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炎症性肠病
原始研究
中性粒细胞通过肽基精氨酸脱亚胺酶-4依赖性免疫血栓形成预防溃疡性结肠炎直肠出血
  1. 莫里茨Leppkes1，2，
  2. Aylin林德曼1，
  3. 斯蒂芬妮去ß葡萄酒1，
  4. Susanne保卢斯1，
  5. 杜米尼克罗斯1，
  6. 安妮·哈1，
  7. 伊娃爱1，
  8. 塞巴斯蒂安Zundler1，2，
  9. 米格尔Gonzalez-Acera1，
  10. Jay V Patankar1，
  11. 法布里奇奥Mascia1，
  12. 克里斯蒂娜麦克尔1，
  13. 马库斯·霍夫曼3.，
  14. Stefan Uderhardt2，3.，
  15. Schauer克里斯汀3.，
  16. 塞巴斯蒂安Foersch4，
  17. 克莱门斯Neufert1，2，
  18. 迈克尔Vieth5，
  19. Georg Schett2，3.，
  20. 拉贾Atreya1，2，
  21. Anja A Kühl6，
  22. 安德烈·布莱西7，
  23. Christoph贝克1，
  24. 马丁·赫尔曼3.，
  25. 马库斯·F·纽莱特1，2
  1. 1医务室1，弗里德里希·亚历山大大学诊所，埃朗根、德国
  2. 2德国免疫治疗中心，埃朗根、德国
  3. 3.3号诊所，弗里德里希·亚历山大大学诊所，埃朗根、德国
  4. 4大学医学中心病理研究所，美因茨、德国
  5. 5弗里德里希·亚历山大大学，Klinikum Bayreuth病理研究所，埃朗根、德国
  6. 6Charité - Universitätsmedizin柏林，企业会员自由Universität柏林和Humboldt-Universität zu柏林，柏林、德国
  7. 7实验室动物科学研究所，汉诺威医学院，汉诺威、德国
  1. 对应到Moritz Leppkes博士，德国埃尔兰根市弗里德里希-亚历山大-埃尔兰根-纽伦堡大学门诊部医学部1部;moritz.leppkes在{}uk-erlangen.de

摘要

客观的出血性溃疡和糜烂是活动性溃疡性结肠炎(UC)的标志。然而，控制出血和黏膜瘀血的机制仍不明确。

设计我们使用高分辨率内窥镜和活性UC的结肠组织样本(n = 36)，以及缺乏肽基精氨酸脱亚胺酶-4 (PAD4)的小鼠、gnotobio小鼠和对照组的物理和化学粘膜损伤的实验模型。我们利用内窥镜、组织化学、活细胞显微镜和流式细胞术研究了粘膜瘀血过程中被侵蚀的粘膜表面。

结果内镜下可见新鲜血液、血素或纤维蛋白覆盖UC糜烂和溃疡。溃疡性结肠炎直肠出血与纤维蛋白层呈负相关，而非新鲜血液或侵蚀上的血色素。纤维蛋白层含有大量与中性粒细胞细胞外陷阱(NETs)共聚集的中性粒细胞，具有可检测到的PAD活性。转录组分析显示显著升高PAD4活跃UC中的表达。在实验造成的伤口中，我们发现中性粒细胞在原发性血块形成数小时后以依赖pad4的方式形成NET，并将血块重塑为含有瓜氨酸组蛋白的免疫血栓，即使在没有微生物群的情况下也是如此。与对照组相比，缺乏pad4的小鼠葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎病程加重，直肠出血显著增加(96% vs 10%)。缺乏pad4的小鼠无法重塑粘膜伤口上的血凝块，从而导致愈合受损。因此，net相关的免疫血栓在急性结肠炎中具有保护作用，而免疫血栓形成不足与直肠出血有关。

结论我们的研究结果揭示了中性粒细胞通过pad4依赖性机制诱导继发性免疫血栓形成。免疫血栓形成不足可能促进UC直肠出血。

  • 炎症性肠病
  • 粘膜损伤
  • 白细胞
  • 溃疡性结肠炎
  • 出血

数据可用性声明

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http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-324725

数据来自Altmetric.com

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    摘要框

    关于这个主题我们已经知道了什么?

    • 直肠出血是活动性溃疡性结肠炎(UC)的一个重要和令人担忧的特征，在许多情况下都存在。在这里，我们研究了中性粒细胞介导的免疫血栓形成和细胞外陷阱形成在受损肠粘膜中的作用，并描述了它们在UC发作期间有益的止血功能。

    新的发现是什么?

    • 被激活的中性粒细胞以肽基精氨酸脱亚胺酶-4 (PAD4)依赖的方式迁移到肠上皮剥落的部位，聚集并挤压去致密的染色质，形成中性粒细胞细胞外陷阱(NETs)。

    • 依赖pad4的NET形成与血块重塑为继发性免疫血栓密切相关。在UC和疾病的实验模型中，pad4依赖的免疫血栓形成成功地实现了粘膜止血和限制直肠出血。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 免疫血栓形成和粘膜表面细胞外陷阱形成的有益作用的概念挑战了net有害的主流观点。活跃UC的治疗方法需要谨慎地平衡而不是废除中性粒细胞反应。

    简介

    自从对真爱和威特的最初治疗研究以来，1直肠出血一直被认为是重度溃疡性结肠炎(UC)患者临床特征的重要组成部分。直肠出血增加可能需要住院治疗，很少需要紧急手术干预。2 3在UC中，上皮内膜被破坏，在上皮恢复之前立即需要紧急屏障。4紧急屏障需要暂时控制微生物的入侵，避免血液和黏膜组织液的流失，并支持及时恢复粘膜上皮的完整性。5结肠炎可由各种感染性微生物引起。此外，粘膜损伤的非感染性原因也存在，从药物诱导到饮食诱导的粘膜应激。6在结构脆弱的微环境中未能清除煽动因素或重复挑战7有利于UC的持续慢性炎症和急性炎症的发展。耀斑常表现为直肠出血和大量多形核粒细胞的存在。8

    中性粒细胞可侵入上皮层，吞噬并充当第一道防线。9日10中性粒细胞可进一步挤压被称为中性粒细胞细胞外陷阱(NETs)的颗粒和核成分装饰的去致密染色质。11肽基精氨酸脱亚胺酶-4 (PAD4)在NET形成过程中对选择的触发器做出反应，有助于染色质去致密化。12 - 15net趋于聚合，16有助于主机防御13越来越多的人认为这是一种促血栓形成的元素。17 18我们观察到，粒细胞和net是UC粘膜表面的主要成分，特别是在糜烂和溃疡区域。在实验模型中，我们注意到NET在血凝块附近直接形成，并假设中性粒细胞和NET在血凝块重塑、粘膜止血和控制直肠出血中的作用。因此，在本研究中，我们在UC和实验模型中密切描述了黏膜侵蚀的表面重塑和NET形成，确定了其在黏膜伤口愈合和急性结肠炎中的功能作用及其对PAD4的依赖性。

    材料与方法

    患者和公众参与

    急性UC患者(n = 36)从德国埃尔兰根大学医院IBD学术中心招募。在临床访问中对直肠出血进行部分Mayo评分。根据标准临床实践进行常规结肠镜检查，并在知情同意后收集结肠组织活检，并同意弗里德里希-亚历山大大学伦理委员会Erlangen-Nürnberg的批准。进一步的临床信息包括疾病的定位和范围、严重程度、年龄、性别和过去或目前的治疗方法在线补充表S1和S2．患者或公众均未参与本研究的设计。由于干预措施是出于诊断和治疗原因而计划的，因此没有给研究患者造成额外的负担。

    内镜分级

    由经验丰富的内窥镜医师以盲法方式评估每位患者来自结肠不同区域的至少5张图像，以便根据黑石评分对黏膜侵蚀和溃疡的频率进行分级评估(0:无可见侵蚀，1:每10厘米切片小于10个侵蚀(尺寸< 5mm)， 2:每10厘米切片超过10个侵蚀(尺寸< 5mm)， 3:每10厘米切片超过10个腐蚀(< 5毫米)和溃疡(> 5毫米)。19影响最严重的部分，几乎完全是直肠和乙状结肠，决定了分级结果。此外，分析了所有粘膜侵蚀的形态，并评估了这些图像中纤维蛋白覆盖或新鲜血液或血色素持续存在的频率。这些发现与临床评估的部分Mayo评分相关，该评分表明直肠出血的频率。在最初评估的41例患者中，纳入了36例患者。3例被排除，因为没有进行内窥镜检查。2例患者因常规抗凝药物治疗被排除。

    人体组织样本

    经患者知情同意，根据临床指南进行结肠镜检查。免疫荧光染色石蜡包埋组织(10例结肠溃疡(包括UC和憩室炎)和22例活动性UC糜蚀面标本)。所有样本均来自美因茨、拜罗伊特和埃尔兰根的常规临床实践，并经过当地当局的积极伦理审查。

    转录组分析

    标准化儿童结肠炎治疗(PROTECT)的预测反应研究是一项多中心初始队列研究，基于美国和加拿大的29个中心，对206例UC患者进行RNAseq分析。此外，基于公开数据集(PROTECT (GSE109142)， RISK (GSE117993))分析了包括55例非ibd对照、43例UC患者和92例克罗恩病(CD)患者在内的RISK研究的独立队列RNAseq分析。20.此外，如前所述，在小鼠结肠伤口组织中进行RNA测序。21简而言之，每个样品的总量为1µg RNA被用作RNA样品制备的输入材料。按照制造商的建议，使用NEBNext Ultra RNA文库Prep Kit for Illumina (New England Biolabs)生成测序文库，并将索引代码添加到每个样本的属性序列中。聚合酶链反应(PCR)采用Phusion高保真DNA聚合酶(New England Biolabs)、Universal PCR引物和Index (X)引物。PCR产物纯化(AMPure XP系统)，文库质量在安捷伦Bioanalyzer 2100系统上进行评估。根据制造商的说明，使用PE Cluster Kit cBot- hs (Illumina)在cBot聚类生成系统上对索引编码样本进行聚类。集群生成后，在Illumina平台上对文库准备进行测序，并生成配对端读，然后进行如上所述的数据分析。21新开发的数据集可在欧洲生物信息学研究所ArrayExpress网站(https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)的登记编号(E-MTAB-10824)。22与每个主题相关的基因(血块重塑、中性粒细胞、髓细胞、淋巴细胞、成纤维细胞)是根据已发表的研究和基因本体术语单独选择的。对于细胞相关基因，利用ImmGen联盟收集的数据分析了表达的特异性。23

    老鼠

    PAD4−−/小鼠是由美国加州拉霍亚斯克里普斯研究所的K Mowen提供的，之前已经描述过。15所有小鼠均以C57BL/6为背景。对于每个单独的实验，使用年龄和性别匹配的小鼠。实验采用6-14周龄小鼠。在将缺乏pad4的小鼠与野生型小鼠进行比较的实验中，使用了精通pad4的同窝小鼠作为对照。所有小鼠都在埃尔兰根大学动物设施的特定无病原体(SPF)条件下饲养。在无菌条件下饲养的C57BL/6小鼠由A Bleich提供，并在无菌条件下的实验过程中保持在隔离器中，对照C57BL/6小鼠在SPF条件下保持在单独的笼子中。实验程序由下法兰克尼亚地方委员会批准(AZ 55.2 2532-2-358)。

    疾病的实验模型

    在小鼠饮用水中加入3 - 4%右旋糖酐硫酸钠(DSS, 36-50 kD) (MP Biotech, Santa Ana, California, USA)，诱发急性结肠炎。在整个实验过程中记录体重和临床特征。如果按照实验安排，每天静脉注射脱氧核糖核酸酶I (DNase I) (5 U/g体重)(Sigma-Aldrich)。在DSS给药第7天对结肠粘膜进行内镜分析。如果在疾病过程中体重下降20%，则对小鼠实施安乐死，或在第9天处死小鼠以作进一步检查。使用COLOVIEW高分辨率小鼠视频内镜系统(Karl Storz, Tuttlingen, Germany)进行小鼠结肠镜检查。如前所述，在小鼠结肠镜检查时使用内窥镜钳造成结肠伤口(尺寸:3 Fr.)。24每天进行结肠镜检查，以动态评估伤口区域的发展。按所述对屏幕截图进行伤口面积计算。25在指定的时间点处死小鼠，解剖结肠组织，使用穿孔活检术恢复伤口。使用RNA和蛋白质分离技术对样本进行进一步分析，并进行组织化学分析。

    细胞隔离程序

    如前所述，分离小鼠固有层单个核细胞。26简单地说，机械解剖结肠组织，在乙二胺四乙酸(EDTA)中孵育去除肠上皮细胞。其余组织用胶原酶D (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)、DNase I (Sigma-Aldrich, Munich, Germany)和disase II (Roche Diagnostics)消化。消化后的组织通过100µm细胞过滤器，剩余的细胞内容物使用针对CD45、CD11b、Siglec F、Ly6C和Ly6G (BioLegend)的荧光标记抗体制备流式细胞仪。在符合当地伦理法规的知情书面同意后，从健康献血者中分离出人外周血中性粒细胞，并使用PanColl (PanBiotech, Germany)密度梯度离心分离。通过葡聚糖沉淀从红细胞小球中富集粒细胞(60分钟，1%，Carl Roth，德国)。中性粒细胞分离物的纯度通常高于90%。用流式细胞术从巯基乙酸诱导的腹膜细胞中分离出小鼠骨髓细胞。在将3%硫乙醇酸滴入腹腔18小时后，通过Hank’s平衡盐溶液(HBSS)-EDTA溶液腹腔灌洗从腹腔中获得这些细胞。细胞悬液被直接分选为RNA裂解缓冲液。

    实时定量PCR

    组织RNA通过peqGOLD Total RNA Kit (Peqlab, Erlangen, Germany)的裂解缓冲液中液氮直接冷冻组织样本进行分离。RNA定量使用Nanodrop技术(Thermo Scientific, Wilmington, Delaware, USA)。使用BioRad iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad Laboratories, Munich, Germany)逆转录成互补DNA (cDNA)。实时定量PCR (qPCR)使用定量引物分析Actb, Aqp9，Csf2，Csf3，Cxcl5，Cxcr2，产生Hprt，Il1b，白细胞介素6，Nos2，Tnfa, Pad2, Pad4, S100a9(Qiagen, Hilden，德国)和Roche LightCycler系统上的定量SYBR Green qPCR试剂盒(Qiagen) (Roche, Penzberg，德国)。相对于管家基因计算表达量产生Hprt使用deltadelta阈值循环(ΔΔCt)算法。分别计算处理动物与未受刺激对照组的倍差与各自对照均值的比值。

    免疫荧光和印迹技术

    采用经典苏木精-伊红(H&E)染色法对石蜡包埋切片进行组织学染色。冷冻切片或石蜡包埋切片的免疫荧光如下所述，并在共聚焦激光扫描显微镜或标准荧光显微镜(Leica，德国)上进行记录，使用α-平滑肌肌动蛋白(Abcam，英国剑桥，1:500)、β - catenin(细胞信号，1:500)、E-Cadherin (BD, 1:100)、EpCAM (BioLegend, 1:100)、柠檬酸组蛋白H3 (Abcam, 1:200)、MPO (Abcam, 1:200)、C3d (R&D Systems, 1:100)特异的原代抗体进行过夜杂交。使用生物素化的二级抗体(山羊抗兔或抗大鼠，Abcam, 1:1000)和TSA荧光素/Cy3试剂盒(PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA)或直接标记Alexa 488或Alexa 555偶联山羊抗大鼠抗体(Abcam, 1:20 - 1:1000)进行检测。检查前，用Hoechst 33342、碘化丙啶或SYTOX Green (Invitrogen Molecular Probes, Karlsruhe, Germany;BD，海德堡，德国)。在没有Alexa 488/异硫氰酸荧光素(FITC)免疫荧光的情况下，在488 nm激发和525 nm发射下测定了石蜡固定切片中血块的自身荧光。使用哺乳动物蛋白提取试剂(MPER)完全缓冲液(Thermo Scientific)从快速冷冻样品中分离组织源性蛋白，并使用球磨机进行机械破坏。用Bradford试剂(Carl Roth)进行蛋白质定量。对于斑点印迹，蛋白质裂解物直接施用于硝化纤维膜。为了进一步分析，使用现成的凝胶(Bio-Rad)，在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后进行Western blots。

    溃疡面积计算

    用H&E染色的组织切片进行盲法形态测量分析，计算相对于整个横切面的溃疡影响面积。

    粪便细菌载量评估

    分别于伤前和伤后18小时采集gnotobioand SPF小鼠粪便样本。粪便样本悬浮在重量标准化量的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。滤液镀于无菌LB琼脂板上，不含抗生素，37℃孵育24小时，计数菌落。

    pad4依赖性纤溶酶活性测定

    不同浓度的人体α2-抗纤溶酶(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)与活性PAD4酶(Cayman Chem, Ann Arbor)在37°C下，在含有100 mM Tris-HCl, 160 mM赖氨酸和10 mM CaCl的缓冲液中预孵育2小时2．然后，加入人活性纤溶酶，在37°C下孵育30分钟。然后将荧光纤溶酶底物n - succinyl - alpha - phi - lys - amc (Merck Millipore)添加到每个孔中，在Tecan Infinite M200微孔仪(Tecan, Männedorf，瑞士)中用ex/em 345/465 nm在37°C下测量60分钟的荧光强度。使用Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, Washington, USA)分析结果。

    结肠伤口转谷氨酰胺酶活性的评估

    将转谷氨酰胺酶底物5-(Biotinamido)戊胺(Merck Millipore)溶解在无菌PBS中，以100 mg/kg体重的野生型和PAD4腹腔注射−−/小鼠在结肠受伤前。276小时后，收集组织，冷冻并切割。伤口切片固定，并用荧光链霉亲和素偶联染色(Dylight 488, Thermo Fisher)。Hoechst反染色后，使用标准荧光显微镜(Leica，德国)成像。通过数字图像分析评估创面血块区域的相对荧光强度。根据制造商说明书，使用Abbexa D-dimer ELISA试剂盒(剑桥，英国)测定结肠伤口匀浆中d -二聚体浓度。

    结肠创面细胞组成的流式细胞术分析

    在小鼠结肠镜检查过程中，每只小鼠使用内窥镜钳造成3至4个结肠伤口，18小时后分离结肠组织。伤口区域使用3mm活检打孔器打孔，伤口和残留的未受伤的结肠组织保留在单独的管中。使用小鼠固有层分离试剂盒(Miltenyi Biotec, order no. 1)分别从这两个组织部分分离出固有层白细胞(LPL)和上皮内白细胞(IEL)。130-097-410)。简单地说，将组织切成小块，在37°C下用预消化溶液孵育2×20 min，并剧烈摇晃，然后通过100µm细胞过滤器过滤。将含有IEL部分的滤液冷藏，其余组织块与不含钙的HBSS一起孵育2 +和毫克2 ++ 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)在37°C下剧烈摇晃20分钟。反复过滤后，组织块在37°C下酶消化30分钟，随后使用gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotec)进行粉碎。将剩余的LPLs转移到新鲜试管中，并与IEL滤液平行离心，使细胞成粒。用Percoll Cytiva密度梯度纯化球团化的LPL和IEL组分，最后一步用流式细胞仪缓冲液洗涤。荧光团偶联抗体染色后，使用LSRFortessa细胞分析仪和FlowJo软件(BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey, USA)进行流式细胞分析。

    dna介导的伤口血块消化体外

    如上所述，在野生型小鼠上施加结肠创伤。18小时后，处死小鼠，从切除的结肠中取出伤口凝块。将血块转移到含有PBS的腔室滑孔中，在室温下用Hoechst和SYTOX Green染色30分钟。随后，在创面血块中加入DNase I (1 U/mL)，在37°C下孵育20小时。在加入DNase前后的3个时间点进行显微成像。

    体外中性粒细胞-血凝块相互作用的评估

    用10毫米氯化钙将柠檬酸过的人全血在玻璃罩卡片上再钙化2按照标准程序。在37°C下孵育1小时后，在血凝块中心打一个确定大小的孔。中性粒细胞悬液(5×105在自体血清中加入5 mM SYTOX Green后，在本孔中接种。180分钟后，样品在4%多聚甲醛中固定(1小时或过夜)，并根据以下程序进行染色。用PBS仔细清洗样品，并将其置于封闭溶液(PBS + 10%胎牛血清(FCS) + 1%牛血清白蛋白(BSA))中。一抗在阻断液中孵育过夜。直接标记的二抗在PBS中孵育2小时。用Hoechst和/或SYTOX Green (5mm)进行染色质染色。

    Live-cell成像

    人中性粒细胞悬浮液在hepes缓冲的Roswell Park Memorial Institute (RPMI)培养基中加入2%的自体人血清和核酸染色剂，在37°C下与选定的抑制剂或溶剂对照孵育1.5小时。然后在48孔板中接种细胞，用凯恩斯显微镜在37°C和5% CO的温度和气体控制下成像2．先前准备的孔中含有高熔点和低熔点琼脂糖凝胶的混合物，在孔的中心与各自供体的人自体血清(20%)混合。使用天然血清或热灭活血清(30分钟，56°C)。使用Keyence显微镜进行重复自动成像，可以研究琼脂糖凝胶边缘NET形成的动力学。

    结肠组织和黏膜溃疡的共聚焦激光扫描显微分析

    人工取粘膜创面上形成的免疫血栓，放在载玻片上，按上述方法进行免疫染色。用穿孔活检法从牺牲小鼠的结肠中切除损伤区域。样品作为一个整体安装在载玻片上，固定并进行如上所示的免疫染色。染色样品进行共聚焦激光扫描显微镜(Leica SP5)，并获得z-stack。进一步用徕卡和image J软件进行图像处理。

    统计分析

    数据分析如图图例所示，使用Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, Washington, USA)的未配对学生t检验，或使用事后Tukey真实显著差异(HSD)检验进行方差分析，以及Fisher精确2×2列联表检验和Wilcoxon秩和检验。用非参数斯皮尔曼秩序相关检验进行了序参量和度量尺度参数的相关检验。

    结果

    活动性UC的出血是通过在黏膜糜烂上成功形成纤维蛋白来控制的

    上皮屏障功能障碍是UC的特征，尤其是在疾病发作期间。在这种情况下，许多患者会出现明显的直肠出血。我们观察到内镜下活跃的UC患者表现出大量的粘膜侵蚀，而直肠出血的强度差异很大(图1A及B)．我们评估了临床就诊报告的直肠出血(部分Mayo评分)以及疾病的内镜特征。直肠出血患者出现黏膜糜烂及溃疡的频率增加(图1 b)．然而，糜烂的存在并不一定会导致直肠出血。即使在活跃的UC中，当侵蚀完全被纤维蛋白覆盖时，粘膜止血也成功建立(图1 c)．然而，纤维蛋白不完全覆盖与直肠出血增加相关。与临床直肠出血相关的粘膜糜烂表面鲜血或血色素增加(图1 d)．这些发现提示纤维蛋白层在活动性UC中具有止血功能。

    Bleeding in active UC is controlled by successful formation of fibrin on mucosal erosions. (A) Patients experiencing flares of UC often suffer from rectal bleeding, typically assessed by the partial Mayo score (0: none, 1: visible blood with stool (< 50 %), 2: visible blood with stool (> 50 %), 3: passing blood alone). Patients suffering from flares of UC underwent routine endoscopy. Representative endoscopic images of patients with various degrees of rectal bleeding are depicted. (B) Clinically observed rectal bleeding coincided with the enhanced presence of mucosal erosions on endoscopy as graded by an experienced endoscopist in a blinded fashion inspired by the Blackstone score (0: no visible erosions, 1: less than 10 erosions (< 5 mm in size) per 10 cm section, 2: more than 10 erosions (< 5 mm in size) per 10 cm section to 3: more than 10 erosions (< 5 mm in size) and ulcerations (> 5 mm in size) per 10 cm section). The section most strongly affected determined the grading result (Spearman’s rho: 0.38, * p < 0.05). additionally, the morphology of mucosal erosions was analysed and the frequency of either fibrin coverage or persistence of fresh blood or haematin was assessed in these images supported by digital image analysis. (C) Presence of erosions did not necessarily prompt rectal bleeding, rather complete coverage by fibrin on all mucosal erosions achieved haemostasis. Less efficient fibrin coverage was observed in patients suffering from rectal bleeding as assessed by partial Mayo score (spearman Rho: 0.73, **** p < 0.0001). (D) Persistent presence of blood or haematin on erosions was associated with clinical rectal bleeding (spearman Rho: 0.73, **** p < 0.0001). The study cohort included 36 patients suffering from active UC with varying degrees of rectal bleeding. UC, ulcerative colitis.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    活动性UC的出血是通过在黏膜糜烂上成功形成纤维蛋白来控制的。(A) UC发作患者常伴有直肠出血，通常通过Mayo部分评分进行评估(0:无，1:可见便血(< 50%)，2:可见便血(> 50%)，3:仅出血)。患有UC耀斑的患者接受常规内镜检查。图示不同程度直肠出血患者的代表性内镜图像。(B)临床观察到直肠出血恰逢增强粘膜的侵蚀在内镜分级的一位经验丰富的endoscopist蒙蔽时尚灵感来自黑石评分(0:不可见的侵蚀,1:不到10侵蚀(< 5毫米大小)每节10厘米,2:10多个侵蚀(< 5毫米大小)每10厘米节3:10多个侵蚀(< 5毫米大小)和溃疡(> 5毫米大小)每10厘米部分)。对分级结果影响最大的部分(Spearman 's rho: 0.38， * p < 0.05)。此外，还分析了粘膜侵蚀的形态，并通过数字图像分析评估了这些图像中纤维蛋白覆盖或新鲜血液或血色素持续存在的频率。(C)糜烂的存在不一定会导致直肠出血，相反，纤维蛋白完全覆盖所有粘膜糜烂实现了止血。通过Mayo部分评分评估，直肠出血患者的纤维蛋白覆盖效率较低(spearman Rho: 0.73， **** p < 0.0001)。(D)侵蚀上持续存在血液或血色素与临床直肠出血相关(spearman Rho: 0.73， **** p < 0.0001)。 The study cohort included 36 patients suffering from active UC with varying degrees of rectal bleeding. UC, ulcerative colitis.

    侵蚀的结肠黏膜以血块为特征，血块被重塑为富含聚集的粒细胞和net的纤维蛋白层

    由于UC中控制黏膜淤血的机制尚不完全清楚，我们在随后的研究中通过显微镜评估了黏膜侵蚀的形态。我们研究了被血或血素覆盖的糜烂和被白色纤维蛋白覆盖的糜烂(图2A及D)．血覆盖的糜烂表面有均匀的血凝块。观察到从血凝块边缘侵入的中性粒细胞(图2 b)．MPO+自体荧光血凝块边缘的中性粒细胞聚集，染色质分散，瓜氨酸化组蛋白H3 (H3cit)作为PAD活性的证据(图2 c)．我们推测，浸润的中性粒细胞和相关的PAD活性可能直接参与了血块重塑为苏木精仿射非晶纤维蛋白层。纤维蛋白覆盖的糜烂也显示大量浸润中性粒细胞(图2 d)．我们发现活跃UC和结肠溃疡中的纤维蛋白层富含CD15+中性粒细胞与髓过氧化物酶(图2 d e，在线补充图1A)．此外，侵蚀表面的纤维蛋白层的特征是细胞外染色质缺乏核形态，显示瓜氨酸组蛋白H3 (H3cit)，典型的NETs (图2 f，在线补充图1B)．在血覆盖糜片的血块边缘，可见单个中性粒细胞，也显示H3cit。而MPO中H3cit基本缺失+固有层细胞(在线补充图1A,B)，强烈的H3cit免疫阳性，因此在聚集的粒细胞附近的纤维蛋白层中发现PAD活性(图2 f)．转录组显示PAD4在两个独立的患者队列中，男性和女性患者的结肠CD、回结肠CD和UC的炎症粘膜中均有明显的变化，而PAD2活动性疾病减少(图2F和G)．随后的研究表明，Padi4表达主要局限于髓系的先天免疫细胞，特别是中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(在线补充图2A)，而在肠上皮细胞中没有检测到。总之，组蛋白瓜氨酸化和NETs的形成与增加的存在有关PAD4主要发生在覆盖粘膜溃疡的纤维蛋白层中。

    Eroded colonic mucosa features blood clots which are remodelled to a fibrin layer rich in aggregated granulocytes and NETs. During colonoscopy of active UC, biopsies were taken specifically from either (A–C) blood clot-covered or (D–F) fibrin-covered erosions and analysed by endoscopy and microscopy as indicated. Representative endoscopic images of (A) blood/haematin-covered and (D) fibrin-covered colon erosions of patients suffering from active UC are shown. (B) Representative low-power and high-power images are provided (scale bars: 100 µm). We identified marked infiltration of neutrophils into the blood clot and adjacent amorphous haematoxyline-affine material. Samples from (E) fibrin-covered erosions showed a strong abundance of aggregated neutrophils (scale bars = 100 µm). (C, F) Immunofluorescence of such biopsies is shown using either MPO or H3cit-directed primary antibodies. (C) Aggregates of MPO+ neutrophils were present at the edge of the autofluorescent primary blood clot (488/525 nm). In this area, decondensed chromatin and H3cit was detected. Combined and single channel analyses are presented (scale bars = 100 µm). (F) Fibrin visible on the endoscopic level is rich in H3cit and aggregated MPO+ neutrophils. As depicted, H3cit is rather restricted to the fibrin layer (representative of n = 22 biopsies studied). (G–H) Publicly available datasets of RNAseq-based transcriptomics of large cohorts of patients suffering from icCD (1), colCD (2) or UC (3) were reanalysed for expression of PAD2 and PAD4, respectively. Fold change as compared with non-diseased controls is depicted. colCD, colonic Crohn’s disease; H3cit, citrullinated histone H3; icCD, ileocolonic Crohn’s disease; MPO, myeloperoxidase; NETs, neutrophil extracellular traps; PAD, peptidyl-arginine deiminase; UC, ulcerative colitis.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    侵蚀的结肠黏膜以血块为特征，血块被重塑为富含聚集的粒细胞和net的纤维蛋白层。在对活动性UC进行结肠镜检查时，对(A-C)血凝块覆盖或(D-F)纤维蛋白覆盖的侵蚀进行活检，并根据指示通过内窥镜和显微镜进行分析。有代表性的内窥镜图像(A)血/血凝素覆盖和(D)纤维蛋白覆盖的结肠侵蚀的患者患有活动性UC。(B)提供了具有代表性的低功耗和高功耗图像(比例尺:100µm)。我们发现有明显的中性粒细胞浸润到血凝块和邻近的无定形苏木精仿射物质。来自(E)纤维蛋白覆盖侵蚀的样品显示大量聚集的中性粒细胞(比例尺= 100µm)。(C, F)使用MPO或h3cit定向的一抗显示活检的免疫荧光。(C) MPO总量+中性粒细胞出现在自体荧光原发性血凝块边缘(488/525 nm)。在这一区域检测到去密度染色质和H3cit。给出了组合和单通道分析(比例尺= 100µm)。(F)内镜下可见纤维蛋白富含H3cit和聚集的MPO+中性粒细胞。如所述，H3cit相当局限于纤维蛋白层(代表n = 22个研究活检)。(G-H)对大量患有icCD(1)、colCD(2)或UC(3)的患者公开的基于rnaseq的转录组学数据集进行了重新分析PAD2而且PAD4,分别。与未患病对照相比，描述了折叠变化。colCD，结肠克罗恩病;H3cit，瓜氨酸组蛋白H3;icCD，回结肠克罗恩病;MPO、髓过氧物酶;net，中性粒细胞细胞外陷阱;肽基精氨酸脱亚胺酶;UC，溃疡性结肠炎。

    粘膜损伤导致红色血块的形成，形成以pad4活性为特征的富含中性粒细胞的纤维蛋白层

    基于这些发现，我们假设中性粒细胞参与了粘膜侵蚀到纤维蛋白层的红色血块的重塑。为了动态模拟粘膜溃疡的愈合在活的有机体内，我们在内窥镜下用抓钳在小鼠身上造成结肠伤口(图3一):在受伤后，粘膜伤口立即形成红色血块，在受伤数小时后重新形成白色纤维蛋白层(图3一)．在受伤18小时后，显微镜下仍可见上皮层破裂(图3 b)．正如先前在人体中观察到的，创面被无定形材料和聚集的MPO所覆盖+中性粒细胞(图3B及C)．纤维蛋白层进一步呈强烈的纤维蛋白原阳性，表明纤维蛋白聚合(图3 d)，以PAD活性为特征，由H3cit (图3 e)，并显示C3d的存在，表明补体活性(图3 f)．通过流式细胞术，我们评估了创面和固有层的各种免疫细胞的相对数量。表面和固有层均显示CD11b浸润显著增加+髓系细胞与邻近健康黏膜的比较。表面和固有层CD11b均明显升高+Ly6G+中性粒细胞:特别是创面显示出高达73%的浸润性CD11b的显著富集+髓系细胞为中性粒细胞(图3 g)，而CD11b+Ly6CintLy6G-SiglecF+嗜酸性粒细胞很少(图3 h)．此外，还用共聚焦显微镜俯视图分析了血覆盖和纤维蛋白覆盖侵蚀的创面。在血凝块附近观察到聚集的中性粒细胞和NETs。最终，血块完全重塑为h3citi阳性层(图3我)．我们进一步量化了结肠伤口中的PAD活性，并检测到伤口中H3cit显著升高(图3J和K)．血凝块在侵蚀表面的重塑导致纤维蛋白层，其特征不仅是纤维蛋白聚合，还包括补体活性和中性粒细胞的显著贡献，它们聚集，形成NETs并显示出显著的PAD活性。

    Mucosal damage leads to the formation of red blood clots subject to remodelling to neutrophil-rich fibrin layers characterised by marked PAD-activity. Colonoscopy was performed in mice and mucosal wounds were induced using an endoscopic forceps. (A) Top Left: forceps during endoscopy; top right: forceps with biopsy; bottom right: red blood clot on the mucosal wound directly after wounding; bottom left: whitish fibrin covers the mucosal wound 6 hours after wounding. The red blood clot was remodelled. (B) H&E staining of sections of mucosal ulcers (18 hours after injury) display an amorphous layer rich in granulocytes at the surface of the mucosal ulceration. An overview of a cross-section (left) and a high-power magnification (centre) is presented, as well as an image of healthy mucosa (right). (C) The remodelled layer covering the wound bed is positive for MPO as evidenced by immunofluorescence. MPO staining shows fiber-like constitution, indicative of a partially extracellular localisation, colocalised to DNA. (D) The remodelled layer is also characterised by fibrin deposition, as evidenced by fibrinogen immunofluorescence (top) as compared with control (bottom) (scale bars = 100 µm). (E) H3cit is preferentially detected in the wound surface, also featuring (F) cleaved complement C3d. (G) Flow cytometric analysis of healthy and wound tissue 18 hours after wounding. Both the LPL fractions and the IEL fractions of wounds were analysed. In wound tissues, CD11b+Ly6G+ neutrophils are the dominant cell type in the IEL fraction, whereas the lamina propria features large populations of both CD11b+Ly6G+ neutrophils and CD11b+Ly6Chi monocytes. (H) Quantification of the cellular composition of colon wounds and adjacent healthy colon tissue (n = 18 wounds studied, *** p < 0.001, Student’s t-test, ** p < 0.01, Student’s t-test, * p < 0.05, Student’s t-test). (I) Colonic wounds were mounted on glass slides as a whole and subjected to epifluorescence analysis after immunostaining of H3cit (in red) and Hoechst (in green) staining. The wound surface of two different wounds both derived from wild-type mice is presented. Left: a wound with persistent presence of the primary blood clot. A cell-rich layer in proximity to the blood clot characterised by H3cit-positive chromatin threads separates the blood clot from the adjacent mucosa. Centre: a remodelled colonic ulcer surface, covered by H3cit+ chromatin. Right: no H3cit is detectable on healthy mucosa. Images are representative of > 10 colonic wounds studied. (J) Western blot analyses of colonic wounds and healthy mucosa collected 18 hours after wounding were performed. (K) Densitometry of Western blots as in (J) shows increased presence of H3cit in the wound bed as compared with healthy control tissues (** p < 0.001, Student’s t-test, 3 independent experiments performed). Loading control: β-Actin. All scale bars = 100 µm. H3cit, citrullinated histone H3; IEL, intraepithelial lymphocyte; LPL, lamina propria leucocyte; MPO, myeloperoxidase; PAD, peptidyl-arginine deiminase.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    粘膜损伤导致红色血块的形成，形成以显著的pad活性为特征的富含中性粒细胞的纤维蛋白层。在小鼠中进行结肠镜检查，并使用内窥镜钳诱导粘膜损伤。(一)左上角:内窥镜检查时使用的钳子;右上方:活检钳;右下角:伤后直接在粘膜创面上形成红色血块;左下:伤后6小时，白色纤维蛋白覆盖在粘膜伤口上。红色血块被重塑了。(B)粘膜溃疡切片H&E染色(损伤后18小时)显示粘膜溃疡表面有富含粒细胞的无定形层。横截面概览(左)和高倍放大图(中)，以及健康黏膜的图像(正确的)．(C)覆盖创面的重塑层经免疫荧光证实为MPO阳性。MPO染色显示纤维样结构，表明部分细胞外定位，与DNA共定位。(D)经纤维蛋白原免疫荧光证实，重塑层也以纤维蛋白沉积为特征(前)与对照组(底)(比例尺= 100µm)。(E) H3cit优先检测在创面，也具有(F) cleaved补体C3d。(G)伤后18小时健康组织和伤口组织的流式细胞术分析。对伤口LPL组分和IEL组分进行了分析。在伤口组织中，CD11b+Ly6G+中性粒细胞是IEL部分的主要细胞类型，而固有层具有大量的CD11b和CD11b+Ly6G+中性粒细胞和CD11b+Ly6C嗨单核细胞。(H)结肠创面及邻近健康结肠组织细胞组成的定量(n = 18个创面，*** p < 0.001, Student 's t检验，** p < 0.01, Student 's t检验，* p < 0.05, Student 's t检验)。(I)将结肠创面整体装入载玻片，经H3cit免疫染色(红色)和Hoechst免疫染色(绿色)后进行epifluorescence分析。介绍了两种不同伤口的创面，它们都来自野生型小鼠。左原发血栓持续存在的伤口。在血块附近有一层富含细胞的层，以h3cit阳性染色质线为特征，将血块与邻近的粘膜分离开来。中心:被H3cit覆盖的结肠溃疡表面+染色质。正确的:健康黏膜未检测到H3cit。所研究的10例结肠伤口的图像具有代表性。(J)对受伤18小时后收集的结肠伤口和健康黏膜进行Western blot分析。(K)如(J)所示的Western blots密度显示，与健康对照组织相比，创面中H3cit的存在增加(** p < 0.001，学生t检验，进行了3次独立实验)。负荷控制:β-肌动蛋白。所有比例尺= 100µm。H3cit，瓜氨酸组蛋白H3;IEL，上皮内淋巴细胞;LPL，固有层白细胞;MPO、髓过氧物酶; PAD, peptidyl-arginine deiminase.

    为了强调先天免疫细胞对创面重塑的重要贡献，我们引入了术语免疫血栓来定义由先天免疫细胞重塑的原发性血凝块。17

    中性粒细胞相关转录签名的增加与血块重塑相关转录本的增加相一致

    为了在转录水平上进一步描述伤口愈合和伤口床重塑的动态过程，我们对结肠伤口在损伤后6、24和48小时的特定时间点与健康组织进行了RNA测序。具体来说，我们评估了与溶血和纤维蛋白溶解、血栓重塑功能相关的预选基因的表达随时间的动态变化，以及与中性粒细胞、髓细胞、淋巴细胞和成纤维细胞相关的免疫细胞相关特征。例如，血块重塑相关的转录本，惠普，Tgm1，Plaur，Serpine1，Serpinf2而且Hmox1在受伤后6小时内显示出明显的丰度增加(图4一)．有趣的是，例如，中性粒细胞相关转录本的增加，Csf3，Clec4e，S100a9，Cxcr2而且Padi4与血块重塑相关转录相吻合(图4 b)．骨髓细胞相关基因在受伤后24小时达到最高丰度(图4 c)，而淋巴细胞相关转录则在48小时达到峰值(图4 d)．与上述免疫细胞区室相比，成纤维细胞相关转录本的丰度变化不太明显(图4 e)．综上所述，血块重塑相关基因的丰度与中性粒细胞相关基因的特征相吻合，而髓细胞和淋巴细胞相关的特征在受伤后的较晚时间点增加(图4 f)．损伤24小时后对结肠伤口和邻近健康黏膜进行选择性qPCR分析，证实了RNA测序研究的结果。具体地说,Padi4结肠创面mRNA表达增加Padi2mRNA没有(在线补充图2B)．

    An increased neutrophil-related transcriptional signature coincides with the increase of clot remodelling-associated transcripts. RNA-sequencing was performed studying the transcriptome of healthy colon and wound tissue from three defined time points after wounding (6 hours, 24 hours, 48 hours after wounding, n = 3 wounds per time point). Expression was analysed as a fold-change in relation to the healthy state. An expression time course for each gene set (clot remodelling-related, neutrophil-related, myeloid cell-related, lymphocyte-related, fibroblast-related) is provided. The area between the minimal and maximal differentially expressed genes of each gene set is coloured. Additionally, the mean of each gene set and exemplary single gene time courses are depicted for the genes indicated. A heat map of the entire topic-related gene set studied is provided visualising the log2 fold change in colour (increase in red, decrease in blue). (A) Expression of clot remodelling-related genes is most strongly increased 6 hours after wound infliction. (B) Neutrophil-related genes – among these Padi4 – are also most strongly increased 6 hours after wound infliction. (C) Expression of myeloid cell-related genes show a slower increase within the first day of healing peaking at 24–48 hours. (D) The profile of lymphocyte-related genes peaks at 48 hours after damage. (E) Expression of fibroblast-related genes shows only a moderate increase over time. (F) Summarised depiction of the expression profiles shown in (A)–(E) over time. Please appreciate the sequential dynamics of the designated profiles.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    中性粒细胞相关转录签名的增加与血块重塑相关转录本的增加相一致。对受伤后3个确定时间点(受伤后6小时、24小时、48小时，每个时间点n = 3个伤口)健康结肠和伤口组织的转录组进行rna测序。表达被分析为与健康状态相关的折叠变化。每个基因集(血块重塑相关，中性粒细胞相关，髓系细胞相关，淋巴细胞相关，成纤维细胞相关)的表达时间过程被提供。每个基因集的最小和最大差异表达基因之间的区域是彩色的。此外，每个基因集的平均值和示范性单基因时间过程描述了所示基因。整个主题相关的基因集研究的热图提供了可视化的日志2颜色的折叠变化(红色增加，蓝色减少)。(A)创面后6h，血块重塑相关基因表达增加最为明显。(B)中性粒细胞相关基因-其中Padi4 -也在受伤6小时后增加得最多。(C)髓细胞相关基因的表达在愈合第一天内呈现较慢的增加，在24-48小时达到峰值。(D)淋巴细胞相关基因在损伤后48小时达到峰值。(E)成纤维细胞相关基因的表达仅随时间适度增加。(F) (A) - (E)中所示的表达剖面随时间的概括描述。请欣赏指定配置文件的顺序动态。

    缺乏PAD4会干扰粘膜溃疡的血块重构，延缓粘膜伤口愈合

    接下来，我们评估了免疫凝血酶的功能贡献在活的有机体内．我们使用了缺乏pad4的小鼠。我们观察到，与对照组相比，pad4缺陷小鼠的伤口愈合过程存在显著的形态学差异。在缺乏PAD4的情况下，创面H3cit显著减少(在线补充图3A)，染色质也较少。在功能上，溃疡表面的重建受到干扰(图5一个，视频1):在受伤6小时后分析，红色血块更常持续，并导致内窥镜检查时持续出血(图5 b)．与野生型对照相比，在无PAD4的情况下，创面重构延迟后，粘膜完整性的及时恢复也延迟。反复的内窥镜检查和形态测量术证实了这一点(图5C和D)．结肠创面H&E染色显示，在缺乏PAD4的情况下，创面上的血凝块持续存在(图5 e)，而在野生型对照中，重塑为富含中性粒细胞的免疫血栓则定期发生。中性粒细胞对创面的化学吸引未被MPO染色所干扰(图5 f)．进一步的全挂免疫荧光显示，在缺乏PAD4的情况下，中性粒细胞的化学吸引持续存在，而组蛋白瓜氨酸化和染色质解凝则明显受到干扰(图5克，在线补充图3A)．流式细胞术分析证实，在缺乏PAD4的情况下，中性粒细胞对伤口具有强大且同样有效的化学吸引力(图5 h)．此外，未观察到其他髓系细胞流入的显著改变(图5我)．

    Deficiency of PAD4 disturbs blood clot remodelling on mucosal ulcerations and delays mucosal wound healing. Mini-colonoscopy was repetitively performed after physical wounding of the colon mucosa. (A) Representative endoscopic imaging of colon wounds 6 hours after wounding performed in PAD4−/− and wild-type (WT) mice display the disturbed remodelling of the blood clot on the ulcer surface in PAD4−/− mice. Please appreciate the persistent sanguinous appearance of wounds in PAD4−/− mice. (B) Quantification of the fraction of wounds displaying a sanguinous morphology covering the wounds (** p < 0.05, Fisher’s exact test for 2×2 contingency tables). (C) Wound bed size was measured on repeated endoscopic examinations. Wounds in PAD4-deficient mice had a delayed kinetic of wound healing (* p < 0.05, Student’s t-test). (D) Time course of mucosal healing as evidenced by representative endoscopic images of colon wounds performed in PAD4−/− and WT mice (n = 24 wounds per group (* p < 0.05, Student’s t-test)). (E) H&E staining of colonic wound sections from WT and PAD4−/− mice after 18 hours shows a remodelled blood clot in the WT colon, characterised by a high abundance of invading granulocytes throughout the fibrin layer. In contrast, the PAD4−/− wound clot still contains the primary blood clot with granulocytes only present at the clot edge (scale bars: low power = 200 µm, high power = 100 µm). The same wound as in (E) was subjected to immunofluorescence. (F) Staining of MPO shows neutrophil infiltration throughout the clot in WT mice. The wound from PAD4−/− mice features MPO+ cells surrounding the unstained sanguinous core (scale bars: low power = 200 µm, high power = 100 µm). (G) Epifluorescence analyses of the colon ulcer surface of PAD4−/− and WT mice displayed the reduced presence of H3cit in PAD4−/− mice as well as the persistence of the primary blood clot (marked by the asterisk). High-power insets are presented on the right. Counterstaining with sytox green. (H) Flow cytometric analyses of cellular infiltrates of wound tissues from WT and PAD4−/− mice 18 hours after wounding are presented. Both genotypes exhibit a marked infiltration of CD11b+Ly6G+ neutrophils to the wound site. Especially in the epithelial fraction representing the ulcer surface, CD11b+Ly6G+ neutrophils are strongly enriched in both groups. (I) Comparative quantification of the cellular composition of WT and PAD4−/− wound tissue as assessed in (H) shows no significant differences in the cellular composition with regard to the examined leucocyte populations (n = 18 wounds from two independent experiments evaluated). H3cit, citrullinated histone H3; MPO, myeloperoxidase; PAD, peptidyl-arginine deiminase; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    缺乏PAD4会干扰粘膜溃疡的血块重构，延缓粘膜伤口愈合。在物理损伤结肠粘膜后，反复进行微型结肠镜检查。(A) PAD4伤后6小时有代表性的结肠伤口内窥镜成像−−/野生型(WT)小鼠在PAD4中显示溃疡表面血凝块重构的干扰−−/老鼠。请欣赏PAD4伤口持续流血的外观−−/老鼠。(B)显示覆盖伤口的出血形态的伤口比例的量化(** p < 0.05, Fisher对2×2列联表的精确检验)。(C)通过反复内镜检查测量伤口床的大小。pad4缺失小鼠的创面愈合动力学延迟(* p < 0.05, Student 's t检验)。(D)由PAD4中结肠伤口的代表性内镜图像所证明的粘膜愈合的时间过程−−/WT小鼠(每组n = 24个创面(* p < 0.05, Student 's t检验))。(E) WT和PAD4结肠伤口切片的H&E染色−−/18小时后，小鼠在WT结肠中发现了一个重塑的血凝块，其特征是纤维蛋白层中浸润性粒细胞的丰度很高。相比之下，PAD4−−/创面凝块仍含有原发血凝块，仅在凝块边缘有粒细胞(比例尺:低倍= 200µm，高倍= 100µm)。与(E)相同的伤口接受了免疫荧光。(F) MPO染色显示WT小鼠中整个血块均有中性粒细胞浸润。PAD4的伤口−−/小鼠特征+未染色血核周围的细胞(比例尺:低功率= 200µm，高功率= 100µm)。(G) PAD4结肠溃疡表面的荧光分析−−/WT小鼠在PAD4中H3cit的存在减少−−/小鼠以及持久性的原发血凝块(标记为星号)。高倍插图呈现在右侧。用sytox绿反染。(H) WT和PAD4对伤口组织细胞浸润的流式细胞术分析−−/小鼠受伤18小时后出现。两种基因型都有明显的CD11b浸润+Ly6G+伤口部位有中性粒细胞。特别是在代表溃疡表面的上皮部分，CD11b+Ly6G+中性粒细胞在两组中均显著富集。(一)WT与PAD4细胞组成的比较定量−−/(H)中评估的伤口组织显示，与所检查的白细胞群相比，细胞组成没有显著差异(n = 18个伤口，来自两个独立的实验评估)。H3cit，瓜氨酸组蛋白H3;MPO、髓过氧物酶;肽基精氨酸脱亚胺酶;WT,野生型。

    视频1 PAD4行直肠镜检查−−/用内窥镜钳诱导创面6小时后，用视频微型内窥镜观察溃疡表面形态。注意，在野生型小鼠中，血块重塑为白色纤维蛋白，而在PAD4中，血块形态持续存在−−/老鼠。

    免疫血栓形成发生在粘膜侵蚀，即使没有细菌

    小鼠结肠伤口上的免疫血栓易受细菌侵袭:在野生型和pad4缺陷型小鼠中，均使用16s-rRNA真细菌定向荧光探针检测细菌对伤口表面的侵袭。未观察到明显的细菌向肠粘膜深层组织浸润(在线补充图3B)．我们的目的是了解微生物入侵对免疫血栓形成NET是否重要。使用gnotobioc57bl /6小鼠，在无菌条件下损伤。内窥镜手术后18小时，治疗小鼠的粪便中仍未检测到细菌(图6)．我们比较了在SPF条件下饲养的小鼠和gnotobioc57bl /6小鼠的伤口愈合过程。我们检测到结肠伤口有规律地形成血凝块，并成功地重塑为免疫血栓，即使在没有菌群的情况下(图6 b)．中性粒细胞浸润在无菌C57BL/6小鼠和SPF小鼠的结肠创面，H&E染色证实(图6 c)并形成免疫血栓。然而，与SPF小鼠相比，gnotobio小鼠的粘膜下水肿和粘膜下白细胞浸润显著减少(图6D和E)．MPO+无菌小鼠和SPF小鼠的创面均有细胞浸润，而粘膜下MPO+小鼠的细胞数量显著减少(图6 f1)．PAD (H3cit)活性(图6G和J)和补体(C3d)活动(图6H和K)在免疫血栓中持续存在，即使是在无生物的条件下。因此，伤口表面的中性粒细胞招募、PAD活性和补体活性在缺乏微生物群的情况下持续存在。

    Immunothrombosis occurs on mucosal erosions even in the absence of bacteria. Colonoscopy was performed in mice and mucosal wounds were induced using an endoscopic forceps system in SPF and gnotobiotic wild-type C57BL/6 mice under sterile conditions. (A) Faecal bacterial load was assessed by 24 h-culture of faecal homogenates on lb agar plates. Gnotobiotic mice remained sterile throughout the experiment. (B) Mini-colonoscopy was performed 6 and 18 hours after wounding. Representative endoscopic images of colon wounds show that remodelling of the wound bed surface occurs in a similar fashion independently of the colonic microbiota. (C) H&E staining of wounded colon tissue sections shows infiltration of leucocytes to the wounded colon and submucosal oedema in both SPF and gnotobiotic mice. (D) Submucosal oedema thickness was quantified in cross sections in SPF and gnotobiotic mice (N: 11–14 wounds per group, *** p < 0.001, Student’s t-test, bars represent the means) (E) scatter plots of leucocyte numbers infiltrating the submucosa quantified in cross sections in SPF and gnotobiotic mice (** p < 0.01, Student’s t-test, bars represent the means). (F) Marked infiltration of MPO+ neutrophils to both wound bed and submucosa in SPF and gnotobiotic mice was observed by immunofluorescence, (G) H3cit was preferentially detected in wound beds of SPF and gnotobiotic mice as compared with the adjacent mucosa as studied by immunofluorescence. Dashed lines indicate the ROI of the immunothrombus area. (H) Complement activation as studied by C3d staining in both SPF and gnotobiotic mice was prominent in the wound bed area in both groups. (I) MPO+ cells in the submucosa were quantified in images as in (F) (N: 8–10 wounds per group, * p < 0.05, Student’s t-test, mean ± SD are depicted). Dashed lines indicate the ROI of the immunothrombus area. The solid line indicates the intact border of the wound (J) H3cit+ speckles per ROI in the wound bed and adjacent mucosa were quantified in images as in (G) (N: 3–7 wounds per group, *** p < 0.001, Student’s t-test, mean ± SD are depicted) (K) C3d relative fluorescence intensity per ROI in the wound bed and adjacent mucosa was quantified in images as in (H) (N: 5–10 wounds per group, *** p < 0.001, Student’s t-test, mean ± SD are depicted, scale bars = 100 µm). H3cit, citrullinated histone H3; MPO, myeloperoxidase; ROI, region of interest; SPF, specific pathogen-free.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    免疫血栓形成发生在粘膜侵蚀，即使没有细菌。在无菌条件下，对SPF和gnotobio野生型C57BL/6小鼠进行结肠镜检查，并使用内镜钳系统诱导粘膜损伤。(A)通过在lb琼脂板上培养24 h的粪便匀浆来评估粪便细菌载量。无菌小鼠在整个实验过程中保持不育。(B)受伤后6小时和18小时进行微型结肠镜检查。结肠伤口的代表性内窥镜图像显示，创面表面的重建以类似的方式独立于结肠菌群发生。(C)损伤结肠组织切片的H&E染色显示SPF和gnotobio小鼠的损伤结肠有白细胞浸润和粘膜下水肿。(D) SPF和gnotobio小鼠横截面粘膜下水肿厚度定量(N:每组11-14个创面，*** p < 0.001, Student 's t检验，柱形表示均值)(E) SPF和gnotobio小鼠横截面浸润黏膜下白细胞数量的散点图定量(** p < 0.01, Student 's t检验，柱形表示均值)。(F) MPO明显浸润+用免疫荧光法观察SPF小鼠和免生小鼠创面床和粘膜下层的中性粒细胞，与免疫荧光法研究的相邻粘膜相比，SPF小鼠和免生小鼠创面床中优先检测到(G) H3cit。虚线表示免疫血栓区域的ROI。(H)通过C3d染色研究SPF小鼠和gnotobio小鼠的补体活化在两组的创面区均显著。(我)MPO+(F)图像定量粘膜下层细胞(N:每组8-10个创面，* p < 0.05，用Student 's t检验，均数±SD表示)。虚线表示免疫血栓区域的ROI。实线表示创面(J) H3cit的完整边界+(K)在(H) (N:每组5-10个伤口，*** p < 0.001，用Student 's t检验，mean±SD，用Student 's t检验，mean±SD，比例尺= 100µm)的图像中，对创面和邻近黏膜每个ROI的相对荧光强度进行量化(G) (N:每组3-7个伤口，*** p < 0.001)H3cit，瓜氨酸组蛋白H3;MPO、髓过氧物酶;ROI，感兴趣的区域;SPF，无特定病原体。

    然后我们设计了在体外评估中性粒细胞与预先形成的血块相互作用的系统。首先，我们在玻璃罩卡瓦上诱发血凝块(在线补充图4A, B)．然后我们将中性粒细胞悬浮液应用于穿孔。有趣的是，中性粒细胞聚集在无菌血凝块边缘，形成NETs，染色质和H3cit (在线补充图4B)，即使在没有微生物的情况下。随着时间的推移，血凝块不稳定，阻碍了进一步的功能分析和成像。我们询问可溶性因子是否可能激活这种中性粒细胞反应。因此，在培养皿中产生了含有20%自体血清的琼脂糖凝胶(在线补充图4C)．中性粒细胞悬浮液的加入导致中性粒细胞在琼脂糖凝胶边缘的积累。在边缘，高细胞密度的中性粒细胞挤压去密度染色质(在线补充图4D)对自体血清(视频2和3)．bb - cl -脒对PADs的抑制并不妨碍中性粒细胞在琼脂糖凝胶边缘的积聚(在线补充图4DE，视频4)．然而，当PADs被抑制时，NET的形成被废除，无论使用天然或热灭活血清(在线补充图4FG，视频3 - 6)．因此，中性粒细胞对凝固的血液有反应，并在对可溶性因子的反应中以高细胞密度形成依赖于pad的NETs，即使在没有微生物群的情况下也是如此。

    视频2 中性粒细胞在添加2%自体血清的RPMI培养皿中培养，培养皿中预先准备了琼脂糖凝胶，培养皿中心不准备自体血清作为对照。凝胶边缘用活细胞显微镜成像(37°C, 5% CO2)．这段视频显示了凝胶边缘的高细胞密度，只有少量的NET形成。视频时间课程12小时。
    视频3 中性粒细胞在添加2%自体血清的RPMI培养皿中培养，培养皿的中心是含有20%自体血清的琼脂糖凝胶。凝胶边缘用活细胞显微镜成像(37°C, 5% CO2)．本视频显示了含血清琼脂糖凝胶边缘的高细胞密度中性粒细胞，它们优先在凝胶边缘形成net。视频时间课程12小时。
    视频4 中性粒细胞在添加2%自体血清的RPMI培养皿中培养，培养皿的中心是含有20%自体血清的琼脂糖凝胶，培养皿中存在pad抑制剂bb - cl -脒(20µM)。凝胶边缘用活细胞显微镜成像(37°C, 5% CO2)．本视频显示血块边缘高细胞密度的中性粒细胞。bb - cl -脒在凝胶边缘阻断NET的形成。视频时间课程12小时。
    视频5 中性粒细胞在添加2%自体血清的RPMI中培养，培养皿中预先用含有20%热灭活自体血清的琼脂糖凝胶制备。凝胶边缘用活细胞显微镜成像(37°C, 5% CO2)．这个视频显示了高细胞密度的中性粒细胞在凝胶边缘形成net。视频时间课程12小时。
    视频6 中性粒细胞在添加2%自体血清的RPMI培养皿中培养，培养皿的中心是含有20%热灭活自体血清的琼脂糖凝胶，存在pad抑制剂bb - cl -脒(20µM)。凝胶边缘用活细胞显微镜成像(37°C, 5% CO2)．这段视频显示了凝胶边缘高细胞密度的中性粒细胞。bb - cl -脒在凝胶边缘阻断NET的形成。视频时间课程12小时。

    pad4介导的免疫血栓形成控制急性dss诱导的结肠炎的粘膜止血

    免疫血栓的形成并不局限于物理造成的粘膜损伤。我们还观察到中性粒细胞聚集和NETs在结肠粘膜化学损伤过程中。我们采用急性dss诱导的结肠炎模型，其特征是上皮侵蚀和出血。结肠切片H&E染色显示肠壁有明显的白细胞浸润，管腔内有大量的粒细胞(图7)．具体来说，在血液附近的腔内，有大量的MPO+可检测到中性粒细胞(图7 b)．进行免疫印迹检测，在急性dss诱导的结肠炎的第8天，炎症结肠中H3cit的存在增加(图7C和D)．根据对人体组织的分析，我们发现了MPO+中性粒细胞聚集体和H3cit优先分布于溃疡粘膜表面(图7 e)．为了评估pad4介导的免疫血栓形成在该模型中的功能作用，我们再次使用了pad4缺陷小鼠。缺乏pad4的小鼠急性dss诱导的结肠炎病程加重、加速:缺乏pad4的小鼠体重减轻加剧(图7 f)和增强杀伤力(图7 g)．此外，结肠长度也缩短了(图7 h)．值得注意的是，与内窥镜评估的野生型小鼠相比，缺乏pad4的小鼠显示出更多的粘膜溃疡出血(图7我，视频7)．事实上，96%缺乏pad4的小鼠表现出持续的直肠出血，而野生型小鼠只有10% (图7 j)．全血细胞计数也证实了这一点:DSS诱导红细胞压积显著降低(图7 k)和血红蛋白水平与野生型对照比较(图7 l)．远端结肠切片分析表明，DSS治疗导致上皮表面严重破坏，经常完全失去粘膜隐窝结构。这些严重的粘膜变化在缺乏pad4的小鼠结肠中比野生型(在线补充图5AB)．在免疫荧光分析中，我们观察到野生型小鼠大多显示完整的粘膜表面。然而，缺乏pad4的样本通过β-catenin和E-cadherin染色显示更多的上皮剥蚀区域(在线补充图5C)．在急性dss诱导的结肠炎中，我们注意到伤口相关的上皮开始覆盖隐窝丢失的区域。有趣的是，在缺乏pad4的小鼠中，破坏的溃疡表面重塑和破坏的免疫血栓形成阻碍了伤口相关上皮细胞的上皮恢复(在线补充图5DE):在缺乏PAD4时，伤口相关上皮覆盖的扭曲黏膜明显减少。特定的伤口相关上皮细胞，其特征是残余上皮内膜边缘claudin-4形式的表达升高，并随着时间的推移连接溃疡表面。与野生型相比，pad4缺陷小鼠在钳诱导的结肠伤口边缘的伤口相关上皮中claudin-4阳性层的长度减少(在线补充图5F, G)．此外，我们通过流式细胞术和免疫荧光技术评估了dss诱导的结肠炎过程中浸润肠壁的髓系细胞的组成。在这里,CD11b+Ly6C嗨和CD11b+Ly6C罗髓细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞是炎症浸润的特征。然而，这种方法忽略了结肠腔内的中性粒细胞(图7A和B，在线补充图6A, B)．在dss诱导的结肠炎过程中，缺乏pad4的中性粒细胞和野生型中性粒细胞都能稳定地迁移到肠固有层，并在结肠腔中大量存在。横切面MPO免疫荧光考虑了腔内中性粒细胞，显示PAD4浸润中性粒细胞显著增加−−/老鼠(在线补充图6C)与野生型控制。总的来说,PAD4−−/小鼠显示更多的浸润中性粒细胞作为增加的粘膜溃疡在这些小鼠。

    PAD4-mediated immunothrombosis controls mucosal haemostasis in acute DSS-induced colitis. Acute colitis was induced in mice by 4 % DSS in the drinking water for 7 days. (A) H&E staining and (B) immunofluorescence of MPO of murine colonic wounds at day 9 shows a massive destruction of the epithelial cell layer with abundant neutrophils in the colon lumen (scale bars = 100 µm). (C) Colon tissue lysates from day 9 of acute DSS-induced colitis and untreated controls were analysed by an immuno-dot blot technique. The amount of citrullinated histone H3 and hence PAD activity is markedly increased under inflammatory conditions. β−actin immunoblot serves as a loading control (representative of 3 independent experiments with a total of n = 12 samples). (D) Semiquantitative image density analyses of immuno-dot blots as in (C) reveal a significantly higher H3cit expression in DSS-colitis tissue compared with healthy tissue (* p < 0.05, Student’s t test). (E) Immunofluorescence of MPO (top), EpCAM and H3cit (bottom) performed on cryosections of colonic tissue samples derived from day 9 of acute DSS-induced colitis (4 %) shows the increased presence of MPO in the inflamed mucosa with H3cit restricted to the eroded area with a breached epithelial lining (as seen by lack of EpCAM staining (top part of the lower micrograph)) (representative of n > 10 samples, scale bar = 100 µm). (F) Weight (in %) of mice subjected to 4 % DSS in the drinking water was measured during the course of the experiments comparing PAD4-deficient (PAD4−/−) mice and PAD4-proficient littermates (WT). Please appreciate the accelerated weight loss in PAD4−/− mice. (G) Lethality of mice, interpreted by the number of mice suffering a weight loss of > 20 %, was strongly increased in the PAD4−/− group (*** p < 0.001, Fisher’s two-tailed exact test). (H) At the time of sacrifice, colon length of mice was measured. A reduced length is typical of increased inflammation. A reduced colon length was observed in PAD4−/− mice as compared with WT littermates after DSS treatment. (I) Rectal bleeding is a typical hallmark of severe acute DSS-induced colitis, detectable on both clinical assessment (left) and on analyses by endoscopy of affected mice (right). This was evident more often in PAD4−/− mice. (J) The number of mice suffering from persistent rectal bleeding was strongly increased in PAD4−/− mice subjected to DSS as compared with wild-type littermates (*** p < 0.001, Fisher’s two tailed exact test, n: number of mice suffering from rectal bleeding, N: total number of mice studied). Complete blood count was performed on day 10 of DSS-induced colitis. (K) Haematocrit and (L) haemoglobin were measured in the blood of WT and PAD4−/− mice subjected to drinking water containing DSS or not (H2O). when subjected to DSS, PAD4−/− mice exhibited significantly more blood loss than WT mice, whereas untreated mice showed no differences (** p < 0.01, Student’s t test). DSS, dextrane sodium sulfate; MPO, myeloperoxidase; PAD, peptidyl-arginine deiminase; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    pad4介导的免疫血栓形成控制急性dss诱导的结肠炎的粘膜止血。在饮用水中加入4% DSS诱导小鼠急性结肠炎，持续7天。(A)第9天小鼠结肠创面MPO的H&E染色和(B)免疫荧光显示，结肠腔内上皮细胞层大量破坏，有大量中性粒细胞(比例尺= 100µm)。(C)用免疫斑点杂交技术分析急性dss诱导的结肠炎第9天的结肠组织裂解物和未处理的对照组。瓜氨酸组蛋白H3的数量和PAD活性在炎症条件下显著增加。β−肌动蛋白免疫印迹作为加载对照(代表3个独立实验，共n = 12个样本)。(D)免疫点印迹的半定量图像密度分析(C)显示，与健康组织相比，dss -结肠炎组织中H3cit的表达显著升高(* p < 0.05, Student 's t检验)。(E)在急性dss诱导结肠炎(4%)第9天结肠组织样本冰冻切片上进行的MPO(上)、EpCAM和H3cit(下)的免疫荧光显示，炎症黏膜中MPO的存在增加，H3cit局限于上皮内膜破裂的侵蚀区域(通过缺乏EpCAM染色可见(下显微照片的上半部分))(代表n > 10个样本，比例尺= 100µm)。(F)饮用水中含有4% DSS的小鼠的体重(%)在与缺乏PAD4 (PAD4)的小鼠进行比较的实验过程中测量−−/)小鼠和精通pad4的窝仔(WT)。请欣赏PAD4的加速减肥−−/老鼠。(G)小鼠的致死率，以体重减轻> 20%的小鼠数量来解释，在PAD4中显著增加−−/组(*** p < 0.001, Fisher双尾精确检验)。(H)牺牲时，测量小鼠结肠长度。长度减少是炎症增加的典型表现。PAD4的结肠长度缩短−−/与WT同窝小鼠比较。(I)直肠出血是严重急性dss诱导的结肠炎的典型标志，在临床评估(左)和受影响小鼠的内窥镜分析(右)中均可检测到。这在PAD4中更为明显−−/老鼠。(J)在PAD4中，持续直肠出血的小鼠数量显著增加−−/经DSS处理的小鼠与野生型同窝小鼠的比较(*** p < 0.001, Fisher双尾精确检验，n:直肠出血小鼠数量，n:研究小鼠总数)。在dss诱导结肠炎的第10天进行全血计数。(K)在WT和PAD4的血液中测量红细胞压积(hatocrit)和(L)血红蛋白−−/小鼠饮用含或不含DSS的水(H2O).受到DSS时，PAD4−−/小鼠的失血量显著高于WT小鼠，而未处理小鼠无差异(** p < 0.01, Student 's t检验)。DSS，葡聚糖硫酸钠;MPO、髓过氧物酶;肽基精氨酸脱亚胺酶;WT,野生型。

    视频7 在急性dss诱导的结肠炎(4%)的第7天对小鼠进行了直肠镜检查，并通过视频内窥镜监测。请注意PAD4直肠出血增多和溃疡增多−−/与对照组相比。

    PAD4通过降低丝氨酸酶活性影响血块重构，从而形成由谷氨酰胺转胺酶共价交联的成熟免疫血栓

    PAD4对增强免疫血栓的稳定性的作用可能部分归因于NETs的染色质。因此，我们询问DNase i治疗是否可以概括dss诱导的结肠炎中pad4缺乏的观察结果。在急性dss诱导的结肠炎过程中，每日给予DNase I并没有显著改变疾病严重程度的临床参数:在线补充图7A)，冒号长度(在线补充图7B)，直肠出血的小鼠比例不受此干预的影响(在线补充图7C)．在显微镜水平上，在DNase i处理的小鼠中观察到轻微的结肠溃疡保护(在线补充图7DE)．我们进一步描述了DNase i介导的结肠免疫血栓消化的动力学。从结肠伤口中提取的结肠免疫血栓和分离的中性粒细胞产生的NETs进行DNase I处理在体外（在线补充图6F):虽然分离的中性粒细胞产生的NETs在90分钟内被DNase I迅速分解，但DNase I介导的结肠免疫血栓的消化效率较低。20小时后，DNA减少SYTOX在DNase i处理的免疫血栓中被注意到。然而，DNase I没有分解血块，Hoechst仍然可以结合免疫血栓。因此，在dss诱导的结肠炎模型中，DNase I治疗不能使pad4缺陷小鼠表型改变，只能无效地消化结肠免疫血栓。

    在我们的模型中，我们进一步评估了pad4介导的染色质去凝以外的功能。PAD4已被证明通过灭活多个丝氨酸反应中心环中的核心P1精氨酸残基来抑制丝氨酸蛋白酶抑制剂28对凝血和纤溶级联具有复杂的理论后果(在线补充图8A)．的确,在体外研究表明，在PAD4存在时，α2-抗纤溶酶活性受到抑制，纤溶酶活性增加(在线补充图8B)．我们通过评估结肠伤口中的d -二聚体，分析了PAD4在凝血和纤溶下游的净效应。有趣的是，与野生型对照相比，缺乏pad4的伤口中d-二聚体的相对数量显著减少(在线补充图8C)．d -二聚体的形成需要转谷氨酰胺酶交联纤维蛋白，例如FXIIIa (在线补充图8D)．因此，我们评估了PAD4是否改变结肠伤口中谷氨酰胺转氨酶的活性。我们在损伤野生型和pad4缺陷型小鼠之前注射生物素标记的谷氨酰胺转氨酶底物，并通过链霉亲和素链接荧光显微镜评估免疫血栓中的谷氨酰胺转氨酶活性。在缺乏PAD4的情况下，结肠伤口免疫血栓中的谷氨酰胺转氨酶活性显著降低(在线补充图8E, F)．

    综上所述，中性粒细胞利用PAD4部分通过NETs和纤维蛋白凝块的重塑和成熟来稳定被侵蚀的表面，从而有利于上皮的恢复。

    讨论

    直肠出血和血性腹泻是UC急性发作的主要特征。29早期粘膜愈合是改善长期临床结果的重要目标30.但是溃疡性病变的黏膜愈合的起始仍然是难以捉摸的。在这项研究中，我们发现了中性粒细胞和PAD4在控制人类IBD和疾病实验模型中的直肠出血和调节粘膜出血中的作用。我们对人类UC的内窥镜和显微镜研究表明，成功的止血与血凝块的重塑有关31纤维蛋白层作为粘膜愈合的重要步骤。伤口表面的重塑是由先天免疫细胞引导的，主要是中性粒细胞。因此，我们提出术语免疫血栓来定义已被先天免疫细胞重塑的血凝块。17我们在免疫血栓中鉴定了细胞外染色质、聚集的中性粒细胞和PAD4活性，这些覆盖了UC中的粘膜溃疡和糜烂。糜烂、溃疡、血液、中性粒细胞和纤维蛋白与严重疾病呈正相关。32 33然而，我们观察到与直肠出血相关的是侵蚀的血液/血蛋白覆盖，而不是纤维蛋白覆盖，这与纤维蛋白作为保护性紧急屏障的作用一致。这与这些看似矛盾的观察结果相一致:纤维蛋白和富含中性粒细胞的免疫血栓发生在严重疾病中，但在这种情况下通过稳定受损粘膜并在上皮恢复之前成功实现止血来提供保护。

    我们仔细研究了小鼠黏膜损伤随时间的动力学。25 34我们检测到血凝块在数小时内被先天性免疫细胞重塑为白色的免疫血栓，这些细胞具有高度流行的中性粒细胞和依赖pad4的NETs。与pad4介导的NETs和免疫血栓形成的保护功能一致，缺乏pad4的小鼠急性dss诱导的结肠炎病程加重，伴有明显的直肠出血，红细胞压积和血红蛋白水平连续降低。这进一步证实了PAD4在支持结肠炎粘膜止血和控制直肠出血中的作用。通过荧光原位杂交观察，共生菌能在一定程度上浸润免疫血栓。虽然微生物可以在特定环境下刺激中性粒细胞形成NET，11特别是关于可能与uc相关的病原体，35我们的研究表明，即使在没有微生物群的情况下，PAD4活性和补体激活仍然存在于结肠伤口的免疫血栓中。事实上，凝固的血液和血清的热不敏感成分强烈刺激中性粒细胞聚集并形成NETs。中性粒细胞在高细胞密度下形成显著的pad4依赖性net36在血块的边缘。在含血清琼脂糖凝胶边缘的高细胞密度中，抑制PAD酶可以抑制NET的形成。这些观察结果与之前关于NETs在各种疾病中的作用的研究一致。虽然最初对net的研究主要集中在它们在宿主防御微生物方面的作用，11日13随后的研究强调了NETs在血栓性疾病过程中的作用18 37以及非感染性炎症。38-41在我们的实验中，缺乏PAD4导致粘膜表面的血块无法重塑，结肠伤口愈合延迟，结肠炎加重，直肠出血无法控制。PAD4在血块重塑成稳定的免疫血栓的机制是什么?PAD4在NET形成过程中介导中性粒细胞的染色质解凝，在直接接近血块的地方观察到。NETs的胞外染色质可阻塞血管42并可作为进一步血小板聚集的支架37以及因子XII的激活。43然而，在我们的实验中，如果细胞外染色质单独负责凝块稳定，那么DNase i治疗并不像预期的那样有利于直肠出血。然而，DNase I只能无效地分解结肠免疫血栓在体外．大的免疫血栓由于体积大，穿透性有限以及DNA不敏感的钠盐或钙盐44可能会限制DNase I在该模型中的作用，但这些实验不能排除或提示细胞外染色质在免疫血栓中的重要作用。尽管如此，我们还是选择寻找PAD4在NET形成之外的其他影响。在分子水平上，PAD4介导肽结合的精氨酸转化为瓜氨酸。除了对染色质结构的影响，14各种蛋白酶及其抑制剂的功能包括丝氨酸蛋白酶，28metalloproteases45 46和钙蛋白酶47被PAD4修饰，可能与免疫血栓形成过程相关。17 18与Tilvawala的发现一致等28我们检测到在反应中心环中具有中心P1精氨酸的丝氨酸蛋白酶，如α2-抗纤溶酶，被PAD4灭活在体外．在缺乏PAD4的情况下，抑制凝血/纤溶平衡的多种丝氨酸导致纤维蛋白周转的总体减少。在pad4缺陷小鼠的结肠伤口中检测到d -二聚体水平的降低。有趣的是，在缺乏PAD4转谷氨酰胺酶活性的情况下，转谷氨酰胺酶的共价交联免疫血栓降低。这与一个模型一致，在该模型中，pad4介导的对丝氨酸(例如抗凝血酶)的抑制对于凝血酶介导的转谷氨酰胺酶因子XIIIa的有效激活以及随后的免疫血栓的稳定是必需的。在dss诱导的结肠炎期间对结肠黏膜的分析表明，在缺乏PAD4的情况下，侵蚀表面的上皮恢复受到干扰。基因表达分析未检测到Padi4认为在缺乏PAD4的情况下，免疫血栓的稳定性降低和侵蚀表面会产生间接影响，从而阻碍上皮细胞的恢复。

    中性粒细胞在结肠炎中的观察和研究已有多年:中性粒细胞被认为是IBD黏膜炎症的驱动因素。8具体地说，有人提出NET的形成应该在治疗上被抑制。32 48 49感染诱导或自身免疫诱导的NET形成过多或清除缺陷确实可能损害宿主，特别是小血管，42百分比较特别是当uc相关病原体存在时。35 53相比之下，在过去研究结肠炎中性粒细胞耗竭方法的实验模型中报告了混合结果。54 55吞噬细胞功能障碍与儿童单基因IBD的发生有关。56此外，不同来源的嗜中性粒细胞减少症可能导致嗜中性粒细胞减少性小肠结肠炎的发展。57在糖原储存疾病Ib型的情况下，慢性肠炎可通过G-CSF输注成功治疗。58这进一步强调了中性粒细胞在粘膜炎症中的保护潜力。我们通过描述中性粒细胞、NETs和免疫血栓形成对活动性结肠炎溃疡和糜烂的止血功能，为这一主题提供了一个新的视角。我们的研究为先前报道的粒细胞耗竭导致出血增加提供了解释。54

    综上所述，我们已经证明中性粒细胞利用PAD4将富含NETs的粘膜溃疡上的血凝块改造为免疫血栓。免疫血栓在上皮细胞破坏的情况下起紧急屏障的作用。我们的研究结果表明，pad4依赖的免疫血栓支持严重IBD的粘膜伤口愈合和预防溃疡出血。因此，这些数据表明，活动性UC的中性粒细胞反应应谨慎平衡，而不是完全取消。

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    脚注

    • ML和AL是联合第一作者。

    • 贡献者ML、AL、SG、SP、DR、CS、FM、EL进行实验。ML起草了手稿。SF、SZ、RA、AAK、AB和MV为本研究提供了有价值的样本和建议。ML, MFN和MH设计了这项研究，所有作者都编辑了手稿。ML为本稿件整体内容的保证人。

    • 资金这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE3686/2-1, KFO 257 CEDER, FOR 2438, TRR241 (A03, B04, C04, INF)， CRC 1181 (B02, C02, C03, C05)， SPP1656, SCHA 1940 /1-1)的支持，德国Bundeswirtschaftsministerium (Grant-No. 1)。ZF4010106MD9)和埃尔兰根-纽伦堡大学临床研究跨学科中心(IZKF) (J63, J68)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。

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