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文摘
客观的特发性帕金森病(PD)的特点是α-突触核蛋白(aSyn)聚合和中脑多巴胺神经元的死亡。最近的证据指出,PD或许发起在肠道被细菌或其毒素,促进慢性肠道炎症,最终会影响大脑。在这项工作中,我们试图证明微生物毒素的影响β-N-methylamino-L-alanine (BMAA)在肠道可能会触发某些PD的情况下,尤其令人担忧,因为这毒素存在于某些食物但不经常由公共卫生当局监控。
设计来测试假设,我们对待野生型小鼠,初级神经文化,细胞株和孤立与BMAA线粒体,并分析了其影响肠道微生物群组成,屏障通透性,炎症和aSyn聚合以及脑部炎症,多巴胺能神经元损失和运动行为。为了进一步研究线粒体的关键作用,我们还确定了具体BMAA对线粒体功能的影响和inflammasome激活。
结果BMAA诱导大量消耗分段丝状细菌(SFB),调节肠道免疫,从而引发肠道失调,免疫细胞迁移,增加肠道炎症,失去屏障完整性和caudo-rostral aSyn的进展。此外,BMAA诱导在体外和在活的有机体内神经元的线粒体功能障碍与心磷脂曝光和顺向激活先天免疫。这些事件启动神经炎症,多巴胺能神经元损失和电动机赤字。
结论综上所述,我们的研究结果表明,长期暴露于饮食BMAA会引发一系列连锁反应,概括PD病理的演变从肠道的大脑,这是符合gut-first PD。
- 肠道屏障功能
- 肠道炎症
- 肠道细菌
- 神经生物学
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
帕金森病(PD)是一种多因素疾病的特点是长前驱期,至少在某些情况下包括胃肠道症状。
之间的直接相关性肠道失调和PD患者的疾病进展被发现。
慢性膳食暴露BMAA被认为是肌萎缩性脊髓侧索硬化症的原因/ parkinsonism-dementia复杂的特定人群。
BMAA cysteine-glutamate转运体编码的目标SLC7A117(溶质载体家庭成员11),一个基因的启动子甲基化在PD相关转运体表达的差别,对这些符合环境暴露与PD的风险。
有什么新发现吗?
在活的有机体内BMAA政府耗尽回肠的水平CandidatusArthromitus’,一群细菌调节肠道粘膜免疫小鼠的体内平衡导致增加肠道炎症,破坏肠道屏障的完整性和肠道aSyn聚合。
BMAA专门针对中脑的诱导线粒体碎片,心磷脂曝光,进而激活先天免疫反应,如nod样受体3激活和aSyn聚合。
肠道炎症疗效增加血脑屏障通透性和神经炎症,最终导致神经元损伤和黑PD-like运动功能障碍。
本研究的意义
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
这工作生成的前沿知识通过建立直接联系长期饮食消费环境微生物毒素和PD特性。食源性BMAA确认这里的特定抗生素效果的确认作用dysbiotic肠道的级联触发事件的高潮在大脑中,会有决定性的公共卫生影响的修订食品安全指导方针,监视和控制这种食物毒素。这给上升到一个前所未有的机会为新的双向胃肠病学和神经病学学科之间的协同效应,它开辟了新的创新预防或早期诊断PD的可能性。
介绍
特发性帕金森病(PD)是一种与年龄相关的神经退行性疾病的特点是电机震颤等症状,姿势不平衡,动作迟缓和刚度。1 2前非特性还包括丧失嗅觉和胃肠道(GI)功能障碍。3便秘,出现在前驱的阶段,是发展PD视为一个风险因素。3组织病理学的后期PD的特点是存在α-synuclein (aSyn)含有不溶性纤维聚合物,称为路易小体和神经突路易的损失在黑质致密部多巴胺能神经元。1聚合aSyn还可以发现在胃肠道和器官受迷走神经支配4个5前几年到几十年检测中枢神经系统(CNS)的参与。这些观察允许制定一个假说认为或者他们的产品可以从肠道微生物通过迷走神经逆行轴突运输到大脑。6这个假设发现间接支持数据从人类经历了完整的躯干的迷走神经切断术,谁似乎患帕金森病的风险较低。7此外,某些微生物产品提出了发生在dysbiotic肚触发aSyn过度和聚合。8,9粪便和肠道微生物群mucosa-associated PD患者和健康对照组之间的不同,10但是功能强大的解释仍然是有争议的。11PD患者肠道失调与肠道炎症,推断upregulation的促炎细胞因子。12日13在小鼠肠道内稳态是由tissue-resident 17 (Th17)辅助T细胞分化在回应共生有机体mucosa-associated分段丝状细菌(SFB) 'CandidatusArthromitus”,履行屏障完整性保护的重要角色。14日15SFB坚持上皮细胞信号血清淀粉样蛋白的释放,作用于CD11c+固有层细胞刺激生产和释放白介素(IL) 6和IL-23刺激Th17细胞的分化和激活。IL-17释放tissue-resident自我平衡的肠道上皮细胞Th17细胞信号产生抗菌肽和紧密连接蛋白。15然而,肠道失调也可能诱发非居民Th17细胞,通过微生物的侵蚀防护(SFB)小鼠或pathobionts扩散,推动生产peripherical促炎细胞因子的影响。14最近的数据表明,炎症性肠病病人可能有更高的患帕金森病的风险。16尽管PD经常被关联到一个漏水的肠道屏障,17 18肠道失调会影响屏障完整性的机制仍不完全清楚。越来越多的证据表明,一些肠道微生物产生的毒素会影响宿主的生理。19β-N-methylamino-L-alanine (BMAA),自然non-proteinogenic二氨基酸由蓝细菌或其他微生物和最常见于水产食品,可能参与神经退化。19BMAA最初发现在苏铁属植物的种子植物及其消费提出了引起肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS-PDC) / parkinsonism-dementia复杂。20.证据表明BMAA可以在蛋白质的丝氨酸,misincorporated或静电结合蛋白新生链导致错误折叠,聚合,内质网(ER)压力和细胞凋亡。19此外,BMAA可以诱导线粒体功能障碍干扰氧化磷酸化,同时解除对钙的恒定性,导致活性氧(ROS)生产过剩。21虽然目前还没有证据表明,肠道微生物群的成员可以产生BMAA,甲基化的cg06690548 4号染色体上的启动子SLC7A11PD患者的基因的差别与对这些cysteine-glutamate逆向转运,一个已知的目标BMAA,22这被认为是符合透析相关环境暴露。事实上,长期暴露于环境毒素,可能会导致线粒体功能障碍已被先进的基因易感个体作为PD的可能原因。23在PD的线粒体级联假说的基础上,23我们推论,具体可以从肠道微生物分子大脑神经元线粒体和目标,24从而生成一个self-amplified有害周期神经元激活先天免疫的首选。因此,在活的有机体内BMAA administration-induced强烈的促炎细胞因子的表达。25我们的工作进一步显示,慢性治疗小鼠BMAA明显侵蚀SFB的水平,在回肠粘膜微生物群丰富,随之改变的局部免疫细胞反应,导致增加肠道炎症和破坏肠道屏障的完整性。令人惊讶的是,我们还观察到中脑的线粒体功能失调和积累aSyn聚集进而导致神经元先天免疫和神经炎症的进一步激活。最后,我们展示了一种caudo-rostral进展从肠道疾病的大脑最有可能通过迷走神经,就是明证aSyn之路,最终导致黑质(SN)变性和运动障碍,所有PD的典型特征。
方法
动物模型和实验设计
C57BL / 6雄性老鼠从查尔斯河(西班牙巴塞罗那)获得被安置在12小时光/暗周期与免费的水和食物。在26周小鼠被随机分为两组(未经处理的(单元)和BMAA-treated)和日常口头管理与BMAA(0.1克/公斤体重)12周在凝胶颗粒,直到他们牺牲了。根据先前的研究这BMAA剂量被选中。26未经处理的动物收到车辆。行为分析(30 - 40周),老鼠牺牲和采集样本进行分析,详细描述在线补充材料。列出使用的所有试剂在线补充表S1。
微生物分析
粪便、回肠和盲肠mucosa-associated材料收集评估微生物概要文件使用16 s rRNA基因测序如前所述27 28和使用V.1.44.1 mothur包29日和席尔瓦参考文件(138年版)30.治疗的原始数据,聚类和分类注释。数据分析与MicrobiomeAnalyst在线工具31日DESeq2及其R包32软件中描述在线补充材料。
免疫组织化学、免疫荧光和显微镜分析
在实验的最后,动物被灌注transcardially。大脑和回肠样本收集,cryoprotected并存储在−80°C。大脑和肠道免疫组织化学和免疫荧光染色法对样品进行发表38和详细描述在线补充材料。在肠道的样品我们评估(a)通过免疫荧光肠道屏障的完整性,使用评分系统的规模18 39;(b) CD11b划分的数量每计算总面积(毫米2通过免疫组织化学方法)和(c) CD4细胞的数量/每计算总面积(毫米2);和(d)的光学密度(OD) aSyn骨料和phosphorylated-aSyn (p-aSyn)夹杂物。在大脑的样品中,我们使用免疫荧光来确定在Iba1 (a)的数量+细胞在SN和(b)和Trem2表达TH +和聊天+细胞的数量在迷走神经背运动核(DMV) / /计算总面积(毫米2)。我们使用免疫组织化学评估(c)的OD aSyn聚集在纹状体(STR), SN, DMV p-aSyn DMV和SN和酪氨酸羟化酶(TH)的OD STR, (d)的stereological量化TH +细胞在SN和(e) IgG-immunopositive染色的数量每总面积(mm血管周的地区2)在大脑皮层,STR和SN评估血脑屏障(BBB)的完整性。所有图像收购进行行之有效的蒙蔽下协议和随机过程,和不同技术和生物复制,全面描述在线补充材料。
流式细胞术
血液通过心脏穿刺收集,转移到Histopaque 1083解决方案(σ)和离心机。外周血单核细胞(PBMC)分数是孤立的,洗和孵化Anti-Mouse CD45 PerCP(克隆30 f11), Anti-Mouse CD3 FITC(克隆REA641) Anti-Mouse CD4 APC(克隆REA604)和Anti-Mouse CD8 PE(克隆REA601) (1/50) (Miltenyi研究)。细胞悬液的收购了BD FACSCalibur血细胞计数器(BD生物科学)和分析FlowJo软件(BD生物科学)(见在线补充材料全面的描述)。
西方墨点法、分光光度法和ELISA决定在大脑中,小肠匀浆和血液
完成行为测试之后,螺母和BMAA-treated小鼠安乐死和血液,中脑,纹状体、回肠和盲肠样本孤立。组织快速冷冻,储存在−80°C和单一化中描述的故事在线补充材料。等离子体干扰素(IFN)γ和il - 6水平测定。在中脑的匀浆我们确定突触标记和先天免疫标记免疫印迹,caspase-1活动通过分光光度法和先天免疫标记和aSyn寡聚物与ELISA试剂盒和免疫印迹。在纹状体匀浆我们与酶联免疫试剂盒测定多巴胺的水平。在回肠和盲肠匀浆我们确定caspase-1活动通过分光光度法,和先天免疫标记和aSyn寡聚物与ELISA试剂盒和免疫印迹(见在线补充材料)。
提取液在细胞免疫印迹、分光光度法和ELISA测定
NT2ρ+,Rho0细胞40和初级C57Bl / 6小鼠中脑神经元从mesencephala获得胚胎的大脑在一天妊娠14/15是培养与前面描述的一些修改41 42和处理3毫米BMAA 48小时1µM CCCP(细胞)或5µM(神经元)2小时前细胞收获或NH 20毫米4Cl和/或20µM亮抑酶肽4小时到培养基的地方。细胞被洗在冰冷的磷酸盐(PBS 1×),刮和单一化中描述的故事在线补充材料。在细胞中提取我们确定aSyn寡聚物、LC3II和先天免疫标记免疫印迹。在神经元线粒体分数我们确定phospho-Drp1水平和aSyn寡聚物的免疫印迹。在神经元胞质分数,我们分析了先天免疫标记与ELISA试剂盒,分光光度法(见Caspase-1激活在线补充材料)。
免疫细胞化学和共焦显微镜分析
主要中脑的神经元,NT2ρ+和Rho0细胞生长在玻璃盖玻片(16毫米直径)12-well盘子或ibidiμ-Slide 8-well盘子。治疗后,我们确定线粒体与MitoTracker绿色运动神经元,线粒体膜电位与TMRM探针在细胞和神经元和双磷脂酰甘油分布和荧光使用10-N-Nonyl吖啶橙的神经元。免疫细胞化学和共焦显微镜中描述的程序在线补充材料。
线粒体分离、耗氧率,Ca2 +处理能力和糖酵解通量(ECAR)分析
鼠标中脑的和皮质线粒体被Percoll梯度(见孤立在线补充材料)。耗氧速率(OCR)以新鲜中脑的或皮质与海马线粒体XF24细胞外磁分析器(美国马萨诸塞州海马生物科学、Billerica)。对于呼吸系统耦合实验,以下决定计算根据随后的速度测量方程(见在线补充材料)。43线粒体钙2 +吸收测量fluorometrically Ca的存在2 +敏感的荧光染料钙绿色5 n(150海里),通过激发和发射波长506 nM和532 nM,分别。44在初级中脑的OCR和ECAR决定使用海马神经元XF24细胞外磁分析器(海马生物科学)。实验设置中描述在线补充材料。
统计分析
微生物人口统计的详细描述在线补充材料和方法。统计分析的数据集进行使用GraphPad棱镜V.8 (GraphPad软件)软件的总结在线补充表2。所有数据被表示为均值±SEM。常态分布分析(Shapiro-Wilk测试)应用于确定后续的参数或非参数测试。成对比较是由未配对t测试或Mann-Whitney测试学生的。比较多个组进行单向方差分析Dunnett紧随其后的事后测试或克鲁斯卡尔-沃利斯检验之后,邓恩的因果检验。皮尔森相关分析两个变量之间是由相关的测试。所有统计测试双尾和价值意义的注释是:* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001。P和N值显示在每个图的传说。
结果
肠道微生物群的改变与BMAA小鼠口服治疗
BMAA微生物毒素,可以通过饮食摄取由于其积累在食物链中,特别是从水生生态系统。19我们有口头管理BMAA 12周的野生型(WT) C57BL / 6雄性小鼠,观察体重没有变化或glycaemia (在线补充图S1A-C)虽然在观察粪便含水量显著增加(数据没有显示)。治疗后,粪便收集的材料和老鼠牺牲孤立回肠和盲肠。综合分析ileum-associated (图1)、粪便(图2)和cecum-associated细菌(在线补充图S2)使用Illumina公司执行MiSeq在我们下一代测序技术单元Genoinseq (https://www.cnc.uc.pt/en/services)。我们获得了平均1876±1650读/回肠样本,检测到102属,59岁的家庭,40订单,14类和10细菌类群。从大便的我们获得52 952±996读/样本,165属,82个家庭,56个订单,18类和11个类群。盲肠的样品我们获得平均31 001±7140读/样品,检测到121属,62个家庭,39个订单,15类和11个类群。我们观察到在BMAA-treated ileum-associated细菌的多样性的增加小鼠(alpha-diversity,衡量within-sample分类学多样性;图1一个)最有可能的损失最具代表性SFB成员,虽然整个社区的多样性之间的相似环境(beta-diversity,评估两个群体之间的相似或相异;图1 b)。5属被显著改变序列BMAA-treated ileum-associated粘膜的老鼠最显著的减少的CandidatusArthromitus”(约17倍减少)和Turicibacter(约13倍减少)和增加的Colidextribacter(大约倍增长),拟杆菌(约7倍增加)和Lachnospiraceae_NK4A136增加,“碳足迹”(约11倍)(图1我)。大多数微生物的研究一直集中在瞬态凳子的微生物群,这可能不是真正的翻译不同疾病状态的影响。粪便中的材料,未发现显著变化丰富的微生物群BMAA-treated与未经处理的小鼠在任何分类级别(α多样性;图2一个)和一些重叠在观察这两个社区的微生物组成(β多样性;图2 b)。我们发现11属BMAA-treated老鼠的粪便样本中显著改变:Olsenella,Mucispirillum、Eggerthellaceae_unclassified和Roseburia丰富而RF39_ge,MonoglobusFamily_XIII_AD3011_group,Akkermansia,Tyzzerella,Turicibacter和Clostridia_UCG_014_ge耗尽(图2我)。虽然Roseburia(图2 g)与短链脂肪酸(SCFAs)生产和枯竭的PD患者被发现,45他们丰富的凳子BMAA-treated老鼠。另一方面,大量的Akkermansia已知调制黏液层改善肠道屏障功能的有益影响的免疫反应,降低在BMAA-treated小鼠粪便(图2 h)。45有趣的是,BMAA治疗引起的成员的重要消耗Turicibacter和成员的神秘Clostridia_UCG_014_ge (图2 f I)。我们的研究结果链接ileum-associated的侵蚀Turicibacter与瞬态观察粪便微生物群在盲肠微生物群,后者显示总体减少多样性和不同的微生物群落组成(在线补充图S2A, B)。粪便的观察材料,的丰度Turicibacter和Clostridia_UCG_014_ge也耗尽后的盲肠BMAA治疗(在线补充图S2C-F,我)。拟杆菌被浓缩在回肠和盲肠BMAA-treated老鼠(图1 h,在线补充图S2C-E, G)。注意是盲肠的附近失踪双歧杆菌属水平(在线补充图S2H),其成员被认为促进健康和恢复粘液增长通过SCFAs生产。
在β-回肠mucosa-associated微生物多样性N-methylamino-L-alanine (BMAA)治疗的老鼠。(A)α多样性利用香农指数衡量在操作分类单位(OTU)水平源自16 s rDNA测序的回肠肠未经处理的样本(单元)或BMAA-treated老鼠(Unt = 10 n值和BMAA = 10, Unt vs BMAA, Mann-Whitney测试,* * p = 0.0089)。(B)β多样性评价主坐标分析(PCoA)基于Bray-Curtis指数辣子鸡源自16 s rDNA测序的回肠肠样本单元或BMAA-treated老鼠(n值Unt = 10和BMAA = 10;PERMANOVA: r2= 0.205,p < 0.015;PERMDISP: F = 0.773, p = 0.391)。(C)分类学多样性的回肠肠样本单元或BMAA-treated老鼠门和属的水平。(D)的热图的相对丰度属中发现回肠肠样本单元或BMAA-treated老鼠使用皮尔逊相关系数的距离度量,根据病房的算法与聚类。(E)饼图显示比例分类组合在属级的肠道菌群样本单元或回肠BMAA-treated老鼠。(外)微分丰富的选择属回肠肠样本单元或BMAA-treated老鼠(Unt = 10 n值和BMAA = 10, Unt vs BMAA, DESeq2统计分析)。(F)”CandidatusArthromitus”(* padj = 0.0296)。(G)Turicibacter(* * padj = 0.0027)。(H)拟杆菌(* padj = 0.0150)。(我)Colidextribacter(* padj = 0.0103)。
微生物多样性的凳子β-N-methylamino-L-alanine (BMAA)治疗的老鼠。(A)α多样性利用香农指数衡量在操作分类单位(OTU)水平源自16 s rDNA序列从未经处理的粪便样本(单元)或BMAA-treated老鼠(n值Unt = 17和BMAA = 16,螺母与BMAA Mann-Whitney测试,p = 0.136)。(B)β多样性评价主坐标分析(PCoA)基于Bray-Curtis指数辣子鸡源自16 s rDNA测序的粪便样本单元或BMAA-treated老鼠(n值Unt = 16和BMAA = 16;PERMANOVA: r2* * * = 0.108,p < 0.001;PERMDISP: F = 2.378, p = 0.134)。(C)分类学多样性的粪便微生物群螺母或BMAA-treated老鼠门和属的水平。(D)的热图的相对丰度的属检测粪便从螺母或BMAA-treated老鼠使用皮尔逊相关系数作为距离度量,根据病房的算法与聚类。(E)饼图显示的比例分类组合在属级粪便微生物群样本单元或BMAA-treated老鼠两类级别选择类群受BMAA治疗,细菌和Coriobacteria。(外)微分大量的粪便样本中选择属螺母或BMAA-treated老鼠(n值Unt = 17和BMAA = 16, Unt vs BMAA, DESeq2统计分析)。(F)Turicibacter(* padj = 0.0169)。(G)Roseburia(* padj = 0.0242)。(H)Akkermansia(* * padj = 0.0078)。(我)Clostridia_UCG_014_ge (*padj = 0.0190)。
BMAA-induced肠道失调影响胃肠道功能,加重炎症
BMAA-induced侵蚀的Candidatus从回肠粘膜Arthromitus”(图1 e-f)是伴随着增加类群可能信号肠道上皮细胞和CD11b +积极促进组织炎症巨噬细胞和树突细胞,我们还发现增加的回肠BMAA-treated老鼠(图3 a - b)。激活居民免疫细胞或放大扩散的有毒分子pathobionts增殖确实在回肠粘膜引起炎症,如推断水平上升的促炎介质如肿瘤坏死因子(TNF) -α(图3 c),引发(图3 d)和IL-17 (图3 e)和低水平的il - 10,抗炎细胞因子(图3 f)。回肠SFB已知积极刺激肠道免疫,诱导稳态Th17细胞反应,促进肠道屏障的完整性。15我们的研究结果表明,IL-17水平的增加不是因为SFB-induced tissue-resident稳态Th17细胞,而是炎症Th17细胞的刺激。14丧失SFB BMAA-treated老鼠可能假设允许pathobionts能够刺激炎症Th17细胞的增生。这些炎症条件下nod样受体(NLRP) 3 inflammasome激活是由于核因子的易位kappa-B NF-kB p65进入核(图3 g)允许激活半胱天冬酶1和生产IL-1β(图3设定h)。这似乎是一个特定的效果CandidatusArthromitus回肠的枯竭以来BMAA盲肠的影响是不一致的主要炎性概要文件(在线补充图S3A-D)。水平的提高TNF-α和已知IL-1β增强肠道通透性由于掩饰的紧密连接蛋白,即ZO-1和occludin。46我们观察到显著减少ZO-1 (图3 j, K)和occludin (图3 j L)水平BMAA-treated回肠的老鼠,这表明破坏肠道屏障的完整性。以来渗透T细胞大多CD4-expressing“助手”T细胞,我们解决CD4 +细胞的水平在回肠固有层BMAA-treated老鼠但没有检测相关的差异(图3 m, N)。然而,我们观察到的改变血液中CD4 / CD8比值BMAA-treated老鼠(图3 o, P),由于CD4细胞减少(在线补充图S3E, F),这可能表明系统性炎症和与此同时增加permeabilisation BBB。事实上,我们观察到的增加IFNγ和BMAA-treated小鼠血浆中il - 6含量(图3问),同样PD患者中观察到47这可能会影响BBB的完整性。48我们观察到阳性微血管泄漏在SN BMAA-treated老鼠(图3 r, S),但不改变在纹状体或皮层(在线补充图S3G-J)。另外,我们没有观察到CD4 +细胞浸润在SN在这个时间点,尽管BBB通透性增加(在线补充图S3K)。值得注意,皮层和纹状体渗透性增加血源性组件与中脑区域相比,49留下了一个问题,为什么我们看到在SN BBB通透性改变,但无法大脑皮层和纹状体回答。
β-N-methylamino-L-alanine (BMAA)诱发回肠炎症和黑质(SN)微血管渗漏。(一)代表图像的横向回肠部分沾在未经处理的小鼠(单元)和BMAA-treated anti-CD11b。(B) CD11b量化+细胞每毫米2所有条件的回肠(n值= 4,Unt vs BMAA, * p = 0.0435)。(我)测量特定介质参与炎症反应在回肠肠样本单元或BMAA-treated老鼠。(C)肿瘤坏死因子衡量ELISA (n值Unt = 11和BMAA = 8, Unt vs BMAA, * * p = 0.0036), (D)白介素8 (IL)的ELISA (n值单元= 4和BMAA = 4, Unt vs BMAA p = 0.135), (E) IL-17衡量ELISA (n值Unt = 11和BMAA = 11, Unt vs BMAA, * * p = 0.0011), (F) IL - 10的ELISA (n值Unt = 7和BMAA = 8, Unt vs BMAA, * * p = 0.009), (G) NF-κB衡量ELISA (n值Unt = 9和BMAA = 12, Unt vs BMAA, * * * p = 0.0008), (H) Caspase-1活动。值都减去螺母(n值Unt = 8和BMAA = 12, Unt vs BMAA, * * p = 0.0068),(我)IL-1β衡量ELISA (n值Unt = 7和BMAA = 6, Unt vs BMAA * * * p = 0.0002)。(J-L)评估肠道屏障的完整性。(J)免疫荧光染色zonula occludens-1 (ZO-1)和occludin。(K) ZO-1完整性得分(n值条件= 4,Unt vs BMAA, * * p = 0.0019)。(左)Occludin完整性得分(n值条件= 4,Unt vs BMAA, * * p = 0.0095)。(M)代表图像的横向回肠部分沾anti-CD4螺母和BMAA-treated老鼠。(N) CD4的量化+细胞每毫米2所有条件在回肠(n值= 4,Unt vs BMAA, p = 0.411)。(O-P),测定血液中淋巴细胞的数量通过流式细胞术。(O)代表块淋巴细胞(CD45+CD3+)CD4和CD8人口在螺母和BMAA-treated老鼠。(P)量化CD4 / CD8比值(所有条件下n值= 5,Unt vs BMAA, * P = 0.036)。(Q)干扰素(IFN)γ和血浆中il - 6含量是衡量ELISA (Unt的n值= 5 - 7和BMAA = 8, Unt vs BMAA * p = 0.0346 IFNγ和il - 6 * p = 0.0238)。(r)的评估IgG-positive微血管渗漏SN的螺母和BMAA-treated老鼠。(R)代表图像的SN日冕部分染色和免疫球蛋白。(S)量化每毫米IgG-positive微血管渗漏2所有条件在SN (n值= 4,Unt vs BMAA, * p = 0.0108)。酒吧规模50µm除了R(上框)= 500µm。数据代表的意思是+ SEM。统计分析:未配对的学生的学习任务是执行B, d e,胃肠道,K-L, N, p q、s Mann-Whitney测试是在C和F。
BMAA目标中脑的线粒体
我们的发现支持了这样的观点,即BMAA, non-proteinogenic微生物来源的氨基酸,可能目标他们古老的亲戚,线粒体。BMAA治疗后我们分离小鼠中脑的线粒体和观察到的减少线粒体功能,即降低基底和最大呼吸和ATP合成(减少图4模拟),减少线粒体池calcium-buffering容量(图4 e-f)。然而,皮质线粒体隔绝BMAA-treated老鼠没有影响(图4 g-l)。调查如果BMAA专门针对神经元线粒体有助于神经退化,我们执行在体外实验使用纯分离线粒体,发现急性BMAA管理降低线粒体氧化磷酸化在孤立的中脑的(在线补充图S4A-GWT)和皮质线粒体的老鼠。21确实我们的研究结果证实这两个大脑区域受到不同的影响,不是因为线粒体池中脑和皮质之间的差异,但由于血源性易位或迷走神经的喙的轨迹BMAA或其他未知的效应器,不能达到皮质在这一工作中定义的时间点。此外,我们还确定OCR在初级中脑神经元接触BMAA并观察基底线粒体呼吸和ATP合成减少,引起类似挺(在线补充图S4H-L)。此外,我们观察到BMAA-induced降低糖酵解,糖酵解能力率和多余的糖酵解能力在初级中脑的神经元,影响与那些由于挺(在线补充图S4M-P)。因此,和由于观察线粒体功能障碍在初选BMAA-treated中脑的神经元,我们发现降低线粒体膜电位(在线补充图S5A)。有趣的是,BMAA没有进一步降低线粒体膜电位Rho0细胞(mitochondrial-deficient细胞线粒体DNA缺失)(在线补充图S5B)。而不正常的线粒体池需要碎片被mitophagy退化和避免mitochondrial-mediated死亡,50我们发现BMAA裂变的水平增加蛋白质phosphoDrp1主要中脑的神经元的线粒体(图4 m, N)从而导致分散线粒体网络(图4里)。值得注意的是,毒素无法进一步碎片线粒体细胞缺乏线粒体功能池(在线补充图S5C-E)。降低线粒体功能增加碎片导致的心磷脂,脂质发生在线粒体内膜和细菌。51事实上,我们证实治疗原发性中脑神经元BMAA引发心磷脂接触(图4 t, U)。为了克服这个危险分子的接触模式(潮湿),线粒体功能失调和分散mitophagy预计将被删除。52我们检查了线粒体运动和macroautophagy在初级中脑的神经元和观察到的减少引起的线粒体平均速度BMAA (在线补充图S6A, B)。此外,我们还观察到自噬流量的减少主要中脑的神经元处理BMAA (在线补充图S6C-E),这表明线粒体功能失调的营业额下降。我们进一步表明,线粒体是位于自噬体(在线补充图S6F-H)但不是co-localised自吞噬泡(在线补充图S6I-K),它指向一个积累BMAA-treated主要中脑神经元线粒体功能失调的心磷脂的不良过度曝光。
β-N-methylamino-L-alanine (BMAA)诱发神经元线粒体功能障碍,碎片和双磷脂酰甘油曝光。从未经处理的(单元)和孤立的中脑的线粒体BMAA-treated老鼠了。(一)代表图显示耗氧速率(OCR);(B)基底呼吸;(C) ATP合成;(D)最大呼吸。值是pmol O2/分钟/μg蛋白质。所有条件(罪犯,n值= 7,Unt vs BMAA, B * p = 0.0125, C * p = 0.0286和D, * p = 0.020)。(E-F)中脑的线粒体钙吸收能力的评估与荧光探针Calcium-green(所有条件= 4,n值Unt vs BMAA, * * * * p < 0.0001)。孤立的皮质线粒体螺母和BMAA-treated老鼠了。(G)代表图显示OCR皮层;(H)基底呼吸;(我)ATP合成;(J)最大呼吸。值是pmol O2/分钟/μg蛋白质。所有条件(H-J) n值= 4,Unt vs BMAA;H, p = 0.4456;我,p = 0.1246和J, p = 0.9689)。(K-L)皮质线粒体钙吸收能力的评估与荧光探针calcium-green(所有条件= 4,n值Unt vs BMAA, p = 0.1870)。(m u)主要中脑神经元文化BMAA服用3毫米和1µM CCCP 2小时。(M)代表为phospho-Drp1水平和免疫印迹(N)各自的光密度分析。墨迹是TOM20 re-probed确认等于加载和线粒体蛋白质分数纯度(n值Unt CCCP = 4, BMAA = 3。Unt vs挺,p = 0.0711;Unt vs BMAA, * p = 0.0375)。 (O) Primary mesencephalic neurons were immunostained with Tom20. (P–S) Alterations in mitochondrial network were calculated with an ImageJ Macro tool (n values for all conditions=6). (P) Number of mitochondrial networks (Unt vs CCCp, p=0.2674; Unt vs BMAA, p=0.3169). (Q) Number of mitochondrial branches (Unt vs CCCP, ****p<0.0001; Unt vs BMAA, ***p=0.0002). (R) Mitochondrial footprints (Unt vs CCCP, *p=0.0247; Unt vs BMAA, *p=0.0241). (S) Number of mitochondrial individuals (Unt vs CCCP, **p=0.026; Unt vs BMAA, p=0.0968). (T) Representative images of cardiolipin exposure which was visualised with the fluorescent dye 10-N-nonyl acridine orange. (U) Cardiolipin fluorescence was calculated with ImageJ. Data is reported as absolute values (n values for all conditions=6, Unt vs CCCP, p=0.676; Unt vs BMAA, *p=0.0255). Scale bars in O=50 µm and T=33 µm. Data represents mean+SEM. Statistical analysis: Unpaired Student’s t-test was performed in B–E, H–J and L. One-way analysis of variance followed by Dunnett’s test was performed in N, Q–S and U. Kruskal-Wallis test followed by Dunn’s test was performed in P.
线粒体心磷脂的驱动器激活先天免疫和神经炎症
线粒体功能失调暴露心磷脂,一个公认的潮湿,52激活先天免疫反应self-amplified循环的高潮在逐步退化。解决先天免疫激活神经元贡献我们证实了低水平的初级中脑的神经胶质细胞污染的文化(少于1%的Iba1 + Trem2 + CD11b +细胞和胶质原纤维酸性蛋白,不到20% GFAP-positive细胞)(数据未显示),导致我们认为神经元可以挂载的先天免疫反应介导BMAA-induced线粒体功能障碍。我们发现BMAA诱导toll样受体表达增加(TLR) 4在初级中脑神经元(图5 a - b)。TLR信号导致NF-κB激活和易位到细胞核,它结合催化剂的IL-1β基因诱导转录。53我们还观察到NF-κB激活BMAA治疗后(图5 c)和预期增加pro-IL-1β水平(图5 a, D)。半胱天冬酶1,劈开pro-IL-1βBMAA治疗后还发现在神经元被激活(图5 e),导致增加成熟IL-1β水平(图5 f)。
β-N-methylamino-L-alanine (BMAA)激活大脑神经元先天免疫在体外和在活的有机体内。主要从天真的小鼠中脑神经元文化处理1µM CCCP BMAA 48小时2小时3毫米。(一)代表免疫印迹toll样受体(TLR) 4和pro-interleukin (IL) 1β水平。屁股re-probedβIII-Tubulin证实对平等的蛋白质在装货。(B)的光密度分析水平的TLR4与βIII-Tubulin正常化(所有条件= 4,n值治疗(螺母)vs挺,p = 0.076;Unt vs BMAA, * * p = 0.0023)。(C)核因子kappa-B (NF-κB)水平计算使用NF-κB p65酶联免疫试剂盒。值是μg /毫升(所有条件下n值= 7,Unt vs挺,* p = 0.0039, Unt vs BMAA, * p = 0.013)。(D)的光密度分析的水平pro-IL-1β与βIII-Tubulin正常化(所有条件下n值= 5,除了BMAA = 4, Unt vs挺,p = 0.1213;Unt vs BMAA, * p = 0.044)。 (E) Caspase-1 activation (n values for all conditions=4, Unt vs CCCP, *p=0.047, Unt vs BMAA, **p=0.002). (F) IL-1β levels in the isolated cytosolic fraction was determined using an IL-1β ELISA kit. Values are pg/mL (n values for all conditions=5, Unt vs CCCP, p=0.5928; Unt vs BMAA, *p=0.018). Homogenates from the mesencephalon of mice treated with or without BMAA were examined. (G) Representative immunoblot for TLR7, TLR4 and pro-IL-1β levels. The blots were re-probed for βIII-tubulin to confirm equal protein loading. (H) Densitometric analyses of TLR7 levels normalised against βIII-tubulin (n values for Unt=7 and BMAA=6, Unt vs BMAA, *p=0.027). (I) Densitometric analyses of TLR4 levels normalised against βIII-tubulin (n values for Unt=6 and BMAA=4, Unt vs BMAA, **p=0.004). (J) NF-κB levels were calculated using NF-κB p65 ELISA kit. Values are μg/mL (n values for Unt=6 and BMAA=4, Unt vs BMAA, **p=0.002). (K) Densitometric analyses of pro-IL-1β levels normalised against βIII-tubulin (n values for Unt=6 and BMAA=3, Unt vs BMAA, **p=0.007). (L) Caspase-1 activation (n values for Unt=10 and BMAA=8, Unt vs BMAA, **p=0.003). (M) IL-1β levels were determined using an IL-1β ELISA kit. Values are pg/mL (n values for Unt=6 and BMAA=4, Unt vs BMAA, **p=0.003). (N) IL-17 levels were determined using an IL-17 ELISA kit. Values are pg/mL (n values for Unt=5 and BMAA=6, Unt vs BMAA, p=0.8029). (O) IL-10 levels were determined using an IL-10 ELISA kit. Values are pg/mL (n values for Unt=5 and BMAA=8, Unt vs BMAA, p=0.483). (P–R), Iba1 and Trem2 expression in SN from Unt and BMAA-treated mice by immunofluorescence. (P) Representative images of brain coronal sections stained with Iba1 (microglial and macrophage-specific calcium-binding protein), Trem2 (triggering receptor expressed on myeloid cells 2) and Hoechst 33 342 as nuclei marker in SN. Enlarged boxes show the area of Trem2 (white pixels) contained in Iba1 signal. (Q) Quantification of the number of Iba1+细胞每毫米2所有条件(n值= 4,Unt vs BMAA, * p = 0.028)。(R)的百分比Trem2 Iba1表达式中包含的区域(所有条件= 4,n值Unt vs BMAA, * * * p = 0.0002)。酒吧是50µm规模。数据代表的意思是+ SEM。统计分析:单向方差分析其次是Dunnett测试执行B、d e。克鲁斯卡尔-沃利斯检验之后,邓恩的测试是在C和f .不成对学生的学习进行了在h n和O q r和Mann-Whitney测试。
证明BMAA治疗通过选择性地诱导神经炎症mitochondria-dependent神经元激活先天免疫,我们分离小鼠中脑应对NLRP3 inflammasome激活和观察到BMAA诱导TLR7和TLR4受体表达增加在活的有机体内(图5胃肠道)。TLR7,位于核内体和TLR4在质膜,能够触发先天免疫反应神经元。54这些受体信号NF-κB (图5 j),这将激活NLRP3 inflammasome。事实上,我们观察到的增加pro-IL-1β水平(图5 g和K)和激活半胱天冬酶1 (图5 l),它允许释放促炎IL-1β(图5米)。综上所述,我们的研究结果有力地表明,通过BMAA激活小鼠大脑先天免疫可能由于线粒体接触抑制。虽然最近的研究大脑中的链接生产IL-17 BBB泄漏和炎性疾病进展,55我们的鼠标模型未能揭示IL-17中脑的水平显著增加(图5 n)或显著改变抗il - 10的水平(图5啊)。我们观察到小胶质细胞的激活在SN Iba1呈现扩大细胞体和过程(图5 p q),发现增加本地化Trem2-positive变异小胶质细胞(图5 p-r)。活化的小胶质细胞也释放促炎细胞因子,即TNF-α和IL-1β可能支持BBB permeabilisation和随后的外周白细胞渗透到中枢神经系统。55然而,在选定的时间点我们没有观察到在SN BMAA-treated小鼠CD4 +细胞浸润(在线补充图S3K)。
BMAA治疗引发传播aSyn总量从肠道黑的大脑区域可能通过迷走神经
aSyn总量是帕金森病的主要组织病理学特征。最近的数据从人类和PD小鼠模型表明,upregulation aSyn表达和随后oligomerisation和聚合最初发生在肠道肠神经元和后来在SN多巴胺能神经元。3个5事实上,我们观察到aSyn骨料和p-aSyn回肠BMAA-treated老鼠的样本(S129P) (图6 a e)。回肠样本BMAA-treated老鼠显示水平的提高aSyn聚合和/或低聚物通过免疫组织化学(图6 a, B)、ELISA (图6 c)和免疫印迹(图6 d e)。在回肠这些差异是显著的,但不是在盲肠(在线补充图S7A)。此外,同意Braak假说提出,病原体或毒素从肠道通过迷走神经到大脑,5我们可以检测aSyn总量和p-aSyn (S129P)形式在车管所(图6做减法),显示出明显的高水平的aSyn BMAA-treated老鼠总量(图6克)。最后,我们发现aSyn骨料BMAA-treated中脑的老鼠,但不是p-aSyn (S129P)形式(图6 h l)。事实上,提出只有在积累degradation-resistant aSyn聚集我们会看到大量聚集的磷酸化。56同意Braak的阶段,可能不够degradation-resistant聚合诱导广泛存在磷酸化在SN我们实验的时间点。因此,我们的数据没有显示aSyn总量的增加皮层BMAA-treated小鼠免疫反应性(在线补充图S7B)。在这里,我们表明,BMAA促进过度和oligomerisation aSyn可能由于其对神经元线粒体的影响,本质上是因为BMAA提升aSyn oligomerisation在初级中脑的神经元(图6 m-o)和ρ+细胞,但未能增加aSyn聚合Rho0细胞(图6 p q)。的确,文学的数据表明,不同的细胞和动物模型可以通过针对PD线粒体功能,一样的PD胞质杂种和MPTP-mice模型,57发展中国家透析相关神经病理特征包括aSyn oligomerisation。事实上,我们也观察到aSyn寡聚物的积累BMAA-treated小鼠中脑的线粒体分数(在线补充图S7C, D)。
β-N-methylamino-L-alanine (BMAA)诱发caudo-rostralα-突触核蛋白(aSyn)聚合。(一)显微照片代表组织学aSyn总量和phosphorylated-aSyn (p-aSyn) (S129P)免疫反应性回肠从未经处理的(单元)和BMAA-treated老鼠。(B)定量分析的光学密度(OD) aSyn聚集在肠肌丛免疫反应性。数据是正常单元组(n值条件= 4,Unt vs BMAA, * * * * p < 0.0001)。(C) aSyn寡聚物评估在回肠匀浆酶联免疫试剂盒。值是pg / mL (n值条件= 8,Unt vs BMAA, * p = 0.0425)。(D)代表免疫印迹显示aSyn单体和低聚物在回肠匀浆。这些墨迹re-probedβIII-Tubulin证实对平等的蛋白质在装货。(E)的光密度分析的水平对βIII-Tubulin aSyn正常化。数据表达相对单元组(n值条件= 4,Unt vs BMAA * p = 0.0286)。 (F) aSyn aggregates and p-aSyn (S129P) histological immunoreactivity in the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV). (G) Quantitative analysis of OD for aSyn aggregates immunoreactivity in DMV. Data normalised to Unt group (n values for all conditions=4, Unt vs BMAA, *p=0.0109). (H) aSyn aggregates and p-aSyn (S129P) histological immunoreactivity in substantia nigra (SN). (I) Quantitative analysis of OD for aSyn aggregates immunoreactivity in the SN. Data normalised to Unt group (n values for all conditions=4, Unt vs BMAA, **p<0.0047). (J) aSyn oligomeric levels were calculated using an ELISA kit in mesencephalic homogenates of Unt and BMAA-treated mice. Values are pg/mL (n values for Unt=8 and BMAA=4, Unt vs BMAA, **p=0.0042). (K) Representative immunoblot showing aSyn monomer and oligomers in mesencephalic homogenates. The blots were re-probed for βIII-Tubulin to confirm equal protein loading. (L) Densitometric analyses of the levels of aSyn normalised against βIII-Tubulin. Data are expressed relatively to Unt group (n values for all conditions=4, Unt vs BMAA *p=0.0286). (M) Cytosolic aSyn oligomeric levels from primary mesencephalic neuronal cultures treated with 1 µM CCCP for 2 hours and 3 mM BMAA for 48 hours were calculated using an ELISA kit. Values are pg/mL (n values for all conditions=3, Unt vs CCCP, p=0.2615; Unt vs BMAA, **p=0.0063). (N) Representative immunoblot showing aSyn monomer and oligomers in mesencephalic neuronal cultures treated with 3 mM BMAA for 48 hours. The blots were re-probed for β-Actin to confirm equal protein loading. (O) Densitometric analyses of the levels of aSyn normalised against β-Actin. Data are expressed relatively to Unt neurons (n values for all conditions=4, Unt vs BMAA *p=0.0286). (P) NT2-Rho+ and Rho0 cells treated with 5 µM CCCP for 2 hours and 3 mM BMAA for 48 hours were evaluated by western blot. Representative immunoblot showing aSyn oligomers. The blots were re-probed for α-βIII-Tubulin to confirm equal protein loading. (Q) Densitometric analyses of the levels of aSyn normalised against α-βIII-Tubulin in Rho+ cells (n values for all conditions=6, Unt vs CCCP, *p=0.0236, Unt vs BMAA, **p=0.0018) and Rho0 cells (n values for all conditions=4, p>0,5). Histology samples were counterstained with cresyl violet. Scale bars are 50 µm (enlarged inner square) and 1 mm. Data represent mean+SEM. Statistical analysis: Unpaired Student’s t-test was performed in B–J and Mann-Whitney test in L and O. One-way analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s test was performed in M. In Q one-way ANOVA followed by Dunnett’s test was performed to compare different treatments against Unt group, and unpaired Student’s t-test was performed to compare Rho+ vs Rho0 cells.
β-N-methylamino-L-alanine (BMAA)诱导多巴胺能神经退化在活的有机体内。(A)代表免疫荧光显微照片的本地化酪氨酸羟化酶(TH)和胆碱乙酰转移酶(聊天)阳性神经元在迷走背运动核(DMV)治疗(单元)和BMAA-treated老鼠。(B)量化TH-positive神经元的数量每毫米2所有条件DMV地区(n值= 4,Unt vs BMAA, * * * p = 0.004)。(C)量化ChAT-positive神经元的数量每毫米2所有条件DMV地区(n值= 4,Unt vs BMAA, p = 0.41)。(D)代表TH免疫印迹,synaptophysin和PSD95蛋白质。这些墨迹re-probedβIII-tubulin证实对平等的蛋白质在装货。(E)的光密度分析,(F) synaptophysin (G) PSD95。数据与βIII-tubulin正常化,并表示相对Unt老鼠(Unt E-F n值= 10 BMAA = 8, G, Unt = 9和BMAA = 7, Unt vs BMAA;E, * * p = 0.006, F, p = 0.8286 G, p = 0.2799)。显微照片(H)代表大脑日冕部分应用在纹状体(STR)和黑质TH (SN)从螺母和BMAA-treated老鼠。(我)的光密度分析TH-positive STR正常化的纤维单元组(n值单元= 6和BMAA = 5, Unt vs BMAA, * * p = 0.0016)。(J)总数nigral TH-positive神经元在SN stereological评估分析(n值单元= 6和BMAA = 5, Unt vs BMAA, * p = 0.0135)。(K)多巴胺水平评估从Unt STR匀浆和BMAA-treated小鼠多巴胺酶联免疫试剂盒。 Values are pg/mL (n values for Unt=6 and BMAA=7, Unt vs BMAA, *p=0.035). Scale bars are 50 µm (A) and 100 µm (H) (enlarged inner square) and 200 µm (A) and 1 mm (H). Data represents mean+SEM. Statistical analysis: Unpaired Student’s t-test was performed in B–C, E, G, I–J and Mann-Whitney test in F and K.
小鼠口服与BMAA发达黑变性和运动功能障碍
BMAA-induced侵蚀的Candidatus从回肠粘膜Arthromitus”(图1 e-f)导致胃肠道炎症和aSyn caudo-rostral聚合,这可能导致的损失TH-positive神经元。我们的研究显示,BMAA-treated TH-positive神经元减少动物的水平,但不是DMV ChAT-positive神经元(图7 a - c)。这反映了多巴胺能神经元BMAA易感性的增加,可以通过迷走神经传递到SN含有儿茶酚胺的纤维位于腹部迷走神经TH-positive大约70%的神经元。58进一步检查是否BMAA-induced神经炎症和aSyn oligomerisation导致中脑多巴胺能神经元损伤分析了TH含量和STR BMAA-treated老鼠。有趣的是,我们观察到在中脑多巴胺神经元的损失由减少TH水平(图7 d e),没有任何可以改变其他的突触标记,如PSD95和synaptophysin (图7 d和做减法)。我们还观察到枯竭的STR TH-positive纤维(图7设定h)和减少的总数nigral SN TH-positive细胞(图7 h和J)BMAA-treated小鼠,其损失导致STR(多巴胺水平较低图7 k)。相关分析表明,聚合的水平aSyn DMV和SN导致损耗的中脑的TH-positive神经元,尽管我们也观察到SN免疫球蛋白泄漏导致SN aSyn总量水平的增加,可能不仅caudo-rostral产生影响,因为SN免疫球蛋白漏不与aSyn DMV聚合的水平(在线补充图S7E-H)。
测试如果BMAA-induced多巴胺能神经元的损失,会使全身慢性炎症(图3问),可能会影响电机性能,我们评估小鼠运动性能使用不同的运动行为测试。我们发现,在梁行走电动机性能测试(8毫米)明显受损BMAA-treated老鼠(图8)。我们还观察到BMAA后抱住分数增加(图8 b)和减少延迟的反向控制测试(图8 c)。这些结果表明,BMAA-induced发动机损伤但没有明显的对记忆功能的影响性评估的测试选择的时间点(图8 d e)。开放的运动活动现场试验也显著下降(图8外:我)。此外,我们还注意到,BMAA治疗诱导改变气味歧视,它同意PD症状(数据没有显示)。
β-N-methylamino-L-alanine (BMAA)在活的有机体内政府诱发运动行为改变。(A)平衡和运动协调性能评估和梁行走测试(n值治疗(螺母)= 9和BMAA = 11, Unt vs BMAA, * * * * p < 0.0001)。(B)下肢搂抱反射被监控,为快速表型神经评分系统来评估疾病进展(n值Unt = 10和BMAA = 15, Unt vs BMAA, * * * p = 0.0008)。(C)反向控制测试是用来评估肌肉力量的肢体肌肉(所有条件= 8,n值Unt vs BMAA, * p = 0.0132)。(d e)认知和记忆能力是评估使用性。(D)的百分比之间的交替武器和(E)延迟反应(s)是评估(所有条件= 8,n值Unt vs BMAA, D, p = 0.2165;E、p = 0.192)。(外)运动活动在开放领域评估领域。(F)行驶距离(cm), (G) %的时间在舞台的中心,(H)平均速度(厘米−1),(我)%休息时间(所有条件下n值= 14日Unt vs BMAA, F, * p = 0.0384;G * p = 0.0165;H * p = 0.0383和我,* p = 0.0495)。数据表示的意思是+ SEM。统计分析:未配对t检验进行的学生,C和练习和Mann-Whitney测试B和D。
讨论
特发性帕金森病代表大约90%的疾病病例,但病原学的因素仍然是难以捉摸的。1目前认为运动症状之前非胃肠道功能障碍等特性。2aSyn总量,主要PD病理特征,发现积累在某些病人的外围肠道等器官,在前驱的早期阶段。3 - 5因此,假定环境因素,即某些肠道微生物或他们的产品,可以作为PD的环境诱因。6理解肠道失调对中枢神经系统的影响已成为开发新的诊断和治疗的关键工具,在未来可能逮捕疾病进展。这项工作表明,BMAA环境微生物代谢物与已知的毒害神经的特性,耗尽特定细菌群体,本质上可能调节回肠粘膜免疫和肠道蠕动。这样的窄谱侵蚀伴随着加重胃肠道炎症、屏障破坏和aSyn聚合,它也可能进一步追踪的病理过程中脑,线粒体功能受损。因此,线粒体网络分裂和接触抑制神经元激活先天免疫促进aSyn聚合、神经炎症、多巴胺能神经元和运动改变WT老鼠。这些观察结果支持某些微生物代谢物可以触发‘gut-first PD但他们也加强的作用线粒体疾病进展的关键球员。
PD患者肠道菌群的变化检测包括增加的比例与炎性细菌组属性和伴随减少组的相对丰度与抗炎作用。45肠道失调患者中发现快速眼动睡眠行为障碍59表明这些改变发生在“身体”的前驱阶段早期PD的病例。60在这里,我们表明,BMAA暴露显著改变关键细菌种群的相对水平在回肠和盲肠黏膜,以及粪便材料,尽管回肠黏膜的影响更明显。Turicibacter丝状孢子形成细菌BMAA治疗后明显减少。这些细菌是最近发现从肠嗜铬细胞的细胞刺激血清素的释放,一种神经递质,调节肠道蠕动。61年因为便秘是一种常见的PD症状,我们推测,大量流失Turicibacter回肠和盲肠粘膜和粪便物质可能导致受损的5 -羟色胺信号可能假设导致受损的肠道蠕动。贴切地,BMAA治疗也明显减少CandidatusArthromitus的最突出的细菌属老鼠回肠粘膜。在小鼠肠道内稳态SFB以来基本角色,14日15他们的损耗可以证明增强肠道炎症13和观察到的损失的肠道屏障的完整性。的确,损耗SFB激活CD11b +肠道细胞释放居民TNF-αIL-1β,而非居民促炎Th17细胞激活可能也开车生产IL-17外围的影响。14有趣的是,在早期PD循环Th17细胞增加。62年在炎症条件下,肠道上皮细胞暴露在多种细胞因子可以通过减少occludin协同损害肠道屏障和ZO1水平以及细胞骨架重排。46另外,我们观察到CD4 +淋巴细胞减少和增加的IFNγ和il - 6水平BMAA-treated老鼠的血液,像所描述的PD患者。48 63CD4 + T细胞的减少和增加的PD患者的血液中促炎细胞因子在先前的研究报告可能显示的外围免疫障碍倾向系统性炎症。64年增加中脑的免疫球蛋白g渗透在我们的研究发现表明,BMAA提升BBB通透性的SN虽然没有可检测纹状体或皮层的效果观察。BMAA已经穿过BBB和ALS患者的大脑中发现/ PDC。20.在此,我们证明在活的有机体内BMAA治疗受损的OCR和钙吸收中脑的线粒体而不是皮质线粒体,尽管直接急性在体外治疗孤立中脑的或皮质线粒体BMAA诱导OCR下降。21BMAA治疗导致线粒体功能障碍和分裂在初级中脑的神经元,而由于mitophagy障碍没有退化,因此暴露心磷脂,潮湿能够激活神经元先天免疫。52有趣的是,当实验在Rho0细胞缺乏线粒体功能,BMAA没有影响线粒体的膜电位或碎片。我们还观察到BMAA治疗激活NLRP3 inflammasome伴随着丰富的释放IL-1β中脑的神经元的文化。虽然在在活的有机体内背景下,我们不能确认NLRP3激活和释放IL-1β局限于神经元,小胶质细胞的激活在SN和更强烈的co-localisation Trem2-positive单核细胞强烈表明系统性免疫的参与。54由于神经元表达通常和主要组织相容性复合体类我蛋白质,能够释放促炎介质,65年我们建议在BMAA-treated老鼠,神经元的最初影响,后来小胶质细胞的信号。
一个描述的先天免疫激活的结果是抗菌肽的生产。66年最近的数据表明,在肠神经系统(ENS), aSyn在先天免疫防御中发挥作用的消化道。事实上,增加表达aSyn肠神经突的儿科患者的上消化道与急性和慢性炎症程度呈正相关诱导在肠壁诺瓦克病毒感染。67年也证明了aSyn展品抗菌活性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,这表明,除了在神经递质释放,aSyn也可以作为天然抑菌蛋白质。68年BMAA-treated老鼠,我们观察到一个明显增加aSyn聚合在回肠,caudo-rostral进展通过车管所核SN。我们的发现与研究在无菌鼠与PD的肠道微生物群或curli-producing殖民大肠杆菌显示,增加聚合aSyn在肠道和大脑,69年9建议一个aSyn-dependent机制一些PD的病因学“gut-first”案件。70 71这个提议,细菌毒素如BMAA可以刺激的表达和传播aSyn通过enteroendocrine与肠神经细胞突触胃肠道3创新和可能揭示前驱的重要新目标地址,外围synucleinopathy。对于实体,一个非常有趣的研究在PD患者的十二指肠活检没能证明黏膜下神经元数量的改变以及改变线粒体膜电位和aSyn水平。72年然而,这些数据同意我们的研究,因为我们没有观察到十二指肠aSyn总量的增加BMAA-treated老鼠(数据未显示)。此外,提出了aSyn像prion-like蛋白质蔓延caudo-rostral轨迹从肠道通过迷走神经到大脑。70 73 - 76我们还观察到大脑线粒体内aSyn积累,这可能表明一个正反馈机制进一步导致功能障碍。几个在体外研究表明,aSyn目标诱导线粒体形态和功能的改变。77年有趣的是,鱼藤酮,一种复杂的我抑制剂会导致线粒体功能障碍和分裂,也引发aSyn积累。78年因此我们建议PD神经退化过程密切相关的线粒体的作用在先天免疫的激活。这项工作进一步强化了至关重要的作用,线粒体在PD的病因学,本质上是因为BMAA治疗不会增加aSyn聚合Rho0细胞。BBB permeabilisation和线粒体功能障碍发生的观察在SN但不是皮质让我们设定的重要影响通过迷走神经caudo-rostral aSyn的病理过程。事实上,尽管以前的观测显示增加皮质的渗透率和STR地区血源性组件,49我们观察到BBB permeabilisation之间的正相关和aSyn中脑的总量水平,这表明血液和迷走神经的路线可能参与线粒体BMAA的有害影响。这将反过来完全激活先天免疫反应和神经炎症,将协同诱导多巴胺能神经细胞退化和影响运动机能。总之,我们的研究结果表明,在遗传易感PD患者,病理可能会在肠道环境毒素引发的如BMAA、微生物产品常见的海鲜,贝类和鱼。BMAA观察效果的特定成员的小鼠肠道微生物组即“CandidatusArthromitus’,我们建议这毒素可能最初进化为一种抗菌化合物,可能提供了一些生产商在共享生态系统的竞争优势,并偶有针对性的线粒体,承认一个古老的内共生变形菌门的亲属。在支持gut-to-brain范式,我们表明,肠道炎症与aSyn聚合和突出线粒体的关键作用在下游神经先天免疫的激活,aSyn聚合和DMV和SN TH-positive神经元的损失。虽然我们不确定存在神经元线粒体功能,我们认为肠道和实体作为网关通过BMAA aSyn到达DMV和SN,目标线粒体,逐渐造成损害最脆弱TH-positive神经元。79年然而,我们不能完全抛弃周围炎症和顺向BBB破坏的可能性参与BMAA大脑实质的访问,必须解决的一个重要的问题在未来的研究。
我们建立理论,长期暴露于微生物BMAA通过食物来源影响主机和可能引起表型变化可能引发PD。我们的研究结果表明,BMAA具有窄谱抗生素活动对一些细菌“哨兵”负责肠道粘膜免疫内稳态,证期局。尽管宿主遗传易感性的作用以及其他贡献者,即那些由肠道失调作为病理学进展的可能的司机,这个工作是很重要的提醒卫生部门迫切需要实现常规协议监控的水平(和其他)毒素在食品和食品补充剂。总之,我们的工作了额外的光到一个持久的讨论80年通过提供的第一个概念可能参与微生物毒素的PD的病因学(图9),这是一个重要的一步发展的创新疗法成功地阻止这种神经退行性疾病的发作和慢性过程。
‘Gut-first PD的示意图。环境微生物毒素导致分段丝状细菌的侵蚀在回肠(SFB、绿),这强化了Th17促炎反应和肠道屏障完整性的丧失。这些事件在肠道允许疾病的进展进入大脑通过血液或迷走神经。微生物毒素目标中脑的线粒体和激活神经元先天免疫紧随其后aSyn表达式,最终小胶质激活和PD。aSyn,α-突触核蛋白;BMAA,β-N-methylamino-L-alanine;IL,白介素;帕金森病,帕金森病;Th17,辅助T 17所示。(这张照片是在BioRender.com)创建的。
数据可用性声明
合理的请求数据。的数据支持本研究的发现可以从相应的作者。
伦理语句
病人同意出版
伦理批准
动物程序批准的动物福利委员会中心的神经学和细胞生物学和医学院,葡萄牙当局Coimbra的大学认证(Direcao; de Veterinaria)。
确认
SMC投入这项工作她的导师和博士生导师,卡塔琳娜州Resende de Oliveira教授。作者承认Ines梅洛品牌寻求帮助盲人的量化和得分,如果/包含IHC图像,安娜克里斯蒂娜提供关键的“政府改造”海马方法和主力起飞(Genoinseq,下一代测序,神经科学和细胞生物学中心)对微生物基因组测序的支持。
引用
补充材料
脚注
和MFM-P同样起到了推波助澜的作用。
调整通知本文已经被修正,因为它第一次在网上发布。图6的传说已经被修正。
贡献者NE和SMC概念化设计的学习和研究计划。不监督微生物工作和SMC监督其他的工作。SA和DN-C生成的微生物组的数据。DFS和执行所有的在体外实验。EC和MFM-P执行动物手术,组织清算。MFM-P和JDM进行组织学分析。MFM-P进行流式细胞仪分析。EC和DFS细胞因子进行分析。JDM, EC, MFM-P和ARP-S执行行为实验。董继玲女士,和DFS海马执行技术。是和DFS蛋白进行分析。DFS和MFM-P执行共焦成像。MFM-P和DN-C进行数据分析。 NE and SMC wrote the manuscript. All authors contributed to the material and methods section, results section and figure legends. SMC and NE are guarantors of this work.
资金这项工作是由Santa Casa da Misericordia de葡京,葡萄牙通过Mantero Belard神经科学奖2016 (mb - 40 - 2016);由FMUC-PEPITA (2018);欧洲区域发展基金(ERDF),通过先涛公司2020支线运营项目项目Centro - 01 - 0145 -菲德尔- 000012 (HealthyAging 2020)和通过2020 -经营项目竞争力和国际化竞争和由葡萄牙国家基金通过FCT-Fundacao para Ciencia e Tecnologia下项目PTDC MED-NEU / 3644/2020, PINFRA / 22184/2016 / poci - 01 - 0145 -菲德尔- 022184和兴趣库/ 04539/2020。电子商务得到了奖学金mb - 40 - 2016。如果/ 01061/2014调查员合同支持。支持JDM博士奖学金PD / BD / 146409/2019, DN-C博士奖学金支持SFRH / BD / 117777/2016和支持ARP-S博士奖学金PD / BD / 2020.06543.BD。
相互竞争的利益没有宣布。
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