条文本
PDF
摘要
客观的尽管在COVID-19患者的粪便中检测到严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2) RNA，但该病毒在病程中在胃肠道中的活性和传染性在很大程度上尚不清楚。我们研究了SARS-CoV-2的时间转录活性及其与COVID-19患者粪便微生物组纵向变化的关系。
设计我们对来自15名住院COVID-19患者的一系列粪便病毒提取进行了RNA鸟枪宏基因组测序。对SARS-CoV-2基因组测序覆盖率进行量化。我们评估了与SARS-CoV-2粪便传染性特征相关的粪便微生物组组成和微生物组功能。
结果通过病毒RNA宏基因组测序，15例COVID-19患者中有7例(46.7%)粪便中SARS-CoV-2呈阳性。即使没有胃肠道表现，所有7名患者的粪便病毒宏基因组中SARS-CoV-2基因组3 '端和5 '端的覆盖率(p=0.0261)和密度(p=0.0094)都显著高于其他患者。在从呼吸道样本中清除SARS-CoV-2后的6天内，三名患者的粪便病毒宏基因组继续显示活跃的病毒感染特征(3 ' vs 5 '端覆盖率更高)。具有高传染性特征的粪便样本具有较高的细菌种类丰度Collinsella aerofaciens，Collinsella tanakaei，链球菌对象，摩根氏菌属morganii具有较高的核苷酸从头生物合成、氨基酸生物合成和糖酵解功能能力，而具有低至无传染性特征的粪便样本具有较高的短链脂肪酸生产细菌丰度，Parabacteroides merdae，拟杆菌stercoris，Alistipes onderdonkii而且Lachnospiraceae细菌1 _1_57faa．
结论这项初步研究为活跃和长期的“静止”GI感染提供了证据，即使在没有GI表现和从SARS-CoV-2呼吸道感染恢复后。活动性SARS-CoV-2 GI感染患者的肠道菌群特征是机会性病原体富集，有益细菌丢失，核苷酸和氨基酸生物合成和碳水化合物代谢功能增强。
- 肠道炎症
- 传染性疾病
- 诊断病毒学
这是一篇开放获取的文章，按照创作共用署名非商业性(CC BY-NC 4.0)许可发布，该许可允许其他人以非商业性的方式发布、混编、改编、构建本作品，并以不同的条款授权他们的衍生作品，前提是原创作品被正确引用，给予适当的荣誉，任何更改都被注明，且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
关于这个问题，我们已经知道了什么?
很大一部分COVID-19患者出现胃肠道症状。
在一些COVID-19患者的粪便样本中检测到严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2) RNA，即使呼吸道样本病毒RNA呈阴性，但仍保持阳性。
对SARS-CoV-2感染细胞模型的体外转录分析表明，SARS-CoV-2基因组3 '端比5 '端被大量覆盖，表明病毒复制和感染活跃。
新的发现是什么?
我们首次在一组(47%)COVID-19患者中发现了活跃性肠道病毒感染的特征，即使在没有胃肠道症状的情况下，这表明SARS-CoV-2的胃肠道感染是“静止的”。
即使在呼吸道清除SARS-CoV-2后，病毒感染和复制的转录活性仍在肠道中持续存在。
具有SARS-CoV-2高传染性特征的粪便样本含有更多的机会性病原体，Collinsella aerofaciens，Collinsella tanakaei，链球菌对象，摩根氏菌属morganii核苷酸和氨基酸的生物合成能力和碳水化合物代谢(糖酵解)的能力增强，而具有低至无SARS-CoV-2传染性特征的粪便样本有更高丰度的短链脂肪酸生产细菌，Parabacteroides merdae，拟杆菌stercoris，Alistipes onderdonkii而且Lachnospiraceae细菌1 _1_57faa．
本研究的意义
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
COVID-19患者肠道内的SARS-CoV-2活性活跃且持续时间长，即使在没有胃肠道症状和康复后也突显了长期冠状病毒和健康监测的重要性，以及潜在的粪-口病毒传播的威胁。
应该探索包括消除肠道SARS-CoV-2活性和调节肠道微生物组组成和功能在内的治疗方法。
简介
COVID-19是一种由新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2))引起的急性呼吸道疾病，特征是病毒在上呼吸道复制活跃。1来自武汉的早期报告显示，2%-10%的COVID-19患者有腹泻等胃肠道症状，但最近的一项元分析报告称，高达20%的患者有胃肠道症状。2 - 5此外，在COVID-19腹泻患者中，粪便钙保护蛋白(肠道炎症反应的一个指标)被发现升高。6这些证据表明，消化道可能是有胃肠道表现的COVID-19患者SARS-CoV-2感染的肺外部位。然而，在COVID-19患者病程期间和疾病消退后，SARS-CoV-2在胃肠道中的病毒活性和传染性基本未知。
通过RT-PCR，在相当一部分COVID-19患者的肛门拭子和粪便样本中检测到SARS-CoV-2 RNA。1 7此外，通过电子显微镜从COVID-19患者的粪便中观察到SARS-CoV-2病毒颗粒。8在一组COVID-19患者的呼吸道标本呈病毒阴性后，粪便中SARS-CoV-2 RNA的存在可以持续更长时间７ ９．但对经呼吸道清除后粪便中仍呈SARS-CoV-2阳性的COVID-19患者，其肠道中SARS-CoV-2病毒的活性尚不清楚。目前，SARS-CoV-2在肠道中的病毒活性主要是通过间接观察肠道类器官和哺乳动物细胞模型的发现来推断:(1)SARS-CoV-2受体ACE2在肠道肠上皮细胞和结肠细胞中高度表达10 11(2) SARS-CoV-2感染人类和蝙蝠肠道类器官中的肠细胞谱系细胞。12日13迄今为止，缺乏人类肠道中具有复制能力和感染能力的SARS-CoV-2病毒的数据。更深入地了解SARS-CoV-2在人类肠道中的生命周期和致病性是一项尚未满足的迫切需求。
在这项初步观察性研究中，我们假设SARS-CoV-2在COVID-19患者的肠道中活跃，因此描述了COVID-19住院患者在病程和疾病清除后肠道中SARS-CoV-2的时间转录活性和传染性。我们前瞻性地纳入了2020年2月16日至2020年3月2日期间在中国香港住院的15名COVID-19患者，随访从住院到出院。提取粪便病毒RNA，然后进行鸟枪宏基因组测序和分析，以研究SARS-CoV-2的转录活性。
方法
研究课题与设计
这项前瞻性研究涉及15名因实验室确诊的SARS-CoV-2感染而住院的COVID-19患者(表1)．由当地医院和公共卫生实验室(中国香港)进行的针对RdRp基因不同区域的连续两次RT-PCR检测确认了SARS-CoV-2感染。所有COVID-19患者均于2020年2月5日至2020年3月17日期间入住香港威尔士亲王医院或基督教联合医院。随访至他们出院或至2020年4月4日。所有患者均提供了参与本研究的知情同意，并同意发表研究结果。资料包括人口统计、流行病学、临床及化验结果，均取自香港医院管理局临床管理系统的电子病历。连续收集COVID-19患者的粪便样本，直至出院。
粪便病毒RNA提取和鸟枪宏基因组测序
根据制造商说明，使用TaKaRa MiniBEST病毒RNA/DNA提取试剂盒(TaKaRa，日本)从粪便样本中提取总病毒核酸。然后提取病毒总核酸，然后用RNA清洁浓缩试剂盒(Zymo Research, California, USA)纯化病毒RNA。经Qubit 2.0质量控制程序、琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2100检测后，使用KAPA RNA HyperPrep Kit (Illumina, USA)进行文库制备。文库制备物在Illumina NextSeq 550平台上测序(配对端150 bp)。
使用Trimmomatic V.0.36对原始序列读取进行过滤和质量修剪14具体措施如下:1)修低质基(质量分数<20);2)去除读数小于50 bp;3)追踪和切断测序适配器。使用带有默认参数的Kneaddata V.0.5.1(参考数据库:GRChg38)过滤污染的人类读取。
通过宏基因组测序分析SARS-CoV-2基因组的覆盖范围和密度
截至2020年4月20日，共从国家生物技术信息中心的SAS-CoV-2基因组库下载了1666个完整基因组。使用BBMap V.38.81对定制的SARS-CoV-2参考基因组进行清洁粪便病毒宏基因组读数查询。15手工检查了映射的reads，特别是那些映射到SARS-CoV-2基因组3 '端的reads，并丢弃了以Poly A结尾的reads。
将SARS-CoV-2基因组的3 '端定义为从2.5万个碱基开始的基因组区域，直到SARS-CoV-2基因组全长端(~29 9000个碱基)，其余的基因组区域(0-25 000个碱基)定义为SARS-CoV-2基因组的5 '端。测序覆盖率定义为映射到给定基因组区域的鸟枪读取数(每100个SARS-CoV-2基因组核苷酸基)。测序密度定义为SARS-CoV-2基因组某一基因组区测序位点的频率(SARS-CoV-2的宏基因组命中数/ 500个核苷酸基)。
粪便DNA提取，宏基因组测序和细菌微生物组分类和功能分析
用1ml ddH预洗约0.1 g粪便样本2O在13000 × g离心1 min成球。随后，按照制造商的说明，使用Maxwell RSC PureFood GMO和认证试剂盒(Promega, Madison, Wisconsin, USA)从颗粒中提取粪便DNA。简单地，在粪便颗粒中加入1 mL十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)缓冲液，旋涡30 s，然后在95°C加热样品5 min。在此之后，用珠子以最大速度彻底旋动样品15分钟。然后在样品中加入40µL的蛋白酶K和20µL的RNase A, 70°C孵育10 min。13 000× g离心5 min取上清，加入Maxwell RSC机提取DNA。提取的DNA进行DNA文库构建，使用Nextera DNA Flex Library Preparation kit (Illumina)，通过末端修复、尾部加A、纯化、PCR扩增等过程完成。文库随后在香港中文大学微生物区系研究中心用我们的内部测序仪Illumina NextSeq 550 (150 bp对端)进行测序。粪便宏基因组中人类reads的比例是通过比对reads与参考基因组(human release 32, GRCh38)而产生的。p13，下载自Gencode)16
使用Trimmomatic V.0.36对原始序列读取进行过滤和质量修剪14具体措施如下:(1)修剪低质量基数(质量分值<20);(2)去除小于50 bp的读数;3)去除测序适配器。使用带有默认参数的Kneaddata(参考数据库:GRCh38.p13)过滤污染的人类读取。使用MetaPhlAn2 (V 2.9)对粪便细菌群落进行分类分析，将reads映射到进化支特异性标记。17使用HUMAnN2.0对粪便细菌群落进行功能分析。18通过LefSE对对应于各自COVID-19患者的所有时间点粪便中SARS-CoV-2高传染性和SARS-CoV-2低至无传染性粪便中的差异细菌种类进行了识别。只绘制线性判别分析(LDA)效应值为>2和错误发现率(FDR)校正p值<0.05的物种。高传染性定义为SARS-CoV-2基因组在粪便病毒RNA宏基因组中有较高的3 '端和5 '端覆盖率。低至无SARS-CoV-2传染性定义为粪便病毒RNA宏基因组中SARS-CoV-2基因组的3 '和5 '端覆盖相似或无覆盖。
结果
患者COVID-19
招募了15名实验室确诊的SARS-CoV-2感染的COVID-19住院患者并进行了随访(图1，表1)．15例患者中，7例为男性。COVID-19住院患者的中位年龄为55岁(IQR: 44-67)。11例患者为中度至重度COVID-19, 2例患者病情严重，被送入重症监护室。所有患者均出现呼吸道症状，但只有1例患者在发病时同时出现腹泻的胃肠道症状(患者5)。所有患者在住院期间均未出现胃肠道症状。从每个患者收集连续的粪便样本，直到患者出院的连续两个样本的鼻咽或咽拭子检测为阴性。中位住院时间为21±2.4天(平均±SE)。
15例COVID-19住院患者的发病、住院、咽拭子清除严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)和出院时间线。
COVID-19患者SARS-CoV-2暂时性粪便病毒活性的描述
SARS-CoV-2基因组大小约29.9 kb核苷酸(图2一个)．19日20在进入宿主细胞后，全长基因组RNA(也作为mRNA)被翻译为ORF1a和ORF1b (SARS-CoV-2基因组的5 '端)。除了全基因组RNA外，还产生了9种主要的亚基因组RNA (sgRNAs)，编码结构蛋白S、E、M和N (SARS-CoV-2基因组的3 '端)。20.最近的一项研究表明，在受感染的细胞模型(Vero细胞)中，通过高通量转录组测序，SARS-CoV-2病毒的活跃复制和转录导致SARS-CoV-2基因组3 '端比5 '端的测序覆盖率大大提高。20.这种3 '端sgRNAs的高转录表达是SARS-CoV-2在宿主细胞中活跃复制和感染的标志。
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)的粪便病毒RNA宏基因组谱及其肠道感染性的假设情景(A) SARS-CoV-2病毒的全基因组、转录亚基因组rna (sgRNA)和病毒粒子结构示意图。(B)假设COVID-19患者肠道中存在SARS-CoV-2并具有传染性的三种情景，以及通过粪便病毒RNA气象基因组学测序检测SARS-CoV-2病毒。如果SARS-CoV-2病毒感染了肠道内的宿主细胞，其基因组和sgRNAs应在细胞溶解过程中高度表达并释放到肠道腔内，其中SARS-CoV-2基因组的3 '端应被粪便病毒RNA宏基因组测序高度覆盖。
基于这些复制性SARS-CoV-2的转录组模式，我们假设了三种可能的情况，即SARS-CoV-2病毒存在于人类肠道中，并通过粪便病毒RNA宏基因组学(转录组学)检测其:(i)情况1:如果SARS-CoV-2病毒不存在于肠道中，则无法通过宏基因组测序检测到其RNA基因组;(ii)场景2:如果游离的SARS-CoV-2病毒粒子通过肠道而未感染宿主细胞，则病毒RNA基因组应被宏基因组reads均等覆盖;(iii)情形3:如果SARS-CoV-2病毒存在于肠道并感染宿主细胞，病毒RNA基因组的3 '端区域应比宏基因组的5 '端区域覆盖得更多(图2 b)．
为了描述COVID-19患者肠道中SARS-CoV-2的病毒转录活性，我们对时间序列的粪便样本进行了粪便病毒RNA鸟枪宏基因组测序。因此，我们从15例COVID-19患者的连续粪便病毒RNA制剂中平均获得18 773 883±420 617(均值±SE)读数。通过宏基因组学测序(图3)，表明在一组COVID-19患者的肠道中存在SARS-CoV-2。这些受试者均无胃肠道症状。宏基因组测序未在其他8名患者的粪便中检测到SARS-CoV-2 (在线补充图1)．尽管我们的序列深度不能让我们在粪便样本中识别SARS-CoV-2的全基因组，但有趣的是，我们观察到，在基线时，所有7名患者(宏基因组SARS-CoV-2阳性)的3 '端区覆盖率和密度都高于SARS-CoV-2基因组的5 '端区(p分别为0.0261和0.0094)，图3 d)．患有中度COVID-19的患者12和患有轻度COVID-19的患者15(胸部检查正常)没有表现出胃肠道症状，但在病程的所有时间点上，两人在粪便病毒宏基因组中SARS-CoV-2基因组的3 '端覆盖均一致(图3A及C)．这些发现表明，SARS-CoV-2在患者肠道中持续存在。鉴于SARS-CoV-2基因组的3 '端和5 '端覆盖率较高是宿主细胞中病毒复制和转录(感染)活跃的标志，20.我们的数据强调了COVID-19患者肠道内持续活跃的SARS-CoV-2感染，尽管没有胃肠道症状和轻微的COVID-19。相比之下，3号和7号患者分别在SARS-CoV-2鼻咽清除后1天和10天失去了这种活性病毒感染的特征(图3 b)，这表明在疾病过程中，COVID-19患者消除肠道和呼吸道SARS-CoV-2感染的时间线不一致。
COVID-19患者连续粪便中严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)的病毒传染性描述利用SARS-CoV-2基因组的粪便病毒RNA宏基因组覆盖谱，研究SARS-CoV-2病毒在肠道中的传染性。(A)在咽拭子检测结果为SARS-CoV-2阴性之前，SARS-CoV-2基因组3 '端和5 '端覆盖率较高的患者子集(SARS-CoV-2感染活性的标志)。(B)表现为SARS-CoV-2基因组3 '和5 '端覆盖更高(SARS-CoV-2传染性的特征)，但在咽拭子为SARS-CoV-2阴性之前，随着住院时间的推移逐渐失去这一特征的亚组患者。(C)咽拭子检测结果为SARS-CoV-2阴性后，表现为SARS-CoV-2基因组3 '端和5 '端高覆盖(SARS-CoV-2传染性的特征)的患者亚组。“第0天”定义为通过RT-PCR检测，咽拭子检测结果为SARS-CoV-2阴性的日期。(D) SARS-CoV-2基因组5 '端和3 '端在COVID-19粪便病毒RNA宏基因组中的覆盖率和密度。绘制了7例SARS-CoV-2粪便阳性患者的基线(住院后首次收集粪便的日期)粪便病毒RNA宏基因组并进行比较。覆盖率的定义是，猎枪读取到SARS-CoV-2基因组的给定基因组区域的数量。密度定义为SARS-CoV-2基因组某一特定区域的测序位点的频率。
令人惊讶的是，患者4、11和15的粪便病毒RNA宏基因组继续显示出活跃的病毒感染特征(更高的3 '端覆盖率和SARS-CoV-2基因组的密度)(图3 c)，在咽拭子清除SARS-CoV-2后的1至6天内。在患者11和15中，在咽拭子阴性(患者11在第1天和第6天，患者15在第2天)后，粪便病毒宏基因组中5 '端的覆盖率和密度与3 '端相似。图3 c)．这些观察结果表明，在呼吸道清除SARS-CoV-2后，这些患者肠道内的活性病毒感染逐渐消失(从情景3转移到情景2)。我们的数据表明，尽管SARS-CoV-2已从气道清除，但其在人肠道中仍可持续检测到并持续表现出感染性特征，但其转录活性和感染性可能在随后逐渐下降。在没有肠道感染的患者以及康复患者的粪便中，活动性SARS-CoV-2的时间如此之长，突出了粪口传播的可能性。
与SARS-CoV-2粪便病毒活性相关的粪便微生物组特征
研究高传染性和低传染性至无传染性粪便样本肠道菌群差异，以了解新冠病毒、菌群和宿主之间的相互作用。我们对15名COVID-19患者的所有时间点进行了粪便微生物组宏基因组测序，并比较了SARS-CoV-2传染性高和SARS-CoV-2传染性低或无的粪便的细菌微生物组组成。我们发现，SARS-CoV-2传染性高的粪便样本中细菌种类的丰度更高Collinsella aerofaciens，Collinsella tanakaei，链球菌对象，摩根氏菌属morganii，与低至无传染性样本相比(LefSE分析，LDA效应量>2,FDR p值<0.05，图4一)．在这些物种中,c . aerofaciens而且m . morganii与人类机会性感染有关。21日22美国的对象在上呼吸道和口腔是大量的殖民者。23在SARS-CoV-2高传染性和低传染性至无传染性的粪便中，粪便宏基因组中的宿主(人)DNA比例没有差异(在线补充图2)．这些数据一起表明，SARS-CoV-2主动感染肠道，可能对宿主造成额外的威胁。
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)高传染性和SARS-CoV-2低传染性至无传染性粪便的细菌种类和功能能力差异通过对15例COVID-19患者所有时间点粪便的LefSE分析，确定了差异细菌种类(A)和功能(B)。仅绘制LDA效应值为>2、fdr校正p值<0.05的物种和功能模块。高传染性定义为SARS-CoV-2基因组在粪便病毒RNA宏基因组中有较高的3 '端和5 '端覆盖率。低至无SARS-CoV-2传染性定义为粪便病毒RNA宏基因组中SARS-CoV-2基因组的3 '和5 '端覆盖相似或无覆盖。
相比之下，SARS-CoV-2传染性低至无的粪便样本有更高的丰度Parabacteroides merdae，拟杆菌stercoris，Alistipes onderdonkii而且Lachnspiraceae细菌1 _1_57faa(LefSE分析，LDA效应值>2,FDR p值<0.05，图4一)．细菌成员Parabacteroides，拟杆菌而且Lachnospiraceae已知是短链脂肪酸(特别是丁酸盐)的生产者，在提高宿主免疫力方面起着至关重要的作用。24 - 27日Alistipes物种是吲哚阳性，参与血清素前体色氨酸代谢和维持肠道免疫稳态。28 29此外，有很高的丰度b . stercoris与SARS-CoV-2病毒粪便量较低略有相关(斯皮尔曼相关系数rho=−0.26,p=0.06)。我们的数据强调了这些驻留在肠道的有益细菌在对抗肠道内的SARS-CoV-2感染方面的潜在有益作用。
我们进一步探索了具有高传染性特征的粪便和具有低至无传染性特征的粪便之间粪便微生物群功能的差异。我们发现SARS-CoV-2传染性高的粪便样本中核苷酸代谢相关功能通路的丰度更高(腺苷核苷酸从头生物合成I、嘌呤核糖苷降解、腺苷核苷酸从头生物合成II、鸟苷核苷酸从头生物合成II、腺苷脱氧核糖核苷酸从头生物合成II和鸟苷脱氧核糖核苷酸从头生物合成II)，碳水化合物代谢(果糖-6-磷酸的糖酵解II)和氨基酸生物合成(l -赖氨酸生物合成II和l -丝氨酸和甘氨酸生物生成的超途径)，与低至无SARS-CoV-2传染性样本进行比较(LefSE分析，LDA效应大小>2,FDR p值<0.05，图4 b)．肠道菌群功能中核苷酸和氨基酸生物合成的增加表明细菌细胞构建大分子的模块的生产可能增强，而乙醇酸活性的增加表明细菌的能量提取增强，这些都是免疫病理条件下肠道细菌的基本生命活动。与SARS-CoV-2传染性相关的微生物组功能的这种改变可能是COVID-19的发病机制和病程的基础，尽管因果关系值得进一步研究。
与SARS-CoV-2粪便病毒活性相关的粪便微生物组的纵向变化
然后，我们研究了粪便微生物群的纵向变化与活性复制SARS-CoV-2病毒从粪便中清除相关。我们随访了3号和7号患者，他们的连续粪便显示SARS-CoV-2粪便传染性从阳性到阴性，以及11号、12号和15号患者，他们的连续粪便不断显示病毒传染性高的特征。总体而言，所有患者的粪便微生物组组成均有显著差异，而不考虑粪便病毒感染的存在(图5)，表明在COVID-19的病程中肠道微生物群不稳定。在粪便中SARS-CoV-2的感染特征变为阴性后，患者3的有益细菌出现了扩张，Parabacteroides distasonis而且拟杆菌均匀化和炎症相关细菌的收缩，瘤胃球菌属gnavus在粪便微生物群中。然而，7号患者有一过性的p . distasonis伴随着细菌病原体的大量繁殖，肺炎克雷伯菌，枸橼酸杆菌属koseri而且双歧杆菌dentium在清除粪便中的传染性SARS-CoV-2病毒后。肠道炎症和医院感染相关细菌，r . gnavus，hathewayi梭状芽胞杆菌而且肠球菌鸟结核，在SARS-CoV-2传染性持续高的患者的粪便中普遍存在(图5)．我们的数据表明，尽管在SARS-CoV-2传染性被粪便清除后，COVID-19患者的肠道微生物群失调可能得到改善，但细菌病原体的继发性侵袭可能在疾病过程中变得至关重要，因此可能有必要进行临床监测。
COVID-19患者粪便微生物群的纵向变化与粪便严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)传染性相关患者3和7在随访期间连续大便表现为SARS-CoV-2粪便传染性从阳性到阴性，而患者11、12和15在随访期间连续大便持续表现为典型的高病毒传染性。只绘制了最丰富的20个物种的相对丰度图。
讨论
我们首次描述了COVID-19患者住院时间内肠道中SARS-CoV-2的转录活性。考虑到我们的大多数COVID-19患者没有出现胃肠道症状，COVID-19患者肠道中显著的活性病毒感染(特征是通过宽靶点霰弹枪病毒宏基因组分析，SARS-CoV-2基因组的3 '端和5 '端覆盖更高)表明SARS-CoV-2的胃肠道感染是活跃但静止的。在部分COVID-19患者中，即使在呼吸道清除了SARS-CoV-2后，这种活跃的病毒感染和复制的转录特征仍然存在于肠道中。我们的数据表明，在至少一部分COVID-19患者中，呼吸道感染和SARS-CoV-2胃肠道感染的清除之间似乎存在长达1周、甚至更长时间的滞后窗口期。目前尚不清楚恢复期是否可能是病毒传播的风险，但SARS-CoV-2在肠道中的生命周期似乎比预期的要长。我们的初步观察研究为COVID-19患者肠道内的传染性和长时间的SARS-CoV-2病毒活性提供了证据，即使没有胃肠道表现。
我们之前的研究表明，15例COVID-19患者中有14例(93%)通过RT-PCR在粪便样本中检测出SARS-CoV-2阳性。9相比之下，其中7人(47%)通过粪便病毒RNA宏基因组学检测出SARS-CoV-2阳性。只有粪便中含有丰富的>3.2×104用RT-PCR法测定的每毫升接种物的拷贝数，通过粪便病毒RNA宏基因组学检测。霰弹枪宏基因组在检测SARS-CoV-2靶病毒时，其宽靶点测序的灵敏度可能低于RT-PCR，但其优点是可以更广泛地检测SARS-CoV-2基因组的不同区域，从而能够描述病毒的转录活性和传染性。尽管粪便RNA病毒元基因组可能低估了肠道中存在SARS-CoV-2病毒的COVID-19患者的比例，但我们发现，即使没有胃肠道症状的COVID-19患者的粪便中也存在SARS-CoV-2传染性的强大转录特征，表明SARS-CoV-2在胃肠道中感染是静止的但活跃的。增加宏基因组测序的深度和通量将识别出更多活动性胃肠道感染患者以及更多SARS-CoV-2的病毒变异和突变体。检测到的SARS-CoV-2病毒RNA有可能是吞食病毒的残留物。然而，在咽拭子对SARS-CoV-2呈阴性后6天仍可检测到病毒RNA (图3 c)，这表明在粪便中检测到的SARS-CoV-2不太可能是人工制品。总之，我们的数据表明，人类肠道是一个肺外感染部位。
机会性致病菌,Collinsella aerofaciens而且摩根氏菌属morganii21日22在具有高传染性的COVID-19患者的粪便样本中富集。链球菌对象是上呼吸道和口腔中大量的殖民者，23在这些病人的粪便样本中也有富集。它的存在表明，在COVID-19环境下，肠外微生物通过或传播到肠道。相比之下，短链脂肪酸和色氨酸生产者，24-29p . merdae，b . stercoris，答:onderdonkii而且Lachnospiraceae细菌1 _1_57faa，在粪便样本中富集，其特征是SARS-CoV-2传染性低至无。为了支持这一发现，我们最近的研究还表明答:onderdonkii而且l .细菌与不那么严重的COVID-19有关。9b . stercoris是一种来自拟杆菌门的细菌，已知与抑制小鼠模型中ACE2 (SARS-CoV-2宿主细胞入口点)的结肠表达有关。30.这些数据强调了有益细菌在对抗SARS-CoV-2感染方面的潜在有益作用，以及条件致病菌在SARS-CoV-2感染中潜在的有害作用。然而，这些物种是否可以被用于诊断尚不清楚。
高传染性的粪便具有较高的核苷酸新生生物合成、氨基酸生物合成和糖酵解菌群功能能力。其中，腺苷和鸟苷的合成途径明显丰富。腺苷和鸟苷是参与嘌呤核苷酸代谢的两种重要代谢物。31腺苷在生理上处于低水平，但在病理条件下可迅速增加，如缺氧、缺血、炎症或创伤，这是一种“警报”或危险信号。32鸟苷及其修饰衍生物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是TLR7的内源性配体。33重要的是，8-OHdG是一种众所周知的氧化DNA损伤标志物，可诱导强细胞因子的产生。33此外，l -丝氨酸的细菌生物合成途径在SARS-CoV-2高传染性的粪便中增加。l -丝氨酸可促进炎症肠道中致病菌的扩散。34所有这些增加的微生物功能在粪便微生物群中是细菌生存、生长和代谢必不可少的生物活性。这种细菌功能的增强可能是SARS-CoV-2在肠道中的感染性的结果，或增强了COVID-19的病程，这仍有待进一步研究。
呼吸道传播仍是新冠病毒的主要传播途径，有可能通过粪-口途径传播。35 36研究表明，释放到肠腔的SARS-CoV-2病毒被结肠液灭活，并没有从COVID-19患者的粪便标本中检出感染性病毒。1 37出于安全考虑，我们在处理粪便样本时预先添加了杀菌剂以消除SARS-CoV-2病毒，由于这种方法的限制，我们无法从COVID-19患者的粪便中滴定或分离活病毒，但SARS-CoV-2强大的粪便病毒转录特征表明它在COVID-19患者的肠道中具有活跃的感染性。与此同时，最近的一项研究能够从一名COVID-19患者的粪便标本中分离出传染性的SARS-CoV-2病毒，13进一步支持我们的发现。在呼吸道样本结果为阴性但粪便样本为阳性的患者组中，目前还没有足够的证据来制定抑制病毒传播和感染的实际措施。需要进一步研究揭示SARS-CoV-2在胃肠道的传染性和发病机制，以及对抗包括胃肠道在内的全身感染的措施，如调节人类肠道微生物群。
致谢
提交人要感谢在中国香港威尔斯亲王医院和基督教联合医院隔离病房工作的所有医护人员。本文的作者谨向麦淑珍、杨苹首席行政主任、何淑珍、陈美玲、黄丽丽和李薇致谢，感谢他们对本研究的贡献。作者亦谨此感谢许浩及周善兰慈善基金有限公司、松鹤有限公司及许明先生对本研究的资助。
参考文献
脚注
TZ、QL和FZ贡献相等。
贡献者TZ, QL和FZ进行了实验，数据分析并起草了手稿。YKY, SSB, ZC, FKLC和PC修改了手稿并提供了批评意见。GC-YL和ET招募患者和临床资料。TZ阐述了这个概念和假设。SCN设计并监督了这项研究。TZ、QL和FZ对这项工作贡献相同。
资金这项工作得到香港陈德衡基金会及健康及医学研究基金的支持。
相互竞争的利益没有宣布。
病人同意发表不是必需的。
伦理批准本研究获香港中文大学联合新界东集群临床研究伦理委员会批准(参考编号:2020.076)。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的。
来源和同行评审不是委托;外部同行评议。
数据可用性声明根据合理的要求提供数据。
请求的权限
如果您希望重用这篇文章的任何部分或全部，请使用下面的链接，它将带您访问版权清除中心的RightsLink服务。您将能够快速获得价格和以多种不同方式重用内容的即时许可。