条文本

原始研究
小说启动—提高免疫治疗抑制B和D型肝炎病毒感染
  1. 王妃发热管1,
  2. Panagiota Maravelia2,
  3. 古斯塔夫Ahlen2,
  4. 桑德拉Ciesek3,4,5,
  5. 佩雷斯Noelia卡罗2,
  6. 安娜Pasetto2,
  7. Stephan城市6,
  8. 弗雷娅Van Houtte1,
  9. 列文Verhoye1,
  10. (Heiner Wedemeyer7,
  11. 马格努斯·约翰逊8,
  12. 佬司Frelin2,
  13. 马蒂·Sallberg2,
  14. 菲利普Meuleman1
  1. 1肝脏传染病实验室(LLID)诊断部门科学、医学和健康科学学院,根特大学,根特、比利时
  2. 2临床微生物学,分工部门实验室医学,卡罗林斯卡医学院,斯德哥尔摩、瑞典
  3. 3歌德大学医学病毒学研究所大学医院,法兰克福、德国
  4. 4弗劳恩霍夫研究所转化医学和药理学ITMP,法兰克福、德国
  5. 5德国感染研究中心、DZIF、外部合作伙伴的网站,法兰克福、德国
  6. 6传染病、分子病毒学,海德堡大学医院,海德堡、德国
  7. 7美国胃肠病学、肝病和内分泌学,汉诺威医学院,汉诺威、德国
  8. 8医学科学学院、炎症反应和感染易感性中心(iRiSC),医学院和健康,据英国大学,据英国、瑞典
  1. 对应到教授菲利普·Meuleman肝脏传染病实验室(LLID)诊断部门科学、医学和健康科学学院,根特大学,绅士,比利时;philip.meuleman在{}ugent.be;马蒂·Sallberg教授的临床微生物实验室医学系,卡罗林斯卡医学院,斯德哥尔摩,瑞典;matti.sallberg在{}ki.se

文摘

客观的慢性乙肝病毒/丁肝病毒感染是肝癌的主要原因。目前的治疗只能很少消除乙肝病毒和丁肝病毒。我们之前开发的preS1-HDAg免疫疗法可以诱导中和抗体体内乙肝病毒和提高HBV / HDV-specific t细胞。这里,我们进一步研究不同的启动—提高战略是否能规避t细胞耐受和排除体内丁肝病毒双重感染。

设计DNA prime-protein推动策略是评估免疫原性在老鼠和兔子。规避t细胞耐受能力评估在免疫活性的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)转基因小鼠。中和乙肝病毒和丁肝病毒在免疫缺陷评估体外和人类肝脏嵌合小鼠过继转移。

结果启动—提高策略引出健壮的HBV / HDV-specific t细胞和preS1-antibodies,可以有效防止乙肝病毒和丁肝病毒感染体外和体内(合作)。在老鼠模型中代表慢性HBsAg携带者状态,活跃的高水平的免疫质数preS1-antibodies HDAg-specific t细胞。此外,将诱发抗体完全保护HBV-infected人类肝脏嵌合小鼠从丁肝病毒双重感染。

结论preS1-HDAg免疫疗法所描述的在此显示免疫原性,诱发抗体是高度有效的预防感染乙肝病毒和丁肝病毒(超级)在体外和体内。我们的疫苗可以补充当前和未来的治疗慢性乙肝病毒和丁肝病毒感染的控制。

  • 抗病毒治疗
  • 乙型肝炎
  • D型肝炎
  • 免疫疗法
  • 慢性病毒性肝炎

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已知在这个问题上是什么?

  • 目前还没有治疗可以消除慢性乙肝病毒或丁肝病毒感染。

  • 慢性丁肝病毒感染是最有害的在所有病毒性肝炎感染死亡率最高。

  • 参与和促进宿主先天和适应性免疫反应需要规避由乙肝病毒和免疫逃避策略施加达到一个高度要求功能治愈。

  • 我们之前开发preS1-HDAg免疫疗法提供乙肝病毒/ HDV-specific t细胞和体内乙肝病毒中和抗体。

有什么新发现吗?

  • 这种疫苗的方法能够防止乙肝病毒和丁肝病毒感染体外具有明显的剂量效应。

  • 此外,转移immunotherapy-induced抗体免疫活性的动物接种疫苗可以有效预防乙肝病毒/丁肝病毒合并感染,更重要的是,防止丁肝病毒双重感染的人类肝脏嵌合小鼠模型。

  • 主动免疫接种的乙肝表面抗原(HBsAg)转基因小鼠,代表慢性HBsAg携带者状态,能够诱导高水平的preS1-antibodies HDAg-specific t细胞。

它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

  • 这种疫苗的方法可以绕过问题HBsAg-specific t细胞耐受,能够促进preS1-antibody生产在慢性感染主机环境。

  • 我们的策略可以有效地补充现有的或新兴的疗法,阻止病毒成熟终于实现功能性治愈乙肝病毒和丁肝病毒或防止慢性HBV-infected患者获得有害丁肝病毒双重感染。

介绍

D型肝炎病毒(丁肝病毒)感染患者的慢性感染乙型肝炎病毒(HBV)代表最严重的病毒hepatitides导致死亡率最高的国家。1丁肝病毒需要与乙肝病毒包膜蛋白涂层,即乙肝表面抗原(HBsAg),为其装配和随后的病毒传播。2 - 4尽管预防乙型肝炎病毒疫苗的可用性,但目前慢性感染人数超过2.5亿人,约5% -13%的(6000万人)最终将获得一个丁肝病毒感染。5个6如果丁肝病毒持续下去,发展肝细胞癌(HCC)的风险增加三倍与乙肝病毒后5 - 10年内mono-infection诊断。1 7

目前,还没有有效的功能性治愈慢性乙肝病毒或丁肝病毒。对于慢性丁肝病毒患者,标准疗法仍pegylated-interferon-α,罕见的长期反应。8 - 11最近临床进步丁肝病毒治疗侧重于抑制病毒通过扰乱绑定条目preS1域之间的复杂的大型HBsAg (L-HBsAg)乙肝病毒的蛋白质/丁肝病毒和Na+牛磺胆酸盐co-transporting多肽(NTCP)肝细胞表面的受体。122020年,肽链型entry-inhibitor Myrcludex B (bulevirtide)获得有条件的营销批准用于治疗慢性丁肝病毒患者在欧洲。13尽管鼓励临床结果,可能实现持续off-therapy响应需要额外监控由于HBsAg持久性。此外,不同的(免疫)疫苗策略已在老鼠身上试验过,土拨鼠(Marmota monax)模型使用土拨鼠肝炎病毒(WHV orthohepadnavirus展示强大的同源性与乙肝病毒),然而有限的治疗结果。14 - 24

目前乙肝病毒疗法包括终身管理干扰素有ide (t)类似物,能有效抑制病毒复制,然而阻塞逆转录既不影响蛋白质的生产和发布(特别是HBsAg的),也不是共价闭合环状DNA的合成,这两个代表乙肝病毒持久性和因此肝癌发展的主要原因。13日25日26日

宿主先天和适应性免疫的重要性在控制乙型肝炎病毒感染是目前被广泛接受的。-然而,主要的挑战是规避免疫功能障碍和宽容,是由多个乙肝病毒的免疫逃逸机制,特别是大量生产过剩subviral,非感染性粒子隔离S-specific中和抗体引起的传统相比,乙型肝炎病毒疫苗。25 30-33

这些事实强调需要一个有限的治疗,达到长期控制和最终功能治疗感染。34这可能需要联合疗法针对病毒生命周期的不同步骤,同时促进宿主免疫清除感染的肝细胞储层和/或防止感染的天真的肝细胞。

最近,我们开发了一种新颖的免疫治疗策略能防止乙肝病毒在人类肝脏mono-infection嵌合体小鼠。35这个免疫疗法是基于preS1-sequences诱导preS1 entry-inhibiting抗体,可以更有效地针对传染性病毒粒子与抗体针对S-HBsAg和M-HBsAg相比。31日36-38preS1-sequences都与HDAg,后者充当不同的t细胞表位能够对preS1 '幼稚t细胞。35更具体地说,尽管在慢性乙肝病毒mono-infected HBV-specific t细胞免疫受损患者,HDAg抗原决定基仍然可以'幼稚t细胞内源性抗体生产协助b细胞成熟和诱导t细胞对同行(preS1和HDAg)能够杀死被感染的肝细胞。旁边绕过这个HBV-induced公差,提高了自适应免疫反应也可以保护这些病人获得丁肝病毒双重感染。

在这项研究中,我们第一次评估外源DNA prime-protein促进战略能否有效地提高HBV / HDV-specific t细胞和entry-inhibiting preS1-antibodies野生型老鼠。我们提议下对于调查是否活跃的免疫活性的免疫HBsAg-transgenic (HBsAg-Tg)小鼠,代表慢性HBsAg携带者状态,可能引发t细胞和抗体反应。39最后,我们评估如果诱发的自适应传输preS1-antibodies可以防止乙肝病毒体外/丁肝病毒合并感染和重复感染,免疫缺陷人类肝脏嵌合小鼠(图1)。

图1

疫苗结构和实验概述。四种不同的DNA /蛋白质preS1-HDAg融合结构进行评估在老鼠和兔子基于不同的免疫原性(DNA prime-protein增加)或同源(启动—提高DNA或蛋白质prime - boost)疫苗接种策略为了评估自适应免疫反应(t细胞和抗体)。进一步评估诱发的preS1-antibodies中和乙肝病毒的能力和丁肝病毒合并感染和重复感染设置在纯合子urokinase-type纤溶酶原activator-severe物联合免疫缺陷(uPA)+ / +scid)人类肝脏嵌合体小鼠。图像创建BioRender.com。

材料和方法

更详细的版本的这一节中可以找到在线补充材料

合成preS1-HDAg疫苗结构和免疫协议

D4, D7 D8疫苗构建港口的不同组合L-HDAg (gt1和2)和preS1A / B共识序列(氨基酸2-48)(图1)。HDAg序列得到从四个不同的临床分离株:2和CB;和7/18/83 TW2476。D4 DNA构建生成和评价进行了如前所述。35对三种重组蛋白,即D7, D8和D7-D8融合蛋白结构,向量pET-30a(+)与他(c端)的使用大肠杆菌恒星BL21 (DE3)表达系统。所有生产蛋白质制剂通过了质量控制和评估内毒素去除和纯洁。内毒素水平被量化为2.6欧盟/毫克(D7蛋白质),0.73欧盟/毫克(D8蛋白质)和低于100欧盟/毫克(D7-D8融合蛋白构造)。合成、subcloning、高档生产、蛋白质纯化和表达分析由GenScript (在线补充材料和图1)。

免疫在野生型C57BL / 6 j或HBsAg-Tg老鼠和兔子用质粒DNA进行了。35D7 D8蛋白质制剂和皮下接种要么单独(10µg),作为混合(20µg)或融合蛋白(20µg) (在线补充表1)。之前确定QS21作为免疫原性辅助(图3),明矾是用于一些动物研究(图6在线补充表1)。扩展信息是可用的在线补充文件

启动—提高免疫原性评价ELISA和酶联immunospot试验

有关酶联免疫斑点)ELISA和酶联immunospot试验(试验进行了与此前被描述的完全一致。35 40详细描述是可用的在线补充文件。信息中提供了有关酶联免疫斑点试验中使用的肽在线补充表2

乙肝病毒/丁肝病毒病毒接种物

乙型肝炎病毒(gtD)生产使用HepAD38 tetracycline-inducible细胞系。41丁肝病毒(gt1)生产、质粒pSVL (D3)和pT7HB2.7 co-transfected Huh7.5细胞。上层清液的收集和使用挂钩降水集中。血浆从乙型肝炎病毒mono-infected和HBV /丁肝病毒合并感染患者也用作病毒培养液的体内抗体中和实验和作为主要来源HDV-specific immunofluorescent染色。

体外中和乙肝病毒和丁肝病毒的老鼠preS1-HDAg抗血清

预防乙肝病毒和丁肝病毒感染体外,HepG2。hNTCP细胞被播种在poly-L-lysine-coated 96 -孔板。三天后,乙肝病毒(2.530 IU /细胞)或丁肝病毒培养液(4 IU /单元)在完成杜尔贝科的修改鹰介质(cDMEM)补充2.5%二甲亚砜(DMSO)和4% PEG8000孵化1小时在室温下具有不同小鼠抗血清的稀释(在线补充表1)。天真的血清作为控制和条件都是在重复执行。这virus-antiserum随后添加到HepG2混合物。hNTCP细胞和培养24小时。Myrcludex B (MyrB 200海里)被用作控制和应用于细胞病毒孵化前1小时。24小时后,细胞被洗了三次磷酸盐(PBS)删除病毒培养液;每2 - 3天,抗血清/天真的鼠标或MyrB刷新在cDMEM血清培养基(2.5% DMSO),直到天8 postinfection读出。

乙肝病毒和丁肝病毒免疫荧光染色和成像

乙型肝炎核心抗原(HBcAg)染色,细胞被固定,permeabilised一夜之间在4°C和阻塞。细胞染色相结合的多克隆兔HBc-antibody (DakoCytomation REF-B0586)和一个AlexaFluor 488 -标签山羊antirabbit免疫球蛋白二次抗体(表达载体,REF-A11034)。丁肝病毒免疫荧光(如果)染色进行以类似的方式,利用丁肝病毒病人EDTA-plasma初级抗体和AlexaFluor 488山羊反人类的免疫球蛋白二次抗体(表达载体,REF-A11013)。核与4’,6-diamidino-2-phenylindole复染色(DAPI)。图像捕获使用徕卡TCS-SPE共焦显微镜(20×目标)。每口井,三个随机拍摄照片和所有条件进行重复(每条件六个随机图片)。使用ImageJ软件V.1.53c执行自动细胞计数。

一代的人类肝脏嵌合uPA+ / +scid小鼠和被动免疫工作

人类的肝脏移植生成的嵌合小鼠大约106主要人类肝细胞(供体C342从康宁,荷兰或捐赠L191501 Lonza、瑞士)为纯合子urokinase-type纤溶酶原activator-severe物联合免疫缺陷(uPA)+ / +scid小鼠)如前所述。42 43在小鼠血浆白蛋白量化(通过ELISA)被用来评估肝脏教化的水平。

被动免疫,人类肝脏嵌合uPA+ / +scid小鼠intrasplenically注射100µL总鼠标/或5.5毫克纯化兔兔血清免疫球蛋白1天前乙肝病毒/丁肝病毒合并感染(图4)和丁肝病毒双重感染(图6在线补充图4)。额外的纯化免疫球蛋白注射(100µl - 5.5毫克)腹腔内接种在第一天,4,7,11和14丁肝病毒双重感染后C342-transplanted老鼠(图6);而额外的鼠标总抗血清(50µL)注射在第一天完成,4和7在L191501-transplanted丁肝病毒双重感染小鼠(在线补充图4)。控制老鼠注射了天真的血清或PBS。一个详细的概述所有实验中所示的结构在线补充表1。对于乙肝病毒/丁肝病毒交叉感染,小鼠腹腔注射100µL病毒接种体组成的5×106IU乙肝病毒和1.48×106IU丁肝病毒(包括细胞培养中)。丁肝病毒双重感染,首先在老鼠感染乙型肝炎病毒(5×106IU细胞而或106IU patient-derived)和8周后与丁肝病毒(2.55×105国际单位细胞培养或patient-derived)。血浆收集和病毒血症是由RealStar丁肝病毒/乙肝病毒(RT) qPCR(阿尔托那诊断、德国)后总核酸提取(NucliSENS EasyMag, BioMerieux,法国)。等离子体preS1-antibody滴定度ELISA测定如上所述。

结果

固有免疫原性同源和异源启动—提高策略

我们首先确定了固有免疫原性的各种启动—提高策略(图1在线补充表1)。总之,老鼠影射肌内D4 DNA编码preS1-HDAg融合基因与个人使用体内电穿孔或皮下注射D7蛋白质(丁肝病毒gt1与preS1序列)和D8蛋白质(丁肝病毒gt2 preS1有关),提高了一次或两次与D4 DNA, D7蛋白质、D8蛋白质或D7-D8融合蛋白在辅助结构(在线补充表1)。老鼠每个免疫和牺牲流血2周后2周后最终促进随后血和脾细胞从每组分别为评估收集preS1-antibody感应通过ELISA (图2一个)和IFN-γ生产48小时后回忆与乙肝病毒和丁肝病毒多肽抗原刺激体外有关酶联免疫斑点(通过图2 b)。

Induction of preS1-antibodies and HBV/HDV-specific T-cells following vaccination. C57BL/6J mice were primed with D4 DNA (50 µg) followed by in vivo electroporation and boosted twice at monthly intervals with D4 DNA, or D7 or D8 protein constructs, respectively (10 µg for each protein) or primed-boosted with D7/D8 proteins in incomplete Freud adjuvant. Two weeks after the final boost, mice were sacrificed to collect blood and splenocytes for subsequent ELISA (A) and interferon (IFN)-γ enzyme-linked immunospot assay (ELISpot) (B) analysis, respectively. (A) PreS1-antibody titres were determined as end point serum dilutions (at logarithmic scale) at which the optical density (OD) value at 405 nm was at least twice the OD of the negative control (naïve mouse serum) at the same dilution. The cut-off was set at 60, the starting dilution tested. Mean of five mice per vaccinated group is shown and each dot represents one mouse. (Bi–v) Induction of HBV/HDV-specific T-cells after 48 hours stimulation with indicated antigens. The D4 DNA prime-boost group was used as reference. Bars represent the mean number of IFN-γ spot-forming cells (SFCs) per million with SE from triplicate wells tested for each antigen condition. The different bar colours correspond to the respective sequences of the vaccine constructs, that is, green for HDAg gt1, orange for HDAg gt2 and blue for preS1A/B. HDV peptide pools 1–4 correspond to gt1 and pools 5–8 to HDAg gt2. Pools 1 and 2 of gt1 refer to sequence/isolate A, while pools 3 and 4 correspond to sequence/isolate B. Similarly for HDV gt2, pools 5 and 6 refer to sequence/isolate C and pools 7 and 8 to sequence/isolate D. Each pool contained 20 or 21 (for pools 1 and 5) 15-mer peptides with 10 amino acids (aa) overlap. PreS1A and preS1B peptides refer to the consensus sequences (total 47 aa; region 2–48 aa), while cytotoxic T-lymphocyte and T-helper ovalbumin peptides (respectively OVA CTL and OVA Th) at 10 µg/mL were used as negative controls. Concanavalin A (ConA) was used as assay positive control at 0,5 µg/mL. Image was created with BioRender.com.
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
图2

感应preS1-antibodies和HBV / HDV-specific t细胞疫苗接种。C57BL / 6 j小鼠的被试D4 DNA(50µg)其次是体内电穿孔和提高两倍在每月的间隔D4 DNA,或者D7 D8蛋白质结构,分别为每个蛋白质(10µg)或primed-boosted D7 / D8蛋白质在弗洛伊德不完全佐剂。最终促进两周后,小鼠牺牲为后续收集血和脾细胞ELISA (A)和干扰素(IFN) -γ酶联immunospot试验有关酶联免疫斑点)((B)分析,分别。(A) PreS1-antibody滴定度被确定为终点血清稀释(在对数尺度)的光密度值(OD)至少两次在405 nm的OD -控制(天真的小鼠血清)在同一稀释。截止被设定为60,稀释测试开始。意味着每个接种组五个老鼠显示和每个点代表一个鼠标。(Bi-v)诱导HBV / HDV-specific表示抗原t细胞刺激后48小时。D4 DNA启动—提高集团作为参考。酒吧代表的平均数量IFN-γspot-forming细胞从一式三份(证监会)每百万SE井为每一个抗原测试条件。不同的酒吧的颜色对应于相应的疫苗的序列结构,即绿色HDAg gt1,橙色为preS1A / B HDAg gt2和蓝色。 HDV peptide pools 1–4 correspond to gt1 and pools 5–8 to HDAg gt2. Pools 1 and 2 of gt1 refer to sequence/isolate A, while pools 3 and 4 correspond to sequence/isolate B. Similarly for HDV gt2, pools 5 and 6 refer to sequence/isolate C and pools 7 and 8 to sequence/isolate D. Each pool contained 20 or 21 (for pools 1 and 5) 15-mer peptides with 10 amino acids (aa) overlap. PreS1A and preS1B peptides refer to the consensus sequences (total 47 aa; region 2–48 aa), while cytotoxic T-lymphocyte and T-helper ovalbumin peptides (respectively OVA CTL and OVA Th) at 10 µg/mL were used as negative controls. Concanavalin A (ConA) was used as assay positive control at 0,5 µg/mL. Image was created with BioRender.com.

关于preS1-antibody感应,我们观察到的启动—提高同源preS1-HDAg蛋白质(D7 prime-D7提高或D8 prime-D8提高)仅在辅助,或异种的D4 DNA ' - (D7或D8)蛋白质促进策略始终诱导104-10年5preS1-titres (图2一个)。可以想象,启动与DNA编码preS1-HDAg组合其次是提高蛋白质编码只HDAg(即D9或D10),或与这些独家HDAg启动—提高蛋白质,有限的感应preS1-antibodies或者没有增加他们(水平类似天真组),分别,因为这些HDAg蛋白质结构不包含任何preS1-sequences (在线补充图2)。此外,一个清晰的关系基于ELISA (preS1-antibody水平在线补充图2),每个构建的能力窝藏preS1中和乙肝病毒在体外可以观察到(在线补充图2 b)。因此,DNA prime-protein提高和同源D7-D7或D8-D8蛋白持续诱导病毒中和50% (VNT启动—提高策略50)> 10水平3

有关t细胞反应对preS1 HDAg,最有效的反应诱发的外源DNA prime-protein促进策略(图2 bii,三世在线补充图3)。相应的启动—提高方案(即。,D4 DNA prime-protein boost and D7-D7 or D8-D8 homologous protein prime-boost) primed IFN-γ-producing T-cells mainly to the preS1 and HDAg gt2 components (图2 bi, iv, v)。综上所述,DNA prime-protein提升策略有效地引发广泛的t细胞反应preS1 HDAg抗原genotype-specific的方式。

Pres1-HDAg接种小鼠的抗血清中和乙肝病毒和丁肝病毒体外。

评估诱发的抗血清能否抵消丁肝病毒和乙肝病毒感染体外抗血清与preS1-titres接近105(终点血清稀释在对数尺度)来源于小鼠接种两次与preS1-HDAg蛋白质混合D7 / D8 (图3一)和病毒,然后添加到HepG2孵化。hNTCP细胞。一周后,细胞染色HBcAg或HDAg确定抑制感染。最低的血清稀释测试(1:10 0)提供完整的保护乙肝病毒和丁肝病毒(图3 b, C),类似于MyrB 200海里。连环三倍稀释血清显示一个明确的剂量反应的最大抑制浓度(IC的一半50)滴定度1:5.386 1:4.909乙肝病毒和丁肝病毒,分别为(图3 d, E)。

图3

预防乙肝病毒和丁肝病毒感染体外。C57BL / 6小鼠影射,增强了一旦D7 / D8蛋白质混合在不同佐剂(明矾,MF59和QS21)。过去的提振,两周后血清收集和检测preS1 end-titres基于ELISA。D4 DNA启动—提高集团作为参考。(一)意味着anti-preS1终点为每个接种组血清稀释对数刻度;每个符号代表一个鼠标。体外乙肝病毒和丁肝病毒感染的预防,从preS1-HDAg小鼠血清蛋白质组(D7 / D8) QS21使用佐剂。HepG2。hNTCP细胞被孵化的pre-incubated细胞而病毒培养液和鼠标preS1-HDAg抗血清(蓝色)或天真的小鼠血清(黑)。抗血清或天真的小鼠血清应用1:10 0稀释和1:3系列稀释培养基。 Immunofluorescence staining was performed for cells after 1 week for HBcAg (B) and HDAg (C). (B–C) HBV and HDV infection, respectively (% relative to control condition ‘infection’ which is set to an arbitrary level of 100%). (D–E) Non-linear regression modelling and IC50分别稀释为乙肝病毒和丁肝病毒。所有条件都是在重复执行和三个图像捕获/使用共焦显微镜(20×)。感染细胞评估使用自动细胞计数(ImageJ软件V.1.53c)。图像创建BioRender.com。

Pres1-HDAg从小鼠接种疫苗预防乙肝病毒抗血清/丁肝病毒合并感染体内。

接种小鼠接受(我)D4 DNA prime-D7蛋白质增加,(ii) D4 DNA prime-D8蛋白质增加,(3)D7-D7蛋白质启动—提高或(iv) D8-D8蛋白质启动—提高,导致相对高anti-preS1免疫球蛋白滴定度(104-10年5在对数尺度)(图2和图4)。因此,我们被动接种人类肝脏嵌合uPA+ / +scid小鼠的池(i)和(ii), n = 3;或(3)(iv), n = 2;或天真的小鼠血清/ PBS评估潜在的预防HBV /丁肝病毒合并感染(图4在线补充表1)。一天后,所有受到乙肝病毒小鼠/丁肝病毒(5×106IU HBV /鼠标和1.48×106IU丁肝病毒/鼠标,包括细胞培养派生)。所有控制老鼠(n = 6)收购了乙肝病毒(图4 b)和丁肝病毒(图4 c)感染迅速增加等离子体从星期4 postinfection开始滴定度与HBV DNA和丁肝病毒RNA(至少)10左右的水平7在研究结束的国际单位/毫升(每周20 postinfection)。值得注意的是,所有的小鼠被动接种与两种抗血清的方案完全保护乙肝病毒和丁肝病毒评估时间点(图4 b, C)。评价preS1-antibody滴定度在小鼠血浆单一的抗血清注射后1天显示终点之间的血清稀释103和104(在对数尺度)和拒绝两周后检测不到(图4 d, E)。一个控制鼠标竟然在星期4 preS1A抗体阳性。这可能是由于污染引起的,但是样品无法测试,因为有限的体积。

图4

预防乙肝病毒/丁肝病毒合并感染的体内。小鼠抗血清与滴定度≥104(一)被动管理通过在人类肝脏嵌合uPA intrasplenical注入+ / +scid小鼠(肝细胞供体C342)或与天真的血清/磷酸盐(控制老鼠,黑点)HBV /丁肝病毒合并感染前1天(周0)(c)。蓝色三角形(n = 2):过继转移从D7 / D8获得抗血清蛋白质的混合接种疫苗的老鼠。红色三角形(n = 3):过继转移从DNA prime-D7 D4 / D8获得抗血清蛋白质的混合刺激组。血浆收集在星期4、6、8、12、16和时间点sacrification(每周20)。乙型肝炎病毒DNA (B)和丁肝病毒RNA (C)水平以鼠标等离子体。检测极限(LOD)乙肝病毒在1:10稀释3.750国际单位/毫升;丁肝病毒的LOD 1:10稀释是187.5国际单位/毫升。PreS1A (D)和preS1B (E)抗体滴定度在鼠标等离子体通过ELISA测定终点血清稀释(在对数尺度)的光密度值(OD)至少两次在405 nm的OD -控制(天真的小鼠血清)在同一稀释。截止被设定为60。

主动免疫preS1-HDAg诱发preS1-antibodies和HDV-specific t细胞反应的模型HBsAg慢性载体

迄今为止我们所看到的,一个有效的疫苗能够诱导广泛活性HBV / HDV-specific t细胞和中和抗体对乙型肝炎病毒和丁肝病毒理想情况下应该包含丁肝病毒gt1-2和外源DNA prime-protein preS1序列基于提升方法(图2在线补充图3)。因此,我们合成一个融合蛋白构造包含D7和D8序列的组合与preS1 (在线补充表1)和使用这种疫苗接种计划(D4 DNA '和D7-8融合蛋白促进)来测试是否可以绕过HBsAg-induced公差在慢性HBV-infected主机。39

HBsAg-Tg鼠标模型用于这个研究表达了MT-PSX转基因,zinc-inducible鼠标metallothionein-I启动子序列L-HBsAg蛋白质的直接表达,而表达S-HBsAg和M-HBsAg信封蛋白质是由既定的活跃内部启动子在转基因信封位于编码区。因此,在缺乏饮食补锌,S-HBsAg M-HBsAg蛋白质,但不是L-HBsAg包膜蛋白,表达,导致高血清水平的表面抗原(HBsAg ELISA的基础上,数据没有显示)与肝细胞保持很低,类似于人类的感染。重要的是,这些老鼠的疫苗接种后一个提高(图5一个x1), preS1-antibodies诱导,尽管相比低得多的C57BL / 6接种组(滴定度10左右3对105分别)。然而,两个蛋白促进第二次独立实验(图5一个“x2”),导致抗体水平与接种C57BL / 6野生型小鼠(滴定度在105)。有趣的是,这种疫苗接种的方法也引起高HDV-specific t细胞反应的基因型,但没有preS1-directed IFN-γHBsAg-Tg小鼠t细胞分泌后一刺激,与观察C57BL / 6小鼠接种疫苗(图5双,二世)。这证实了转基因小鼠的t细胞耐受HBsAg-derived序列模型,并且我们的免疫疗法可以有效地规避这种t细胞缺乏基于感应preS1-antibodies HDV-specific t细胞。一个鼠标(HBsAg-Tg # 407 - 13)没有开发preS1-antibodies (图5一个),但也缺乏HBV / HDV-specific t细胞后个人评估(图5双)。反应后观察体外刺激D7-D8融合蛋白(图5双)可以最有可能主要归因于丁肝病毒组件的蛋白质。

Immunogenicity of heterologous prime-boost vaccination in the HBV chronic carrier. Hepatitis B surface antigens (HBsAg)-transgenic (Tg) and wild-type C57BL/6 mice were immunised with D4 DNA and boosted once (‘x1) or twice (‘x2) with D7-D8 fusion protein construct in two independent experiments. Two weeks after last boost, blood and splenocytes from each vaccinated mouse were collected for subsequent ELISA (A) and interferon (IFN)-γ enzyme-linked immunospot assay (ELISpot) (B) assays, respectively. (A) Mean anti-preS1 titres for each vaccinated group were determined as end-point serum dilutions (at logarithmic scale) at which the optical density (OD) value at 405 nm was at least twice the OD of the negative control (naïve mouse serum) at the same dilution. The cut-off was set at 60. Each symbol represents one individual mouse. (B) Number of IFN-γ secreting T-cells after 48 hours stimulation with preS1 and HDV antigens for individual HBV-Tg mice or pooled C57BL/6 mice (n=4) after one boost (x1). (Bi) Dot plots summarise the frequencies of IFN-γ-producing cells and individual dots represent the mean number of spot-forming cells per million from triplicate wells tested for each antigen condition for individual HBV-Tg mice or C57BL/6 pools. (Bii) Representative ELISpot images of IFN-γ spot-forming cells for C57BL/6 vaccinated group and HBV-Tg mice showing responses to HDV gt2C peptide pool, preS1 peptide, D7-8 fusion protein antigen and ConA. HDV peptide pools 1–4 correspond to gt1 and pools 5–8 to HDAg gt2. Pools 1 and 2 of gt1 refer to sequence/isolate A, while pools 3 and 4 correspond to sequence/isolate B. Similarly for HDV gt2, pools 5 and 6 refer to sequence/isolate C and pools 7 and 8 to sequence/isolate D. Each pool contained 20 or 21 (for pools 1 and 5) 15-mer peptides with 10 amino acids (aa) overlap. PreS1 peptide refer to the consensus sequence (total 4 7aa; region 2–48 aa), while cytotoxic T-lymphocyte and T-helper ovalbumin peptides (respectively OVA CTL and OVA Th) at 10 µg/mL were used as negative controls. Concanavalin A (ConA) was used as assay positive control at 0.5 µg/mL. Image was created with BioRender.com.
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
图5

不等的启动—提高疫苗的免疫原性乙肝病毒慢性载体。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)转基因(Tg)和野生型C57BL / 6小鼠接种D4 DNA和推动一次(x1)或两次(x2) D7-D8融合蛋白构建的两个独立的实验。去年增加两周后,从每个接种小鼠血和脾细胞收集后续ELISA (A)和干扰素(IFN) -γ酶联immunospot试验有关酶联免疫斑点)((B)化验,分别。(A)意味着anti-preS1滴定度为每个接种组测定终点血清稀释(在对数尺度)的光密度值(OD)至少两次在405 nm的OD -控制(天真的小鼠血清)在同一稀释。截止被设定为60。每个符号代表一个单独的老鼠。(B)的数量与preS1 IFN-γ分泌刺激t细胞48小时后,丁肝病毒抗原对个人HBV-Tg小鼠或汇集C57BL / 6小鼠(n = 4)后一刺激(x1)。(Bi)点情节概括IFN-γ-producing细胞和个体的频率点代表的平均数量spot-forming每百万从一井测试每个细胞抗原条件个人HBV-Tg老鼠或C57BL / 6池。有关酶联免疫斑点的图片(Bii)代表IFN-γspot-forming细胞对C57BL / 6小鼠接种组和HBV-Tg丁肝病毒gt2C肽显示反应池,preS1肽,D7-8融合蛋白抗原和ConA。丁肝病毒肽池1 - 4对应gt1, HDAg gt2池5 - 8。 Pools 1 and 2 of gt1 refer to sequence/isolate A, while pools 3 and 4 correspond to sequence/isolate B. Similarly for HDV gt2, pools 5 and 6 refer to sequence/isolate C and pools 7 and 8 to sequence/isolate D. Each pool contained 20 or 21 (for pools 1 and 5) 15-mer peptides with 10 amino acids (aa) overlap. PreS1 peptide refer to the consensus sequence (total 4 7aa; region 2–48 aa), while cytotoxic T-lymphocyte and T-helper ovalbumin peptides (respectively OVA CTL and OVA Th) at 10 µg/mL were used as negative controls. Concanavalin A (ConA) was used as assay positive control at 0.5 µg/mL. Image was created with BioRender.com.

从接种小鼠Pres1-HDAg抗血清(部分)保护HBV-infected丁肝病毒双重感染的老鼠

为了评估我们的疫苗策略诱导抗体反应的能力在一个更大的动物物种,同时获得大量的血清,因此纯化免疫球蛋白,我们与D4 DNA接种兔子',提振D7 / D8蛋白质混合佐剂,或启动和推动D7 / D8蛋白质混合佐剂(图6)。两组显示出类似的抗体- - - - - -滴定度达到至少104因此,反- - - - - -血清是汇集和IgG-purified (图6)。接下来,我们调查如果与这些preS1-antibodies被动免疫调解防止丁肝病毒双重感染在人性化的小鼠慢性乙型肝炎病毒感染。10因此,老鼠最初接种乙肝病毒和等离子体显示增加HBV DNA水平,直到达成高原在第八周(图6 b)。然后,六老鼠superinfected cell-culture-derived丁肝病毒和四只老鼠patient-derived丁肝病毒,分别三个和一个与纯化小鼠被动接种诱发的免疫球蛋白(5.5毫克/鼠标,100µL intrasplenically) 1天前病毒的挑战。相同剂量免疫球蛋白是腹腔内注射在第一天,4、7、11和14 post-HDV重复感染。剩下的小鼠要么相同剂量安排与天真的免疫球蛋白(n = 1)或没有治疗(n = 5)。这些控件显示检测到丁肝病毒RNA水平在等离子体已经3周后重复感染,达到2×10左右7国际单位/毫升第6周post-HDV重复感染(图6 c)。虽然没有效果观察HBV DNA水平,很可能由于已经建立和广泛传播乙肝病毒感染(图6 b),我们表明,所有四个被动接种完全保护获得一个丁肝病毒双重感染(图6 c)。我们也显示高preS1A和10之间preS1B抗体滴定度3和105不能察觉成为最后的抗血清注射后的2 - 4周(图6 d e)。我们注意到两个控制样本处理鼠标(接收天真的血清)得分略呈阳性preS1-specific抗体的存在,很可能由一个未指明的反应引起的。确认,我们还包括老鼠从另一个肝细胞和肝细胞移植供体(L191501;在线补充图4)。这里,六个人性化老鼠最初patient-derived感染乙肝病毒(在之前的设置相同的剂量)和重复感染前1天patient-derived丁肝病毒(HBV感染后8周),4,6小鼠被动接种100µL总抗血清来源于小鼠接种preS1-HDAg D7 / D8蛋白质混合QS21佐剂(在线补充图4),而两个老鼠天真的小鼠血清处理(在线补充图4 b, C)。抗血清注射(50µL)在第一天,另外考虑到腹腔内4和7 postsuperinfection。控制小鼠建立检测丁肝病毒滴定度重复感染后1周(在线补充图4 c在12周),达到最高水平,所有老鼠怀有越来越积极的HBV DNA滴定度在等离子体(在线补充图4 b)。有趣的是,我们明确指出减毒感染antiserum-treated老鼠:两只老鼠显示延迟丁肝病毒病毒血症(第12周和周14),而其他两个重复测试-至少在10和每周w12日,他们自发地死后(在线补充图4 c)。preS1A和preS1B ELISA显示滴定度或以上10左右4成为- 3周后,最终注入(在线补充图4 d, E)。

Prevention of HDV superinfection in vivo. (A) New Zealand white rabbits were immunised with DNA/protein preS1-HDAg harbouring regimens and induction of preS1-antibodies was assessed by ELISA. Anti-preS1 end point serum dilutions are shown at logarithmic scale. IgGs from rabbit antiserum was purified and pooled based on comparable antibody titres for use in this in vivo superinfection setting. (B–E) Six human-liver chimeric uPA+/+-SCID mice (hepatocyte donor C342) were infected with cell-culture or patient-derived HBV at week 0 and accordingly superinfected with HDV at week 8. One day prior to superinfection, 3/6 cell-culture inoculum infected and 1/4 patient inoculum infected mice intrasplenically received 100 µL purified rabbit preS1-IgGs. In addition, these mice received repeated IgG injections (of 100 µL) intraperitoneally at day 1, 4, 7, 11 and 14 post-HDV superinfection. One mouse received the same dosing schedule, but with naïve serum, the other control mice were non-treated (black dots). Blood plasma was collected at week 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16 and end point (week 17). HBV DNA (B) and HDV RNA (C) titres in mouse plasma. Limit of detection (LOD) for HBV at 1:10 dilution is 3.750 IU/ml; LOD for HDV at 1:10 dilution is 187.5 IU/mL. (D–E) PreS1A and preS1B antibody titres, respectively, represented as end point serum dilutions (at logarithmic scale) at which the optical density (OD) value at 405 nm was at least twice the OD of the negative controls at the same dilution. The cut-off is set at 60. Image was created with BioRender.com.
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
图6

丁肝病毒预防重复感染的体内。(一)新西兰白兔接种与DNA、蛋白质preS1-HDAg窝藏方案和感应preS1-antibodies评估ELISA。Anti-preS1终点血清稀释在对数刻度所示。从兔抗血清免疫球蛋白是纯化和基于类似的抗体滴定度集中使用在本体内设置重复感染。六个人类肝脏嵌合uPA(中)+ / +scid小鼠(肝细胞供体C342)细胞培养或patient-derived HBV感染与HDV为0,因此superinfected每周8。一天重复感染之前,3/6感染细胞培养剂和1/4患者接种体感染小鼠intrasplenically收到100µL纯化兔preS1-IgGs。此外,这些老鼠收到重复注射免疫球蛋白(100µL)腹腔内1天,4、7、11和14 post-HDV重复感染。一个老鼠收到相同的剂量时间表,但与天真的血清,其他控制老鼠摘要(黑点)。血浆收集在星期4,6,8,9,10,11、12、14、16和终点(星期17)。乙型肝炎病毒DNA (B)和丁肝病毒RNA (C)在小鼠血浆滴定度。检测极限(LOD)乙肝病毒在1:10稀释3.750国际单位/毫升;丁肝病毒的LOD 1:10稀释是187.5国际单位/毫升。(d e) PreS1A preS1B抗体滴定度,分别表示为终点血清稀释(在对数尺度)的光密度值(OD)至少两次在405 nm的OD -控制在同一稀释。截止是设定在60。 Image was created with BioRender.com.

讨论

目前的抗病毒治疗慢性乙型肝炎病毒感染可以抑制病毒载量和减缓疾病进展,但不幸的是不能总是消除病毒或防止肝脏疾病和癌症。44管道中的多个新的抗病毒药物,但人们普遍认为宿主免疫刺激需要绕过off-therapy控制使用的乙肝病毒免疫逃避策略。34个45这可能导致高度期望的功能性治愈,也就是说,稳定循环HBsAg的损失,尤其是针对免疫宽容慢性携带者。33 46 47此外,消除乙肝病毒直接意味着消除丁肝病毒,这被认为是最有害的一种病毒性肝炎和特定的抗病毒药物是可用的。3 13

以前,我们设计了一个免疫治疗方法基于preS1序列引起HBV / HDV-specific entry-inhibiting另外与HDAg抗体,作为抗原决定基向preS1和HDAg '幼稚t细胞。35我们提出这可能绕过诱导t细胞耐受慢性HBsAg携带者。因为我们以前显示有效的乙肝病毒中和体外和部分保护人类肝脏从HBV mono-infection嵌合体小鼠,我们优化疫苗接种方法和扩展我们的评估向丁肝病毒的预防。

在这项研究中,各种疫苗接种方法进行评估,以确定最免疫原性的策略,同时考虑临床适用性方面包括构造设计和制造,提高剂量和蛋白质佐剂(图1在线补充表1)。因此,外源DNA D4 prime-protein提升方法优越在诱导高preS1-antibody反应(图2一个)和乙肝病毒/ HDV-specific t细胞(图2 bii,三世在线补充图3)相比,同源D7 D8蛋白质的方法,也会引起类似的抗体水平(图2一个),但更低的HBV /丁肝病毒t细胞反应(图2 bi, iv, v)。值得注意的是,虽然不同的方案诱发稍微不同的反应主要是关于t细胞,在体外和体内中和实验使用类似的抗体滴定度(血清稀释大约10点结束4-10年5在对数刻度)(图3,图4和6)。

使用适当的体外系统,48 49我们表明,转移诱导preS1-antibodies中和乙肝病毒和丁肝病毒在体外有效预防与MyrB实现(图3 b, C),合成preS1肽链型HBV /丁肝病毒受体NTCP竞争性抑制剂。50然而,这种抑制剂已被证明导致胆汁酸改变运输和代谢物NTCP及其长期每日皮下行政功能达到最佳抗病毒活性慢性丁肝病毒患者相当不方便。百分比较重要的是,我们的策略意味着抗血清窝藏preS1-antibodies直接目标两种病毒的受体,从而不影响这个主机的自然功能的蛋白质。

保护小鼠免受乙肝病毒mono-infection旁边,就像我们之前所示工作,35我们这里证明改进的免疫治疗诱发完成预防HBV /丁肝病毒合并感染体内提供随访期间(图4)。

此外,我们研究了如果活动不同的免疫也可能引起适应性免疫反应HBsAg-Tg老鼠,代表宽容在慢性HBsAg携带者的典范。39我们表明,preS1-HDAg方法能够诱导preS1-titres 103终点在对数尺度血清稀释后一个升压剂(图5一个;x1)增加到10点滴定度5相对的C57BL / 6小鼠接种疫苗后两个升压剂(图5一个;x2)。虽然丁肝病毒t细胞反应诱导后与各自HDAg-antigens召回所有接种疫苗组(除了一个HBsAg-Tg鼠标,没有出现任何t细胞或preS1-antibodies),很弱preS1-specific t细胞可以观察到在HBsAg-Tg小鼠与野生型相比(图5双,二世)一个升压后疫苗剂量。这证实了这些小鼠的t细胞耐受HBsAg-derived序列,并且我们的免疫疗法可以有效地规避这些t细胞缺陷通过感应preS1-antibodies和HDV-specific t细胞。

有趣的是,其他乙肝病毒疫苗研究支持的角色preS1独自克服公差在慢性载体,37然而在我们的案例中我们看到(至少)一个preS1-HDAg疫苗刺激没能引起足够preS1-specific t细胞反应。总的来说,只有HDAg-induced t细胞和重要的是preS1-antibodies诱导,确认HDAg包容的重要性'幼稚t细胞和支持内源性抗体生产,即使在这个设置HBsAg-induced宽容的慢性感染主机。

重要的是,我们进一步证明保护HBV-infected人性化的小鼠获得丁肝病毒双重感染(图6)转让immunotherapy-induced preS1-antibodies。虽然没有疗效观察乙肝病毒,很可能由于已经建立的高水平和传播感染(图6 b)、丁肝病毒RNA水平仍察觉所有接种小鼠(图6 c)。在从不同的供体小鼠肝细胞重新填充,至少部分预防(完整的保护或推迟动力学)丁肝病毒双重感染可以实现(在线补充图4)。要注意的是,从这个供体肝细胞(L191501)似乎更容易感染(数据没有显示),这可以解释为什么预防并非完全实现。此外,还有实验差异有关使用的免疫球蛋白制剂类型(50µL总鼠抗血清vs 100µL纯化兔免疫球蛋白)和计量进度(4和6注射)(在线补充图4图6分别)。

值得注意的是,虽然商用乙型肝炎病毒疫苗也呈现在健康人丁肝病毒防护,慢性乙肝患者不应对传统的乙型肝炎病毒疫苗接种对S-HBsAg由于他们获得耐受性的免疫状态。53因此,丁肝病毒双重感染预防实验的影响是非常宝贵,因为这种策略会提供保护慢性乙肝病毒的患者获得一个有害的丁肝病毒双重感染。

不同的策略建立一个保护丁肝病毒疫苗土拨鼠模型中进行了调查14日15:HDAg合成肽来源于b细胞抗原表位16;p24-HDAg表达大肠杆菌,17酵母19和杆状病毒18;牛痘病毒表达p24 / p27-HDAg18日20最后,用向量表示p24-HDAg DNA疫苗接种。21然而,尽管蛋白质免疫诱导特定的抗体反应,没有保护丁肝病毒双重感染可能会实现。使用牛痘病毒和DNA免疫方法,只有调制的丁肝病毒双重感染的过程中可以看到在某些旱獭,但没有保护性免疫反应。HDAg-DNA接种疫苗的研究证实,细胞免疫反应和HDAg-specific抗体可诱导小鼠。23日24此外,DNA ' / adenoviral提高免疫协议能够防止旱獭WHV-HDV合并感染。22据我们所知,没有丁肝病毒的预防重复感染尚未旱獭所示,或任何其他模型。

总之,我们已经开发出一种疫苗免疫疗法,使用HDAg作为规避HBsAg-specific异种抗原t细胞耐受同时促进preS1-antibody生产设置的慢性感染。这些抗体有效防止乙肝病毒/丁肝病毒合并感染和丁肝病毒双重感染体内。这治疗目标条目的步骤和病毒蛋白的翻译,它可以有效补充现有的疗法,阻止病毒的成熟。此外,很可能preS1-antibodies针对乙肝病毒和丁肝病毒病毒粒子,航天飞机这些病毒抗原递呈细胞从而引发额外的t细胞反应启动HBsAg, HBcAg和聚合酶。这可能进一步帮助宿主的免疫系统来控制乙肝病毒和/或丁肝病毒感染。我们的免疫方法提供了一个有趣的和整体安全一步实现功能治愈。

数据可用性声明

所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。

伦理语句

病人同意出版

伦理批准

所有动物程序批准的当地的动物伦理委员会在瑞典和比利时。

确认

我们感谢动物的员工设施卡罗林斯卡大学医院/临床实验室(PKL)和根特大学医学和健康科学学院优秀的援助与老鼠的研究;和城市霍格伦德,Adlego兔子研究。质粒pSVL (D3)是一种来自约翰·泰勒博士的礼物(Addgene质粒# 29335)和pT7HB2.7是卡米尔Sureau博士获得。

引用

补充材料

脚注

  • 女士和点是联合的资深作者。

  • RB和PMa是共同第一作者。

  • 贡献者这项研究是由中外和实验设计由中外职业女士,女士,RB, PMa、低频和GA。实验由RB、PMa LV, FVH, GA,低频,大会党,美联社,乔丹。提供必要的试剂:HW, SC,苏。分析和解释数据:RB, PMa、女士和中外。RB、PMa和中外女士写的手稿。所有作者进行审核和批准的最终版本的手稿。中外职业和女士负责这项工作的整体内容。

  • 资金这项工作是支持由瑞典研究理事会,瑞典癌症协会斯德哥尔摩斯德哥尔摩郡议会/地区(ALF Grant),医疗创新中心(cim)和Vinnova女士(营地Grant)低频被卡罗林斯卡医学院支持。乔丹是支持的知识基础。中外职业得到了根特大学(BOFEXP2017001002),研究Foundation-Flanders (FWO-Vlaanderen项目G089515N和G047417N),绿鹃和VirEOS2.0和卓越的科学项目。

  • 相互竞争的利益女士和低频Svenska Vaccinfabriken的创始人和股东,持有的IP在这个手稿描述的免疫原。所有其他作者报告任何潜在的冲突。作者所提交的国际形式披露潜在的利益冲突。编辑认为冲突相关手稿的内容已经披露。

  • 病人和公众参与病人和/或公众没有参与设计,或行为,或报告,或传播本研究计划。

  • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

  • 补充材料此内容已由作者(年代)。尚未审查由BMJ出版集团有限公司(BMJ)和可能没有被同行评议。任何意见或建议讨论仅代表作者(年代)和不了BMJ的支持。和责任起源于BMJ概不负责任何依赖的内容。内容包括任何翻译材料,BMJ并不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南,术语,药物名称和药物剂量),和不负责任何错误或遗漏引起的翻译和改编或否则。

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