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摘要
客观的特发性帕金森病(PD)的特征是中脑α -突触核蛋白(aSyn)聚集和多巴胺能神经元死亡。最近的证据表明,PD可能是由肠道内的微生物或其毒素引发的,这些微生物或毒素促进了最终影响大脑的慢性肠道炎症。在这项工作中,我们试图证明微生物毒素β-的影响N肠道中的-甲氨基- l -丙氨酸(BMAA)可能会引发一些PD病例,这尤其令人担忧,因为这种毒素存在于某些食物中,但没有受到公共卫生当局的常规监测。
设计为了验证这一假设,我们用BMAA处理了野生型小鼠、原代神经元培养物、细胞系和分离的线粒体,并分析了BMAA对肠道微生物群组成、屏障通透性、炎症和aSyn聚集以及大脑炎症、多巴胺能神经元损失和运动行为的影响。为了进一步研究线粒体的关键作用,我们还确定了BMAA对线粒体功能和炎症小体激活的具体影响。
结果BMAA诱导调节肠道免疫的节段性丝状细菌(SFB)的广泛消耗,从而引发肠道生态失调、免疫细胞迁移、肠道炎症增加、屏障完整性丧失和aSyn的尾-口侧进展。此外,BMAA诱导在体外而且在活的有机体内心磷脂暴露引起的线粒体功能障碍和神经元先天免疫的激活。这些事件引发了神经炎症、多巴胺能神经元损失和运动缺陷。
结论综上所述,我们的研究结果表明,长期暴露于膳食BMAA可以引发一系列事件,概括了PD病理从肠道到大脑的进化,这与“肠道优先”PD一致。
- 肠屏障功能
- 肠道炎症
- 肠道细菌
- 神经生物学
数据可用性声明
如有合理要求,可提供资料。支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。
这是一篇开放获取的文章,根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布,该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建,并以不同的条款许可其衍生作品,前提是正确引用原始作品,给予适当的荣誉,任何更改都已注明,并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/.
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
帕金森病(PD)是一种多因素疾病,其特征是前驱期长,至少在某些情况下包括胃肠道症状。
在PD患者中发现了肠道生态失调与疾病进展之间的直接相关性。
在特定人群中,BMAA的长期饮食暴露被认为是肌萎缩性侧索硬化症/帕金森-痴呆复合体的原因。
BMAA靶向半胱氨酸-谷氨酸反转运蛋白编码SLC7A11(溶质载体家族7成员11),该基因在PD中的启动子高甲基化与反转运子表达下调相关,与与PD风险相关的环境暴露一致。
新的发现是什么?
在活的有机体内BMAA给药使回肠中'CandidatusArthromitus’,一组调节小鼠肠道粘膜免疫稳态的细菌,导致肠道炎症增加,肠道屏障完整性破坏和肠道异步聚集。
BMAA特异性靶向中脑线粒体,诱导其碎片化和心磷脂暴露,从而激活先天免疫反应,如nod样受体3激活和aSyn聚集。
肠道炎症增强了血脑屏障通透性和神经炎症,最终导致黑纹状体神经元损伤和pd样运动功能障碍。
本研究的意义
在可预见的未来,它会对临床实践产生怎样的影响?
这项工作通过建立长期饮食摄入环境微生物毒素与帕金森病特征之间的直接联系,产生了最前沿的知识。本文所确定的食源性BMAA的特定抗生素作用,以及已证实的肠道失调是引发一系列事件的触发器,最终在大脑中达到高潮,这将对修订食品安全指南以监测和控制这种食物毒素产生决定性的公共卫生影响。这为消化病学和神经病学学科之间的新的双向协同作用带来了前所未有的机会,为帕金森病的预防或早期诊断开辟了新的创新可能性。
简介
特发性帕金森病(PD)是一种与年龄相关的神经退行性疾病,其特征为运动症状,如震颤、姿势不平衡、运动迟缓和僵硬。1 2先前的非运动特征还包括嗅觉丧失和胃肠道功能障碍。3.出现在前驱期的便秘被认为是发展帕金森病的危险因素。3.组织病理学的后期帕金森病的特征是存在含有α-突触核蛋白(aSyn)的不溶性纤维聚集体,称为路易体和路易神经突,以及黑质致密部多巴胺能神经元的损失。1在胃肠道和由迷走神经支配的器官中也可发现聚集的aSyn4个5在被检测到涉及中枢神经系统(CNS)之前的几年到几十年。这些观察结果使一种假说得以形成,即微生物或其产物可以通过迷走逆行轴突运输从肠道进入大脑。6这一假设在接受完全截尾迷走神经切断术的人的数据中得到了间接支持,这些人患帕金森病的风险似乎较低。7此外,某些微生物产物出现在一个非生物肠道已被提出触发aSyn过表达和聚集。8,9帕金森病患者和健康对照组的粪便和粘膜相关肠道菌群不同,10但功能解释仍然存在争议。11PD患者的肠道生态失调与肠道炎症相关,从促炎细胞因子的上调推断。12日13在小鼠中,肠道稳态是由组织驻留的T辅助性17 (Th17)细胞维持的,这些细胞对共生粘膜相关节段性丝状细菌(SFB)做出反应而分化。Candidatus,在屏障完整性保护中发挥重要作用。14日15SFB粘附在上皮细胞上的信号是血清淀粉样蛋白A的释放,作用于CD11c+固有层细胞刺激白介素(IL)-6和IL-23的产生和释放,从而刺激Th17细胞的分化和激活。组织稳态肠道Th17细胞释放的IL-17向上皮细胞发出信号,使其产生抗菌肽和紧密连接蛋白。15然而,肠道生态失调也可能通过保护微生物(小鼠SFB)的侵蚀或病原体的增殖诱导非常驻Th17细胞,驱动具有外周效应的促炎细胞因子的产生。14最近的数据显示,炎症性肠病患者患帕金森病的风险可能明显更高。16尽管帕金森病常与肠屏障渗漏有关,17 18肠道生态失调破坏屏障完整性的机制仍不完全清楚。越来越多的证据表明,一些肠道微生物产生的毒素可能会影响宿主的生理机能。19β-N-甲氨基- l -丙氨酸(BMAA)是一种天然的非蛋白原二氨基酸,由蓝藻或其他微生物产生,最常在水生食品中检测到,可能与神经退行性疾病有关。19BMAA最初是在苏铁植物的种子中发现的,它的摄入被认为会导致肌萎缩性侧索硬化症/帕金森病-痴呆复合体(ALS-PDC)。20.有证据表明,BMAA可以错误地结合在蛋白质中取代丝氨酸,或静电结合到蛋白质新生链上,导致错误折叠、聚集、内质网(ER)应激和凋亡。19此外,BMAA可诱导线粒体功能障碍,干扰氧化磷酸化,同时也会破坏钙稳态,导致活性氧(ROS)过量产生。21虽然仍然没有证据表明肠道菌群成员可以产生BMAA,但在启动子的4号染色体上的cg06690548的高甲基化SLC7A11这种半胱氨酸-谷氨酸反转运蛋白是BMAA的已知靶点,22这被认为与pd相关的环境暴露是一致的。事实上,长期暴露于可能导致线粒体功能障碍的环境毒素已被认为是遗传易感个体帕金森病的可能原因。23基于帕金森病的线粒体级联假说,23我们的理论是,特定的微生物分子可以从肠道传播到大脑,并以神经元线粒体为目标,24因此产生了一个由神经元先天免疫激活引发的自我放大的有害循环。因此,在活的有机体内BMAA给药诱导促炎细胞因子强表达。25我们的研究进一步表明,用BMAA对小鼠进行长期治疗,显著降低了SFB(回肠粘膜中丰富的微生物群)的水平,从而改变了局部免疫细胞反应,导致肠道炎症增加和肠道屏障完整性破坏。令人惊讶的是,我们还观察到中脑线粒体功能失调,并积累了aSyn聚集物,这反过来又导致了神经元先天免疫和神经炎症的进一步激活。最后,我们证明了疾病的尾侧-吻侧进展,从肠道到大脑,很可能是通过迷走神经,由aSyn轨迹证明,最终导致黑质(SN)退化和运动障碍,所有的原型特征的PD。
方法
动物模型及实验设计
C57BL/6雄性小鼠从查尔斯河(巴塞罗那,西班牙)被放置在12小时的光/暗循环下,免费获得水和食物。26周时,小鼠随机分为两组(未处理(Unt)和BMAA处理),每天口服BMAA (0.1g/kg bw),以明胶颗粒形式口服12周,直到它们被处死。这个BMAA剂量是根据以前的研究选择的。26未经处理的动物接受车辆。进行行为分析(30-40周),小鼠被处死,并收集样本进行分析,如中详细描述在线补充资料.所有使用的试剂都列在在线补充表S1.
微生物分析
收集粪便、回肠和盲肠粘膜相关物质,如前所述,使用16S rRNA基因测序评估微生物组谱27 28使用母包V.1.44.129和席尔瓦参考文件(第138版)30.用于原始数据的处理,聚类和分类注释。使用在线工具MicrobiomeAnalyst进行数据分析31及其R包DESeq232软件如在线补充资料.
免疫组织化学,免疫荧光和显微分析
实验结束时,动物经心静脉灌注。收集脑和回肠样本,冷冻保护并保存在−80°C。对脑和肠道样本进行免疫组织化学和免疫荧光染色38并详细描述在在线补充资料.在肠道样本中,我们使用评分系统量表,通过免疫荧光评估(a)肠道屏障的完整性18 39;(b) CD11b的数量除以总计数面积(mm2)和免疫组化(c)每总计数面积的CD4细胞数量(mm2);(d) aSyn聚集体的光密度(OD)和磷酸化aSyn (p-aSyn)包裹体的存在。在大脑样本中,我们使用免疫荧光来确定(a) Iba1中的数量+(b)迷走神经背侧运动核(DMV) TH +和ChAT +细胞数量按总计数面积(mm)划分2).我们使用免疫组化方法评估(c)纹状体(STR)、SN和DMV中aSyn聚集物的OD, DMV和SN中p-aSyn的存在以及STR中酪氨酸羟化酶(TH)的OD, (d) SN中TH +细胞的体视学定量以及(e)血管周围区域每总面积中igg免疫阳性染色的数量(mm)2), STR和SN,以评估血脑屏障(BBB)的完整性。所有图像采集均在完善的盲法和随机过程下进行,并进行了不同的技术和生物重复,如中所全面描述的在线补充资料.
流式细胞术
心脏穿刺采集血液,转入Histopaque 1083溶液(Sigma)离心。外周血单个核细胞(PBMC)片段分离、洗涤并与Anti-Mouse CD45 PerCP(克隆30F11)、Anti-Mouse CD3 FITC(克隆REA641)、Anti-Mouse CD4 APC(克隆REA604)和Anti-Mouse CD8 PE(克隆REA601) (1/50) (Miltenyi Biotec)孵育。细胞悬液采集在BD FACSCalibur细胞仪(BD Bioscience)中进行,并在FlowJo软件(BD Bioscience)中进行分析(见在线补充资料为全面的描述)。
Western blotting,分光光度法和ELISA法测定脑,肠匀浆和血液
在完成行为测试后,对Unt和bmaa处理的小鼠实施安乐死,并分离血液、中脑、纹状体、回肠和盲肠样本。组织被快速冷冻,储存在- 80°C,并均质如中所述在线补充资料.测定血浆干扰素γ (IFN γ)和IL-6水平。在中脑匀浆中,我们用western blot法测定突触标记物和先天免疫标记物,分光光度法测定caspase-1活性,用ELISA试剂盒和western blot法测定先天免疫标记物和aSyn低聚物。在纹状体匀浆中,我们用ELISA试剂盒测定多巴胺水平。在回肠和盲肠匀浆中,我们用分光光度法测定caspase-1活性,用ELISA试剂盒和western blot测定先天免疫标记物和aSyn低聚物(见在线补充资料).
Western blotting,分光光度法和ELISA法测定细胞提取物
NT2 Rho+, Rho0细胞40原代中脑神经元取自C57Bl/6小鼠胚胎妊娠第14/15天的大脑,经修改后按上述方法进行培养41 42用3 mM BMAA处理48小时,再用1µM CCCP(细胞)或5µM(神经元)处理2小时,然后再收集细胞或用20 mM NH处理4将Cl和/或20 μ M Leupeptin置于培养基中4小时。细胞在冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS 1×)中洗涤,如中所述刮除并均质在线补充资料.在细胞提取物中,我们用western blot法测定了aSyn低聚物、LC3II和先天免疫标记物。在神经元线粒体部分,我们用western blot检测了磷酸- drp1水平和aSyn寡聚物。在神经元细胞质部分,我们用ELISA试剂盒分析了先天免疫标记物,用分光光度法分析了Caspase-1活化(见在线补充资料).
免疫细胞化学和共聚焦显微镜分析
原代中脑神经元、NT2 Rho+和Rho0细胞分别在直径16mm的玻璃盖板12孔板和ibidi μ-Slide 8孔板上培养。治疗后,我们用MitoTracker Green检测神经元中的线粒体运动,用TMRM Probe检测细胞和神经元中的线粒体膜电位,用10- n -壬基吖啶橙检测神经元中的心磷脂分布和荧光。免疫细胞化学和共聚焦显微镜程序描述在线补充资料.
线粒体分离,耗氧率,钙2 +处理能力和糖酵解通量(ECAR)分析
通过Percoll梯度分离小鼠中脑和皮质线粒体在线补充资料).用Seahorse XF24细胞外通量分析仪(Seahorse Bioscience, Billerica, Massachusetts, USA)在新鲜的中脑或皮质线粒体中测量耗氧率(OCR)。对于呼吸耦合实验,根据随后的“速率测量方程”计算以下测定值(见在线补充资料).43线粒体钙2 +在钙存在的情况下,用荧光法测量摄取2 +-敏感荧光染料钙绿5N (150 nM),激发波长和发射波长分别为506 nM和532 nM。44在初级中脑神经元中,使用海马XF24细胞外通量分析仪(海马生物科学公司)测定OCR和ECAR。实验装置描述在在线补充资料.
统计分析
详细描述了微生物群的统计情况在线补充材料和方法.使用GraphPad Prism V.8 (GraphPad Software)软件对数据集进行统计分析在线补充表2.所有数据均以均数±标准差表示。采用正态分布分析(Shapiro-Wilk检验)确定后续的参数检验或非参数检验。采用非配对学生t检验或Mann-Whitney检验进行两两比较。多组比较采用单因素方差分析后进行Dunnett事后检验或Kruskal-Wallis检验后进行Dunn事后检验。采用Pearson相关检验对两个变量进行相关分析。所有统计检验均为双尾检验,显著性值标注为:*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001。P和N值在每个图形图例中都有说明。
结果
口服BMAA治疗小鼠肠道菌群的改变
BMAA是一种微生物神经毒素,可以通过饮食摄入,因为它在食物链中积累,特别是从水生生态系统中积累。19我们口服BMAA给野生型(WT) C57BL/6雄性小鼠12周,并观察到它们的体重或血糖没有变化(在线补充图S1A-C),但观察到大便含水量显著增加(数据未显示)。治疗后收集粪便,处死小鼠分离回肠和盲肠。综合分析回肠相关(图1)、粪便(图2)和盲肠相关细菌(在线补充图S2)使用Illumina MiSeq技术在我们的下一代测序单元Genoinseq (https://www.cnc.uc.pt/en/services).每个回肠样品平均获得1876±1650个reads,共检测到102属59科40目14纲10个细菌门。从粪便中获得52 952±12 996个reads,鉴定出165属,82科,56目,18纲,11门。盲肠标本平均31 001±7140个reads,共检出121属,62科,39目,15纲,11门。在bmaa处理的小鼠中,我们观察到回肠相关细菌的多样性增加(α -多样性,用于测量样本内的分类多样性;图1一个)很可能是由于最具代表性的SFB成员的损失,尽管环境之间的整体群落多样性是相似的(beta多样性,评估两个群落之间的相似性或不相似性;图1 b).在bmaa处理的小鼠回肠相关黏膜中,5个属的序列发生了显著改变,其中'Candidatus关节挛缩症(约减少17倍)和Turicibacter(约减少13倍)和增加Colidextribacter(大约增加了6倍),拟杆菌(约增加7倍)和Lachnospiraceae_NK4A136(约增加11倍)(图1我).大多数微生物组研究都集中在短暂性粪便的微生物群上,这可能无法转化不同疾病状态的实际影响。在粪便材料中,在任何分类水平(α多样性;图2一个),并且观察到两个群落的微生物组成有一些重叠(beta多样性;图2 b).我们发现,在bmaa处理过的小鼠粪便样本中,有11个属发生了显著变化:Olsenella,Mucispirillum, Eggerthellaceae_unclassified andRoseburia而RF39_ge,MonoglobusFamily_XIII_AD3011_group,Akkermansia,Tyzzerella,Turicibacter和Clostridia_UCG_014_ge被耗尽(图2我).虽然Roseburia(图2 g)与短链脂肪酸(SCFAs)的产生有关,并且在PD患者中被发现消耗殆尽,45它们在bmaa处理过的小鼠的粪便中富集。另一方面,丰富的Akkermansia已知通过调节黏液层改善肠道屏障功能,对免疫反应产生有益影响,在bmaa处理的小鼠粪便中较低(图2 h).45有趣的是,BMAA治疗引起了细胞的显著损耗Turicibacter以及神秘的Clostridia_UCG_014_ge (图2 f I).我们的研究结果与回肠糜烂有关Turicibacter在短暂性粪便微生物群和盲肠微生物群中观察到,后者显示出整体多样性下降和独特的微生物群落组成(在线补充图S2A,B).从粪便中可以观察到Turicibacter和Clostridia_UCG_014_ge在BMAA处理后盲肠中也减少(在线补充图S2C-F, I).拟杆菌在bmaa处理小鼠的回肠和盲肠中均得到富集(图1 h,在线补充图S2C-E, G).值得注意的是盲肠几乎消失了双歧杆菌属水平(在线补充图S2H),它的成员被认为通过产生SCFAs促进健康和恢复粘液生长。
bmaa诱导的肠道生态失调损害胃肠道功能并加剧炎症
bmaa诱导的'侵蚀Candidatus回肠粘膜的关节挛缩(图1 e-f),并伴随着可能信号肠上皮细胞和CD11b+阳性巨噬细胞或树突状细胞促进组织炎症的类群的增加,我们也发现在bmaa处理小鼠的回肠中增加(图3 a - b).回肠粘膜中增殖的病原体激活了常驻免疫细胞或扩大了有害分子的扩散,确实诱发了炎症,这是由促炎介质如肿瘤坏死因子(TNF)-α (图3 c), il-8 (图3 d)和IL-17 (图3 e)和较低水平的IL-10(一种抗炎细胞因子)(图3 f).回肠SFB可积极刺激肠道免疫,诱导稳态Th17细胞反应,促进肠道屏障的完整性。15我们的结果表明,IL-17水平的升高不是由于sfb诱导的组织稳态Th17细胞,而是由于炎症性Th17细胞的刺激。14在bmaa处理的小鼠中,SFB的损失可能假设允许能够刺激炎症Th17细胞的病原体过度生长。在这些炎症条件下,核因子κ b (NF-kB) p65转位进入细胞核,nod样受体(NLRP) 3炎症小体被激活。图3 g),从而激活caspase 1和产生IL-1β (图3设定h).这似乎是'Candidatus由于BMAA在盲肠中的作用与主要炎症特征不一致,因此回肠的节肢动物衰竭(在线补充图S3A-D).已知TNF-α和IL-1β水平的升高可由于紧密连接蛋白(即ZO-1和occludin)的内化而增强肠道通透性。46我们观察到ZO-1 (图3 j, K)和occludin (图3 j L)水平的bmaa处理小鼠回肠,这表明破坏肠屏障完整性。由于浸润的T细胞大多是表达CD4的“辅助”T细胞,我们检测了bmaa处理小鼠回肠固有层中CD4+细胞的水平,但没有检测到相关差异(图3 m, N).然而,我们观察到bmaa治疗小鼠血液中CD4/CD8比值的改变(图3 o, P),因为CD4细胞减少(在线补充图S3E,F),这可能表明有全身炎症,同时血脑屏障的通透性增加。事实上,我们观察到bmaa治疗小鼠血浆中IFNγ和IL-6水平的增加(图3问),与帕金森病患者的情况相似47这可能会影响血脑屏障的完整性。48我们在bmaa处理的小鼠SN中观察到阳性的微血管泄漏(图3 r, S),但纹状体或皮层没有改变(在线补充图S3G-J).此外,尽管血脑屏障通透性增加,但此时我们未观察到SN中CD4+细胞浸润(在线补充数字S3K).值得注意的是,与中脑区域相比,皮层和纹状体对血源性成分的渗透性增加,49这就留下了一个问题,即为什么我们在SN中看到血脑屏障的渗透性改变,而在皮层或纹状体中没有。
BMAA靶向中脑线粒体
我们的发现支持了BMAA,一种微生物起源的非蛋白原氨基酸,可能针对它们的古老亲戚,线粒体的观点。在BMAA治疗后,我们分离小鼠中脑线粒体,并观察到线粒体功能的降低,即基础呼吸和最大呼吸的减少以及ATP合成的减少(图4模拟),从而降低线粒体池的钙缓冲能力(图4 e-f).然而,从bmaa处理的小鼠中分离出的皮质线粒体不受影响(图4 g-l).为了研究BMAA是否通过特异性靶向神经元线粒体而导致神经退行性变,我们进行了研究在体外使用纯分离线粒体的实验,发现急性BMAA给药降低了分离的中脑线粒体(在线补充图S4A-G)和WT小鼠皮层线粒体中。21我们的结果确实证实,这两个大脑区域受到不同的影响,不是由于中脑和皮层之间的线粒体库的差异,而是由于血源性移位或BMAA的迷走神经口侧轨迹或其他未知效应物在本工作定义的时间点无法到达皮层区域。此外,我们还测定了暴露于BMAA的初级中脑神经元的OCR,并观察到基础线粒体呼吸和ATP合成的减少,与CCCP引起的相似(在线补充图S4H-L).此外,我们观察到bmaa诱导的初级中脑神经元糖酵解、糖酵解容量率和备用糖酵解容量的降低,其效果与CCCP引起的效果相当(在线补充图S4M-P).因此,由于在bmaa处理的初级中脑神经元中观察到线粒体功能障碍,我们检测到线粒体膜电位下降(在线补充图S5A).有趣的是,BMAA并没有进一步降低Rho0细胞(缺乏线粒体DNA的线粒体缺陷细胞)的线粒体膜电位(在线补充图S5B).虽然功能失调的线粒体库需要碎片化才能通过线粒体吞噬来降解,避免线粒体介导的死亡,50我们发现BMAA增加了初级中脑神经元线粒体中裂变蛋白磷酸drp1的水平(图4 m, N),从而形成碎片化的线粒体网络(图4里).值得注意的是,毒素无法进一步分裂线粒体库在缺乏功能线粒体的细胞(在线补充图S5C-E).随着碎片增加,线粒体功能下降导致心磷脂暴露,心磷脂是一种存在于线粒体内膜和细菌中的脂质。51事实上,我们证实了用BMAA治疗原发性中脑神经元引发心磷脂暴露(图4 t, U).为了克服这种危险相关的分子模式(DAMP)的暴露,功能障碍和碎片化的线粒体有望通过线粒体自噬去除。52我们检测了初级中脑神经元的线粒体运动和巨自噬,并观察到BMAA诱导的线粒体平均速度降低(在线补充图S6A,B).此外,我们还观察到经BMAA治疗的初级中脑神经元自噬通量减少(在线补充图S6C-E),这表明功能障碍线粒体的周转减少。我们进一步证明线粒体位于自噬体(在线补充图S6F-H),但不与自溶酶体共定位(在线补充图S6I-K),这表明在bmaa处理过的初级中脑神经元中有功能失调线粒体的积累,同时心磷脂也过度暴露。
心磷脂线粒体暴露驱动先天免疫激活和神经炎症
功能失调的线粒体暴露心磷脂,一种公认的DAMP,52在自我放大的循环中激活先天免疫反应,最终导致进行性神经退行性变。为了解决神经元对先天免疫激活的贡献,我们证实了初级中脑神经元培养中低水平的胶质细胞污染(小于1%的Iba1+, Trem2+, CD11b+细胞和小于20%的胶质纤维酸性蛋白,gfap阳性细胞)(数据未显示),这使我们提出神经元可以通过bmaa诱导的线粒体功能障碍介导先天免疫反应。我们观察到BMAA在初级中脑神经元中诱导toll样受体(TLR) 4的表达增加(图5 a - b).TLR信号通路导致NF-κB激活并转位到细胞核,在细胞核中它与IL-1β基因的启动子区域结合,诱导其转录。53我们还观察到BMAA处理后NF-κB的活化(图5 c)和预期的前il -1β水平的增加(图5 a, D).在BMAA处理后,也发现切割il -1β前体的Caspase 1在神经元中被激活(图5 e),导致成熟的IL-1β水平升高(图5 f).
为了证明BMAA治疗通过线粒体依赖的神经元先天免疫激活选择性地诱导神经炎症,我们分离小鼠中脑来处理NLRP3炎症小体激活,并观察到BMAA诱导TLR7和TLR4受体表达增加在活的有机体内(图5胃肠道).位于核内体的TLR7和位于质膜的TLR4都能够在神经元中引发先天免疫反应。54这些受体信号NF-κB (图5 j),激活NLRP3炎性小体。事实上,我们观察到亲il -1β水平的增加(图5G和K)和caspase 1的激活(图5 l),从而释放促炎IL-1β (图5米).综上所述,我们的结果强烈表明,口服BMAA激活小鼠大脑先天免疫可能是线粒体暴露DAMPs的结果。虽然最近的研究将脑内IL-17的产生与血脑屏障渗漏和炎症疾病进展联系起来,55我们的小鼠模型未能显示中脑IL-17水平显著增加(图5 n)或具有统计学意义的抗炎IL-10水平变化(图5啊).我们通过放大的细胞体和Iba1观察到SN中小胶质细胞的激活(图5 p q),并检测到trem2阳性疾病相关小胶质细胞的定位增加(图5 p-r).激活的小胶质细胞也会释放促炎细胞因子,即TNF-α和IL-1β,这可能有利于血脑屏障的通透性和随后的外周白细胞浸润到中枢神经系统。55然而,在选定的时间点,我们没有观察到CD4+细胞浸润在bmaa治疗小鼠的SN (在线补充数字S3K).
BMAA治疗诱导aSyn聚集物从肠道传播到大脑的黑纹状体区域,可能是通过迷走神经
异步聚集物是PD的主要组织病理学特征。来自人类和PD小鼠模型的最新数据表明,aSyn表达的上调以及随后的寡聚和聚集最初发生在肠道肠内神经元,随后发生在SN多巴胺能神经元。3个5的确,我们在bmaa处理的小鼠回肠样本中观察到aSyn聚集物和p-aSyn (S129P) (图6 a e).经bmaa处理的小鼠回肠标本免疫组化显示aSyn聚集物和/或寡聚物水平升高(图6 a, B), elisa (图6 c)及western blot (图6 d e).这些差异在回肠中显著,但在盲肠中不显著(在线补充图S7A).此外,与Braak提出的病原体或毒素可能通过迷走神经从肠道传播到大脑的假设一致,5我们可以检测到aSyn聚合和p-aSyn (S129P)形式的DMV (图6做减法),显示bmaa处理小鼠的aSyn聚集物显著高水平(图6克).最后,我们在bmaa处理的小鼠中脑中检测到aSyn聚集物,但没有检测到p-aSyn (S129P)形式(图6 h l).事实上,有人提出,只有在积累了抗降解的aSyn聚集物之后,我们才能看到聚集物中广泛的磷酸化。56与Braak的阶段一致,在我们的实验时间点,可能存在不足以诱导SN中广泛磷酸化的抗降解聚集物。因此,我们的数据没有显示bmaa处理小鼠皮层中aSyn聚集物免疫反应性的增加(在线补充图S7B).在本文中,我们发现BMAA促进aSyn的过表达和寡聚可能是由于它对神经元线粒体的作用,本质上是因为BMAA促进初级中脑神经元中的aSyn寡聚(图6 m-o)和Rho+细胞中,但未能增加Rho0细胞中的aSyn聚集(图6 p q).事实上,文献数据表明,可以通过靶向线粒体功能获得不同的PD细胞和动物模型,就像PD杂交体和mptp -小鼠模型一样,57两者都出现了pd相关的神经病理特征,包括异步寡聚。事实上,我们还观察到aSyn寡聚物在bmaa处理的小鼠中脑线粒体部分的积累(在线补充图S7C,D).
口服BMAA治疗的小鼠出现黑纹状体变性和运动功能障碍
bmaa诱导的'侵蚀Candidatus回肠粘膜的关节挛缩(图1 e-f)导致胃肠道炎症和aSyn的尾-吻侧聚集,这可能导致th阳性神经元的损失。我们的研究显示,在bmaa处理过的动物中,th阳性神经元的水平下降,但在DMV中chat阳性神经元的水平没有下降(图7 a - c).这反映了多巴胺能神经元对BMAA的易感性增加,BMAA可以通过位于腹部迷走神经的迷走儿茶酚胺能纤维传播到SN,其中大约70%的神经元是th阳性。58为了进一步研究bmaa诱导的神经炎症和aSyn寡聚是否导致多巴胺能神经元损伤,我们分析了bmaa治疗小鼠中脑和STR的TH水平。有趣的是,我们观察到中脑多巴胺能神经元的损失,这是由TH水平的降低决定的(图7 d e),而其他突触标记,如PSD95和突触素(图7D和F-G).我们还观察到STR中th阳性纤维的损耗(图7设定h)和SN中黑质th阳性细胞总数的减少(图7H和Jbmaa治疗的小鼠,其损失导致STR中多巴胺水平降低(图7 k).相关分析表明,DMV和SN中聚集的aSyn水平有助于中脑th阳性神经元的耗竭,尽管我们观察到SN IgG泄漏也有助于SN中aSyn聚集水平的增加,这种影响可能不仅仅是尾侧-口侧的,因为SN IgG泄漏与DMV中aSyn聚集水平无关(在线补充图S7E-H).
为了测试bmaa诱导的多巴胺能神经元损失,是否由系统性低度炎症增强(图3问)会影响运动表现,我们使用不同的运动行为测试评估小鼠的运动表现。我们发现bmaa处理的小鼠在梁行走测试(8毫米)中的运动性能显著受损(图8).我们还观察到BMAA增加了后扣评分(图8 b),降低了倒立握力测试的潜伏期(图8 c).这些结果表明,在选定的时间点,bmaa诱导的运动损伤,但对t迷宫测试评估的记忆功能没有明显影响(图8 d e).野外测试的运动能力也显著下降(图8外:我).此外,我们还观察到BMAA治疗引起了气味辨别改变,这与PD症状学一致(数据未显示)。
讨论
特发性PD约占疾病病例的90%,但病因仍然难以捉摸。1目前公认运动症状之前有非运动特征,如胃肠道功能障碍。2事实上,aSyn聚集物是帕金森病的主要病理标志,在前驱期早期发现在一些患者的外周器官如肠道中积累。3 - 5据此推测,环境因素,即某些肠道微生物或其产物,可能是帕金森病的环境诱因。6了解肠道生态失调对中枢神经系统的影响对于开发新的诊断和治疗工具至关重要,这些工具在未来可能会阻止疾病进展。这项工作表明,BMAA,一种已知具有神经毒性的环境微生物代谢物,会消耗特定的细菌群,这些细菌群基本上调节回肠粘膜免疫和可能的肠道运动。这种窄谱侵蚀伴随着胃肠道炎症加重、屏障破坏和aSyn聚集,也有可能进一步追踪病理到中脑的进展,在那里线粒体变得功能障碍。因此,线粒体网络碎片化和暴露DAMPs激活了神经元先天免疫,促进了aSyn聚集、神经炎症、多巴胺能神经元的损失和WT小鼠的运动改变。这些观察结果支持了这样一种观点,即某些微生物代谢产物可以触发“肠道优先”的PD,但它们也加强了线粒体在疾病进展中的关键角色。
在PD患者的肠道菌群中检测到的变化包括具有促炎特性的细菌群比例的增加和具有抗炎作用的细菌群相对丰度的相应减少。45在患有快速眼动睡眠行为障碍的个体中也检测到肠道生态失调59这表明这些改变发生在“身体优先”PD病例的前驱期早期。60本研究显示,BMAA暴露显著改变了回肠和盲肠粘膜以及粪便中关键细菌种群的相对水平,尽管这种影响在回肠粘膜中更为明显。Turicibacter为丝状孢子形成菌,经BMAA处理后显著减少。这些细菌最近被发现能刺激肠色素细胞释放血清素,这是一种调节肠道运动的神经递质。61由于便秘是帕金森病的常见症状,我们推测广泛的糜蚀Turicibacter回肠和盲肠粘膜以及粪便中的物质可能导致血清素信号受损,从而可能导致肠道动力受损。相关的,BMAA治疗也显著减少了Candidatus节肢菌属是小鼠回肠黏膜最显著的细菌属。由于SFB在小鼠肠道稳态中起着重要作用,14日15它们的消耗可以证明肠道炎症的增强是合理的13以及观察到的肠道屏障完整性的丧失。事实上,SFB的耗尽激活了CD11b+肠道驻留细胞,释放TNF-α和IL-1β,并且可能还激活了非驻留的促炎Th17细胞,驱动IL-17的产生,并在外围产生影响。14有趣的是,循环的Th17细胞在早期PD中增加。62在炎症条件下,肠上皮暴露于多种细胞因子,这些细胞因子可能通过occludin和ZO1水平的降低以及细胞骨架重排协同损害肠屏障。46此外,我们观察到bmaa治疗小鼠血液中CD4+淋巴细胞减少,IFNγ和IL-6水平增加,类似于PD患者中所描述的情况。48 63既往研究发现PD患者血液中CD4+ T细胞的下降和促炎细胞因子的升高可能提示外周免疫功能受损,有全身性炎症倾向。64在我们的研究中检测到的中脑IgG浸润增加表明BMAA促进了SN中血脑屏障的通透性,尽管在纹状体或皮层中未观察到可检测到的影响。BMAA已被证明可以穿过血脑屏障,并在ALS/PDC患者的大脑中被检测到。20.在这里,我们表明在活的有机体内BMAA治疗损害了中脑线粒体的OCR和钙摄取,但没有损害皮质线粒体,尽管直接急性在体外用BMAA处理分离的中脑或皮质线粒体可诱导OCR下降。21BMAA治疗导致初级中脑神经元线粒体功能障碍和碎片化,由于有丝分裂损伤,这些神经元没有降解,从而暴露出心磷脂,一种能够激活神经元先天免疫的DAMP。52有趣的是,当实验在缺乏功能性线粒体的Rho0细胞中进行时,BMAA对膜电位或线粒体网的破碎没有影响。我们还观察到,BMAA治疗激活了NLRP3炎症小体,并伴有丰富的中脑神经元培养中IL-1β的释放。尽管在在活的有机体内背景:我们不能肯定NLRP3激活和IL-1β释放仅限于神经元,SN中小胶质细胞的激活和trem2阳性单核细胞更强烈的共定位强烈表明参与了全身免疫。54由于神经元表达TLRs和主要组织相容性复合体I类蛋白质,并能够释放促炎介质,65我们认为,在bmaa治疗的小鼠中,神经元是最初受到影响的,后来才向小胶质细胞发出信号。
一个被很好描述的先天免疫激活的结果是抗菌肽的产生。66最近的数据表明,在肠神经系统(ENS)中,aSyn在胃肠道的先天免疫防御中发挥作用。的确,儿科患者上消化道肠突中aSyn的表达增加与诺瓦克病毒感染时肠壁急性和慢性炎症的程度呈正相关。67研究还表明aSyn具有抗菌活性大肠杆菌而且金黄色葡萄球菌,这表明,除了在神经递质释放中发挥作用外,aSyn还可能作为一种天然抑菌蛋白发挥作用。68在bmaa治疗的小鼠中,我们观察到aSyn在回肠中的聚集明显增加,并且通过DMV核进入SN的尾侧-嘴侧进展。我们的发现与在无菌小鼠中进行的研究一致,这些小鼠被PD肠道菌群或产生卷菜的菌群定植大肠杆菌结果显示肠道和大脑中aSyn的聚集增加,69年9这表明在一些PD“肠道优先”病例的病因学中存在一种依赖于异步的机制。70 71一种细菌毒素,如BMAA,可以通过肠道内分泌细胞刺激aSyn的表达和扩散,这些细胞与胃肠道中的肠神经发生突触3.是创新的,可能揭示重要的新靶点,以解决前驱症状,周围突触核病变。关于ENS,在PD患者十二指肠活检中进行的一项非常有趣的研究未能证明粘膜下神经元数量的改变以及线粒体膜电位和aSyn水平的改变。72尽管如此,这些数据与我们的研究一致,因为我们没有观察到bmaa处理小鼠十二指肠aSyn聚集物的增加(数据未显示)。此外,aSyn被认为表现为朊病毒样蛋白,通过尾侧-嘴侧轨迹从肠道通过迷走神经传播到大脑。70 73 - 76我们还观察到aSyn在大脑线粒体中积累,这可能表明正反馈机制进一步导致了它们的功能障碍。几个在体外研究表明,aSyn以线粒体为目标,引起形态学和功能上的改变。77有趣的是,鱼藤酮,一种复合物I抑制剂,导致线粒体功能障碍和碎片,也诱导aSyn积累。78因此,我们提出PD神经退行性过程与线粒体在先天免疫激活中的作用密切相关。这项工作进一步加强了线粒体在PD病因学中的关键作用,主要是因为BMAA治疗没有增加Rho0细胞中的aSyn聚集。观察到血脑屏障通透性和线粒体功能障碍发生在SN,而不是在皮层,这使我们假设aSyn病理的尾侧-吻侧进展通过迷走神经的重要影响。事实上,尽管之前的观察显示皮层和STR区域对血源性成分的渗透性增加,49我们观察到血脑屏障通透性与中脑aSyn聚集物水平呈正相关,这表明血液和迷走神经通路都可能参与了BMAA对线粒体的全面有害影响。这将反过来充分激活先天免疫反应和神经炎症,这将协同诱导多巴胺能神经退行性变和损害运动功能。总之,我们的研究结果表明,在基因易感的PD患者中,当由BMAA(一种常见于海鲜、贝类和鱼类中的微生物产品)等环境毒素触发时,病理可能开始于肠道。从观察到的BMAA对小鼠肠道微生物组的特定成员的影响,即对'Candidatus我们认为,这种毒素最初可能是作为一种抗菌化合物进化而来的,可能是为了在共享的生态系统中为其生产者提供一些竞争优势,并意外地瞄准了线粒体,这是一种古老的内共生变形菌门的亲戚。为了支持肠道到大脑的模式,我们证明了肠道炎症与aSyn聚集相关,并强调了线粒体在神经元先天免疫的下游激活、aSyn聚集和DMV和SN th阳性神经元的丢失中的关键作用。虽然我们没有确定ENS神经元线粒体功能,但我们都认为肠道和ENS是BMAA和aSyn到达DMV和SN的通道,以线粒体为目标,并逐渐对最脆弱的th阳性神经元造成损害。79然而,我们不能完全放弃外周炎症和随之而来的血脑屏障破坏参与BMAA进入脑实质的可能性,这是一个必须在未来研究中解决的重要问题。
我们推测,通过饮食来源长期暴露于微生物BMAA会影响宿主,并可能引发可能引发PD的表型改变。我们的结果表明,BMAA对一些负责肠道粘膜免疫稳态的细菌“哨兵”(SFB)具有窄谱抗生素活性。尽管宿主遗传易感性和其他因素的作用,即肠道生态失调可能是病理进展的驱动因素,但这项工作对于提醒卫生当局,迫切需要实施常规方案来监测这种(和其他)毒素在食物和食物补充剂中的水平是重要的。总之,我们的工作为长期的讨论提供了额外的启示80为帕金森病病因中可能涉及微生物毒素提供了第一个概念证明(图9),这是开发创新疗法的重要一步,可以成功阻止这种神经退行性疾病的发病和慢性病程。
数据可用性声明
如有合理要求,可提供资料。支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。
伦理语句
患者发表同意书
伦理批准
动物程序得到了神经科学和细胞生物学中心和科英布拉大学医学院动物福利委员会的批准,并得到了葡萄牙当局的认证(Direção Geral de Veterinária)。
致谢
SMC将这项工作奉献给她的导师和博士导师,Catarina Resende de Oliveira教授。作者感谢Inês Melo Marques在IF/IHC图像盲量化和评分方面的帮助,Ana Cristina Rego提供了关键的海马方法,Conceição Egas (geninseq,下一代测序单元,神经科学和细胞生物学中心)提供了微生物组测序支持。
参考文献
补充材料
脚注
ARE和MFM-P贡献相同。
调整通知这篇文章在Online First发表后已被更正。图6的图例已经更正。
贡献者NE和SMC构思并设计了研究和研究计划。NE监督微生物组工作,SMC监督其余工作。SA、IT和DN-C生成微生物组数据。DFS和ARE执行所有在体外实验。EC和MFM-P进行动物手术,组织清理。MFM-P和JDM进行组织学分析。MFM-P进行FACS分析。EC、ARE和DFS进行细胞因子分析。EC、ARE、JDM、MFM-P和ARP-S进行了行为实验。ILF、ARE和DFS均采用海马技术。ARE和DFS进行蛋白分析。ARE、DFS、MFM-P共聚焦成像。MFM-P和DN-C进行数据分析。 NE and SMC wrote the manuscript. All authors contributed to the material and methods section, results section and figure legends. SMC and NE are guarantors of this work.
资金这项工作由葡萄牙Santa Casa da Misericórdia de Lisboa通过2016年Mantero Belard神经科学奖(MB-40-2016)资助;FMUC-PEPITA (2018);由欧洲区域发展基金(ERDF),通过Centro 2020区域业务计划(Centro -0145-联邦-000012(健康老龄化2020)项目,通过COMPETE 2020 -竞争力和国际化业务计划,以及通过FCT-Fundação Ciência ea Tecnologia项目PTDC/MED-NEU/3644/2020, PINFRA/22184/2016/ poci -01-0145-联邦-022184和UIDB/04539/2020。EC由MB-40-2016奖学金资助。由IF/01061/2014研究员合同支持。JDM由博士奖学金PD/BD/146409/2019支持,DN-C由博士奖学金SFRH/BD/11777 /2016支持,ARP-S由博士奖学金PD/BD/2020.06543.BD支持。
相互竞争的利益没有宣布。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
补充材料此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查,也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议,不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料,BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量),并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。
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