条文本

原始研究
在中性粒细胞保护CARD9结肠炎和控制线粒体代谢和细胞生存
  1. 卡米尔·丹纳1,2,3,
  2. 克洛伊Michaudel1,3,
  3. Jurate Skerniskyte4,
  4. 朱利安Planchais1,3,
  5. Aurelie Magniez1,3,
  6. Allison阿古斯1,3,
  7. 中,米歇尔1,3,
  8. 布鲁诺喇嘛1,3,
  9. 格雷戈里·达·科斯塔1,3,
  10. 玛德琳Spatz1,3,
  11. Cyriane Oeuvray2,3,
  12. 克洛伊Galbert2,3,
  13. 马克西姆地方1,3,
  14. Yazhou王1,3,
  15. 亚莉克希亚Lapiere1,3,
  16. 娜塔莉Rolhion2,3,
  17. 塔蒂阿娜Ledent2,
  18. 塞德里克Pionneau5,
  19. Solenne Chardonnet5,
  20. Floriant Bellvert6,
  21. Edern Cahoreau6,
  22. 含有杏仁的巧克力6,
  23. 拉斐尔玫瑰却7,
  24. 卡罗尔Peyssonnaux8,
  25. Sabine路易8,
  26. 马赛厄斯L理查德1,3,
  27. 菲利普Langella1,3,
  28. Jamel El-Benna9,
  29. Benoit Marteyn4,10,11,
  30. 哈利科尔1,2,3
  1. 1大学Paris-Saclay、INRAE benoir Micalis研究所,案例、法国
  2. 2巴黎索邦大学,INSERM umr - 938,安东尼德精心设计的中心,CRSA, AP-HP de Gastroenterologie安东尼式、服务,f - 75012巴黎、法国
  3. 3巴黎微生物医学中心(PaCeMM) FHU,巴黎、法国
  4. 4CNRS, UPR 9002、斯特拉斯堡大学生物研究所Moleculaire Cellulaire, et de l 'ARN Reactivite架构,斯特拉斯堡、法国
  5. 5巴黎索邦大学、INSERM口头语,Plateforme Postgenomique de la Pitie弗尔(p3),巴黎、法国
  6. 6MetaToul-MetaboHUB,代谢组学的国家基础设施& Fluxomics (anr - 11号- 0010),31077年图卢兹、法国
  7. 7Aix马赛大学、CNRS INSERM CIML, d 'Immunologie de Marseille-Luminy中心,马赛、法国
  8. 8科钦研究所、INSERM CNRS,巴黎大学,Laboratoire d 'excellence GR-Ex,巴黎、法国
  9. 9巴黎大学、INSERM-U1149 CNRS-ERL8252,中心精选的苏尔l 'Inflammation (CRI) Laboratoire d 'excellence Inflamex,将进医学院学习Xavier Bichat,巴黎、法国
  10. 10斯特拉斯堡大学高级研究学院(美国新闻署),斯特拉斯堡、法国
  11. 11巴黎巴斯德研究所,大学,1225年Inserm团结de Pathogenese des感染Vasculaires 28街Roux博士,75724年巴黎Cedex 15、法国
  1. 对应到大学博士,卡米尔·丹纳Paris-Saclay、INRAE benoir, Micalis研究所案例法国;camille.danne在}{gmail.com;哈利科尔博士;harry.sokol在{}aphp.fr

文摘

目标炎症性肠病(IBD)的结果相结合的遗传倾向,肠道微生物群和环境因素的失调,导致胃肠免疫反应和慢性炎症改变。半胱天冬酶招聘领域9 (Card9),炎症性肠病易感基因之一,已被证明能够防止肠道炎症和真菌感染。然而,细胞类型和机制参与CARD9保护作用对炎症仍然未知。

设计我们用葡聚糖硫酸酯钠(DSS)全身总共和过继转移结肠炎模型和条件CARD9淘汰赛老鼠发现CARD9保护性细胞发挥作用的表型。的影响Card9删除对中性粒细胞功能被真菌感染的体内模型评估和各种功能分析,包括端点稀释测定、细胞凋亡测定通过流式细胞术,蛋白质组学和实时生物能量学概要分析(海马)。

结果淋巴细胞本质上并不参与对结肠炎CARD9保护作用。在中性粒细胞CARD9表达式,但不是在上皮或CD11c +细胞,防止DSS-induced结肠炎。在缺乏CARD9,线粒体功能障碍增加线粒体活性氧的生产导致neutrophilsthrough凋亡的过早死亡,尤其是在氧化环境。组织的功能降低中性粒细胞可能解释真菌和易感性增加的安全壳受损肠道炎症。

结论这些结果提供了新的见解的作用在中性粒细胞CARD9线粒体功能及其参与肠道炎症,为新的治疗策略针对中性粒细胞铺平了道路。

  • 炎症性肠病
  • 肠道炎症
  • 胃肠道免疫反应
  • 炎症性肠病,遗传学
  • 细胞凋亡

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已知关于这个主题是什么呢

  • 在炎症性肠病(IBD),免疫反应导致的变化加剧和慢性肠道炎症。

  • 半胱天冬酶招聘领域9 (Card9),炎症性肠病易感基因之一,是预防肠道炎症和真菌感染;但是,细胞和细胞机制仍然未知。

这个研究增加了

  • 不同的小鼠显示CARD9表达式在中性粒细胞,但不是在淋巴细胞,上皮细胞或CD11c+细胞,防止肠道炎症。

  • 在缺乏CARD9,中性粒细胞通过凋亡而过早死亡,由于线粒体功能障碍的产生过度的线粒体活性氧。

  • 中性粒细胞的生存缺陷可以解释对肠道炎症和真菌感染的易感性增加的上下文Card9缺乏体内。

这项研究可能会如何影响研究、实践或政策

  • 理解CARD9的角色和中性粒细胞在慢性炎症可能导致创新的治疗策略针对这些关键免疫细胞对各种复杂的疾病。

介绍

炎症性肠病(IBD)的结果相结合的遗传倾向,肠道微生物群和环境因素的失调,导致胃肠免疫反应和慢性炎症改变。1 2尤其是先天免疫系统的室参与炎症性肠病的发展,角色树突细胞,巨噬细胞和中性粒细胞。3 - 6中性粒细胞,一个最丰富的,先天免疫的重要介质,是专业的吞噬细胞,山急性炎症反应,并对入侵病原体的第一道防线。7 8一个中性粒细胞功能受损可能导致有限的病原体间隙和燃料的一种慢性炎症反应过度淋巴细胞激活。先天性疾病患者等中性粒细胞功能的慢性肉芽肿性疾病(CGD)经常开发IBD-like表型。9 - 12此外,功能性缺陷曾被观察到在中性粒细胞炎症性肠病的患者,包括受损的趋化作用、迁移、吞噬作用或活性氧(ROS)的生产。4个5

CARD9,无数IBD易感基因,编码一个适配器蛋白相结合的模式识别受体下游信号。13-18尤其是CARD9参与宿主防御真菌通过c型凝集素传感。19日20CARD9多态性在人类与多种脆弱的感情包括IBD相关,21而丧失突变与侵入性真菌感染引起的物种等白色念珠菌21 - 24日CARD9证明调解其防护功能,至少在某种程度上,通过自适应的感应Th17细胞反应。22日23日25Card9−−/由于受损的老鼠更容易结肠炎il - 22生成生产和增加负载gut-resident真菌。25的确,CARD9影响肠道微生物群的组成和功能,改变抗炎的微生物代谢产物的生产。26日27日然而,细胞类型参与CARD9保护作用对肠道炎症仍然未知。

在这项工作中,我们表明在中性粒细胞CARD9表达式,而不是等上皮或CD11c +细胞的树突细胞,预防全身的葡聚糖硫酸酯钠(DSS)在小鼠结肠炎。中性粒细胞缺乏CARD9影响能力包含真菌传播,尤其是损害中性粒细胞线粒体功能和生存。的确,Card9删除引起的基底overactivation线粒体,线粒体ROS的生成(mtROS)和导致中性粒细胞凋亡。这些结果提供了新的见解的作用在中性粒细胞CARD9线粒体功能和肠道炎症的影响。

结果

淋巴细胞没有内在的作用Card9- / -对结肠炎

CARD9以前报道主要表达在髓细胞,尤其是树突细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。14 28使用中存在分析各C57BL / 6小鼠的器官,我们确认Card9主要表达在免疫器官如骨髓、脾和远端小肠(回肠),但很低在近端小肠和中期的基线,盲肠、结肠、胃和肝脏,而不是检测Card9- / -组织(在线补充图S1A)。持续、免疫印迹分析显示,骨髓CARD9蛋白质的表达,脾脏和WT小鼠小肠远端(在线补充图印地)。来解剖Card9表达在细胞水平上,我们有序的免疫细胞的数量由WT小鼠的脾脏和骨髓。Card9高度表达的中性粒细胞(Ly6G+CD11b+细胞,巨噬细胞(CD11b+F4/80+细胞),CD11c+细胞,包括树突细胞和单核细胞(CD11bF4/80+细胞);但天生的表达较低或自适应淋巴细胞(CD3+TCRγδ+淋巴细胞、CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞、CD3- - - - - -CD19+B细胞)(在线补充图就是S1C)。因此,CARD9可能在骨髓免疫舱中起着重要作用。

图1

淋巴细胞没有内在的作用Card9- / -表型在结肠炎模型。重量(A)和(B)疾病活动指数(DAI) DSS-exposed得分Rag2- / -Rag2- / -x Card9- / -老鼠。(C)结肠长度和(D)结肠组织学得分的部分在7天。数据点代表个人的老鼠。一个有代表性的实验三。(E)代表从DSS-exposed H&E-stained mid-colon横截面上的图像Rag2- / -(左)和Rag2- / -x Card9- / -(右)在第七天老鼠。酒吧,规模500µm。(F)的老鼠接受幼稚T细胞过继转移的结肠炎实验。Rag2- / -收到WT或Card9- / -淋巴细胞。Rag2- / -x Card9- / -老鼠接受了WT淋巴细胞。数据均值±SEM的两个独立的实验。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001由双向方差分析与Sidak测试后(A, B, F)和Mann-Whitney U测试(C, D)。DSS,葡聚糖硫酸酯钠;LT, T淋巴细胞。

先前的研究从我们组和其他人开始调查的作用Card9在小鼠实验性结肠炎模型,显示Card9删除结肠炎易感性增加。25日26日29日为了解释各自的角色的淋巴细胞和骨髓细胞Card9对肠道损伤和炎症,首先与DSS诱导结肠炎Rag2- / -Rag2- / -xCard9- / -老鼠缺乏功能的T细胞和B细胞。饮用水中小鼠安乐死在收到3% DSS 7天,严重限制了的Rag2- / -xCard9- / -组。事实上,疾病严重程度(定义为减肥,戴疾病活动指数得分,结肠长度和组织学评分)强烈增加Rag2- / -xCard9- / -小鼠相比Rag2- / -老鼠(图1 a e)。结肠炎的过继转移模型,Rag2- / -老鼠缺乏功能性T细胞淋巴细胞收到从WT或Card9- / -小鼠,观察没有区别在结肠炎严重程度(图1 f),也就是说,Card9在T细胞不表达结肠炎易感性的影响。然而,WT T细胞的转移Rag2- / -xCard9- / -收件人老鼠并加剧结肠炎相比Rag2- / -简单的KO接受者,更强大的减肥(图1 f)。这些结果说明Card9通过先天免疫介导的保护作用对结肠炎隔间里,虽然它的角色在肠道上皮细胞的可能性不能排除。

Card9中性粒细胞的表达式,但不是在上皮或CD11c+细胞,预防结肠炎

基于这些发现,我们生成条件KO小鼠使用cre-lox技术,并获得鼠标菌株有缺陷Card9只在上皮细胞(VillincrexCard9液态氧线),CD11c-expressing细胞,包括树突细胞、巨噬细胞和单核细胞(CD11ccrexCard9液态氧线),或只中性粒细胞(Mrp8crexCard9液态氧线)。验证他们的表型,我们孤立的结肠上皮细胞的固有层(LP)Card9VillincreCard9Villinwt老鼠,或者使用mac CD11c分离柱分离+或Ly6G+从脾和骨髓细胞分数Card9CD11cwtCard9CD11ccre老鼠或Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre老鼠,分别。我们在这些细胞中存在执行分数(在线补充图S2ALy6G)和免疫印迹分析+和Ly6G低/ -分数的Card9WT,Card9- / -,Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre老鼠(在线补充图开通)。结果证实,Card9删除被限制为预期的细胞类型(在线补充图S2A, B)。Ly6G纯度+CD11b+中性粒细胞与C57Bl / 6小鼠骨髓内达到95%通过流式细胞术(在线补充图S2C)。

然后我们评估这些新生成的老鼠的敏感性菌株在肠道炎症的典范。DSS进行了7天,紧随其后的是额外的DSS是停止的5天。的删除Card9在上皮或CD11c+细胞并不影响小鼠结肠炎易感性(图2 a, B在线补充图S2D)。然而,删除Card9在中性粒细胞加剧结肠炎与WT同窝出生仔畜控制相比,显著增加减肥从第八天(图2 c从第五天),戴分数(图2 c),组织学评分(图2 e, F),以及减少结肠长度(图2 d)。因此,的表达Card9在中性粒细胞中扮演着关键角色保护肠道炎症。的表达髓过氧化酶(MPO),中性粒细胞抗菌酶大量表达,增加Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt结肠组织在12天,表明一个更重要的存在或激活的中性粒细胞缺乏Card9(图2 g)。同样,炎症标志物的表达lipocalin (Lcn2)增加Card9Mrp8cre结肠组织在12天(图2 h)。

图2

Card9中性粒细胞的表达式,但不是在上皮或CD11c+细胞,预防结肠炎。(一)DSS-exposed戴重量和分数Card9VillinwtCard9Villincre老鼠。DSS-exposed戴(B)重量和分数Card9cd11cwtCard9cd11ccre老鼠。DSS-exposed戴(C)重量和分数Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre老鼠。(D)结肠长度、(E)结肠组织学得分的部分(F)代表从DSS-exposed H&E-stained中期结肠截面的图像Card9Mrp8wt(左)和Card9Mrp8cre(右)老鼠在12天。酒吧,规模500µm。总计(G)髓过氧化酶(MPO)浓度结肠组织在12天。(H) Lipocalin (Lcn2)表达式中存在结肠组织在12天,总计正常化Gapdh。数据点代表个人的老鼠。数据均值±SEM的三个独立的实验。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001由双向方差分析与Sidak测试后(a - c)和Mann-Whitney U测试(d - h)。方差分析,方差分析;戴、疾病活动指数;DSS,葡聚糖硫酸酯钠;ns,不重要。

这些结果表明,Card9缺乏有效地招募中性粒细胞炎症组织,但可能阻止他们充分展示功能缺陷控制微生物入侵者,从而维持肠粘膜炎症。我们之前显示肠道微生物群的总数Card9- / -KO血统老鼠展览相比WT AhR受体激动剂生产的改变。26然而,观察没有区别Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre老鼠(在线补充图S2E),说明这方面相关的表型不是本质上CARD9在中性粒细胞的作用。

Card9删除影响结肠炎症激活中性粒细胞的数量

调查在WT小鼠中性粒细胞功能DSS-induced炎症,我们分析了neutrophil-specific基因的RNA表达Lcn2,Cxcr2S100A8在结肠组织天0、4、7、9、12和16 DSS-induced结肠炎(图3一在线补充图S2F)。嗜中性粒细胞招募在9天,最大峰值对应的临床炎症,且保持了高天16图3一)。远端结肠的组织学部分证实了这些发现(图3 b)。炎症是高的事实Card9Mrp8cre比在Card9Mrp8wt老鼠(在线补充图S2E),Lcn2,Cxcr2S100a8表达在两天9在结肠组织类似的基因型(图3 c)不包括中性粒细胞招募的缺陷的假设Card9Mrp8cre老鼠。然后我们研究了免疫细胞的数量招募的结肠LPCard9Mrp8crevsCard9Mrp8wt小鼠结肠炎的9天。令人惊讶的是,尽管中性粒细胞的总数是相似的两个基因型,成熟和激活Ly6G的百分比和计数+CD11b+中性粒细胞减少结肠LP的Card9Mrp8cre(图3 d, E)。此外,Ly6G和CD11b表面蛋白的表达水平,两个主要的中性粒细胞的成熟和激活标记,在整体的中性粒细胞数量显著降低,如图所示,降低小额信贷机构(平均荧光强度)(图3 f, G)。这些发现表明在中性粒细胞删除结构或功能缺陷Card9

图3

Card9删除影响成熟中性粒细胞的数量在结肠发炎。(一)相对的表达Lcn2,Cxcr2S1008a在远端结肠组织C57BL / 6小鼠WT在DSS结肠炎模型相对于Gapdh。(B)代表H&E-stained中期结肠截面的图像从DSS-exposed WT老鼠在天0、4、7、9、12和16 DSS曝光后。酒吧、规模50µm。(C)Lcn2,Cxcr2S100A8总结肠组织表达Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre老鼠在DSS结肠炎的9天中存在分析、正常化Gapdh。流式细胞术块Ly6G (D)代表+CD11b+细胞(中性粒细胞)结肠固有层DSS-exposed (LP)Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre老鼠。(E)和百分比的Ly6G计数+CD11b+细胞DSS-exposed的LPCard9Mrp8wtCard9Mrp8cre老鼠。(F) Ly6G和(G) CD11b表达Ly6G (MFI,平均荧光强度)+CD11b+中性粒细胞从Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre老鼠。数据点代表个人的老鼠。数据均值±SEM的两个独立的实验。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001由Mann-Whitney U测试。DSS,葡聚糖硫酸酯钠。

白色念珠菌杀死能力影响Card9删除在中性粒细胞

调查造成的缺陷Card9删除在Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt中性粒细胞,我们开发了几个与Ly6G在体外实验中+中性粒细胞分离纯化使用mac从小鼠骨髓列。免疫荧光法、扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)分析并没有显示明显的结构两种基因型之间的区别(在线补充图3)。在功能方面,我们测试了中性粒细胞能够杀死微生物,特别是真菌CARD9起着至关重要的作用在宿主防御真菌感染人类和老鼠。20 25的确,白念珠菌造成强烈的影响能力Card9删除在中性粒细胞(图4)。96孔板的endpoint-dilution生存分析显示,两倍白念珠菌cfu(集落形成单位)后存活24小时co-incubationCard9- / -Card9Mrp8cre中性粒细胞与Card9WT或Card9Mrp8wt分别控制(图4 a, B)。一笔使用琼脂平板上的菌落计数法测定证实Card9Mrp8cre中性粒细胞有能力杀死受损白念珠菌相比之下,Card9Mrp8wt(图4 c)。Card9删除在中性粒细胞吞噬作用本身没有影响,如流式细胞仪实验用异硫氰酸荧光素(FITC)共轭酵母聚糖(从酿酒酵母细胞壁),或文化生活白念珠菌绿色荧光蛋白或大肠杆菌绿色荧光蛋白(在线补充图S4A, B)。此外,我们没有观察到不同水平的活性氧(ROS)生产的中性粒细胞之间随着时间的推移,这两个基因型对十四烷酸佛波醇酯(PMA),一个PKC-dependent中性粒细胞激活或酵母聚糖,一种真菌刺激(网络图自己补充,E)。尽管Card9参与自噬,30.这种细胞过程似乎并没有受到影响Card9删除在体外中性粒细胞,如图所示的常态p62 western-blots和LC3BII /我比(在线补充图4 f)。同样,在我们的条件,我们没有看清楚NETosis模式差异中性粒细胞删除或不是CARD9针对酵母聚糖(在线补充图4 h)。

Candida albicans killing capacity is impacted by Card9 deletion in neutrophils. (A) Representative images of C. albicans cfu number at the endpoint dilution after infection of Card9WT, Card9 -/-, Card9 Mrp8wt or Card9 Mrp8cre neutrophils for 24 hours, using a microscope (top) or directly showing C. albicans cfu in the 96-well plate, with a photography from above (middle picture) or a scan from below the plate (bottom picture). (B) C. albicans cfu after infection of neutrophils for 24 hours. Cfu counting was performed in 96 well plates using a microscope. Data points represent individual mice. Data are mean±SEM of three independent experiments. (C) C. albicans cfu number after infection of Card9 Mrp8wt or Card9 Mrp8cre neutrophils for three or 24 hours. Cfu counting was performed after plating on YEPD agar plates. Data are mean±SEM of two independent experiments. (D) Experimental design of antibiotic treatments and C. albicans inoculation in mice treated with 3% DSS. (E) weight, (F) DAI and (G) colon length of DSS-exposed Card9 Mrp8wt and Card9 Mrp8cre mice after colonisation with C. albicans. (H–K) Fungal burden in the faeces (H), caecal content (I), caecal and colon tissue (J) and liver, spleen and kidney (K) of DSS-exposed Card9 Mrp8wt and Card9 Mrp8cre mice after colonisation with C. albicans. Data are mean±SEM of two independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 as determined by one-way ANOVA with Tukey’s post-test (A), two-way ANOVA with Sidak’s post-test (E, F) and Mann-Whitney test (C, G, I–K). Genta, gentamycin. ANOVA, analysis of variance; DSS, dextran sulfate sodium.
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
图4

白色念珠菌杀死能力影响Card9删除在中性粒细胞。(一)代表的图像白念珠菌感染后菌落数的端点稀释Card9WT,Card9- / -,Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre中性粒细胞的24小时内,使用显微镜(上)或直接显示白念珠菌cfu的96孔板,摄影从上面(中间图片)或从以下扫描板(下图)。(B)白念珠菌中性粒细胞的cfu感染后24小时。在96孔板的Cfu计数进行使用显微镜。数据点代表个人的老鼠。数据均值±SEM的三个独立的实验。(C)白念珠菌感染后菌落数Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre中性粒细胞3 - 24小时。Cfu计数进行电镀后YEPD琼脂板上。数据均值±SEM的两个独立的实验。(D)实验设计的抗生素治疗白念珠菌接种小鼠接受3% DSS。(E)重量,戴秉国(F)和(G)结肠DSS-exposed的长度Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre老鼠在殖民白念珠菌。(H-K)真菌负担的粪便(H)、盲肠的内容(I),如盲肠和结肠组织(J)和肝脏、脾脏和肾脏DSS-exposed (K)Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre老鼠在殖民白念珠菌。数据均值±SEM的两个独立的实验。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001由单向方差分析与图基测试后(A),双向方差分析与Sidak测试后(E, F)和Mann-Whitney测试(C、G i (k)。Genta,庆大霉素。方差分析,方差分析;DSS,葡聚糖硫酸酯钠。

因此,我们遵循的轨道真菌杀死调查是否缺乏Card9表达在中性粒细胞驱动器一般损害免疫系统的控制感染。在DSS-induced结肠炎模型,我们发现轻微的但非重大的增加在总真菌/细菌DNA比天7和12的粪便Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt老鼠(在线补充图S4G)。这些数据显示的能力降低Card9Mrp8cre老鼠含有真菌在发炎的肠道扩张。然而,这种效应可能很难指出由于SPF小鼠微生物群的真菌丰度很低。因此,进一步揭示潜在的表型,我们诱导小鼠结肠炎治疗广谱抗生素和antifongic鸡尾酒和填喂法白念珠菌扩大肠道真菌负载(图4 d)。结肠炎严重程度增加Card9Mrp8cre老鼠是维护在此设置(图4比)。白念珠菌负荷略增加(尽管不是统计学意义)在盲肠的内容(图4 h,我),结肠和盲肠的组织(图4 j)Card9Mrp8cre老鼠,和菌落的数量从肝、脾和肾都明显高于与之相比Card9Mrp8wt老鼠(图4 k)。这些结果表明,Card9表达中性粒细胞是至关重要的控制真菌负载在肠道发炎,直接易位白念珠菌从直觉到肝脏,并避免其系统性传播。

缺席的情况下Card9通过增加细胞凋亡影响中性粒细胞生存

探索能力受损的机制Card9Mrp8cre中性粒细胞杀死白念珠菌尽管完整的吞噬作用,自噬和活性氧的生产,我们研究了中性粒细胞存活率通过流式细胞术使用AnnexinV-FITC分析耦合的生活/死染色(图5)。AnnexinV揭示细胞凋亡,坏死细胞而生活/死只污渍渗透。有趣的是,在37°C小时孵化后,Card9Mrp8cre中性粒细胞有显著提高AnnexinV-FITC MFI相比Card9Mrp8wt中性粒细胞(图5 a, B)。一致,增加凋亡(Q1, AnnexinV的百分比+LD- - - - - -)和死亡(晚期凋亡/坏死)中性粒细胞(Q2, AnnexinV+LD+)和可行的中性粒细胞减少(第四季度,AnnexinV- - - - - -LD- - - - - -),被观察到Card9Mrp8cre基因型(图5 c)。此外,表面的表达CD62L标记(一个迷失在细胞表面蛋白激活)降低Card9Mrp8cre、CD62L的比例较低+细胞和CD62L的比例更高- - - - - -细胞(图5 d)。这些结果表明过度基底的激活Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt中性粒细胞。也得到了类似的结果Card9- / -与Card9WT中性粒细胞(在线补充图S5A-D),确认所带来的影响Card9中性粒细胞的生存。

图5

缺席的情况下Card9通过增加细胞凋亡影响中性粒细胞生存。(一)流式细胞术块Ly6G代表+CD11b+中性粒细胞的骨髓净化Card9Mrp8wt(左)和Card9Mrp8cre(右)小鼠,co-stained AnnexinV和生活/死亡标志。(B) AnnexinV Ly6G的小额信贷机构+CD11b+中性粒细胞从Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre老鼠,孵化为1小时37°C。(C)凋亡中性粒细胞的百分比(Q1: AnnexinV+LD- - - - - -细胞),死亡(晚期凋亡/坏死)中性粒细胞(Q2: AnnexinV+LD+细胞)和可行的中性粒细胞(第四季度:AnnexinV- - - - - -LD- - - - - -在Ly6G细胞)+CD11b+人口。(D) CD62L百分比+和CD62L- - - - - -中性粒细胞在Ly6G+CD11b+人口。数据代表的两个独立的实验。(E)直方图代表基因本体之间的生物过程大大丰富蛋白表达下调(蓝色)或调节(红色)Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt中性粒细胞在如果条件。(F)睡眠热图代表mitochondria-related蛋白质显著表达下调或调节Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt中性粒细胞在如果条件。(E, F)从蛋白质组学数据分析。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * * p < 0.0001由Mann-Whitney U测试(B)和双向方差分析与Sidak测试后(c - d)。方差分析,方差分析;小额信贷机构,平均荧光强度。

进一步说,我们进行了蛋白质组学分析Card9Mrp8crevsCard9Mrp8wt中性粒细胞小时孵化后37°C。这种方法显示,大量的蛋白质与细胞代谢通路相关监管两种基因型之间有差异。事实上,基因本体论(去)功能分析显示,浓缩在许多细胞代谢过程中蛋白质统计表达下调或调节Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt中性粒细胞(图5 e在线补充图S5E)。特别是,我们观察到的高患病率的线粒体蛋白质在不同监管候选人之间的两个基因型(图5 f),这表明嗜中性粒细胞缺乏线粒体功能的影响Card9

Card9中性粒细胞生存通过影响线粒体功能的控制

随后,我们分析了中性粒细胞线粒体功能使用MitoTracker绿色(反映线粒体质量)和MitoTracker红色(反映线粒体膜电位)标记流式细胞术测定(图6)。没有观察到不同的小额信贷机构,但我们观察到显著增加MitoGreen的百分比+MitoRed- - - - - -中性粒细胞(新陈代谢失调或不活跃的线粒体)Card9Mrp8cre相比Card9Mrp8wt基因型(图6)。Tetramethylrhodamine甲酯(TMRM)分析评估线粒体膜电位证实凋亡的增加,新陈代谢(TMRM强调细胞- - - - - -)Card9Mrp8cre中性粒细胞(图6 b)。这些结果表明,缺陷的生存Card9Mrp8cre中性粒细胞可能由于能量代谢的改变。实时生物能量学剖面分析表明,使用海马技术Card9Mrp8cre中性粒细胞具有更高的基底细胞耗氧率在水压力试验(图6 c),表明人类活动与更高的氧化磷酸化Card9Mrp8wt中性粒细胞。基础呼吸和ATP产量都是高度增加Card9Mrp8cre中性粒细胞(图6 d)。此外,试验表明,海马实时ATP率Card9Mrp8cre中性粒细胞具有线粒体ATP (mitoATP)产量增加,而糖酵解ATP (glycoATP)产量只有轻微下降,如图所示的ATP率指数和能量图(图6 e)。海马糖酵解速率试验证实了温和的基底细胞外酸化率的降低Card9Mrp8cre中性粒细胞(在线补充图S6A)。然而,代谢组学分析中性粒细胞上层的孵化24小时显示乳酸产量减少,导致乳酸/葡萄糖比值降低Card9Mrp8cre中性粒细胞(在线补充图S6B)。当我们Card9WT相比,也获得了类似的结果Card9- / -在上述分析中性粒细胞(在线补充图S6C-E)。因此,Card9删除在中性粒细胞诱导线粒体的overactivation和倾向于降低糖酵解的活动,这是正常的中性粒细胞的主要能量来源。阻止糖酵解2 dg (2-Deoxy-D-glucose)凋亡率增加Card9Mrp8wt但不是的Card9Mrp8cre中性粒细胞;表明糖酵解更重要Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre中性粒细胞(图6 f(左)。相反,阻止线粒体呼吸链与oligomycineA的凋亡率增加Card9Mrp8cre但不是的Card9Mrp8wt中性粒细胞,展示线粒体作为能源的至关重要的作用Card9Mrp8cre中性粒细胞(图6 f,对吧)。因此,相反Card9Mrp8wt中性粒细胞主要依靠糖酵解能量的来源,Card9Mrp8cre中性粒细胞出现与overactivation新陈代谢的改变相关的线粒体功能失调的状态,导致细胞凋亡。事实上,我们通过MitoSOX染色显示,线粒体活性氧的生产(mtROS)是在增加Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt中性粒细胞(图6克(左)。这种区别是增加了2 dg治疗线粒体呼吸是提升(图6克,对吧)。相反,阻断线粒体呼吸与oligomycinA减少之间的差异Card9Mrp8creCard9Mrp8wt中性粒细胞(图6克,对吧)。这些结果表明,增加线粒体呼吸Card9Mrp8cre中性粒细胞生成mtROS产量的增加,细胞凋亡的主要决定因素。31日肠道炎症与高度的氧化应激有关。评估氧化应激的表型的影响Card9Mrp8cre中性粒细胞,治疗1小时与H2O2。增加细胞凋亡和坏死率中观察到Card9Mrp8cre中性粒细胞是氧化应激的强比基底条件(图6 h)。这些结果表明,CARD9的作用在中性粒细胞的生存能力,特别是在氧化条件下,由对线粒体功能的影响。一致,血液中性粒细胞CARD9 IBD患者携带的单核苷酸多态性最常见的与炎症性肠病(rs10781499,纯合状态)有增加死亡率与年龄和sex-matched控制IBD患者和健康者(图6我)。

Card9 controls neutrophil energetic metabolism by affecting mitochondrial function. (A) Representative flow cytometry plots and precentages of MitoGreen+MitoRed- cells (corresponding to cells with dysfunctional mitochondria) among Ly6G+CD11b+ neutrophils. Neutrophils were purified from the bone marrow of Card9 Mrp8wt or Card9 Mrp8cre mice, and incubated for 1 hour at 37°C. (B) Representative flow cytometry plots and percentages of TMRM- cells (corresponding to cells with dysfunctional mitochondria/apoptotic or metabolically inactive cells) among Ly6G+CD11b+ neutrophils. (C) Oxygen consumption rate (OCR) of Card9 Mrp8wt and Card9 Mrp8cre neutrophils measured during a Seahorse Cell Mito Stress assay. (D) Basal respiration (late rate measurement before oligomycin injection (t3) - non-mitochondrial respiration rate (t12)) and ATP production rate (late rate measurement before oligomycin (ATP synthase blocker) injection (t3) – minimum rate measurement after oligomycin injection (t6) obtained from the Seahorse Cell Mito Stress assay. (E) ATP rate index and energetic map of Card9 Mrp8wt and Card9 Mrp8cre neutrophils obtained from the Seahorse Real-time ATP rate assay. (F) Percentage of apoptotic cells among the Ly6G+CD11b+ neutrophil population of Card9 Mrp8wt and Card9 Mrp8cre genotypes after treatment with 2-DG 10 mM (left) or oligomycin 1.5 μM (right) for 1 hour. (G) Representative flow cytometry plots and precentages of MitoSOXhigh cells (corresponding to cells with high mitochondrial ROS) among Card9 Mrp8wt and Card9 Mrp8cre neutrophils incubated for 1 hour at 37°C. (H) Percentage of apoptotic and necrotic cells among the Ly6G+CD11b+ neutrophil population of Card9 Mrp8wt and Card9 Mrp8cre genotypes after addition of H2O2 0.01 mM for 1 hour to increase oxydative stress. (I) Death rate of human blood neutrophils from patients with IBD carrying the CARD9 single-nucleotide polymorphism most commonly associated with IBD (rs10781499, homozygous state, n=8) and age-matched and sex-matched control patients with IBD (n=11) and healthy subjects (n=6). Data are mean±SEM of at least two independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 as determined by Mann-Whitney test (A, B, D, E, I) or two-way ANOVA with Sidak’s post-test (F, G, H). Norm. Unit, normalised unit; FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone; Rot/AA, Rotenone/AntimycinA; 2DG, 2 deoxy-glucose; OligoA, oligomycinA. ANOVA, analysis of variance; IBD, inflammatory bowel disease; ROS, reactive oxygen species.
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
图6

Card9控制中性粒细胞通过影响线粒体能量代谢的功能。流式细胞术(A)代表MitoGreen情节和要+MitoRed- - - - - -细胞(对应于细胞线粒体功能失调)Ly6G之一+CD11b+中性粒细胞。中性粒细胞的骨髓净化Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre老鼠,孵化为1小时37°C。流式细胞术(B)代表TMRM情节和百分比- - - - - -细胞(对应于细胞线粒体功能失调/凋亡或新陈代谢活性细胞)Ly6G之一+CD11b+中性粒细胞。(C)耗氧速率(OCR)Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre中性粒细胞中测量海马细胞水压力试验。(D)基底呼吸(迟到率测量之前寡霉素注射(t3)——non-mitochondrial呼吸率(病人))和ATP产量(迟到率测量之前寡霉素(ATP合酶阻断剂)注入(t3) -最低比率测量寡霉素注射后(t6)从海马细胞获得水压力试验。(E) ATP率指数和精力充沛的地图Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre中性粒细胞从海马实时获得ATP率测定。(F) Ly6G中凋亡细胞的比例+CD11b+中性粒细胞的人口Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre基因型与2 dg治疗后10毫米(左)或寡霉素1.5μM(右)为1小时。流式细胞术(G)代表MitoSOX情节和要高的细胞(对应于细胞线粒体ROS)之间Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre中性粒细胞孵化为1小时37°C。(H) Ly6G凋亡和坏死细胞的比例+CD11b+中性粒细胞的人口Card9Mrp8wtCard9Mrp8cre基因型后添加过氧化氢0.01毫米1小时增加oxydative压力。(I)患者死亡率的人类血液中性粒细胞炎症性肠病携带CARD9单核苷酸多态性最常见的与炎症性肠病(rs10781499,纯合状态,n = 8)和年龄和sex-matched控制IBD (n = 11)患者和健康者(n = 6)。数据均值±SEM至少两个独立的实验。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001由Mann-Whitney测试(A、B、D、E、我)或双向方差分析与Sidak测试后(F, G, H)。规范。单位,正常化单位;FCCP,羰基氰化物4 - (trifluoromethoxy)苯腙;腐烂/ AA,鱼藤酮/ AntimycinA;2 dg, 2 deoxy-glucose;OligoA oligomycinA。方差分析,方差分析; IBD, inflammatory bowel disease; ROS, reactive oxygen species.

讨论

总之,这项研究显示,在缺乏CARD9,线粒体功能障碍在中性粒细胞通过细胞凋亡导致他们过早死亡,尤其是在氧化环境中。肠道功能的减少中性粒细胞影响真菌控制和增加对肠道炎症。CARD9多态性与炎症性肠病有关。老鼠研究显示CARD9宿主防御和肠道屏障的贡献,特别是通过il - 22生成的生产和调节肠道微生物群的代谢活动。25日26日然而,CARD9在疾病发病机理中的作用尚未阐明在细胞水平上。我们的研究显示,Card9删除在中性粒细胞,相反上皮或CD11c+细胞,增加DSS-induced结肠炎易感性。我们因此专注于研究CARD9表达式在中性粒细胞功能的作用。事实上,研究了中性粒细胞在不同型号的IBD和真菌感染,但他们的直接贡献发病机理和CARD9在这些机制仍然知之甚少。4 5 32 33

人类CARD9不足导致中性粒细胞真菌杀死受损,导致选择性缺陷包含侵入性真菌感染。34在人类和老鼠,需要CARD9小胶质细胞中性粒细胞招募和控制真菌感染中枢神经系统。35 36CARD9信号也参与中性粒细胞吞噬作用和NETosis(中性粒细胞胞外陷阱)功能,增强老鼠生存的致命剂量白念珠菌37此外,CARD9表达式在小鼠中性粒细胞促进autoantibody-induced关节炎和皮炎,38和炎症水平中性皮肤病的小鼠模型。39与这些研究,我们发现Card9删除影响中性粒细胞的能力杀死真菌体外和体内,但我们没有发现影响中性粒细胞结构,ROS生产,自吞噬,吞噬作用或NETosis。我们没有检查CARD9趋化性原因的作用,真菌感染患者的上下文中CARD9不足,neutrophil-intrinsic趋化性没有影响。24在DSS-induced结肠炎,Card9在中性粒细胞缺乏症并不影响他们招聘结肠,但成熟的中性粒细胞减少。我们不认为抗真菌的功能受损解释结肠炎的易感性增加,而是表明CARD9-deficient中性粒细胞产生重大功能缺陷。事实上,我们发现没有CARD9在老鼠和人类中性粒细胞增加死亡率。这个过早死亡是由于线粒体overactivation mtROS和增加生产。事实上,mtROS生成副产品的线粒体呼吸是细胞凋亡的主要决定因素。31日其他卡蛋白质调节凋亡信号通过CARD-CARD域交互。13除了调节炎症、CARD9卡蛋白家族的一员,最近显示抑制mitochondria-dependent凋亡的心肌细胞氧化应激。40在这里,我们表明,CARD9介导的线粒体功能和细胞凋亡中性粒细胞,尤其是在氧化环境中。有趣的是,观察线粒体功能异常在人类中活跃的加州大学。41需要进一步调查充分阐明线粒体overactivation对中性粒细胞功能的影响,尤其是体内。的影响Card9对中性粒细胞线粒体功能可能无法完全解释易感性的增加Card9Mrp8cre老鼠DSS结肠炎。此外,其他细胞可能参与了Card9- / -小鼠表型,解释的影响Card9删除对微生物群的代谢活动,我们表明,这不是依赖于中性粒细胞。25日26日

中性粒细胞包含很少的线粒体与其他白细胞相比,主要依赖糖酵解产生ATP,执行他们的指定任务至关重要。这使得能源发电在低氧环境中,氧气用于中性粒细胞效应函数。42因此,中性粒细胞的依赖糖酵解可能是一种适应允许氧气用于抗菌反应而不是进入氧化磷酸化。42在这里,我们表明,在缺乏CARD9,线粒体overactivation,导致过早死亡的中性粒细胞通过细胞凋亡和抗菌功能的丧失。DSS和anti-CD40结肠炎模型执行的anti-Ly6G抗体,尤其是耗尽中性粒细胞,表明缺乏中性粒细胞的强烈加剧肠道炎症和影响老鼠的生存。43在人类中,嗜中性白血球减少症与严重的肠道炎症有关,对于粒细胞减少性小肠结肠炎44在表型和IBD-like表型CGD患者45例如。过度的氧化磷酸化和线粒体ATP生产中性粒细胞也可以破坏周围组织,加重炎症。这可以解释缺乏对小肠结肠炎易感性增加Card9,尤其是在炎症环境中中性粒细胞活动通常是严格控制的低氧的压力。在人类中,«糖原存储疾病类型Ib»引起中性粒细胞的功能缺陷由于糖酵解障碍和受损的能量体内平衡。46这种疾病与IBD-like表型,突出的重要性,中性粒细胞在肠道健康的新陈代谢。46个47Immunometabolism是一个核心概念,免疫和代谢影响对方在两个方面:(1)能量代谢影响免疫功能,这是有据可查的淋巴细胞和巨噬细胞,48但不为中性粒细胞;(2),我们表明,在先天免疫蛋白以其角色,CARD9,也会影响细胞代谢。需要进一步调查了解CARD9并与线粒体功能直接或间接的方式。

中性粒细胞参与各种疾病,包括感染、心血管疾病、炎症性疾病和癌症,这使得它们令人兴奋的治疗干预的目标。49尽管疾病复杂含义的中性粒细胞,各种治疗方法旨在增强,抑制或恢复中性粒细胞功能,根据病理变化。与过多的中性粒细胞炎症活动,其衰减可以期望,即使杀死函数对微生物可能仍然需要被保留下来。我们的工作表明,增加细胞凋亡中性粒细胞不减轻肠道炎症,即使这些细胞对疾病发展做出贡献。最近的研究表明大量中性粒细胞的表型和功能异质性。49因此,针对特定族群可能允许有害方面的中性粒细胞的衰减不影响宿主防御。一些neutrophil-targeted治疗策略获得了利益,特别是在IBD的背景下积极作用的生长因子粒细胞集落刺激因子(g - csf)。50最近,anti-GM-CSF自身抗体也被证明之前克罗恩氏病发病数年。51打开有前途的选择众多复杂的病态。

材料和方法

老鼠

Card9- / -,Rag2- / -xCard9- / -,Rag2- / -,Card9loxxMrp8cre,Card9loxxVillincre和Card9loxxCD11ccre对C57BL / 6 j小鼠背景得到安东尼的研究中心和安置IERP特定的无菌条件下(INRAE案例)。动物实验根据机构的指导方针进行经当地伦理委员会批准的法国当局的“拉西'Ethique en实验Animale”(COMETHEA CEEA45)。

DSS诱导结肠炎和殖民白念珠菌

老鼠饮用水管理补充了2 - 3% (wt /卷)DSS (MP生物医学)5 - 7天(根据每个实验结肠炎严重程度),然后水只有5天。动物是减肥每天监测。为白念珠菌殖民化,老鼠服用0.4毫克/毫升链霉素,300 U /毫升青霉素G和0.125毫克/毫升氟康唑示图4

组织学

结肠癌样本固定,嵌入在石蜡和沾染了)。幻灯片进行扫描和分析来确定组织学评分(在线补充表S1)。25

粪便DNA提取和总细菌和真菌量化

粪便DNA提取如前所述。26卢娜普遍qPCR大师混合(新英格兰生物学实验室)是用于量化真菌ITS2序列和TaqMan基因表达分析(技术)的量化细菌16 s rDNA序列。

细胞制备和刺激

从结肠上皮细胞组织使用dithiotheritol(德勤)/ ethylenediaminetetraacetic (EDTA)缓冲区。中性粒细胞是纯化使用anti-Ly6G从小鼠骨髓微超纯和mac分离列(Miltenyi研究)。CD11c+从小鼠脾细胞纯化使用anti-CD11c微超纯和mac分离列(Miltenyi研究)。纯度检查和细胞计数进行使用BD Accuri C6流式细胞分析仪(BD生物科学)。净化后,中性粒细胞在96年被播种,悬挂板(Sarstedt),休息30分钟的RPMI 1640中(Gibco ThermoFisher科学)heat-inactivated添加2%胎牛血清的边后卫,2 dg 10毫米,oligomycine 1.5μm或过氧化氢0.01和孵化37°C表示。执行隔离LP免疫细胞如前所述。52

使用定量rt - pcr基因表达分析

总RNA与结肠癌样本或细胞悬浊液使用RNeasy迷你包(试剂盒)和定量rt - pcr进行使用QuantiTect逆转录工具包(试剂盒)和卢娜普遍rt - pcr试剂盒(新英格兰生物学实验室)StepOnePlus装置(应用生物系统公司)与特定的鼠标寡核苷酸(在线补充表S2)。我们使用了2−ΔΔCt量化方法用鼠标Gapdh作为一个内生控制和WT组校准器。

免疫印迹分析。小鼠组织或细胞悬浊液细胞溶解使用Laemmli缓冲区,加载在sds - page和分析抗体CARD9 (8: sc - 374569,圣克鲁斯生物技术),或β-ACTIN (D6A8, CST)。

流式细胞术、细胞分类和功能分析

流式细胞术是利用光敏电阻Fortessa×20 (BD)和细胞进行流式细胞仪咏叹调机器(BD)。细胞凋亡测定,4×105中性粒细胞是沾染了AnnexinV-FITC绑定缓冲(Miltenyi研究)和生活/死亡(僵尸Aqua可以解决的,BioLegend)。线粒体分析,MitoTracker绿色和红色MitoTracker调频或MitoSOX红色线粒体超氧化物指标,被添加到中性粒细胞15分钟在mac RT缓冲或PBS,分别(ThermoFisher科学)。另外,中性粒细胞与TMRM孵化的RPMI 20分钟在37°C (Abcam)。吞噬作用测定,105中性粒细胞刺激zymosan-FITC(50μg / ml,荧光素zymosanA BioParticles轭合物,FisherScientific),白念珠菌gfp (MOI1:1)或大肠杆菌gfp (MOI1:10) 45分钟。细胞被沾表面抗体在mac缓冲区(在线补充表S2)。

端点稀释生存分析

分离小鼠中性粒细胞被播种在105细胞/在RPMI 96 -孔板+ 2%的边后卫和感染白念珠菌(连续4倍稀释的OD = 1的解决方案添加了画(第一行,MOI20:1;row2, MOI5:1…)。24小时后在37°C,殖民地的视觉与尼康TMS倒置显微镜和计算最低的稀释(row7-8)。

死亡分析

纯化中性粒细胞被播种在96孔板106细胞与PBS /好,刺激,白念珠菌(MOI1)或大肠杆菌(MOI10) 90分钟37°C。细胞被洗和细胞溶解200μl TritonX100 0.025%。连续稀释镀YEPD或者磅盘子。

Oxydative破裂

实验进行一个三星LB942读者使用105中性粒细胞在200年µL汉克的平衡盐溶液(哈佛商学院,ThermoFisher科学)和鲁米诺80年μm(σ)和PMA刺激(0.1µg /毫升;σ)或opsonised酵母聚糖(20毫克/毫升酵母聚糖酿酒酵母;σ)。索引的最大相对发光(相对光单位(RLU))被计算为:索引RLU max = ((haemochromatosis病人最大RLU) /(健康的捐赠者最大RLU))×100。另外,superoxyde歧化酶(5单位/毫升)和过氧化氢酶(10单位/毫升)被添加到分化和细胞内ROS总产量。吸光度测量30分钟的550海里。

实时生物能量学概要分析

水压力测试、糖酵解率分析和实时ATP测定进行XF96细胞外磁分析器(海马生物科学)。小鼠中性粒细胞被播种在2×105细胞/在RPMI + 2%的边后卫poly-L-lysine预涂板在0.01%。休息两个小时后,细胞被洗海马RPMI中、孵化为1小时37°C没有二氧化碳。分析仪,寡霉素1.5µM FCCP 1µM,鱼藤酮+ antimycinA 0.5µM和2 dg 50µM注射在指定的时间。每次实验后蛋白质标准化执行,没有明显的蛋白浓度和细胞表型的差异。

电子显微镜

纯化中性粒细胞刺激了白念珠菌(MOI 2)或大肠杆菌(MOI 10)为1小时37°C,洗在PBS和固定。样品制备、SEM和TEM分析显微成像平台MIMA2(大学Paris-Saclay, INRAE, benoir,案例法国,https://doi.org/10.15454/1.5572348210007727E12)。

蛋白质组学

5µg蛋白提取物被提交为胶液消化。像之前描述的那样进行脱盐。53多肽进行分析在nanoElute-timsTOF ProLC-MS / MS系统(力量)。54原始文件进行分析使用MaxQuant V.1.6.10.43:数据库UP000000589_10090(21 994项,2020年6月17日)。数据过滤、非难和ProStar零V.1.20.0进行统计分析。54蛋白质与错误发现率(罗斯福< 5%(磅方法)是重要的褶皱变化> 1.2。

核磁共振

200年µL培养基被1 d 1 h - nmr分析。核磁共振光谱都记录在一个力量AvanceIII 800 mhz光谱仪配备了QPCI 5毫米低温探测头。光谱是收购和加工使用力量上旋V.4.0软件。量化的葡萄糖和乳酸进行使用添加25% TSPd4 D2O作为内部标准。

病人和样品收集

炎症性肠病的诊断是由临床、放射学、内镜和组织学标准。病人特点提出了在线补充表S3。人类血液neutrohpils分离用葡聚糖沉积技术和聚蔗糖密度梯度,并沾AnnexinV-FITC (Miltenyi研究)和现场/死亡标记(僵尸Aqua可以解决的,BioLegend)。数据获得使用CytoFlex血细胞计数器(贝克曼)。

统计分析

使用GraphPad棱镜7节软件执行统计分析。

数据可用性声明

所有数据都包含在相关研究文章或上传在线补充信息。

伦理语句

病人同意出版

伦理批准

从当地伦理委员会批准了(拉西德保护des人巴黎第四,IRB 00003835, Suivitheque研究中,注册号2012/05NICB)。参与者给知情同意参与这项研究之前的部分。

引用

补充材料

脚注

  • 推特@h_sokol

  • 贡献者CD和HS的构思和设计研究,进行数据分析和写的手稿,充当担保人;CD设计并进行实验,除非另有指示;厘米,JP, AA, M-LM,提单,环球数码创意,MS, CG, MP, YW提供技术帮助和阿尔•体外或体内实验;JS和BM进行免疫荧光显微镜实验;CeP和SC进行蛋白质组学分析;FB, EC和AR metobolomics分析;TL提供小鼠和公司进行基因分型;帽,SL与ROS JE-B帮助生产化验;基本与中性粒细胞为测试提供了Scenith包;CD,厘米,摩根大通,高钙、PL NR, JE-B、BM和海关讨论实验和结果。

  • 相互竞争的利益没有宣布。

  • 病人和公众参与病人和/或公众参与设计,或行为,或报告,或传播本研究计划。是指部分进一步了解细节的方法。

  • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

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