条文本
PDF
摘要
客观的全面的HBV感染免疫图景是实现HBV治愈的关键。
设计我们对23个个体的46对肝脏和血液样本中的243000个细胞进行了单细胞RNA测序，包括6个免疫耐受者、5个免疫活跃者(IA)、3个急性恢复者(AR)、3个慢性缓解者(AR)和6个无hbv健康对照(hc)。在第二个HBV队列中应用流式细胞仪和组织学分析进行验证。
结果IA和AR均以肝内大量CD8+ T (Tex)细胞枯竭为特征。IA中，Tex细胞主要来源于肝脏常驻的GZMK+效应记忆T细胞和自我扩增。相比之下，外周CX3CR1+效应T细胞和GZMK+效应记忆T细胞是AR中Tex细胞的主要来源。在IA而非AR中，Tex细胞与调节性CD4+ T细胞之间以及Tex与FCGR3A+巨噬细胞之间观察到显著的细胞-细胞相互作用。这种相互作用可能分别通过人类白细胞抗原I类分子及其受体CANX和LILRBs介导，从而导致抗病毒免疫反应的功能障碍。相比之下，CX3CR1+GNLY+中央记忆CD8+ T细胞在AR的肝脏和血液中同时扩增，为病毒化解提供了潜在的替代标记物。临床中，肝内Tex细胞与血清丙氨酸转氨酶水平及组织学分级评分呈正相关。
结论我们的研究剖析了HBV感染不同阶段的协调免疫反应，为充分了解免疫发病机制和制定有效的治疗策略提供了丰富的资源。
- 乙型肝炎
- 免疫反应
- T淋巴细胞
- 宽容
- 巨噬细胞
数据可用性声明
如有合理要求，可提供资料。与本研究相关的所有数据均包含在文章中或作为补充信息上传，除本文报道的单细胞RNA测序原始数据外，可在基因表达Omnibus (GSE182159)和基因组序列档案(https://ngdc.cncb.ac.cn，注册编号HRA001730)。
这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
数据来自Altmetric.com
本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
全世界有2.8亿多人慢性感染乙肝病毒，每年有70万人死于肝硬化和肝细胞癌。只有少数慢性乙型肝炎(CHB)患者可以通过目前的治疗方案实现功能性治愈。
在单细胞分辨率下对HBV感染的肝内免疫应答的全面观点仍然缺乏。
CD8+ T细胞被广泛认为是急性消退HBV感染期间病毒清除的关键效应因子，但在CHB期间功能受损。
新的发现是什么?
我们以单细胞分辨率描绘了不同乙肝分期免疫细胞的全面图景。
精疲力尽的CD8+ T细胞在不同动态的免疫活跃(IA)和急性恢复期患者中优先扩增。
细胞-细胞相互作用的网络分析和组织学验证显示，在免疫耐受(IT)和IA患者中，耗尽的CD8+ T细胞与调节性CD4+ T细胞和FCGR3A+巨噬细胞表现出显著的相互作用，可能分别由HLA I类分子及其受体CANX和白细胞免疫球蛋白样受体介导。
本研究的意义
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
全面的转录组图谱是了解乙型肝炎免疫和发病机制的宝贵资源。
我们的研究结果强调了IT患者肝脏中MAIT、调节性T细胞、耗尽的CD8+ T和髓系亚群的协调失调，这意味着这些患者可能需要早期治疗。
循环的CX3CR1+GNLY+ CD8+中央记忆T细胞可作为预测HBV清除的替代标志物。
细胞空间组织图谱分析为慢性乙型肝炎治疗提供了潜在的细胞和分子靶点。
简介
超过2.8亿人患有慢性乙型肝炎病毒(CHB)感染，并处于发展为肝硬化、肝衰竭或肝细胞癌(HCC)的高风险中，每年导致70多万人死亡。1有效疫苗的可用性和阻断母婴传播已成功降低了发病率，但目前的一线抗病毒治疗很少实现功能性治愈，其定义为尽管停止治疗，但血清HBV表面抗原(HBsAg)持续损失。2
绝大多数在成年期感染乙肝病毒的人发展为急性肝炎，而大多数在婴儿期或儿童早期感染成为慢性乙型肝炎。CD8+ T细胞被广泛认为是急性恢复(AR)期间病毒清除的关键效应因子，但在CHB中，由于持续暴露于高病毒抗原和免疫抑制性肝脏微环境而造成的疲惫而受损。3.CHB的自然史遵循肝脏疾病进展中不同水平的病毒复制和动态的几个临床阶段。4免疫耐受(IT)期的特征是血清HBV DNA高，但血清谷丙转氨酶(ALT)正常，肝组织基本正常。目前尚不清楚宿主在这一阶段是如何精确地建立和维持对病毒复制的免疫无知的。免疫活动期以肝坏死、肝纤维化和血清ALT水平波动为特征。在IA期，宿主免疫反应被认为是肝脏发病的原因。5 - 8只有少数CHB患者能够自行或通过抗病毒治疗实现HBsAg血清清除(定义为慢性消退(CR))。然而，与HBV不同阶段的建立、维持和过渡相关的潜在免疫机制仍不明确。
虽然通过研究外周血已经对HBV发病机制有了许多免疫学见解，但已经发现组织常驻免疫亚群在肝脏一线免疫监测中起着至关重要的作用。9日10例如，肝脏富含粘膜相关不变T细胞(MAIT)、自然杀伤细胞(NK)和独特的组织驻留CD8+ T细胞亚群。11日12由于在大多数hbv感染患者中无法进行肝脏采样，因此可以获得的信息有限。然而，单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术极大地促进了我们对肝脏生物学和疾病的理解。通过解剖细胞异质性，对肝脏分区和再生有了新的认识。13 - 15与HCC病理过程相关的多种新型细胞亚型16日至18日肝纤维化19日20以及代谢相关的脂肪肝21也被scRNA-seq识别出来。通过使用scRNA-seq对HBV感染的肝内免疫反应进行全面的研究仍然缺乏。
为了公正和全面地了解hbv感染患者的肝内免疫特征及其与疾病状态的联系，我们应用scRNA-seq构建了不同乙肝分期(IT、IA、AR、CR和健康对照(hc))肝脏和血液中免疫细胞的全面图景。精疲力尽的CD8+ T (Tex)细胞在IA期和AR期扩增，来源和细胞相互作用不同。我们的数据强调了T细胞和巨噬细胞的相互作用网络，有助于HBV持续期间的免疫失败，这可能用于指导免疫治疗的发展。
结果
hbv感染者的单细胞免疫图谱
为了更好地了解HBV感染个体内部和之间的异质性，我们应用scRNA-seq来表征IT、IA、AR和CR期个体的肝内免疫细胞以及外周血单个核细胞(pmcs)的转录组状态(图1一个而且在线补充图1A)。作为对照，我们分析了肝移植供者(hc)的外周血和正常肝组织。详细的临床和病理信息，包括诊断HBV的时间，HBsAg水平，HBV DNA水平，ALT和AST表1而且在线补充表1)。
肝脏和血液中免疫细胞的单细胞转录组图谱。(A)总体研究设计的实验方案图。收集肝免疫细胞和成对的pbmc，进行细胞条形码。分别构建5’-mRNA表达、TCR和BCR的cDNA文库，进行高通量测序和下游分析。(B) 23个个体的243000个单细胞的UMAP图，包括8个主簇和60个亚簇。(C)每个细胞簇中的基因表达热图。EXP, z分数归一化平均表达式。(D)显示组织分布和分期分布的主要细胞簇UMAP图。(E) Ro/ E评分估计的主要细胞簇的组织流行率。AR，急性恢复期; BCR, B-cell receptor; cDNA, complementary DNA; CR, chronic resolved; HC, healthy control; IA, immune active; IT, immune tolerant; NK, natural killer; PBMC, peripheral blood mononuclear cell; TCR, T-cell receptor; UMAP, uniform manifold approximation and projection.
此外，AR和CR患者的纵向信息见在线补充图1B, C．AR患者的采样时间点为恢复期，即初诊后HBsAg迅速下降的时间小于6个月(在线补充图1B，表1而且在线补充表1)。CR患者被诊断为有CHB史和HBsAg丢失，或自发或通过抗病毒治疗(在线补充图1C，表1而且在线补充表1)。
经过质量控制和过滤(在线补充图2A, B,在线补充表2)，我们从23个个体中获得了243000个单细胞转录组。鉴定出8种主要的细胞群，包括CD4+ T细胞(CD3D + CD4 +)、CD8+ T细胞(CD3D + CD8A +)、γδ T细胞(CD3D + TRDC +)、nkt样细胞(CD3E + KLRF1 +)、NK细胞(gn + NKG7 +)、B细胞(MZB1 + CD79A +)、浆B细胞(MZB1 + CD38 +)和骨髓细胞(LYZ + CD14 +) (图1 b)。总的来说，我们鉴定出10个CD4+ T细胞亚群，12个CD8+ T细胞亚群，9个γδ T细胞亚群，1个nkt样细胞亚群，7个NK细胞亚群，7个B细胞亚群，3个浆B细胞亚群和11个髓系细胞亚群(图1 b)。基于顶级差异表达基因(DEGs)，我们为60个聚类(图1 c而且在线补充表3)。
在疾病阶段，细胞簇表现出不同的组织来源和富集(图1 d，在线补充图3A, B,在线补充表2)。为了研究不同疾病阶段的独特免疫特征，我们分析了每个个体的免疫细胞组成。我们发现在IA期和AR期肝脏中CD4+和CD8+ T细胞都富集，这两个阶段的特征都是肝脏炎症水平升高。骨髓细胞在肝IT期和IA期优先富集，表明慢性HBV感染期间骨髓区室发生改变。CR期肝脏中γδ T细胞和B细胞增加，提示慢性感染对这些细胞的潜在长期影响类似于已解决的HCV感染。22日23日NK和nkt样细胞在HC和IT中富集(图1 e而且在线补充图3C)。值得注意的是，肝脏和血液中CD8+ T和骨髓细胞在疾病阶段的趋势是一致的(图1 e而且在线补充图3C)。这些结果表明hbv感染患者的每个疾病阶段都可能与独特的免疫特征相关。
hbv感染患者Tex扩增和MAIT细胞丢失
进一步的CD8+ T细胞聚类产生了12个亚簇，包括naïve (CD8T_c01-LEF1);中央存储器T (Tcm) (CD8T_c02-SELL, CD8T_c09-ACTN1和CD8T_c10-BACH2);最近激活的效应记忆或效应T (Temra) (CD8T_c03-CX3CR1);效应存储器(CD8T_c04-GZMK-SIRPG, CD8T_c05-GZMK-GPR183, CD8T_c06-GZMK-IFNG和CD8T_c07-GZMK-PDCD1);耗尽(CD8T_c08-LAYN);MAIT (CD8T_c11-SLC4A10);增殖子集(CD8T_c12-MKI67) (图2一个，在线补充图4A而且在线补充表3)。
CD8+ t细胞亚群的免疫学特征。(A) CD8+ t细胞亚群的UMAP图。(B) PAGA分析显示不同CD8+ t细胞亚群之间潜在的发育连通性。(C) RNA速度分析显示CD8+ t细胞亚群之间的转移潜力。(D)显示组织分布的CD8+ t细胞亚群UMAP图。(E)通过Ro/ E评分估计CD8+ t细胞亚群的组织患病率。(F)显示分期分布的CD8+ t细胞亚群UMAP图。(G)显示MAIT细胞在肝脏CD8+ T细胞中不同阶段的比例的箱线图。单侧未配对Wilcoxon检验。(H)显示比例的箱形图和显示不同阶段Tex细胞耗尽分数的小提琴图。 One-sided unpaired Wilcoxon test. (I) Clonal expansion and state transition of CD8+ T-cell subsets estimated by STARTRAC analysis based on all patients. (J) Box plots showing the expansion levels (STARTRAC-expa) of Temra and Tex subsets in IA and AR stages. One-sided unpaired Wilcoxon test. (K) Box plots showing the transition scores (STARTRAC-tran) between Tex and CD8T_c06-GZMK-IFNG and CD8T_c03−CX3CR1 in IA and AR stages. One-sided unpaired Wilcoxon test. (L) Box plots showing the migration scores (STARTRAC-migr) of the Tex subset between blood and liver in IA and AR stages. One-sided unpaired Wilcoxon test. AR, acute recovery; CR, chronic resolved; HC, healthy control; IA, immune active; IT, immune tolerant; MAIT, mucosal-associated invariant T; PAGA, partition-based graph abstraction; STARTRAC, single T-cell analysis by RNA sequencing and TCR tracking; Temra, recently activated effector memory or effector T; Tex, exhausted CD8+ T; UMAP, uniform manifold approximation and projection.
通过检查之前定义的特征基因，24我们观察到每个CD8+ t细胞亚群的不同功能状态，其中CD8T_c08-LAYN的衰竭评分最高(Tex)，效应记忆亚群和MAIT的炎症评分高，CD8_C03-CX3CR1的细胞毒性评分最高(Temra)， CD8T_c01-LEF1和两个中央记忆亚群(CD8T_c02-SELL和CD8T_c09-ACTN1)的naive评分高(在线补充图4B而且在线补充表4)。
为了了解CD8+ T细胞簇的潜在发育转变，我们应用基于分区的图形抽象(PAGA)分析构建了12个CD8+ T细胞簇的发育轨迹。25CD8T_c11-SLC4A10细胞作为一个不同的群体在轨迹之外脱颖而出，与MAIT细胞的注释一致。对于其他CD8+ t细胞子集，Tex (CD8T_c08-LAYN)和Temra (CD8_C03-CX3CR1)子集被描述为两个不同的分支(图2 b)。RNA速度分析进一步支持Tex和Temra的这些发育特征(图2 c)。26
CD8T_c01-LEF1、CD8T_c02-SELL、CD8T_c03-CX3CR1、CD8T_c05-GZMK-GPR183和CD8T_c09-ACTN1聚类主要来源于血液，CD8T_c04-GZMK-SIRPG、CD8T_c06_GZMK-IFNG、CD8T_c07-GZMK-PDCD1、CD8T_c08-LAYN、CD8T_c10-BACH2和CD8T_c11-SLC4A10聚类主要来源于肝脏(图2 d, E)。正如预期的那样，与血液富集的亚群相比，这些肝脏富集的细胞亚群表达了更高水平的肝脏驻留标记物，如CXCR6，CXCR3，CD69而且CD10315 20 27 28并展示了GZMB低- 2高表型29（在线补充图4C)。我们进一步比较了肝脏和血液中每个簇的转录特征。有趣的是，我们在肝脏亚群中发现了一系列普遍上调的基因趋化因子受体CXCR4在12个子集中出现次数最多(8次)，在线补充图4B)。据报道，CXCR4在肝内hbv特异性CD8+ T细胞上高水平表达，30.CXCL12/CXCR4通路参与了慢性HBV感染期间免疫细胞在肝脏中的募集和保留。31需要进一步的研究来阐明CXCR4在肝脏滞留中的意义。
12个CD8+ t细胞亚群表现出阶段性异质性(图2 f而且在线补充图5A, B)。在CD8+ T亚群中，所有四组hbv感染患者肝脏中的MAIT数量均显著下降，IA组最低(图2 g)。该结果与先前的一项研究一致，该研究报告了hbv相关HCC患者的肝脏MAIT细胞丢失。11值得注意的是，CR中MAIT细胞的频率未能恢复到HC的水平(图2 g)，虽然这些患者的HBsAg损失超过8个月，这表明HBV感染诱导的肝内MAIT损失是持久的。值得注意的是，IT、IA和AR患者CD8T_c08-LAYN细胞频率增加(图2 h)，其中IA患者的CD8T_c08-LAYN细胞也表现出最高的衰竭评分(图2 h)。值得注意的是，IA患者的CD8T_c08-LAYN细胞表现出较高的衰竭基因表达(如LAG3而且蕾)，而AR患者的细胞毒基因(如Gzmh, gzma, GZMB而且GZMK) (在线补充图6A)，提示细胞毒性CD8+ t细胞反应可能有助于控制HBV感染。
由于精疲力竭标志物在CD8+ T细胞中也通过T细胞受体(TCR)诱导的激活上调，也有可能来自AR的CD8T_c08-LAYN细胞被激活而不是精疲力竭，这让人想起在COVID-19患者中观察到的情况。32在转录水平上，AR细胞CD8T_c08-LAYN表现为典型的耗尽状态，其特征是高表达抑制标志物(托克斯，HAVCR2，LAG3，蕾，PDCD1而且TIGIT)和低表达效应标记(TBX21而且IFNG) (在线补充图6B)。此外，流式细胞术也验证了AR中耗尽的CD8+ T细胞的表型(在线补充图6C, D)。因此，在AR中，CD8T_c08-LAYN细胞代表了耗尽的簇，在其他组中也是如此。
为了进一步了解肝脏免疫细胞中CD8+ t细胞亚群的变化，我们还比较了不同阶段肝脏CD45+细胞中每个CD8+ t细胞簇的丰度(在线补充图5C)，证实IA和AR患者MAIT细胞的显著损失和CD8+ Tex细胞的显著扩增(在线补充图5A)。综上所述，这些结果表明，在慢性(IT和IA)和急性(AR) hbv感染患者中，肝脏中耗尽的CD8+ T细胞均扩增。
IA和AR患者Tex细胞的动力学差异
因为我们也从scRNA-seq (在线补充表5)，这使我们能够追踪T细胞的动态，如克隆扩增(expa)，迁移(migr)和发育转化(tran)，通过先前开发的生物信息学指标，即通过RNA测序和TCR跟踪(STARTRAC)指数(图2我)。33
STARTRAC-expa指数显示CD8T_c03-CX3CR1和CD8T_c08-LAYN表现出高度的克隆扩增，主要出现在AR期和IA期(在线补充图7A)。值得注意的是，CD8T_c03-CX3CR1在AR患者中扩增得更多，而CD8T_c08-LAYN在IA患者中扩增得更多(图2 j)。
starrac -tran分析表明，CD8T_c08-LAYN与GZMK+亚型CD8T_c07-GZMK-PDCD1、CD8T_c04-GZMK-SIRPG和CD8T_c06_GZMK-IFNG (在线补充图7B, C)。值得注意的是，与AR相比，IA中的CD8T_c08-LAYN与cd8t_c06_gzmkifng的连接更紧密，而与CD8T_c03-CX3CR1的连接则不那么紧密(图2 k)，提示IA和AR患者中CD8+ T细胞衰竭的来源不同。
总体而言，CD8T_c08-LAYN表现出适度的移动性，STARTRAC-migr分析显示(在线补充图7D)，与肿瘤的观察结果相似。29然而，与IA患者相比，AR患者中耗尽的T细胞表现出更高的starrac -migr评分(图2 l)。此外，我们发现与肝脏Tex细胞具有相同TCR克隆类型的细胞主要是CD8T_c03-CX3CR1和CD8T_c04-GZMK-SIRPG亚群(在线补充图7E)。
此外，CD8+ t细胞簇的RNA速度分析也证实了IA患者CD8+ Tex的强烈自我膨胀，IA患者肝脏Tem向CD8+ Tex的转变以及AR患者血液Tem向CD8+ Tex的转变(在线补充图8A, B)。IA和AR患者Tex的不同动态提示CD8+ T细胞在肝脏和血液之间的转移可能促进病毒清除，提示影响CD8+ T细胞功能和分化的因素在HBV感染中的重要作用。
IT和IA患者肝内调节性CD4+ T细胞增加
共鉴定出10个CD4+ T细胞簇，包括3个幼稚型(CD4T_c01-LEF1、CD4T_c05-CCR7和CD4T_c06-IFI44L)、中心记忆型(CD4T_c02-ANXA2)、效应型(CD4T_c03-GNLY)、2个调节型(CD4T_c04-FOXP3和CD4T_c09-CTLA4)、瞬态记忆型(CD4T_c07-TIMP1)、效应型记忆型(CD4T_c08-GZMK)和th1样(CD4T_c10-CXCL13) T细胞(图3一，在线补充图9A而且在线补充表3)。PAGA轨迹分析显示CD4+ T细胞有4种不同的命运，CD4T_c02-ANXA2, CD4T_c03-GNLY, CD4T_c04-FOXP3和CD4T_c06-TIMP1为不同的末端(图3 b)。效应子和调控子的发展方向也由RNA速度分析(图3 c)。发育轨迹与各种细胞簇的功能评分相关，CD4T_c08-CTLA4簇是最耗尽的，CD4T_c03-GNLY簇是最具细胞毒性的(在线补充图9B)。组织偏好分析显示CD4T_c05-CCR7、CD4T_c07-TIMP1、CD4T_c08-GZMK、CD4T_c09-CTLA4和CD4T_c10-CXCL13在肝脏中聚集，其余5个亚群主要存在于血液中(图3 d, E)。
CD4+ T细胞亚群的免疫学特征及其与CD8+ T细胞的相互作用(A) CD4+ t细胞亚群的UMAP图。(B) PAGA分析显示不同CD4+ t细胞亚群之间潜在的发育连通性。(C) RNA速度分析显示CD4+ t细胞亚群之间的转变潜力。(D)显示组织分布的CD4+ t细胞亚群UMAP图。(E)通过Ro/ E评分估计CD4+ t细胞亚群的组织患病率。(F)显示分期分布的CD4+ t细胞亚群UMAP图。(G)显示不同阶段CXCL13+ CD4+ T细胞在肝脏CD4+ T细胞中的比例的盒状图。单侧未配对Wilcoxon检验。(H)盒状图显示肝脏驻留Treg细胞在不同阶段的比例和小提琴图显示调节评分。 One-sided unpaired Wilcoxon test. AR, acute recovery; CR, chronic resolved; HC, healthy control; IA, immune active; IT, immune tolerant; PAGA, partition-based graph abstraction; Treg, regulatory T-cell; UMAP, uniform manifold approximation and projection.
然后我们比较了CD4+ T细胞亚群在CD4+ T细胞中的分量(图3 f而且在线补充图10A, B)或肝脏CD45+细胞(在线补充图10C)。在这些CD4+ T亚群中，AR患者肝脏CD4+ T细胞中CD4T_c10-CXCL13亚群富集(图3 g)和肝脏CD45+免疫细胞(在线补充图10C)。CD4T_c10-CXCL13细胞表现出t滤泡辅助细胞的转录特征(PDCD1，国际安全和发展理事会，TIGIT，TNFRSF4而且CXCL13,加) (在线补充图9A而且在线补充表3)，暗示了该亚群在使保护性b细胞免疫反应中发挥的潜在作用。此外，CD4T_c09-CTLA4，被称为肝脏居住调节性T细胞(Treg)亚群，在IT和IA患者的肝脏CD4+ T细胞中都有所增加(图3 h)或肝脏CD45+免疫细胞(在线补充图10C)。此外，CD4T_c09-CTLA4细胞在不同阶段的调节效应评分分析显示，IT和IA患者的调节效应功能水平较高(图3 h)。这些结果提示Treg细胞的免疫调节可能与CHB的免疫耐受和病毒持久性有关。
Treg和Tex细胞之间潜在的细胞-细胞相互作用
使用细胞空间组织映射器(CSOmap)，34一种生物信息学工具来推断组织的空间组织和细胞相互作用的分子决定因素，我们估计了CD4+ t细胞和CD8+ t细胞亚群在计算构建的伪空间中的细胞相互作用潜力。在IT期和IA期，Treg (CD4T_c09-CTLA4)和Tex (CD8T_c08-LAYN)之间存在显著的相互作用(图4一而且在线补充表6)。值得注意的是，在IT和IA患者的肝脏中Tex和Treg协调扩张(图2 h)。我们通过多色免疫组化(IHC)染色进一步证实IT和IA患者中Tex (CD8+PD-1+)和Treg (CD4+FOXP3+)细胞之间的相邻空间关系(图4 b而且在线补充图11)。
肝脏Treg和Tex细胞的多色免疫组化染色。(A) CSOmap分析显示CD8+ t细胞和CD4+ t细胞亚群之间的相互作用。(B) HC、IT、IA和AR组肝脏多色IHC染色。为每组显示一个代表性的图像。白色实箭头表示Tex细胞，白色实箭头表示Tregs细胞，黄色实箭头表示CD4 +PD1+细胞。比例尺，50µm。(C)显示L-R对在IT期和IA期对Tex和Treg相互作用亲和力的贡献的箱线图。单侧未配对Wilcoxon检验。(D)气泡热图显示Treg和Tex细胞之间所选的L-R对。AR，急性恢复期; CR, chronic resolved; CSOmap, cellular spatial organisation mapper; HC, healthy control; IA, immune active; IHC, immunohistochemistry; IT, immune tolerant; L-R, ligand–receptor; Tex, exhausted CD8+ T; Treg, regulatory T-cell.
然后，我们比较了IT和IA患者中促成Treg-CD8 Tex相互作用的潜在配体-受体(L-R)对的强度。我们发现CD44_VIM、HLA-B_CANX、TNFRSF1A_LTB和CD74_APP这几个L-R对在IT期表现出较高的相互作用电位，而HLA-A_APLP2、KLRD1_HLA和KLRD1_HLA- e在IA期表现出较高的相互作用电位(图4 c, D)。最近有报道称HLA-B_CANX轴能够抑制T细胞的抗肿瘤免疫。35由VIM基因编码的Vimentin是Treg活性的关键代谢和功能控制器，36CD44免疫检查点控制CD8+ t细胞的激活。37此外，HLA-E_KLRD1信号参与介导慢性HBV和HCV感染中的t细胞功能障碍和病毒持久性。38 39总之，这些数据为今后关于CHB的免疫发病机制和治疗尝试的功能验证研究提供了有价值的信息。
hbv感染患者肝内骨髓细胞及其与T细胞的相互作用
基于典型细胞标记(图5一个，在线补充图12A, B,在线补充表3)。dc进一步分为两个经典的cDC亚群(CLEC9A+cDC1和CLEC10A+cDC2)、成熟的cDC亚群(cDC2- lamp3)、增殖亚群(cDC2- mki67)和pDC。所有5个DC亚型均主要存在于肝脏(图5 b, C)，并在IT患者(图5 d, E)，这表明这些细胞可能是由IT患者的高水平病毒复制所驱动的。巨噬细胞进一步分为macro_c01-C1QC、macro_c02-NLRP3和macro_c03-FCGR3A。与dc相似，巨噬细胞亚群也主要分布在肝脏(图5 b, C)。在5组患者中，macro_c01-C1QC和macro_c03-FCGR3A在IT患者肝脏CD45+细胞中明显扩增(图5 f)。
髓系细胞亚群的免疫学特征及其与T细胞的相互作用。(A)髓系细胞亚群的UMAP图。(B)显示组织分布的髓系细胞亚群UMAP图。(C)通过Ro/e评分估计骨髓细胞亚群的组织患病率。(D)显示分期分布的髓细胞亚群UMAP图。(E)显示DC亚群在肝脏CD45+细胞各阶段的比例的箱线图。单侧未配对Wilcoxon检验。(F)显示肝脏CD45+细胞中巨噬细胞亚群在不同阶段的比例的盒状图。单侧未配对Wilcoxon检验。(G) Kupffer评分和MoMF评分定义的巨噬细胞点图。 (H) Violin plots showing the functional scores (phagocytosis, proinflammatory, regulation of T-cell activation) of macrophage subsets across stages. One-sided unpaired Wilcoxon test. (I) CSOmap analysis showing the interaction between macrophage and T-cell subsets. (J) Bubble heatmap showing the selected ligand-receptor pairs between FCGR3A+ macrophage and Treg or Tex cells. AR, acute recovery; CR, chronic resolved; CSOmap, cellular spatial organisation mapper; DC, dendritic cell; HC, healthy control; IA, immune active; IT, immune tolerant; Tex, exhausted CD8+ T; Treg, regulatory T-cell; UMAP, uniform manifold approximation and projection.
为了了解巨噬细胞亚群的起源，我们根据所报道的标记物定义了关于Kupffer来源(Kupffer评分)或单核细胞来源的巨噬细胞(MoMF评分)的评分(在线补充表4)。基于Kupffer/单核细胞起源相关基因的表达分析并不能完全解释巨噬细胞的异质性(图5克，在线补充图12C, D,在线补充表4)。进一步比较巨噬细胞群体间的deg，发现macro_c01-C1QC表达了高水平的补体C1Q基因和HLA II类分子，提示其具有吞噬能力(图5 h)和抗原呈递(在线补充图12E而且在线补充表4)。Macro_c02-NLRP3表达高水平的促炎基因，如S100基因，IL1B，VCAN而且LYZ（在线补充图12E而且在线补充表3)，其特点是促炎评分高(图5 h)。Macro_c03-FCGR3A表达高水平抗病毒ISGs (IFITM2，IFITM3，SPN)，战争而且CTSC)和免疫调节基因(SOD1，MT2A，LST1，林恩，MTSS1，PECAM1，LILRB2而且LILRA5) (在线补充图12E而且在线补充表3)，表现出高促炎评分和高抑制t细胞活化的能力(图5 h)。
为了解剖巨噬细胞和T细胞之间潜在的串扰，我们使用CSOmap来推断巨噬细胞亚群和T细胞之间的细胞-细胞相互作用。引人注目的是，CSOmap分析显示macro_c03-FCGR3A在两个慢性期(IT和IA)中主导与T细胞的相互作用，在两个解决期(AR和CR)中这种相互作用强度下降，而macro_c02-NLRP3在解决期中主导与T细胞的相互作用(图5我)。通过检测macro_03-FCGR3A和CD8T_c08-LAYN之间的L-R对相互作用，HLA I类分子(HLA-I)和白细胞免疫球蛋白样受体(LILR)家族之间的几个L-R对表现出强烈的潜在相互作用(图5 j)。我们一致地观察到，在IT和IA患者的肝脏中，与Tex细胞相邻位置的lilrb2阳性巨噬细胞富集(图6)。这些潜在的相互作用可能是功能性的，考虑到先前的研究发现，LILRB1和LILRB2可以通过与CD8+ T细胞竞争HLA-I结合，以及通过其基于酪氨酸的免疫受体基元募集抑制分子，从而促进肿瘤微环境中的免疫逃避。40综上所述，这些结果表明FCGR3A+巨噬细胞在CHB中调节t细胞反应的核心作用，可能是通过HLA-I_LILRB信号通路。
IT、IA和AR组肝脏中Tex细胞和巨噬细胞的多色IHC染色。hbv感染者肝脏的多色免疫组化染色为每组显示一个代表性的图像。比例尺，50µm。AR，急性恢复期;IA，免疫活性;包含IHC,免疫组织化学;IT，免疫耐受;Tex，耗尽的CD8+ T。
肝脏免疫亚群与临床参数的相关性
为了了解HBV感染患者肝脏免疫亚群与临床参数的关系，我们在所有17例HBV感染患者中应用了细胞频率与HBsAg、HBV DNA、ALT、AST水平以及组织学分级和分期的相关性分析。年龄和诊断后的时间也包括在分析中，以排除受这两个参数影响的因素(在线补充图13)。
有趣的是，ALT水平与MAIT细胞频率呈负相关，与肝脏中CD8+ Tex、Treg和CD4T_c10-CXCL13频率呈正相关(图7而且在线补充图13)，提示这些细胞亚群可能是肝损伤的关键执行者或反应者。此外，肝脏CD45+细胞中NK_c03-PTGDS和pDC的频率也与ALT水平呈负相关(在线补充图13)。我们一致地观察到，与ALT相比，AST水平与肝脏免疫亚群的相关性具有相似的模式(在线补充图13)。
hbv感染者肝内免疫特征与临床参数的关系(A) hbv感染者肝脏CD45+细胞亚群组成与ALT水平的相关性。(B) hbv感染患者肝脏CD45+细胞亚群组成与肝活检组织学分级的相关性。(C) hbv感染者肝脏CD45+细胞亚群组成与血清HBsAg水平的相关性。(D)血液和肝脏之间免疫亚群的相关性。(E)小提琴图显示每个CD8+ t细胞亚群中指示基因的表达水平。(F)各阶段血液中CX3CR1+GNLY+ Temra或Tcm细胞在CD8+ T细胞中的频率点图。单侧未配对Wilcoxon检验。谷丙转氨酶;AR，急性恢复期; CR, chronic resolved; HbsAg, HBV surface antigen; HC, healthy control; IA, immune active; IT, immune tolerant; PBMC, peripheral blood mononuclear cell; Tcm, central memory T; Temra, recently activated effector memory or effector T.
与ALT相似，MAIT细胞与肝活检组织学分级评分呈负相关，CD8+ Tex与肝活检组织学分级评分呈正相关(图7 b)。此外，组织学分级与CD8T_c05-GZMK-GPR183的频率呈正相关，与plasmaB_c01-SDC1和两个髓系亚群(cDC1和macro_c03-FCGR3A)呈负相关(图7 b而且在线补充图13)。而肝脏CD45+细胞中CD8T_c05-GZMK-GPR183的表达频率仅与组织学分期呈正相关(在线补充图13)。
然后我们评估了肝内免疫亚群与血清HBsAg和血清HBV DNA水平的关系。血清HBsAg水平与macro_c03-FCGR3A、macro_c02-NLRP3、cDC-LAMP3、cDC-MKI67频率呈正相关(图7 c)。HBV DNA水平与肝脏CD45+细胞中NK_c07-MKI67、CD4T_c08-GZMK、pDC频率呈正相关(在线补充图13)。
综上所述，这些结果表明，IT患者中大量的HBV DNA和HBsAg可能与髓样室的改变有关，而IA和AR患者的肝损伤可能与t细胞功能障碍密切相关。这一观点与最近的研究结果一致，即HBsAg对人体内病毒特异性或全局T细胞的影响最小41 42或者动物模型。43
为了分析血液和肝脏之间是否存在协调的免疫变化，我们对17例hbv感染患者的血液和肝脏之间所有已确定的免疫亚群进行了相关分析。在60个亚群中，CD8T_c03-CX3CR1、CD8T_c09-ACTN1、CD8T_c12-MKI67和plasmaB_c03-MKI67 4个亚群与血液和肝脏的相关性显著(图7 d而且在线补充表7)。肝内免疫细胞亚群在不同阶段发生显著变化，如MAIT、Treg和CD8+ Tex，在血液中几乎找不到(图7 d)。值得注意的是，CD8T_c03-CX3CR1和CD8T_c09-ACTN1的频率均与血液和肝脏呈正相关(图7 d)。CD8T_c03-CX3CR1(类似Temra)和CD8T_c09-ACTN1(中医子集)细胞均表现出相似的功能特征，包括低衰竭和高细胞毒性水平(图7 e而且在线补充图7A, B)。循环的CX3CR1+CD8+ T细胞最近被确定为癌症检查点治疗反应的预测因子。44通过使用额外的验证队列(在线补充表1)，我们证实了CX3CR1+GNLY+ Tcm细胞(CD8T_c09-ACTN1细胞的潜在替代品)在AR患者血液中优先扩增(图7 f而且在线补充图14)。CX3CR1+GNLY+ CD8+Tcm细胞在HBV治愈中的可能作用有待进一步研究。
讨论
在本研究中，我们利用scRNA-seq在急性或慢性HBV感染患者中以单细胞分辨率生成肝脏和外周免疫微环境的综合免疫景观。该研究结果不仅有助于进一步了解人类HBV感染不同阶段的HBV发病机制，而且有助于发现新的免疫靶点或开发新的治疗策略，以临床治愈CHB。
我们的数据为hbv感染患者的免疫特征提供了一个公正的说明(在线补充图15)。具体而言，IT患者的特征是MAIT细胞减少，肝脏中Treg和Tex增加。这些变化在IA患者中更为明显，并与肝脏炎症有关。值得注意的是，Tex、Treg和FCGR3A+巨噬细胞亚群在IT期和IA期表现出强烈的相互作用。这些改变可能共同促进免疫耐受和病毒持久性。急性HBV感染方面，AR患者也有Tex扩增，但来源与IA患者不同。重要的是，我们发现肝脏中的这种免疫改变很难同时在血液中观察到，这突出了评估感染部位划分的免疫变化的要求。最近的几项研究建议使用细针抽吸和流式细胞术来分析肝脏中的局部免疫细胞，45 46显示出良好的临床操作性。我们的数据提供了对肝脏免疫学的深入了解，并可能成为未来药物发现的重要资源。
目前的指南建议对IT患者进行观察，而不是积极治疗。47-49然而，人们逐渐认识到，至少在一些it患者中，可能存在深刻的免疫改变，这随后可能与疾病进展有关。例如，在IT患者中，NK细胞和T细胞都有功能受损。50我们的研究深刻地强化了这一观点，并强调了IT患者肝脏中MAIT、Treg、Tex和髓系亚群的协调失调，这先于转氨酶升高和组织学改变。因此，我们建议在决定在IT期开始抗病毒治疗时考虑免疫学参数。
本研究揭示了IA期和AR期免疫特征的明显差异，分别代表“不充分反应”和“成功反应”。首先，IA期和AR期肝脏Tex细胞扩增来源不同。具体而言，AR患者肝内Tex细胞来源于外周CX3CR1+ Temra细胞，IA患者则没有。此外，AR中CX3CR1+GNLY+ Tcm细胞比IA表现出更强的扩增，在肝脏和血液中均一致，提示CX3CR1+GNLY+ Tcm细胞可能作为预测HBV清除的候选标记物。其次，IA和AR的Tex细胞表现出不同的细胞相互作用模式。特别是在IA中，Tex与Treg和FCGR3A+巨噬细胞的相互作用比在AR中更明显，提示这些细胞-细胞通信在形成CHB中CD8+ t细胞功能障碍和病毒持久性方面的潜在作用。此外，一些L-R对，如HLA-B_CANX和RPS19_C5aR1，分别可能参与介导Tex细胞与Treg和/或FCGR3A+巨噬细胞的相互作用。第三，CD4T_c09-CXCL13子集优先在AR中扩展。CD4T_c09-CXCL13被引用为产生cxcl13的PD-1嗨CXCR5−(tfh样或外周辅助)CD4+ t细胞簇，首次在类风湿性关节炎的滑膜组织中被描述，51促进三级淋巴样结构的形成和b细胞反应。52 53综上所述，IA型活动性肝炎和AR型活动性肝炎背后的不同免疫特征可能有助于了解各种临床情况下的活动性肝炎，包括治疗中发作、治疗停药发作、免疫抑制治疗的再激活发作等，并进一步优化管理。
总之，我们的研究揭示了HBV感染不同阶段免疫细胞的肝内格局。尽管样本量小、缺乏肝细胞和CD45阴性非实质细胞的横断面设计存在局限性，但我们的数据将作为丰富的资源，更深入地了解HBV感染中的免疫反应，并可能为开发新的HBV治愈免疫治疗策略提供有价值的见解。
方法
研究对象
本研究招募了中国人民解放军总医院第五医学中心的慢性乙型肝炎患者和HBV感染已治愈的患者。根据2017年欧洲肝脏研究协会指南，患者被分为HBV感染的不同临床阶段，49它考虑了HBeAg、HBV DNA水平、转氨酶水平(ALT和AST)以及是否存在肝脏炎症。入选急性HBV患者的时间窗口为“刚刚达到或即将达到HBsAg阴性”(在线补充图1B)，使我们能够观察对HBV的持续免疫反应，具有较好的肝活检安全性。如果患者怀孕或同时患有丙型或丁型肝炎病毒、HIV感染、威尔逊氏病、自身免疫性肝炎、原发性胆管炎、非酒精性脂肪性肝炎、大量饮酒或有HCC史，则不纳入研究。对照肝组织取自天津市第一中心医院器官移植科认为可接受肝移植的已故捐赠者的肝脏。入选受试者的基本特征列于表1而且在线补充表1．
样品采集和细胞分离
根据制造商的说明，使用histoque -1077 (Sigma-Aldrich)溶液分离pbmc。简单地说，术前在EDTA抗凝管中收集2 mL新鲜外周血，随后分层到histopque -1077上。离心后，免疫细胞保持在血浆-组织aque -1077界面，并被转移到新的试管中，使用磷酸盐缓冲盐水(PBS) (Gibco)洗涤两次。用红细胞裂解缓冲液(Miltenyi Biotec)在冰上处理细胞1~2分钟。洗涤两次后，将细胞球重新悬浮在荧光激活细胞分选(FACS)缓冲液(PBS添加2%胎牛血清(FBS))中，大约浓度为106细胞/毫升。
经超声引导下21G针经皮肝活检取肝组织样本，按前文所述处理。16简单地说，将组织在rmi -1640培养基(Invitrogen)和10%胎牛血清(ScienCell)中切成小块，并根据制造商的说明，在37°C的转子上用MACS肿瘤分离试剂盒(Miltenyi Biotec)进行酶消化60分钟。然后用APC抗人CD45抗体(克隆HI30, BioLegend)和7-AAD (ThermoFisher)染色细胞。活CD45+细胞用BD FACSAria III仪器(BD Biosciences)分选到0.2 mL低结合管(Eppendorf)中。流式细胞仪分选的代表性图像见在线补充图1A)。细胞利用率一般在90%以上，CD45+部分的百分比在60% ~ 80%左右。
文库制备与测序(10× Genomics)
按照制造商的协议，使用10× Chromium单细胞5 '和VDJ Library construction Kits V.1.1 (10× Genomics, Pleasanton)进行文库构建。使用Illumina Hiseq 4000测序仪对纯化文库进行分析，配对端reads为150 bp。
单细胞RNA-seq数据处理
利用10× Genomics提供的Cell Ranger工具箱V.3.1.0，比对从10× Genomics官网下载的参考基因组GRCh38，生成基因-细胞唯一分子标识符(UMI)矩阵。对于每个细胞，我们量化了基因和UMIs的数量，并保留了检测到600 - 10,000个基因且线粒体基因计数不超过10%的高质量细胞。54
特征基因的无监督聚类分析与鉴定
为了全面分配细胞簇，我们对大多数细胞类型进行了三轮聚类。每一轮聚类都从一个原始计数矩阵开始。使用Scanpy V.1.4.3，我们将原始计数归一化，并将其转换为对数刻度。使用该函数选择高度可变的基因sc.pp.highly_variable_genes参数“batch_key”设置为患者ID。然后计算主成分分析(PCA)矩阵，使用前50个PCA分量，使用BBKNN算法构建批量平衡k近邻图。55调整批效应后，采用Leiden算法进行细胞簇识别。56使用扫描功能识别degsc.tl.rank_genes_group参数' use_raw=True '基于集群。
基于每个聚类的deg，第一轮聚类确定了主要的细胞类型，如T细胞、NK细胞、B细胞、髓系细胞和非免疫细胞。在每个主要细胞类型中进行额外一轮聚类。以相对大的分辨率(2-10)提取各主要细胞类型的细胞并聚类。产生的簇中有超过10%的细胞双态分数大于0.5(由Scrublet定义)57)被标记，并通过规范标记的表达进一步检查。来自标记群集的细胞，如果它们表达超过一组标准标记，将被识别为双态。然后排除了双重细胞和非免疫细胞，得到243000个细胞用于进一步分析。然后进行第三轮聚类，以识别细胞的亚型，在每个主要类型的细胞中遵循与第一轮类似的过程。对于cDC2细胞，还进行了第四轮聚类以研究详细状态。
降维
为了可视化，使用Barnes-Hut t分布随机邻域嵌入或均匀流形近似和投影(UMAP)进一步降低了每个数据集的维数修拉58功能RunTSNE而且RunUMAP在R和scanpy59功能工具包sc.pl.umap而且sc.pl.tsne在Python。用于计算嵌入的主成分与用于聚类的主成分相同。
TCR/ b细胞受体(BCR)分析
TCR/BCR-seq测序数据使用Cell Ranger vdj管道处理，GRCh38为参考。在所有组装的TCR/BCR contigs中，我们首先丢弃了低置信度、非生产性或UMIs<2的contigs。对于组装了两条或两条以上α或β链的T细胞，显示最高表达水平(UMI)的α -β对被定义为相应T细胞中的显性α -β对。如果两个或两个以上的细胞具有相同的显性α -β对，则显性α -β对被鉴定为克隆TCRs，这些T细胞被鉴定为克隆T细胞。为了整合TCR结果与基因表达数据，基于TCR的分析仅对被鉴定为T细胞的细胞进行。
应用类似的方法来鉴定BCR克隆。对于组装了两条或两条以上重或轻(kappa或lambda)链的B细胞，表达水平最高的重轻链(UMI)被定义为显性重轻对。
然后使用TCR克隆信息和细胞簇注释进行STARTRAC分析，如前所述。33简而言之，分别使用STARTRAC指数STARTRAC-expa、STARTRAC-migr和STARTRAC-tran来测定t细胞簇的克隆扩增、迁移和转化程度。有关详情，请浏览网页(https://github.com/Japrin/STARTRAC)。
细胞-细胞相互作用CSOmap分析
CSOmap34用于构建三维(3D)伪空间，并基于我们的scRNA-seq数据计算细胞-细胞相互作用。对于每个样本，分别应用CSOmap，根据相应的scRNA-seq数据重建细胞空间组织。然后，基于CSOmap生成的三维坐标，计算细胞间的距离矩阵。一对细胞之间的距离越短，表示细胞在三维空间中的位置越近。进一步构建细胞簇的连接矩阵，将特定对细胞簇的连接定义为属于特定细胞簇且其距离小于CSOmap根据细胞邻居中位数估计的截止点的细胞对数目。对于一个簇对，进一步计算归一化连接，将其对应的连接值除以它们各自的细胞数的乘积，然后乘以10000，以消除不同细胞簇的细胞数可能带来的偏差。同时，为了突出细胞相互作用的关键L-R对，我们还利用CSOmap提供的功能检测了每个L-R对对细胞-细胞亲和力估计的贡献。在分析过程中，MATLAB和R版本(https://github.com/lijxug/CSOmapR)。
功能评分的定义
为了说明每种细胞类型的功能特性，我们从文献中收集了一组基因，并计算了每种细胞的功能评分。对于T细胞，衰竭相关基因和天真相关基因定义为Guo等24；效应基因从Herbst中提取等60；炎症基因先前在Spranger中被定义等61；调控基因来自Zemmour等．62对于巨噬细胞，Kupffer评分和MoMF评分的基因来自Guillot，等，63从中提取了吞噬和促炎基因。14日14每个分数被定义为功能相关基因的平均表达(用z分数归一化)。每个分数的基因都列在在线补充表4．
组织富集分析
为了量化不同组织中免疫细胞类型的富集，我们根据以下公式比较了每个组织中每个簇的观察到的和预期的细胞数量，正如我们之前描述的那样:24 33Ro/e=(观察到的/预期的)，其中通过卡方检验计算给定组织中免疫细胞簇的预期细胞数。我们假设Ro/e>1在特定组织中富集了一个簇。采用Fisher精确检验和Bonferroni方法调整p值，以获得的显著性水平在线补充图3C．
细胞类型比例与临床特征的相关性
我们通过拟合线性模型来研究细胞类型比例与临床特征之间的关系。以细胞类型比例为预测因子，以临床特征值为响应变量，利用R函数对每种细胞类型和每种临床特征进行线性拟合lm．输出系数为'的电池类型公关(t >)' <0.05被认为是显著的。
流式细胞分析
用于表型染色图6 e，在4°C下，用一抗对pmcs进行细胞外染色，特异性检测表面标志物30分钟。然后用FACS缓冲液清洗细胞。对于随后的细胞内染色，根据制造商的说明，使用eBioscience渗透/固定试剂盒对细胞进行渗透、固定和染色。然后细胞在4°C下与抗体孵育30分钟，用于细胞内抗原的特异性检测。所使用的抗体和试剂的信息列于在线补充表8．使用BD Canto II流式细胞仪(BD Biosciences)和FlowJo软件(BD Biosciences)对样品进行流式细胞仪分析。
用于流式细胞谱分析在线补充图6B, C，将冷冻保存的pmcs解冻并在含有10% FBS的RPMI 1640培养基中37℃孵育3小时。然后将pmcs在PBS中洗涤两次，并在Fc块和True Stain Monocyte Blocker中室温孵育5分钟。在室温下固定和渗透30分钟后，用表面抗体在4℃下染色15分钟，用Brilliant Buffer Plus (eBioscience)在4℃下染色30分钟。抗体的信息列在在线补充表8)。数据在五激光极光光谱流式细胞仪(Cytek)上获得，然后使用FlowJo软件V.10.8.1 (BD Biosciences)进行分析。用于UMAP生成和可视化在线补充图6B， 1例IA、1例AR和1例CR患者的FCS文件用于下游分析。首先，使用FlowAI插件删除异常事件。使用DownSample插件将每个样本中的CD8+ T细胞随机下采样至10万个细胞，并将所有下采样的CD8+ T细胞连接到单个FCS文件中。使用UMAP插件来计算UMAP坐标(有15个邻居，公制=欧里得和最小距离=0.5作为默认参数)。然后在同一数据集上并行使用FlowSOM插件来创建一个自组织映射(使用n=12个集群作为默认参数)。按照常规门控策略对细胞群进行标注，并按指示进行颜色编码。
多色包含IHC
新鲜组织用4%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋。根据制造商的方案，使用PANO 7-plex IHC Kit (cat#0004100100, Panovue)进行多重免疫荧光染色。简而言之，组织切片(4µm)在60°C下熔化1小时，然后脱亲和再水化。热介导抗原在柠檬酸缓冲液(pH值6.0)中进行微波孵卵。在室温下用阻断缓冲液孵育10 min后，用CD4 (ZM0418, Zsbio)、CD8 (CST70306, CST)、FOXP3 (BLG320202, BioLegend)、PD-1 (CST43248, CST)、CD68 (CST76437, CST)、LILRB2 (AF2078, R&D)、HLA-B (17 260-1-AP, ProteinTech)等不同一抗孵育切片。切片用抗兔或抗小鼠辣根过氧化物酶偶联二抗在室温下孵育10分钟。染色信号用酪胺信号放大试剂(0004100100,Panovue)进一步放大。最后用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色细胞核。染色切片用Mantra System (PerkinElmer)扫描。
数据可用性声明
如有合理要求，可提供资料。与本研究相关的所有数据均包含在文章中或作为补充信息上传，除本文报道的单细胞RNA测序原始数据外，可在基因表达Omnibus (GSE182159)和基因组序列档案(https://ngdc.cncb.ac.cn，注册编号HRA001730)。
伦理语句
患者发表同意书
伦理批准
本研究涉及人类受试者，由中国人民解放军总医院第五医学中心(编号2018-006-D)伦理审评界批准。参与者或其监护人在参与研究前给予书面知情同意。
致谢
感谢北京大学BIOPIC高通量测序设备和北京大学生命科学中心计算平台的贡献。我们感谢栾俊卿(中国人民解放军总医院)和王鑫(天津第一中心医院)对病人的管理。我们感谢周春宝(中国人民解放军总医院)对FACS的技术支持。
参考文献
补充材料
脚注
CZ, JL和YC是共同第一作者。
ZZ, XR和F-SW是联合资深作者。
调整通知这篇文章在Online First发表后已被更正。补充图文件已经替换完成。
贡献者F-SW作为担保人对整体内容负责。F-SW, ZZ和XR构思并指导了这项研究。CZ、YC、FM、J-WS、XF、HF、JL、S-YW、Y-JF、XH进行样品制备、文库构建和数据生成。JL在XR和ZZ的指导下进行了生物信息学分析，CZ、JL和XR撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。
资金国家自然科学基金(no . 81721002, no . 32 022 016, no . 82130019)，中国人民解放军总医院优秀青年培养基金(no . 2019-JQPY-009)和国家重点研发计划(no . 2019YFC0840704)资助。
相互竞争的利益ZZ是分析生物科学的创始人和InnoCare的顾问。所有经济利益均与本研究无关。其余作者声明没有竞争利益。
患者和公众参与患者和/或公众未参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
补充材料此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。