聚集+AKT/Ras/miR-206小鼠中靠近KCs的T细胞(预防和治疗模型)(图4 d, E，在线补充图9E,F)。综上所述，miR-206促进了KCs的M1极化和CD8的肝脏募集+T细胞。

    miR-206 promoted hepatic recruitment of CD8+ T cells by driving CCL2 production. (A) mRNA levels of M1 marker genes in KCs of AKT/Ras/scramble (n=6, 5 w.p.i.) and AKT/Ras/miR-206 (n=6, 5 w.p.i.) mouse cohorts. (B) Serum levels of TNFα, IL-6 and CCL2 in two groups of mice. (C) mRNA levels of CCL2 in HCC, colon cancer (COAT), breast cancer (BRCA), lung adenocarcinoma (LUAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) and rectum adenocarcinoma (READ) in the TCGA database (T: tumour; N: normal livers). Expression levels were shown as Log2 (TPM+1). (D) Immunostaining of CD8, CLEC4F and the numbers of CD8+ cells per 1000 liver cells in two group of mice. (E) Immunostaining of CD8 and CLEC4F and the numbers of CD8+ cells per 1000 liver cells in AKT/Ras (n=6, 3 w.p.i.), AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n=6, 7 w.p.i.) and AKT/Ras/ MC-CD68p-miR-206 (n=6, 7 w.p.i.). Data represent mean±SEM. *P<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 (figure 4A, B D: Mann-Whitney U test; figure 4C: two-tailed Student’s t-test; figure 4E: two-way analysis of variance test). Scale bar: 100 μm. HCC, hepatocellular carcinoma; KCs, Kupffer cells; TPM, transcripts per million; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    miR-206促进CD8在肝脏的募集+T细胞通过驱动CCL2的产生。(A) AKT/Ras/scramble (n= 6,5 w.p.i.)和AKT/Ras/miR-206 (n= 6,5 w.p.i.)小鼠队列KCs中M1标记基因的mRNA水平。(B)两组小鼠血清TNFα、IL-6、CCL2水平。(C)CCL2HCC、结肠癌(COAT)、乳腺癌(BRCA)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)和直肠腺癌(READ)在TCGA数据库(T: tumor;N:正常肝脏)。表达水平表示为Log2 (TPM+1)。(D) CD8、CLEC4F的免疫染色及CD8的数量+两组小鼠中每1000个肝细胞中的细胞。(E) CD8和CLEC4F的免疫染色及CD8的数量+AKT/Ras (n= 6,3 w.p.i)、AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n= 6,7 w.p.i)和AKT/Ras/ MC-CD68p-miR-206 (n= 6,7 w.p.i)中每1000个肝细胞的细胞数。数据代表平均值±SEM。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001(图4A, B D: Mann-Whitney U检验;图4C:双侧Student 's t检验;图4E:方差检验的双向分析)。标尺:100 μm。HCC，肝细胞癌;KCs, Kupffer细胞;TPM，每百万份成绩单;w.p.i.，注射AKT/Ras后周。

    MiR-206驱动人和小鼠巨噬细胞的M1极化

    接下来，我们对miR-206进行功能增益，以促进小鼠RAW264.7和人THP-1巨噬细胞的M1极化。RAW264.7和THP-1细胞中过表达miR-206可使M1标记物的诱导率提高2.0 ~ 21倍(图5 a, C)，但M2标记物mRNA水平显著降低(在线补充图10)。流式细胞术证实miR-206导致iNOS阳性RAW264.7和THP-1细胞增加5倍(图5 b, D)。总之，miR-206促进了人和小鼠巨噬细胞的M1极化。

    miR-206 triggered M1 polarisation of both human and mouse macrophages. (A and C) mRNA levels of M1 marker genes in RAW264.7 and THP-1 cells transfected with pT3-CD68p-miR-206 (miR-206) or pT3-CD68p-scramble (control). (B and D) Flow cytometry analysis of iNOS+ cells in RAW264.7 and THP-1 cells transfected with pT3-CD68p-miR-206 or pT3-CD68p-scramble. Data represent mean±SEM. **P<0.01 (figure 5: two-tailed Student’s t-test).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    miR-206触发人和小鼠巨噬细胞的M1极化。(A和C)转染pT3-CD68p-miR-206 (miR-206)或pT3-CD68p-scramble(对照)的RAW264.7和THP-1细胞中M1标记基因的mRNA水平。(B、D) iNOS的流式细胞术分析+转染了pT3-CD68p-miR-206或pT3-CD68p-scramble的RAW264.7细胞和THP-1细胞。数据代表平均值±SEM。**P<0.01(图5:双侧学生t检验)。

    KLF4介导miR-206在促进巨噬细胞M1极化中的作用

    MiRNAs抑制其靶标的表达。然而，miR-206上调Ccl2;。因此，我们推测miR-206促进了Ccl2通过双重抑制机制，miR-206促进转录Ccl2通过靶向的转录抑制因子Ccl2。我们首先试图确定在巨噬细胞中特异性表达的miR-206靶点。肝细胞、巨噬细胞单细胞测序数据库挖掘与生物信息学预测相结合(在线补充表3)，我们确定了在巨噬细胞中特异性表达的miR-206的7个潜在靶点(在线补充表4)。miR-206的潜在靶点包括:KLF4是唯一一个编码转录抑制因子的基因，可以通过损害NF-κB的能力来调节巨噬细胞的极化。25一些M1标记基因的启动子含有NF-κB结合位点。26因此，我们推测miR-206通过直接靶向KLF4-NF-κB轴促进CCL2的产生，从而触发KCs的M1极化。的3'UTR内的miR-206结合位点Klf4在人和老鼠之间是保守的(图6)。这两个Klf4和Ccl2与肝细胞相比，主要在KCs中表达(图6 b)。RAW264.7细胞中miR-206过表达明显减少Klf4但增加Ccl2（图6 c)。荧光素酶测定证实miR-206直接结合到3 ' utrKlf4小鼠和人巨噬细胞(图6 d，在线补充图11A,B)。KLF4损害NF-κB位点共激活因子的募集。25因此，我们推断KLF4破坏了增强NF-κB (p65)转录活性的辅因子的募集。的确，在RAW264.7细胞中，p65的过表达驱动了M1标记物的表达Klf4抵消了p65 (图6 e)。

    KLF4 mediated the role of miR-206 in promoting M1 polarisation of macrophages. (A) Graphic representation of the conserved miR-206 binding motif within the 3’UTR of Klf4. Complementary sequence to the seed region of miR-206 within the 3’UTR of Klf4 is conserved between human and mouse (highlighted in green). (B) mRNA levels of Klf4 and Ccl2 in hepatocytes and KCs isolated from wild-type FVB/NJ mice. (C) mRNA levels of Klf4 and Ccl2 in RAW264.7 cells transfected with pT3-CD68p-miR-206 or pT3-CD68p-scramble (control). (D) Luciferase activities of the reporter constructs containing either wild-type or mutated 3’UTR of mouse Klf4 after transfection of pT3-CD68p-scramble (control) or pT3-CD68p-miR-206. (E) mRNA levels of M1 maker genes in RAW264.7 Cells transfected with pT3-EF1α (control), pT3-p65 (p65) or a combination of pT3-Klf4 and pT3-p65 (p65+KLF4). (F) Protein levels of KLF4 and CCL2 in three groups of RAW264.7 cells transfected with pT3-CD68p-scramble, pT3-CD68p-miR-206 or a combination of pT3-CD68p-miR-206 and a sgRNA designed to ablate the binding site within the 3’UTR of Klf4. (G) mRNA levels of M1 marker genes in three groups of RAW264.7 cells. (H) Levels of iNOS, COX-2, TNFα and CCL2 in cell lysates of three groups of RAW264.7 cells. (I–J) Immunostaining of iNOS and the ratios of iNOS+ cells in three groups of RAW264.7 cells. Data represent mean±SEM. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 and NS (figure 6B–D: two-tailed Student’s t-test; figure 6E–J: two-way analysis of variance test). COX-2, cyclooxygenase 2; KCs, Kupffer cells; NS, no significance.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    KLF4介导miR-206促进巨噬细胞M1极化的作用。(A)的3'UTR内保守的miR-206结合基序的图示Klf4。的3'UTR内与miR-206种子区互补的序列Klf4在人和老鼠之间是保守的(以绿色突出显示)。(B)Klf4和Ccl2在野生型FVB/NJ小鼠肝细胞和KCs中(C)Klf4和Ccl2转染pT3-CD68p-miR-206或pT3-CD68p-scramble(对照)的RAW264.7细胞。(D)含有野生型或突变小鼠3'UTR的报告基因构建体的荧光素酶活性Klf4转染t3 - cd68p -scramble(对照)或t3 - cd68p - mir -206后。(E)转染pT3-EF1α(对照)、pT3-p65 (p65)或pT3-Klf4和pT3-p65组合(p65+KLF4)的RAW264.7细胞中M1 maker基因的mRNA水平。(F)转染pT3-CD68p-scramble、pT3-CD68p-miR-206或pT3-CD68p-miR-206与sgRNA的组合后，三组RAW264.7细胞中KLF4和CCL2的蛋白水平Klf4。(G)三组RAW264.7细胞M1标记基因mRNA水平。(H)三组RAW264.7细胞裂解液中iNOS、COX-2、TNFα和CCL2水平。(I-J) iNOS免疫染色及iNOS比例+三组RAW264.7细胞。数据代表平均值±SEM。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001, NS(图6B-D:双尾Student 's t检验;图6E-J:方差检验的双向分析)。COX-2，环氧合酶2;KCs, Kupffer细胞;NS，没有意义。

    为了确定KLF4是否是miR-206诱导M1极化所必需的，我们采用了一种基因组编辑方法来切除miR-206的3'UTR内的结合位点Klf4。这样的设计破坏了miR-206抑制Klf4RAW264.7细胞(图6 f)。MiR-206驱动RAW264.7细胞的M1极化，而MiR-206结合位点的消融消除了MiR-206的作用(图6 g-j，在线补充图11C)。破坏miR-206和KLF4也削弱了miR-206诱导THP-1细胞M1极化的能力(在线补充图11D,E)。此外，AKT/Ras小鼠的KCs中KLF4-NFκB轴被抑制，而AKT/Ras/miR-206小鼠的KCs中该信号被恢复(在线补充图12)。总之，miR-206通过调节KLF4-NF-κB轴，触发巨噬细胞的M1极化。

    MiR-206增强CD8的扩增和迁移+T细胞通过CCL2/CCR2轴

    高水平的CCL2或CCR2与肝癌患者生存率的提高密切相关(在线补充图8B,C)。CCL2与CD8的募集有关+T细胞。27 28因此，我们假设miR-206通过促进CCL2/CCR2轴来招募CD8+T细胞。接下来我们共培养CD8+T细胞与mir -206转染RAW264.7细胞。MiR-206驱动CCL2分泌和CD8扩增+T细胞(图7 a, B)。CD69是CD8的早期激活标记物+T细胞。CD154允许CD8+T细胞促进自身扩张。29事实上,CD8+T细胞高表达Cd69和Cd154的（图7 c)。MiR-206通过促进巨噬细胞中CCL2的产生，增强CD8的迁移+T细胞(图7 d)。

    miR-206 enhanced chemotaxis of CD8+ T cells by activating the CCL2/CCR2 axis. (A) Levels of CCL2 in the medium of RAW264.7 cells that were transfected with pT3-CD68p-scramble (control), pT3-CD68p-miR-206 (miR-206) or a combination of pT3-CD68p-miR-206 and the sgRNA to ablate the binding site of miR-206 within the 3’UTR of Klf4 (miR-206+sgRNA). (B) Proliferation of CD8+ T cells cocultured with three groups of RAW264.7 cells. (C) mRNA levels of genes encoding CD69 and CD154 in CD8+ T cells that were cocultured with the three groups of RAW264.7 cells. (D) The migration ratios of CD8+ T cells cocultured with three groups of RAW264.7 cells. (E) The migration ratios of CD8+ T cells cocultured with three groups of RAW264.7 cells treated with pT3-CD68p-scramble (control), pT3-CD68p-miR-206 or a combination of pT3-CD68p-miR-206 and CCL2 mAb. CCL2 mAb was used to neutralise CCL2 in the culture medium. (F) The migration ratios of CD8+ T cells cocultured with three groups of RAW264.7 cells treated with pT3-CD68p-scramble (control), pT3-CD68p-miR-206 or a combination of pT3-CD68p-miR-206 and CAS, a CCR2 antagonist. (G) The migration ratios of CD8+ T cells cocultured with KCs isolated from livers of FVB/NJ mice injected with pT3-EF1α (control, n=3, 5 w.p.i.), AKT/Ras/scramble (n=3, 5 w.p.i.) or AKT/Ras/miR-206 (n=3, 5 w.p.i.). (H) The migration ratios of CD8+ T cells cocultured with KCs isolated from livers of AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n=3, 7 w.p.i.) and AKT/Ras/MC-CD68p-miR-206 (n=3, 7 w.p.i.). (I–J) Immunostaining of CD8 and CCL2 in livers of the AKT/Ras models of prevention and treatment. Scale bar: 100 µm. Data represent mean±SEM. *P<0.05; **p<0.01 and NS (figure 7A–G: two-way analysis of variance test. figure 7H: two-tailed Student’s t-test). NS, no significance; KCs, Kupffer cells; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    miR-206增强CD8的趋化性+T细胞通过激活CCL2/CCR2轴。(A)转染pT3-CD68p-scramble(对照)、pT3-CD68p-miR-206 (miR-206)或pT3-CD68p-miR-206与sgRNA的组合以吞噬3'UTR内miR-206的结合位点的RAW264.7细胞培养基中的CCL2水平Klf4(mir - 206 + sgRNA)。(B) CD8的增殖+T细胞与三组RAW264.7细胞共培养。(C) CD8中编码CD69和CD154基因的mRNA水平+T细胞与三组RAW264.7细胞共培养。(D) CD8的迁移率+T细胞与三组RAW264.7细胞共培养。(E) CD8的迁移率+T细胞与三组经pT3-CD68p-scramble(对照)、pT3-CD68p-miR-206或pT3-CD68p-miR-206和CCL2 mAb联合处理的RAW264.7细胞共培养。用CCL2单抗中和培养基中的CCL2。(F) CD8的迁移率+T细胞与三组经pT3-CD68p-scramble(对照)、pT3-CD68p-miR-206或pT3-CD68p-miR-206与CAS(一种CCR2拮抗剂)联合处理的RAW264.7细胞共培养。(G) CD8的迁移率+注射t3 - ef1 α(对照组，n= 3,5 w.p.i.)、AKT/Ras/scramble (n= 3,5 w.p.i.)或AKT/Ras/miR-206 (n= 3,5 w.p.i.)的FVB/NJ小鼠肝脏分离的T细胞与KCs共培养。(H) CD8的迁移率+AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n= 3,7 w.p.i)和AKT/Ras/MC-CD68p-miR-206 (n= 3,7水渍险)。(I-J)预防和治疗AKT/Ras模型肝脏CD8和CCL2免疫染色。比例尺:100µm。数据代表平均值±SEM。* P < 0.05;**p<0.01和NS(图7A-G:方差检验的双向分析。图7H:双侧学生t检验)。NS，无显著性;KCs, Kupffer细胞;w.p.i.，注射AKT/Ras后周。

    接下来，我们确定了miR-206激活M1极化以及随后CD8的扩增和迁移是否需要KLF4-CCL2-CCR2轴的每个组分+T细胞。3'UTR内miR-206结合位点的消融Klf4miR-206诱导RAW264.7细胞分泌CCL2的能力受损(图7)。这种破坏也限制了miR-206促进CD8扩增和迁移的能力+T细胞(图7罪犯)。CCR2中和和CCR2拮抗损害了miR-206驱动CD8迁移的能力+T细胞(图7 e, F)，表明miR-206募集CD8同时需要CCL2和CCR2+T细胞。3'UTR内miR-206结合位点的消融KLF4THP-1细胞基因组中miR-206驱动CD8增殖和迁移的能力也受损+T细胞(在线补充图13)。AKT/Ras小鼠的KCs驱动CD8迁移的能力降低+而在AKT/Ras/miR-206小鼠分离的KCs中，这种缺失得以恢复(图7 g H)。在AKT/Ras/miR-206小鼠中，CCL2的出现与CD8呈正相关+T细胞(预防型和治疗型)(图7 i j)。

    破坏miR-206和Klf4部分损害了miR-206预防HCC的能力

    我们着手确定KLF4-CCL2轴是miR-206阻止HCC发展的下游效应因子在活的有机体内。为此，我们采用基于aav8的CRISPR/Cas9技术，在3'UTR内消融miR-206的结合位点Klf4在AKT/Ras小鼠的KCs基因组中。miR-206结合位点的消融损害了miR-206的抑制能力Klf4并促进氯化碳的生成(图8 a, B)。表型上，破坏miR-206和Klf4与HCC恢复生长相关，miR-206 (图8 c)。在机制上，miR-206的HDI促进了KCs的m2到m1转换和CD8的肝脏募集+T细胞，同时破坏miR-206和Klf4M1 KCs和CD8水平升高+T细胞与处理过的小鼠(图8 d - i)。综上所述，至少在一定程度上，KLF4-CCL2轴介导了miR-206驱动KCs的m2 - m1极化和CD8的肝脏募集的能力+T细胞对AKT/Ras小鼠肝癌的预防作用。

    Disrupting the interaction between miR-206 and Klf4 offset the role of miR-206 in preventing HCC development. (A and B) mRNA levels of Klf4 in KCs and serum CCL2 in AKT/Ras mice injected with pT3-CD68-scramble (n=6, 8 w.p.i.), pT3-CD68-miR-206 (n=6, 8 w.p.i.) or a combination of pT3-CD68-miR-206 and the sgRNA (n=6, 8 w.p.i.). (C) Macroscopic and microscopic (H&E) appearance of livers of three groups of mice. (D–G) Ratios of M1 or M2 KCs in livers of three groups of mice. (H–I) Ratios of CTLs (CD8+GrB+) to CD8+ T cells in livers of three groups of mice. Data represent mean±SEM. **P<0.01 (figure 8: two-way analysis of variance test). HCC, hepatocellular carcinoma; KCs, Kupffer cells; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8
    图8

    破坏miR-206和Klf4抵消了miR-206在预防HCC发展中的作用。(A、B)Klf4AKT/Ras小鼠注射pT3-CD68-scramble (n= 6,8 w.p.i.)， pT3-CD68-miR-206 (n= 6,8 w.p.i.)或pT3-CD68-miR-206和sgRNA (n= 6,8 w.p.i.)后，KCs和血清CCL2的变化。(C)三组小鼠肝脏的宏观和微观(H&E)外观。(D-G)三组小鼠肝脏中M1或M2 KCs的比值。(H-I) ctl (CD8+伽马线暴+)至CD8+三组小鼠肝脏中的T细胞。数据代表平均值±SEM。**P<0.01(图8:方差检验的双向分析)。HCC，肝细胞癌;KCs, Kupffer细胞;w.p.i.，注射AKT/Ras后周。

    CD8耗竭+T细胞消除了miR-206阻止HCC发展的能力

    我们假设ctl是miR-206预防HCC的主要下游参与者。为了验证这一点，我们耗尽了CD8+腹腔注射CD8或IgG1 mAb(对照)对AKT/Ras小鼠T细胞的影响(图9)。MiR-206抑制Klf4，促进CCL2的产生，促进KCs的M1极化，完全预防AKT/Ras小鼠的HCC (图9中)。相比之下，尽管miR-206恢复了肝脏M1 KCs (图9 c)， CD8耗竭+T细胞抵消了miR-206抑制HCC发展的能力(图9 e)。总而言之，CD8+T细胞是miR-206抑制HCC的下游参与者。

    Depletion of CD8+ T cells impaired the ability of miR-206 to prevent HCC. (A) Levels of CD8+ T cells in livers of AKT/Ras treated with scramble (n=6, 7 w.p.i.), miR-206 and IgG1 mAb (n=6, 7 w.p.i.), or a combination of miR-206 and CD8 mAb (n=6, 7 w.p.i.). (B) mRNA levels of Klf4 in KCs and serum CCL2 in three groups of mice. (C and D) Ratios of M1 or M2 KCs in livers of three groups of mice. (E) Macroscopic and microscopic (H&E) appearance of livers in three groups of mice. Data represent mean±SEM. **P<0.01, ***p<0.001 and NS (figure 9: two-way analysis of variance test). HCC, hepatocellular carcinoma; KCs, Kupffer cells; mAb, monoclonal antibody; NS, no significance; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图9
    图9

    CD8耗竭+T细胞损害了miR-206预防HCC的能力。(A) CD8水平+用scramble (n= 6,7 w.p.i.)、miR-206和IgG1单抗(n= 6,7 w.p.i.)或miR-206和CD8单抗联合(n= 6,7 w.p.i.)处理AKT/Ras肝脏中的T细胞。(B)Klf4三组小鼠的KCs和血清CCL2(C、D)三组小鼠肝脏中M1、M2 KCs的比值。(E)三组小鼠肝脏的宏观和微观(H&E)外观。数据代表平均值±SEM。**P<0.01， **P< 0.001和NS(图9:方差检验的双向分析)。HCC，肝细胞癌;KCs, Kupffer细胞;mAb，单克隆抗体;NS，无显著性;w.p.i.，注射AKT/Ras后周。

    讨论

    免疫治疗的效果受到HCC的几个独特特性的限制，最明显的是肝脏在健康和患病状态下固有的耐受性。11在这项研究中，我们确定了HCC的典型免疫性质，KCs的M2极化损害了肝脏中CD8的富集+T细胞。相反，miR-206驱动KCs的M1极化和CD8的肝脏募集+T细胞，因此显示出强大的治疗HCC的潜力。

    首先，我们观察到AKT信号的激活可以解释AKT/Ras小鼠中KCs的M2极化。迄今为止，巨噬细胞极化的控制在很大程度上归因于一小群因子的功能，包括NF-κB、AP-1、STATs和PPARs。25由于mirna的鉴定，30.它们与人类癌症，特别是miR-206有关。17 18 31 32关于miR-206，其在抑制多种癌症增殖中的作用已经得到了很好的研究。17 31 32然而，在HCC中，hdi的效率为主在活的有机体内转染miR-206仅占肝细胞的30% (在线补充图3C)。因此，认为AKT/Ras/miR-206完全预防HCC是由抑制恶性肝细胞增殖引起的结论是不合理的。肿瘤细胞的免疫逃逸是HCC的典型特征。3.事实上，mir -206介导的KCs的M1极化，通过驱动肝脏中ctl的募集，至少在一定程度上促进了AKT/Ras小鼠对HCC的强烈抑制。然而，不能排除miR-206通过调节TME内的其他信号级联抑制HCC的可能性。

    第二个关键观察结果是miR-206促进CD8的迁移和扩增+T细胞通过驱动KCs产生CCL2。虽然CCL2与CCR1-5的结合是混杂的，但它与CCR2的结合具有特别高的亲和力。33CCL2/CCR2信号通路因其调节巨噬细胞募集和极化的作用而广为人知。23除了吸引M2巨噬细胞外，CCL2/CCR2轴也被证明吸引treg。34据报道，CCL2在HCC患者中升高，拮抗CCL2/CCR2轴会损害HCC的生长。35然而，我们的TCGA数据库分析显示，CCL2降低预示着HCC患者的生存率较低(在线补充图8A,B)。值得注意的是，在TCGA数据库中的其他类型的人类癌症中，CCL2的水平也有所下降(图4 c)。在肉瘤和肺癌患者中，高表达CCL2与改善的预后和更好的总生存有关。36 37据报道，CCR2/CCL2轴与ctl向癌细胞迁移的增加有关。38基于这些发现，我们推测在HCC的起始和早期阶段，KCs的M1极化激活了CCL2/CCR2信号，从而促进了CD8的迁移+T细胞转移到HCC。然而，在晚期HCC中，循环treg水平显著升高，treg表面的CCR2迅速耗尽CCL2，这降低了CCL2与CD8上的CCR2相互作用的机会+T细胞。因此，miR-206至少部分地通过CCL2/CCR2轴促进CD8的吸引+T细胞。

    免疫抑制是HCC的典型特征。尽管miR-206在驱动ctl的肝脏募集中有很强的作用，但基于其对HCC的强抑制作用，不能排除miR-206对免疫抑制的抑制作用。此外，CCR2也在treg中表达，这促使我们评估miR-206对肝脏treg的影响。出乎意料的是，肝脏CD4降低+在AKT/Ras小鼠中观察到T细胞和Tregs升高，而kc特异性表达miR-206使其在AKT/Ras小鼠(预防和治疗模型)中的水平正常化(在线补充图14A-F)。FOXP3本身并不足以使Tregs表现出抑制功能。39IL-10的增加是Treg功能和分化所必需的。40我们推测miR-206通过抑制IL-10的产生，为Treg分化创造了不利的环境。IL-10主要在KCs和肝细胞中表达(在线补充图15A)。kc特异性表达miR-206可降低两种mRNA水平il - 10AKT/Ras小鼠的KCs和血清IL-10升高(在线补充图15B,C)。这一观察结果表明，miR-206除了驱动CTL募集外，还抑制肝脏免疫抑制，这可能是AKT/Ras小鼠完全预防HCC的部分原因。

    CCR2/5拮抗剂Cenicriviroc (CVC)在治疗NASH/纤维化方面显示出良好的效果。41接下来，我们测定了CVC对AKT/Ras小鼠HCC的影响。出乎意料的是，CVC治疗略微加速了AKT/Ras小鼠的HCC生长(在线补充图16)。我们需要进一步研究优化AKT/Ras和CVC的剂量，以使AKT/Ras小鼠长期存活，从而研究CVC在促进AKT/Ras小鼠HCC发展中的作用。促炎KCs可以通过消除癌细胞抑制早期HCC的肿瘤发生，也可以维持慢性炎症状态。M1 KCs的阈值和及时终止KCs的M1极化对于维持其抑制HCC的能力并避免过度炎症至关重要。我们推测，miR-206通过微调M1/M2平衡和TME，在没有过度肝脏炎症的情况下完全预防HCC。

    最后，通过mir -206介导的KCs的M1极化完全预防HCC，强调了mirna在维持免疫稳态中的作用。它们现在已经被确定为自然存在的非编码rna，可以微调代谢和功能途径。42-44mirna的这一特性使我们推测它们以一种高度精确的方式调节免疫反应，从而避免了过度和非现场效应。综上所述，AKT/Ras信号的激活触发了KCs的M2极化，随后破坏了ctl对癌症部位的浸润。MiR-206驱动KCs的M1极化和CCL2的产生。CCL2/CCR2信号的激活促进了肝脏CD8的募集+T细胞和完全预防HCC。基于miR-206增强免疫监视的独特性质，它代表了一种潜在的针对HCC的新型免疫治疗剂。

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    伦理语句

    患者同意发表

    伦理批准

    明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会动物协议ID: 1811-36499A。

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    补充材料

    脚注

    • 贡献者NL对数据的整理、分析、调查、方法论和解读做出了贡献，并撰写了初稿。XW对研究方法和数据收集做出了贡献。CJS为支持方法以及审查和编辑原稿做出了贡献。GS发起和协调研究，获得资金，编辑稿件并提交稿件。

    • 资金这项工作得到了美国癌症协会向GS提供的研究学者资助(ISG-16-210-01-RMC)的部分支持。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料本内容由作者提供。它没有经过英国医学杂志出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担所有的责任和责任，因为任何依赖放置在内容上。如果内容包含任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规，临床指南，术语，药物名称和药物剂量)，并且不对翻译和改编或其他方式引起的任何错误和/或遗漏负责。