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文摘
客观的本研究旨在探讨肠道失调引发炎症的作用在大脑中及其对阿尔茨海默病(AD)发病机制的贡献。
设计我们分析了3×Tg小鼠的肠道微生物群组成以年龄相关性的方式。我们生成的无菌3×Tg老鼠和recolonisation无菌3×Tg小鼠粪便样本来自广告和年龄患者健康的捐赠者。
结果微生物16 s rRNA测序披露拟杆菌浓缩。我们发现显著减少脑amyloid-β斑块和神经纤维缠结在无菌3×Tg小鼠病理与specific-pathogen-free老鼠。和海马RNAseq表明炎症通路和胰岛素/ igf - 1信号在3×Tg老鼠大脑异常改变肠道微生物群的缺失。多不饱和脂肪酸代谢产物鉴定通过代谢组学分析,及其氧化酶选择性地升高,相应的小胶质细胞的激活和炎症。AD病人的肠道微生物组加剧了广告病态3×Tg老鼠,与C / EBPβ/天门冬素相关肽链内切酶途径激活和认知障碍与健康的捐赠者的微生物群移植。
结论这些发现支持,需要一个复杂的肠道微生物行为缺陷,小胶质细胞激活和广告病态,肠道微生物导致病态的广告小鼠模型和人类微生物组的失调可能是广告的一个危险因素。
- 大脑/肠道交互
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
肠道微生物与各种神经系统疾病,包括阿尔茨海默病(AD)。
慢性神经炎症介导amyloid-β沉积和神经原纤维缠结形成,两个病理特点的广告。
C / EBPβ/天冬酰胺肽链内切酶(AEP)信号暂时激活在AD患者的肠道和3×Tg老鼠。
肠道炎症导致C / EBPβ/ AEP信号和原纤维形成在肠道和大脑。
有什么新发现吗?
殖民与肠道微生物群specific-pathogen-free老鼠和AD患者激活C / EBPβ/ AEP信号ex-germfree 3×Tg老鼠,促进广告病态和认知障碍。
AD-derived肠道微生物群增强促炎通路对多不饱和脂肪酸(PUFA)大脑的新陈代谢。
拟杆菌介导促炎PUFA新陈代谢增加在AD患者肠道微生物,调节小胶质细胞激活大脑中。
短链脂肪酸和炎症PUFA代谢物刺激小胶质细胞成熟和广告病态。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
我们的研究表明,人类微生物组可能是阿尔茨海默病的一个危险因素。调制的肠道微生物群通过个性化的饮食或有益微生物群干预,以及排泄物移植可能效用减少炎症和治疗脑部疾病包括广告。
介绍
阿尔茨海默病(AD)是一种进行性神经退行性疾病,特点是病态的细胞外老年斑富含amyloid-β(Aβ)肽和神经原纤维缠结(非功能性测试),与过度磷酸化和聚合τ大脑中的主要组件。慢性炎症在AD发病机制中起着举足轻重的作用,在广告的大脑和神经炎症是由中央刺激激活,如老年斑和非功能性测试1和外围刺激包括木糖醇。2是高度活化的小胶质细胞和神经炎症与AD患者认知能力下降有关。3此外,基因多态性在先天免疫反应的关键证明风险升高的迟发性的广告。4
肠道微生物组是一个重要的环境信号小胶质功能免疫和神经反应在整个主机的寿命。肠脑轴,由免疫、迷走神经和神经内分泌途径,5控制主机的认知行为。6肠道微生物群的不平衡会导致渗透率的增加肠道上皮屏障与促炎细胞因子的释放和促进神经炎症反应。7认知障碍和脑淀粉样变患者表现出改变肠道微生物组成、促炎细胞因子基因显著相关资料在这些科目。8丰富的变形菌门高纯度在AD患者的粪便。相比之下,门的相对比例厚壁菌门显著降低,影响中枢神经系统(CNS)免疫和神经内分泌。9其他研究显示下降厚壁菌门,增加拟杆菌门,减少双歧杆菌属在广告的主题。10 11此外,AD患者微生物,与抗炎22通路的失调有关,包含一个低丰度的丁酸盐合成细菌,和更高的丰度预测促炎的分类单元。12除了人类研究,改变微生物也被报道在各广告小鼠模型。13日14最近,我们报道,肠道失调导致淀粉样病变小鼠模型在一个广告。15明显,无菌(GF) APP / PS1 Tg老鼠显示减少Aβ沉积与特定的无菌(SPF)。殖民GF老鼠老鼠与传统的微生物群增加Aβ病理学。16
多不饱和脂肪酸(欧米伽)分为两类,ω- 3和ω- 6脂肪酸。亚麻酸(ω- 3)和亚油酸(ω- 6)是父母和必需脂肪酸。他们新陈代谢转化为长链乌法与亚油酸和花生四烯酸(AA) docosahexanenoic酸和二十碳五烯酸和亚麻酸。氧化AA代谢是一个主要的神经炎症的标志。17从细胞膜释放后,激活磷脂酶A2, AA是通过环氧酶代谢(COX-1 2)和5-lipoxygenase (5-LOX)前列腺素(后卫)和白细胞三烯(LTs),分别。这些生物活性脂质是强有力的炎症介质。AA代谢途径的核心网络不仅是炎症,而且工作记忆障碍的主要原因导致AD发病机制。18 19例如,AA的毒蕈碱的乙酰胆碱受体抑制广告大脑,加重认知功能障碍。20.AA广告大脑代谢水平通常较高21老鼠和hAPP-J20广告。22cox - 2表达的海马和皮层神经元和COX-1,发现在小胶质细胞,调节神经可塑性产生动力。23值得注意的是,PGE2和LTB4(白三烯B4)作为中间体在这个途径极大地丰富了广告在人类的大脑,与以前的报告一致,AA代谢物结构特点影响Aβ的生产。24PGE2调节Aβ沉积和Aβ释放,增强Aβ肽的分泌。25此外,5-LOX调节大脑通过影响γ-secretase Aβ水平。26因此,淘汰赛5-LOX救援突触功能障碍和改善记忆。27相反,5-LOX过度恶化内存和提高淀粉样蛋白和τ大脑疾病。28
最近,我们报道了天冬酰胺肽链内切酶(AEP)同时劈开应用和τ刺激Aβ生产和非功能性测试的形成。AEP劈开应用N585和τN368广告的大脑,和失活AEP大幅减少广告病态,导致认知功能的恢复。29 30此外,C / EBPβAβ和促炎cytokines-activated转录因子,以年龄相关性的方式调节AEP表达式。31日有趣的是,C / EBPβ还结合炎性细胞因子促进剂和升级他们的upregulation,32在小胶质细胞和C / EBPβ加剧tau-mediated AD病理。33最近,我们报道了C / EBPβ/ AEP信号是年龄相关性激活5 xfad老鼠,调制的肠道微生物群。抗生素减少这个信号减弱amyloidogenic流程,改善认知功能。15Gut-derived Aβ和τN368纤维沿着迷走神经传入大脑,大脑中触发广告病态。34为了评估广告病因学的微生物群的作用,我们试图确定功能性肠道微生物群贡献的病态心理和行为与广告有关。在此,我们报告的殖民GF 3×Tg小鼠粪便微生物群从个人与广告足以推动认知缺陷,促进广告病态,相对于那些健康的控制(HC)微生物群。我们识别特定的微生物代谢物足以促进疾病症状,通过脂肪acid-mediated炎症通路。因此,这些结果表明,肠道微生物可能扮演一个至关重要的和功能在AD发病机制中的作用。
结果
肠道微生物刺激广告病态和认知赤字和小胶质细胞的激活在3×Tg老鼠
我们最近报道,3岁的微生物群年轻3××Tg老鼠加速AD病理Tg老鼠,伴随着活跃C / EBPβ/ AEP信号在大脑中,15表明年龄相关性微生物影响AD病理变化。因此,微生物组成的纵向研究是必要发现微生物群落的变化影响主机。确定时间签名的微生物群,促进生理或病理生理的反应在一个广告小鼠模型,我们利用广告的3×Tg小鼠模型,并生成一个17个月16 s rRNA基因的时间序列资料的高通量测序分析。微生物分析揭示了一个戏剧性的不均衡的微生物组成4、8、12和17个月大3×Tg老鼠。此外,主坐标图(PCoA)表明,微生物群的3×Tg老鼠集群明显的年轻的野生型小鼠(在线补充图1 a, B)。在门级的相对丰度变形菌门在4升级,12和17个月大3×Tg小鼠相比,4 WT (在线补充图1罪犯)。另一方面,厚壁菌门和蓝藻的相对丰度逐渐下降,相比之下,拟杆菌门大幅度增加在8和3 xtg 17个月大的老鼠相比,4 3×Tg老鼠。门的损耗厚壁菌门和增加拟杆菌门与增强炎症和不同的疾病相关联。此外,粘蛋白降解和inflammation-inducing瘤胃球菌属物种证明相对频率增加老年人3×Tg老鼠(在线补充图2 a - c)。总之,微生物分析表明,年龄在3×Tg老鼠港口一个改变微生物群,它的特点是减少社区有益的抗炎细菌其次是浓缩的促炎pathobionts肠(在线补充图1 c、G)。
解决肠道微生物群在AD发病机制中的作用,我们重新推导出女朋友3×Tg AD小鼠模型。平均而言,GF老鼠身体重量比与SPF的同胞更轻。此外,GF老鼠表现出增大盲增加重量和深色盲肠的内容由于没有肠道微生物组(在线补充图3 a, B),尽管他们的消化道长度仍与SPF小鼠的总统(在线补充图3 c, D)。无菌状态的粪便样本GF老鼠被细菌培养进一步验证,显示没有明显的细菌(在线补充图3 e, F)。与SPF 3×Tg小鼠相比,沉积Aβ聚集在黑色皮质和(Thioflavin S) immunofluorescent(如果)co-staining信号明显减少GF老鼠。此外,过度磷酸化τ(AT8)海马和纤维τ夹杂物,验证与特定T22单克隆抗体,也大大减少了GF老鼠与SPF小鼠(图1 a, B)。,但不是Aβ40量化显示Aβ42 GF老鼠与SPF小鼠相比减少(图1 c)。这些观察表明,广告病态时缓解肠道微生物群枯竭。
无菌3 xtg老鼠显示降低AD病理和提高认知功能与SPF 3 xtg老鼠。(一)Immunofluorescent染色Aβ黑色(红色)和(绿色)在大脑的额叶皮层区域,AT8(绿色)和T22(红色)在海马CA1区从无菌3 xtg老鼠和SPF小鼠的大脑。酒吧规模:20µm Aβ阳性细胞(B)定量分析,这笔阳性细胞,分别AT8阳性细胞和T22阳性细胞。Aβ的密度、解说AT8和T22阳性细胞显著增加在spf小鼠大脑。每组(n = 5,数据显示为±SEM。* * P < 0.01, * * * * P < 0.0001与控制相比,未配对t)。(C) Aβ40皮层和Aβ42浓度的无菌3 xtg老鼠和SPF xtg老鼠用人类Aβ40 Aβ42酶联免疫试剂盒。Aβ42不是aβ40的浓度显著增加防晒系数3 xtg小鼠皮层与无菌3 xtg小鼠皮层。每组(n = 5,数据显示为均值±SEM * * * p < 0.001与控制相比,多个未配对T检验)。(D, E) Y-maze行为测试。 Spontaneous alternation (%) (D), number of arms entered (E); n=8 in each group, data are shown as mean±SEM. *P<0.05 compared with control, unpaired T tests. (F) Representative images of immunofluorescent staining of Iba-1 (red) in cortex (upper panel) and 3D reconstruction of Iba-1-stained microglia (lower panel) residing in the cortex of germ-free 3xTg mice and SPF 3xTg mice. (G–I) Quantitative analysis of diameter, number of branch points, and total branch length of microglia residing in the cortex. Data represent the mean±SEM; representative data of 12 samples; *p<0.05, ****p<0.0001 compared with control, unpaired t-tests. Aβ, amyloid-β; GF, germ-free; SPF, specific-pathogen-free.
尽管脑源性神经营养因子的水平,一个重要neurotrophine突触发生和树突arborisation两老鼠大脑相似(图3 g网络补充),高尔基染色表明,海马神经元的树突棘是高度升高与SPF小鼠(GF老鼠相比我在线补充图3 h,)。同时,行为Y-maze显示空间记忆功能显著提高GF老鼠和SPF小鼠(图1 d, E)。小胶质细胞的成熟和激活大脑与慢性神经炎症相关广告。因此,Iba-1染色证明大大延长过程和数量增加的部分,分支和终端分小神经胶质细胞皮层从女朋友老鼠。半自动定量的形态学小胶质细胞的三维测量显示,这些小胶质形态明显改变了GF老鼠与SPF小鼠相比图1外:我)。因此,肠道微生物群促进广告病态,认知缺陷和小胶质细胞的激活。
肠道微生物激活C / EBPβ/ AEP通路,提高酶促炎与PUFA的新陈代谢
我们的最近的研究支持C / EBPβAEP信号tempospatially调节广告病态。31日35评估是否完整的肠道微生物组是必要的,以刺激这个途径,导致广告发病机理,我们进行了免疫印迹分析,发现C / EBPβ/ AEP信号衰减的女朋友3 xtg老鼠的大脑相比SFP老鼠。随后,AEP-truncatedτN368和应用N585片段被减少,降低p-tau AT8和AT100活动。值得注意的是,Lox5, Cox1 Cox2水平显然是减少GF 3×Tg老鼠与SPF小鼠(图2 a, B),拟合与先前发现AA代谢途径不仅是炎症的核心网络,但也工作记忆障碍的主要原因导致AD发病机制。18 19正如所料,蛋白酶试验表明,GF老鼠AEP酶活动低于SPF小鼠,符合减少活跃AEP水平(图2 c)。由于C / EBPβ是主要转录因子il - 6,因此,il - 6浓度GF老鼠与SPF小鼠相比显著降低(图2 d)。存在显示CEBPβ目标/ AA通路基因GF老鼠SPF小鼠相比略有减少(图2 e与RNAseq),相应的数据。然而,存在数据没有统计学意义,这可能是由于高变化定量PCR (qPCR)分析。
无菌(GF) 3 xtg老鼠证明减毒C / EBPβ/ AEP通路和AA-associated炎症。(一)免疫印迹显示pci / EBPβC / EBPβAEP,应用和τ表达和处理,以及花生四烯酸代谢的老鼠的大脑无菌3 xtg老鼠和SPF 3 xtg老鼠。免疫印迹(B)定量分析。active-AEP的乐队,TauN368 APPN585 C / EBPβLOX5, Cox1, COX2、BLT1 BLT2测量与图像与β-actin J和正常化。每组(n = 5,数据显示为±SEM, * * * p < 0.05, p < 0.01与控制相比,未配对t。(C) AEP活动在大脑中测定溶菌产物从无菌3 xtg老鼠和SPF xtg老鼠。防晒指数3 xtg小鼠显示升级AEP与无菌3 xtg小鼠的活动。数据代表均值±扫描电镜;代表5个样本的数据;* * p < 0.01与控制相比,未配对t。 (D) proinflammatory cytokine IL1-β, IL-6 and TNFα concentrations in the brain lysates from germ-free 3xTg mice and SPF 3xTg mice, respectively. Data represent the mean±SEM; representative data of five samples; ***p<0.001 compared with control, multiple unpaired t-tests. (E) Quantitative RT-PCR analysis of the brain samples from GF mice versus spf mice comparing C/EBPb targeted AA pathway genes. AA, arachidonic acid; AEP, asparagine endopeptidase; COX, cyclooxygenases; SPF, specific-pathogen-free.
如果co-staining大脑部分显示降低C / EBPβupregulation, AEP激活,Aβ积累,τN368碎片和p-Tau (AT8)在海马体和大脑皮层的女朋友老鼠vs SPF小鼠(o在线补充图4模拟海马:A和D;皮层:B和C),符合降低C / EBPβ/ AEP信号和减毒应用N585 GF老鼠和τN368碎片。此外,如果5-Lox活动,Cox1 Cox2在女朋友的老鼠的大脑明显减少,与降低C / EBPβ紧密相关的信号(在线补充图4情况皮层:E、F和G)。因此,C / EBPβ/ AEP信号、和AA-associated炎症酶减少GF老鼠vs SPF小鼠,这表明肠道微生物群的调节这些感受器的表达式通过激活C / EBPβ/ AEP通路。这些发现与先前的报道是一致的,C / EBPβ充当这些AA-associated炎症酶的转录因子。36免疫组织化学染色(包含IHC)进一步验证Iba-1和AEP都减少GF的老鼠的大脑中与SPF小鼠(我在线补充图4),符合Iba1和AEP如果co-staining皮层。因此,女朋友3×Tg老鼠证明减毒C / EBPβ/ AEP通路和AA-associated炎症。
肠道微生物群提升炎症代谢产物和改变大脑的炎症和胰岛素/ igf - 1通路
评估全球的影响肠道微生物组AD-associated转录反应,我们进行无偏RNA-sequencing使用女朋友的海马样本和SPF 3×Tg老鼠和全基因组mRNA表达谱的定量测量深度测序的RNA转录(图3和在线补充图5 a, B)。我们发现显著差异mRNA概要文件和整体基因表达模式SPF和女朋友之间的动物。评估的主要来源的方差数据集的主成分分析(PCA)显示强烈的分离(图3一)的女朋友和SPF 3×Tg老鼠。我们观察到1872个差异基因在SPF 3×Tg老鼠与女朋友3×Tg同行(图3 b)。差异表达基因中,我们观察到在海马体SPF 3×Tg小鼠表达下调表达的载脂蛋白E与女朋友3×Tg老鼠。接下来,海马之间的基因差异表达GF和SPF 3×Tg老鼠用于生成的热图的聚类分析功能mrna (图3 c)。引人注目的是,在AA代谢通路相关基因,包括Hpgd,Ptges3,Ptges2,Cyp1b1防晒指数3 xtg差异表达的小鼠相比,女朋友3 xtg老鼠(调节:Hpgd, Ptges3,Cyp1b1;表达下调:Ptges2)(图3 d),配件与我们的观察,许多AA-associated GF小鼠炎症酶明显减少。除了深刻改变了促炎AA代谢通路中的基因,有趣的是,RNAseq显示,胰岛素信号及其相关下游通路在SPF小鼠异常改变与GF老鼠(图3 e)。因此,我们研究了海马胰岛素信号通过免疫印迹,并发现p-insulin受体(IR)和p-IRS (IR衬底)及其下游效应器包括p-Akt和p-MAPK p-GSK活动强烈升级与SPF小鼠(GF老鼠相比图3 f)。这些数据与先前的报道是一致的,AD患者显示进步的大脑胰岛素抵抗和胰岛素缺乏。37 38
Gutmicrobiota影响转录组海马区域的无菌mRNA表达图谱和SPF 3 xtg小鼠模型的广告。(一)情节显示样本主成分分析(PCA)的距离。(B)散点图显示log2(褶皱变化)对正常意味着基因数。(C)聚类分析功能mrna在女朋友和防晒系数,和数据提出了热图(p < 0.05)。每一行代表一个单基因的相对表达水平在所有老鼠;每一列表示一个鼠标的表达水平。颜色红色和绿色表示低和高表达,分别。(D)的热图显示微分花生四烯酸代谢途径的基因GF和防晒系数之间的关系。(E)和KEGG豹途径差异基因的分析。(F)免疫印迹污点显示胰岛素/ igf - 1信号通路在海马体的无菌3 xtg老鼠和SPF xtg老鼠。 (G) Quantitative analysis of immunoblot. The bands of p-IR, p-IRS and p-GSK were measured with image J and normalised with IR, IRS and GSK, respectively. N=5 in each group, data are shown as mean±SEM, **p<0.01 compared with control, unpaired t-tests. AD, Alzheimer’s disease; GF, germ-free; IR, insulin receptors; SPF, specific-pathogen-free.
接下来,我们进行富集分析差异表达基因在海马体使用策划公共基因集的集合(去,KEGG和豹)(在线补充图5 c, D),确定参与凋亡的基因改变,血清素和多巴胺,GABAnergic,谷氨酸和去甲肾上腺素途径(图5在线补充练习)。如图所示,包括proapoptotic基因肿瘤坏死因子、Apaf1 Fasl,等增加,抗凋亡基因Bcl2l1减少在SPF小鼠,虽然proapoptotic基因包括伯灵顿,坏,Casp3SPF小鼠等也减少,这表明不同pathways-mediated细胞死亡效应器大大改变了SPF和GF小鼠和细胞之间的女朋友3×Tg的大脑可能更耐药细胞凋亡(在线补充图5 e)。Slc6a4基因编码一个完整的膜蛋白运输SPF小鼠神经递质5 -羟色胺的水平降低,和Htr3b, Htr4基因,编码的受体在SPF小鼠血清素也下降,表明潜在的增加5 -羟色胺信号在GF老鼠的海马(在线补充图5 f)。Ankk1基因密切相关Drd2SPF小鼠,基因,都减少Drd2 Drd3, Drd4和Drd5编码在SPF小鼠多巴胺受体也降低了,建议更多的多巴胺受体表达的女朋友老鼠(在线补充图5 f)。Gad1编码谷氨酸脱羧酶负责催化生产γ-aminobutyric的酸(GABA)从L-glutamic酸;Aldh9a1基因编码的酶氧化γ-amino GABA丁醛;Gabarap基因编码GABA (A) receptor-associated蛋白质。所有这些在SPF小鼠,减少时间Abat基因编码4-aminobutyrate转氨酶负责分解代谢增加GABA的SPF小鼠,表明在GF GABA生产和实验3×Tg小鼠海马没有退化,以及更多的GABA受体合成GF老鼠与SPF小鼠相比在线补充图5 g);gl和Gls2基因编码谷氨酰胺酶催化水解谷氨酰胺的谷氨酸和氨;Glul基因编码的蛋白质从谷氨酸综合了谷氨酰胺;Grin1、Grin2a Grin2b基因编码的子单元n -甲基- d受体;所有上述基因增加海马的SPF 3×Tg老鼠,而更少的谷氨酸生产的女朋友是老鼠的大脑,伴随着提高谷氨酸退化和减少谷氨酸受体合成,与SPF小鼠相比在线补充图5 h和7 h)。Comt的基因编码Catechol-O-methyltransferase;胸径基因编码多巴胺,去甲肾上腺素的氧化还原酶催化转换,他们减少SPF vs女朋友,Adra1a和Adra2a基因编码alpha-1A-adrenergic SPF小鼠alpha-2A-adrenergic受体增加,表明在GF鼠脑产生更少的去甲肾上腺素(我在线补充图5)。两个梯形的基因通路被存在验证,结果符合RNA-Seq发现(在线补充图5 j)。NeuN和TUNEL co-staining表明SPF小鼠海马神经元的凋亡是大大增加(在线补充图5 k)。在一起,这些数据表明,居民肠道微生物群影响转录组的海马区域景观的mRNA表达GF和SPF 3 xtg小鼠模型的广告。
短链脂肪酸引发C / EBPβ/ AEP激活和认知功能障碍的女朋友3×Tg老鼠和炎症,加剧了前列腺素E2-1-glyceryl酯
AD病人的肠道微生物群具有较低比例的关键butyrate-producing物种,如成员丁酸弧菌属和真细菌属。广告长老也显示了丁酸盐酶编码基因比健康长老没有痴呆。低比例的丁酸盐生产物种会导致促炎的状态。12的确,短链脂肪酸(SCFAs)减少粪便和血清从AD病人的粪便移植ex-GF老鼠(见下文在线补充图11)。调查SCFAs是否部分模拟肠道微生物在殖民SPF小鼠触发C / EBPβ/ AEP途径激活,我们给女朋友3×Tg老鼠与车辆控制或SCFAs醋酸、丙酸和丁酸(虽然动物存活微生物无菌)连续3个月。免疫印迹显示pci / EBPβ和总蛋白质含量在GF白鼠SCFAs升级;因此,下游AEP和其活性形式增加,引发τN368 N585扩充和应用。随后,p-Tau AT8活动也相应升高。因此,C / EBPβ下游目标,包括Lox-5 Cox1, Cox2、BLT1 BLT2水平增强SCFA喂养与汽车相比(图4一)。量化的酶化验证实AEP蛋白酶活动明显增强SCFA-fed GF老鼠和车辆(图4 b)。符合C / EBPβ激活,下游反应炎症细胞因子il - 6增加(图4 c)。AβELISA量化显示Aβ42但不是Aβ40浓度在大脑被显著增加了SCFA治疗(图4 d)。如果costaining进一步证实了这些发现。在海马体,ThS-positive Aβ骨料和p-Tau AT8和纤维τT22信号被SCFAs加剧(图4 e, F)。此外,高架AEP与AEP-truncatedτN368和应用C586碎片也丰富SCFAs治疗(在线补充图6 f)。符合广告产生病态GF 3×Tg SCFAs老鼠,认知行为测试显示百分比的变化显著抑制SCFA美联储GF老鼠,尽管武器进入的数量保持不变(图4 g, H)。小神经胶质细胞,大脑的常驻巨噬细胞,保护中枢神经系统的损伤和感染。小胶质细胞也有助于大脑发育在胚胎和成年生活通过调节突触传递、突触的形成和修剪和胚胎大脑布线。39在海马和皮层区域的影响,小胶质细胞在SCFA-administered GF老鼠表现出形态表明增加激活和成熟与vehicle-treated GF老鼠相比,类似于从女朋友小神经胶质细胞和SPF小鼠,分别为(图4 j第一和第三板)。
SCFAs触发C / EBPβ/ AEP激活和认知功能障碍的女朋友3 xtg老鼠和炎症,PGE2-G加剧了。(一)免疫印迹显示pci / EBPβC / EBPβAEP,应用和τ表达和处理,以及花生四烯酸代谢GF的老鼠的大脑中有或没有SCFAs管理。(B) AEP活动在大脑中测定溶菌产物从女朋友3 xtg老鼠有或没有SCFAs管理。SCFAs治疗提升AEP活动GF 3 xtg小鼠的大脑中。数据代表均值±扫描电镜;代表四个样品的数据;* p < 0.05与控制相比,未配对t。(C) IL1-β促炎细胞因子,il - 6和TNFα浓度在大脑中溶解产物从女朋友3 xtg老鼠和SPF 3 xtg老鼠,分别。数据代表均值±扫描电镜;代表四个样品的数据; *p<0.05 compared with control, multiple unpaired T tests. (D) Aβ40 and Aβ42 concentrations in the cortex of GF 3xTg mice with or without SCFAs administration were measured using human aβ40 and Aβ42 ELISA kit. The concentrations of Aβ42 not aβ40 were significantly increased in the cortex regions of the brains from SCFAs-treated GF 3xTg mice compared with vehicle-treated GF 3xTg mice. (N=4 in each group, data are shown as mean±SEM *p<0.05 compared with control, multiple unpaired T tests). (E) Immunofluorescent staining of Aβ (red) and ThS (green), AT8 (green) and T22 (red) in the hippocampus CA1 region of brains from GF 3xTg mice with or without SCFAs administration. Scale bar: 20 µm (F) quantitative analysis of Aβ positive cells, ThS positive cells, AT8 positive cells and T22 positive cells, respectively. The density of Aβ, ThS, AT8 and T22 positive cells was significantly increased in SCFAs-treated GF 3xTg mice brains. (n=8 in each group, data are shown as mean±SEM. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 compared with control, unpaired T tests.). (G, H) Y-maze behavioural tests. spontaneous alternation (%) (G), number of arms entered (H); (N=9 in each group, data are shown as mean±SEM. ***P<0.001 compared with control, unpaired T tests). (I) Arachidonic acids and its metabolites concentrations in the faeces of GF mice and SPF mice. (N=3 in each group, data are shown as mean±SEM, *p<0.05, **p<0.01 compared with control, multiple unpaired T tests). (J) Representative images of immunofluorescent staining of Iba-1 (red) in the cortex (upper panel) and 3D reconstruction of Iba-1-stained microglia (lower panel) residing in the cortex of GF 3xTg mice, GF 3xTg mice treated with either PGE2-G or SCFAs, GF 3xTg mice treated with both SCFAs and PGE2-G. (K, L) Quantitative analysis of diameter, number of branch points of microglia residing in the cortex. data represent the mean±SEM; representative data of twelve samples; **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 compared with control, multiple unpaired T tests;#P < 0.05,# #P < 0.01,# # #P < 0.001,# # # #P < 0.0001与控制相比,多个未配对t检验。Aβamyloid-β;AEP,天冬酰胺肽链内切酶;女朋友,无菌;PGE2-G,前列腺素E2-1-glyceryl酯;短链脂肪酸,短链脂肪酸。
代谢组学研究脑组织样品提供直接洞察AD发病机制的分子基础。因此,我们进行了代谢组学分析与大脑样本GF和SPF 3×Tg老鼠。代谢组学发现AA-associated代谢物在大脑中减少在女朋友3×Tg老鼠与SPF小鼠(在线补充图7)。正如所料,PUFA代谢物水平显著降低粪便从GF与SPF小鼠相比(图4我)。因此,我们选择了PGE2-G, PGE2 glyceryl-conjugated代谢物,从代谢组学分析确定。PGE2-G治疗几乎引起了女朋友不成熟的小胶质细胞激活小鼠和车辆。然而,短链脂肪酸和PGE2-G cotreatment加法刺激小胶质细胞形态成熟GF老鼠和激活(图4 j-l),这表明PGE2刺激成熟但不是不成熟的小胶质细胞的激活。这些发现支持SCFAs引发C / EBPβ/ AEP激活和认知功能障碍的女朋友3×Tg老鼠和炎症,加剧了AA-metabolite PGE2-G。
拟杆菌涉及PUFA代谢菌株在广告升级微生物殖民地化GF老鼠
患者自广告显示改变微生物,10 - 12我们试图确定是否来自人体的肠道微生物转移到女朋友老鼠时影响疾病的结果。我们接种三个人类广告和三个HC捐赠者的粪便样本到老鼠的女朋友通过口服填喂法。收集粪便颗粒从人性化的小鼠中,细菌的DNA提取,16 s rRNA测序。微生物分析揭示人类肠道微生物群的建立由粪便微生物群移植(FMT) ex-GF老鼠。在门级,分类分析展示了一种非常相似的微生物群落FMT-recipient小鼠的微生物类群人类捐赠培养液(图5一个)。见几个以前的研究,收件人小鼠成功怀有phyla-level 100%和86%的genus-level类群,捐献者培养液中发现。此外,PCoAβ多样性分析表明,微生物群的FMT-recipient老鼠与人类捐赠同行聚集在一起(图5 b)。重要的是,我们的研究证实,没有明显改变α多样性之间的供体和FMT受体小鼠。因此,我们的数据显示成功移植GF人类肠道微生物群的老鼠。此外,我们的研究结果显示出显著的升级意味着相对丰度拟杆菌intestinalis(图5 c),脆弱拟杆菌(图5 d),拟杆菌xylanivsolvens(图5 e),并显著减少意味着相对丰度Parabacteroides goldsteiniii(图5 f),拟杆菌ovatus(图5克),bolteae梭状芽胞杆菌(图5 h)。引人注目的是,AA及其代谢物浓度的定量分析从三个细菌菌株在培养基(b . intestinalis,b . fragilis和b . xylanivsolvens)增加广告人性化ex-GF老鼠表示,这些细菌参与AA新陈代谢,可以生成AA代谢物(图5我)。
微生物分析人性化ex-germ-free 3 xtg老鼠粪便,揭示拟杆菌海拔公元粪便从人类粪便接种无菌鼠。(一)细菌类群的相对多度由高通量测序分析。(B)的主要坐标图(PcoA)微生物群落结构。(碳氢键)平均频率的细菌物种。数据代表±SEM手段;* p < 0.05与控制相比,单向方差分析。(I)的花生四烯酸(AA)及其代谢物浓度的培养基体外的文化拟杆菌intestinalis,拟杆菌fragilis和拟杆菌xylanisolvens。数据代表±SEM手段;代表三个样本的数据;* * p < 0.01, * * * * p < 0.0001与控制相比,单向方差分析。广告,阿尔茨海默病;方差分析,方差分析。
AD患者肠道微生物群加强广告病理学,促进认知赤字
评估人类广告粪便样本能否加速广告病态GF老鼠,我们执行如果costaining,发现ThS-positive Aβ总量显著升高广告人性化ex-GF 3×Tg老鼠大脑而HC。此外,AT8 / T22 costaining在海马体也表现出相似的模式(图6 a, B),支持AD病人微生物促进广告病态包括老年斑和非功能性测试在女朋友3×Tg老鼠。量化显示Aβ42但不是Aβ40浓度大幅增加广告粪便接种ex-GF老鼠(图6 c)。如果costaining显示C / EBPβ和AEP强劲提升广告粪便接种ex-GF老鼠与HC相比;因此,τN368,应用C586和Aβ都大大增强,再加上明显的小胶质激活,验证了著名Iba-1和CD86 costaining信号(在线补充图8 a e、H)。符合upregulation AA的代谢酶,LKB4 12-HHT受体,BLT1 BLT2,两种C / EBPβ下游转录目标,40人类广告也显着地提高微生物移植ex-GF老鼠(在线补充图8 f-h)。与著名的广告协议病理特征,免疫印迹显示突触蛋白包括PSD95 GluR2和Spinophilin减少广告粪便移植ex-GF老鼠和HC (在线补充图9)。兼容这些发现,BDNF水平显著降低AD小鼠粪便人性化(在线补充图9 b)。一致,海马神经元的树突棘是大大减少(在线补充图9 c, D)。因此,广告粪便Y-maze人性化的小鼠表现出认知缺陷,与HC的老鼠相比,虽然数量和武器进入数据统计上没有改变。然而,一双ex-GF小鼠接种广告和HC粪便样本表现出显著降低手臂条目(图6 d)。正如预期的那样,Iba-1染色,和3 d小胶质重建分析证明了小神经胶质细胞广告subject-inoculated GF老鼠高度激活,形态成熟(图6 h-k)。因此,这些数据支持患者粪便微生物群落差异广告和高碳钢可能维护后接种到老鼠的女朋友。
广告粪便人性化ex-germ-free (GF)小鼠表现出增强广告病态和认知障碍。(一)immunofluorescent染色Aβ黑色(红色)和(绿色)在大脑的额叶皮层区域,AT8(绿色)和T22(红色)的大脑海马CA1区的HC人性化ex-GF 3 xtg小鼠和广告人性化ex-GF 3 xtg老鼠。HC, GF老鼠殖民与HC粪便微生物;广告,GF老鼠殖民AD病人的粪便微生物。酒吧规模:20µm Aβ阳性细胞(B)定量分析,这笔阳性细胞,分别AT8阳性细胞和T22阳性细胞。Aβ的密度、解说AT8和T22阳性细胞显著增加在广告人性化ex-GF 3 xtg老鼠的大脑。每组(N = 5,数据显示为均值±SEM * * * * * p < 0.01, p < 0.001, * * * * p < 0.0001与控制相比,未配对T测试)。(C) aβ40和Aβ42浓度的皮质HC人性化ex-GF 3 xtg小鼠和广告人性化ex-GF 3 xtg老鼠用人类aβ40 Aβ42酶联免疫试剂盒。Aβ42不是aβ40的浓度显著增加在广告人性化ex-GF 3 xtg小鼠皮层与HC人性化ex-GF 3 xtg小鼠皮层。每组(N = 5,数据显示为均值±SEM * * * p < 0.001与控制相比,多个未配对T检验)。 (D–G) Y-maze behavioural tests. (D–E) compilation of all independent cohorts in each Y-maze test: spontaneous alternation (%), number of arms entered, grouped by healthy status of faecal donor (n=23–24 in each group, data are shown as mean±SEM. *P<0.05 compared with control, unpaired t-tests); (F–G) spontaneous alternation (%), number of arms entered of mice humanised with microbiota from either AD patients or matched HCs. (N=7–8 in each group, data are shown as mean±SEM, *p<0.05 compared with control, unpaired t-tests). (H) Representative images of immunofluorescent staining of Iba-1 (red) in the cortex (upper panel) and 3D reconstruction of Iba-1-stained microglia (lower panel) residing in the cortex of HC humanised ex-GF 3xTg mice and AD humanised ex-GF 3xTg mice. (I–K) quantitative analysis of diameter, number of branch points, and total branch length of microglia residing in the cortex. data represent the mean±SEM; representative data of 12 samples; *p<0.05, **p<0.01 compared with control, unpaired t-tests. Aβ, amyloid-β; AD, Alzheimer’s disease; HC, healthy control.
广告粪便人性化ex-GF老鼠证明C / EBPβ/ AEP激活升高,升高的炎症
深入描述病理事件人性化ex-GF 3×Tg老鼠,我们进行了免疫印迹,发现pci / EBPβ和总蛋白质含量显着地提高了人类微生物组移植与HC广告。下游AEP和成熟形式也与上游转录因子振荡活动。因此,τN368和应用N585 p-Tau AT8信号显著升高。再次,下游包括Lox-5响应基因,Cox1, Cox2, BLT1和BLT2水平都回荡上游C / EBPβ信号(图7 a, B)。正如预期的那样,适当增强(AEP酶活动图7 c)。炎性细胞因子的量化表明,il - 6和IL-1β被人类粪便移植广告(显著增强图7 d)。存在证明ALOX-5信使rna浓度不是其他AA-metabolism-associated基因是高度增加(图7 e),这表明ALOX5启动子可能更敏感,对上游转录因子C / EBPβ活动。这些发现与观察,AA代谢物在广告增强微生物re-GF老鼠(在线补充图11)。
广告粪便人性化ex-GF老鼠证明C / EBPβ/ AEP激活升高,升高的炎症。(一)免疫印迹显示pci / EBPβ,C / EBPβ,AEP,应用和τ表达和处理,以及花生四烯酸代谢的老鼠的大脑HC人性化ex-GF 3 xtg小鼠和广告人性化ex-GF 3 xtg老鼠。每组四个样品来自两个捐助者每捐赠样本(2)分开。免疫印迹(B)定量分析。乐队的C / EBPβ、LOX5 COX1, COX2、BLT1 BLT2测量与图像与β-actin J和正常化。每组(N = 4,数据显示为±SEM, * * * p < 0.05, p < 0.01与控制相比,未配对t测试)。(C) AEP活动在大脑中测定溶菌产物从HC人性化ex-GF 3 xtg小鼠和广告人性化ex-GF 3 xtg老鼠。广告人性化ex-GF 3 xtg小鼠显示升级AEP活动相比,在HC人性化ex-GF 3 xtg老鼠。数据代表均值±扫描电镜;代表5个样本的数据; *p<0.05 compared with control, unpaired t-tests. (D) Proinflammatory cytokine IL1-β, IL-6 and TNFα concentrations in the brain lysates from HC humanised ex-GF 3xTg mice and AD humanised ex-GF 3xTg mice, respectively. Data represent the mean±SEM; representative data of five samples; *p<0.05 compared with control, multiple unpaired t-tests. (E) Relative mRNA levels of genes involving arachidonic acid metabolism in the brain from HC humanised ex-GF 3xTg mice and AD humanised ex-GF 3xTg mice. Data represent the mean±SEM; representative data of three samples, *p<0.05 compared with control, two-way ANOVA. AD, Alzheimer’s disease; AEP, asparagine endopeptidase; ANOVA, analysis of variance; COX, cyclooxygenases; GF, germ-free; HC, healthy control.
PCA分析表明,有一些代谢差异HC和广告组人性化ex-GF以及在女朋友和SPF组(在线补充图10 a - c)。值得注意的是,粪便和血清样本的代谢组学概要文件明显不同对广告人性化ex-GF与HC人性化ex-GF老鼠。而大脑出现明显不同的代谢组学概要对SPF与女朋友的老鼠相比,似乎没什么代谢差异对广告人性化ex-GF与HC人性化的大脑。数据集内的粪便,一些芳香代谢物明显更高或趋势(不重要)的广告与HC人性化ex-GF集团,而次级胆汁酸(如taurolithocholate 3-sulfate)、维生素(如硫胺一磷酸),苯甲酸酯代谢物(如苯甲酸)显著改变或趋势改变(不重要)(在线补充图10 d)。在血清中,一些芳香族氨基酸代谢产物(如phenylpyruvate,多巴胺3-O-sulfate和3-indoxyl硫酸),和次级胆汁酸(如taurohyodeoxycholic酸)、维生素(如吡哆醛)和苯甲酸(如4-ethylphenylsulfate)代谢物都显著的高于广告与HC人性化ex-GF集团(在线补充图10 e)。此外,在大脑中,多巴胺低的趋势,而苯甲酸酯代谢物hippurate和硫酸苯邻二酚明显更高或趋势,分别在广告与HC人性化ex-GF集团(在线补充图10 f)。几个戊糖代谢产物都显著的高于广告人性化粪便ex-GF集团(在线补充图10 g)。血清,糖酵解代谢丙酮酸显著较高,而戊糖、柠檬酸循环和NAD代谢物类似的结果显示随着粪便当比较广告与HC人性化ex-GF集团(在线补充图10 h)。柠檬酸的能量代谢产物aconitate和苹果酸都显著的高于广告人性化ex-GF集团在大脑中我在线补充图10)。脂类代谢,磷脂酰乙醇胺(PE)代谢产物和1-stearoyl-2-linoleoyl-GPE更高的粪便广告人性化ex-GF集团(在线补充图11)。几个LCFAs(长链脂肪酸,如myristoleate和docosapentaenoate)以及几个carnitine-conjugated脂肪酸中显著降低广告人性化ex-GF组在血清中(在线补充图11 b)。值得注意的是,SCFAs,尤其是丁酸盐,减少粪便和血清(在线补充图11 a, B)。鞘磷脂相关代谢物都显著的高于广告人性化ex-GF组与大脑中的HC (在线补充图11 c)。在血清和大脑AA-associated代谢物,包括凝血恶烷B2, PGF2α12-HHTrE等,增加但不显著。这些数据也暗示了显著改变脂质代谢广告人性化ex-GF集团与HC人性化ex-GF组。精氨酸对细胞代谢的多个方面,炎症信号和能量代谢。AD患者精氨酸代谢改变。41在粪便中,血清和大脑数据集,几个精氨酸代谢产物都显著的高于广告人性化ex-GF组相比,HC组(在线补充图11 d-f)。
免疫印迹还透露,Lox5 Cox1, Cox2、BLT1 BLT2水平更加丰富与年龄相仿的对比组被测者相比,人类AD病人的大脑的大脑(在线补充图12 a, B),符合AA-metabolites升高血清和大脑从广告人性化ex-GF老鼠。如果costaining进一步表明,C / EBPβ和Lox5升级Iba-1-positive小神经胶质细胞和神经元NeuN-positive广告在人类的大脑和大脑控制。此外,标志着人类C / EBPβ增强广告是伴随着大脑增强Lox5和AEP信号,两个下游转录目标(在线补充图12 c, D)。因此,人类微生物组增加广告广告病态和AA在移植ex-GF小鼠代谢酶,与炎症小胶质细胞的激活有关。
讨论
肠道微生物群中起着重要作用在外围以及中央各神经系统疾病的免疫激活和炎症。在当前的研究中,我们提供了证据表明,肠道微生物组需要广告病理学和认知缺陷小鼠模型在一个广告。在女友条件下,3×Tg老鼠显示减少的小胶质细胞的激活,老年斑和非功能性测试,而SPF动物空间记忆缺陷。RNAseq表明胰岛素信号异常改变和炎性通路是高SPF vs GF 3 xtg老鼠的大脑。此外,代谢组学分析人性化GF老鼠大脑,血清和粪便标识促炎信号升级和无数AA-related代谢物,与SCFAs减少有关。治疗PGE2-G,代谢物从AA菌株拟杆菌,恢复广告病态和小胶质激活GF老鼠SCFA的存在。这个发现提供了一个潜在的分子机制由肠脑轴。受损的人性化小鼠空间记忆移植广告微生物群与HC表明Aβτ过度和失调交互调节疾病进展。可以想象,这些临床前研究结果可能会被应用到人类和gene-microbiome交互可以提供洞察AD发病机制。
C / EBPβ是一个关键的球员在神经炎症基因表达的调节。42因此,我们发现它是小神经胶质细胞激活的大脑从SPF或广告病人粪便移植小鼠和升级mRNA转录暗示AA代谢的主要酶(图2和图7,(在线补充图4和在线补充图8)。这些发现与先前的报道是一致的,考克斯的表达和LOX5 ptg由C / EBPβ介导。使Ptges3编码胞质前列腺素E合成酶(cpg),Pgtes2编码微粒体PGES-2 (mPGES-2)、cpg和mPGES-2都是重要的网页将PGH2 PGE2。cpg优先与COX-1坐标转换PGH2 PGE2,虽然mPGES-2夫妇COX-1和cox - 2产生PGE2的炎症。46减少炎症和PGE2的女朋友老鼠的减少Hpgd和Pgtes3信使rna水平。虽然mPGES-2既定的组织中表达,而不是增加明显在组织炎症或损伤。47大概,因为PGE2水平低GF老鼠,Pgtes2可能增加反馈补偿(图3 d)。Alox12 gene-encoded酶及其反应产物调节血小板功能。这个基因表达升高一直在观察胰岛细胞来源于人类的糖尿病患者,48但其在大脑中所扮演的角色还不清楚。因此,它仍然未知是否由C / EBPβ与否。各种AA代谢物的酶升高导致upregulation包括PGE2、血栓素B2, LKB4和12-HHT等,刺激小胶质细胞激活的反馈,进一步升级的存在。此外,C / EBPβ调节许多炎性基因在神经胶质激活。49符合这些发现,PGE2-G SCFA治疗引发著名小胶质细胞激活和广告病态GF 3 xtg老鼠(图4)。因此,C / EBPβ之间存在恶性循环和酶介导炎性AA新陈代谢增强神经炎症。除了神经胶质细胞,C / EBPβ也作为一个关键的转录因子调节神经元的表达主要广告效应物包括应用,MAPT和AEP等。31日最近,我们报道,C / EBPβ/ AEP信号是年龄相关性在神经元和增强应用程序升级和随后τ蛋白裂解活性AEP,触发AD发病机制。31日35 50有趣的是,C / EBPβ不足提供神经保护缺血性或excitotoxic损伤后,51两个模型,cox - 2抑制是有益的。52 53据推测,C / EBPβ/ AEP信号激活肠道的5×时尚15或者SPF小鼠和GF的老鼠的大脑中人性化的广告粪便样本由促炎AA介导代谢物由于广告主题(肠道失调图2和图7)。
RNAseq SPF和GF老鼠大脑的分析,将揭示一些重要信号通路参与广告病态。例如,胰岛素/ igf - 1及其下游效应器pi3激酶/ Akt (PKB)和RAS /皇家空军/ MAP激酶等显着地改变SFP老鼠与GF老鼠(图3)。有趣的是,广告也被称为3型糖尿病(T3D)。广告显示患者低水平的胰岛素,红外,整体胰岛素信号在他们的大脑损伤。也有一个提高的机会发展中轻度认知障碍(MCI)、痴呆,或广告在T2D糖尿病(2型糖尿病)的个人。此外,广告显示进步的患者大脑胰岛素抵抗和胰岛素缺乏。37 382型糖尿病或肥胖动物模型显示认知障碍。与胰岛素感光剂代理或鼻内胰岛素治疗可以提高认知能力在动物模型和人类广告和MCI。54我们意识到它是不准确的画之间的平行广告与HC和GF与SPF小鼠。然而,胰岛素信号变化之间的3×Tg小鼠和野生型老鼠从先前的研究中已得到充分的研究。越来越多的证据显示的葡萄糖耐量障碍3×Tg老鼠,包括女性3×Tg老鼠显示葡萄糖耐量显著恶化,葡萄糖耐受不良和皮质淀粉样蛋白通路随着年龄增长而恶化。55慢性治疗胰岛素感光剂的改进的空间学习和减毒τhyperphosphorylation和神经炎症。56先前的研究表明,胰岛素信号和C / EBPβ相互调节。例如,胰岛素触发大量通过诱导C / EBPβ逆境应答基因的表达。57值得注意的是,C / EBPβ蕴涵在调停igf - 1和人体红外表达式通过绑定他们的推动者。58 59此外,C / EBPβIGF-II-mediated记忆的巩固和提高,是必不可少的60和PGE2移植通过激活C / EBPβigf - 1表达。61 62因此,这些观察结果支持肠道微生物群可能引发C / EBPβ/ AEP途径激活大脑中通过AA代谢物,导致异常胰岛素/广告鼠脑中igf - 1的信号。
代谢组学和高效液相色谱分析表明,AA通路的促炎的代谢物强烈增强大脑和粪便样本中SPF和GF老鼠和广告对HC粪便移植小鼠(我图4和5,(在线补充图7和11所示)。这些观察与先前的报道是一致的,AA, PGE2和LKB4等升高患者的粪便样本广告与高碳钢相比,广告和AA代谢水平升高小鼠模型22和广告病人的大脑。21 63值得注意的是,我们还发现细菌菌株拟杆菌与AA新陈代谢是高度增强的女朋友之前老鼠与人类广告粪便样本(图5汉英)。可以想象,肠道细菌代谢AA PGE2 (图5我),它可以进入循环系统由于肠道泄漏,引发肠道失调。代谢物可能渗透到大脑由于BBB障碍在3×Tg老鼠,刺激小胶质细胞激活和引发神经炎症。以前的报告还表明,肠道微生物群损害BBB的完整性,导致泄漏BBB和木糖醇渗透。64年
一些代谢组学研究检验新陈代谢和AD病理之间的关系。研究血清、血浆和脑脊液(CSF)发现了许多涉及胆汁酸的代谢途径,鞘脂类抗氧化剂、磷脂、氨基酸,似乎与疾病有关。65年许多研究与大脑组织样本来自转基因动物模型和人类显示改变神经递质,氨基酸和抗氧化剂与广告密切相关66年在广告和提高大脑聚胺代谢的大脑。67年有趣的是,多巴胺显著低于广告人性化ex-GF老鼠的大脑(在线补充图7 c和10 f),拟合与以前的报告,多巴胺是AD患者低。68年改变芳香族氨基酸代谢产物除了次级胆汁酸,维生素和苯甲酸酯代谢物表明微生物代谢状态的改变和/或微生物种群在广告中人性化ex-GF集团与HC人性化ex-GF集团,支持人类广告管理病人粪便改变了微生物在广告中人性化ex-GF组。戊糖糖代谢在肠道内的微生物提供碳和能源行动69年和戊糖代谢产物变化表明微生物代谢状态的改变和/或微生物种群内的广告人性化ex-GF集团与HC人性化ex-GF组。此外,糖酵解和三羧酸循环代谢产物的差异暗示改变的葡萄糖利用率,能源体内平衡和排泄。更高水平的脑磷脂加上降低血清LCFAs carnitine-conjugated脂质,并增加粪便PE脂质可能,建议改变脂质代谢在广告人性化广发集团(在线补充图10和11所示)。水平的提高鸟氨酸可以表明一氧化氮产量下降,这是由观察到更高水平的聚胺代谢物在血清(N-acetylputrescine)和粪便(N-carbamoylputrescine)广告人性化ex-GF集团与HC人性化ex-GF组。值得注意的是,有迹象显示肠道微生物新陈代谢的差异是明显的变化在以下类代谢物:芳香族氨基酸代谢产物、二次胆汁酸、维生素和苯甲酸。另外,碳水化合物和能量的代谢产物的差异,脂质代谢产物、精氨酸代谢产物和氧化应激代谢物。硫酸吲哚酚,有趣的是,从饮食色氨酸代谢产物选择性高的血清和的大脑AD-humanised ex-GF老鼠vs HC和SPF小鼠的大脑与HG老鼠(在线补充图7和10)。它扰乱了BBB的完整性,增加氧化应激和提升神经炎症诱导一氧化氮和cox - 2的升级,TNFα和胶质细胞il - 6。70年可以想象,它能促进炎症代谢产物如PGE2-G穿透大脑触发小胶质细胞的激活。
无疑,肠道细菌的机制促进Aβ或Tau-mediated病态可能复杂;在当前的报告中,我们发现了一个潜在的途径要求microbiota-dependent对小胶质细胞的影响。小胶质成熟和功能受损的双方都没有女朋友或微生物的ABX(抗生素)治疗的老鼠。71 72例如,小胶质细胞在女朋友和ABX-treated老鼠显示显著改变炎症基因表达谱影响他们的监视功能,是伴随着细胞形态改变。长期ABX治疗导致减少Aβ沉积和小胶质形态学改变男性而不是女性APP / PS1老鼠。73年在这里,我们表明,小神经胶质细胞显示不同形态与SPF小鼠相比,GF老鼠(图1外:我),表明小胶质细胞成熟GF小鼠受损,这与先前的发现是一致的。71年微生物再殖民化的女朋友小鼠AD病人粪便样本激活小胶质细胞与健康的捐赠者(相比图6 h-k)。SCFAs, microbiota-derived细菌发酵产品,调节小胶质细胞内稳态。71年AD患者肠道微生物群具有较低比例的关键butyrate-producing物种,如成员丁酸弧菌属和真细菌属。广告长老也显示了丁酸盐酶编码基因比健康长老没有痴呆。12因此,我们观察符合这些发现。SCFAs治疗升级GF老鼠的小胶质细胞的成熟与未经处理的小鼠相比,和添加PGE2-G代谢物进一步增加小胶质细胞激活(图4 j-l)。丁酸是一个重要的代谢产物,是首选结肠上皮细胞的能量来源,它有助于维护肠道屏障和具有免疫调节和抗炎作用。74年可以想象,缺乏抗炎butyrate-producing细菌广告肠道微生物群,结合高架炎症PGE2代谢物在大脑中,加法增加小胶质激活,导致慢性神经炎症。这随后激活C / EBPβ/ AEP途径,提升应用和τ表达水平和提高AEPδ-secretase活动,导致AD发病机制。
代的女朋友老鼠
3×Tg老鼠从杰克逊实验室订购(34830)。动物保健和处理进行根据国家卫生研究院动物保健指南和赫尔辛基宣言和埃默里大学医学院的指导方针。动物被随机分配到实验组。只有雌性小鼠被用于所有的实验。
GF B6; 129 - tg (APPSwe tauP301L) 1 lfaPsen1tm1Mpm/ Mmjax (3 xtg)生成与泰康利生物科学(美国纽约伦斯勒理工学院)。创建GF 3×Tg-AD老鼠,在泰康利生物科学,一个3×Tg通过体外受精胚胎被创造出来,然后移植到一个女朋友瑞士韦伯斯特鼠标。怀孕女友瑞士韦伯斯特老鼠运往埃默里大学在一个无菌转运体和转移到光电隔离器由埃默里无菌的动物维护核心(EGAC)。一群女朋友3×Tg小鼠建立了EGAC从这些小鼠的后代。女朋友的状态3×Tg老鼠证实了细菌16 s rDNA PCR试验与厌氧文化测试,由IDEXX BioAnalytics(美国密苏里州哥伦比亚),琼脂革兰氏染色法和电镀的粪便颗粒在血琼脂培养皿在有氧和无氧条件下孵化。所有的女朋友3×Tg老鼠被安置在单独的光电隔离器,直到30 -周的年龄。sterilisable GF chow饮食(Teklad全球19%的蛋白质挤压啮齿动物的饮食,2019年代,ENVIGO)包含脂肪酸含量较高(3.9%欧米珈- 3脂肪酸ω- 6%和0.4%)与SPF chow饮食(5053 * PicoLab啮齿动物的饮食20日,LabDiet)(2.17%欧米珈- 3脂肪酸ω- 6%和0.27%),这是考虑的潜在损失冲销的一步。
人类微生物组相关(协会)小鼠口服填喂法创造的人类微生物组样本GF 3 xtg老鼠。协会3×Tg老鼠住在Tecniplast IsoCage P-Bioexclusion系统的笼子里,直到30 -周的年龄。女朋友3×Tg老鼠补充SCFAs Bioexclusion系统中也有笼子,直到30 -周的年龄。处理中包含的老鼠bioexclusion笼子,笼子是饱和消毒剂和放置在一个无菌生物安全罩。手套和钳鼠标处理消毒消毒前打开笼子里。
人类的捐赠者和标准
人类的粪便样本的捐赠者慷慨地提供了约翰·p·哈兰博士和贝丝麦考密克。人类捐赠者选择标准是如前所述。12人类的粪便样本收集的养老院老人65岁,住在位于马萨诸塞州中部四个养老院设施之一。众长老一直住在那个工厂1月,没有任何的腹泻疾病或抗菌曝光前4周内。没有长老遭受吞咽困难或喂食管。任何长老与抗菌暴露或腹泻疾病研究的行为被排除在分析之外。样本的捐赠者的信息应用于本研究中所示在线补充表1。
Recolonisation GF动物与人类微生物
捐赠样本收到我们冻结在−80°C(收集后随着时间的推移和冷冻合作者),分配到~ 0.5 g部分。一个0.5 g部分resuspended在5毫升碳酸氢钠(5%)。女朋友3×Tg老鼠收到200 uL的粪便悬在4 - 5周的年龄,和殖民被允许发生。总共有8 - 10与每个捐赠者样品老鼠殖民地化。收件人老鼠被安置在单独的无菌笼和保留在生物安全立方体直到30 -周的年龄。
SCFAs治疗
SCFAs对待女朋友3×Tg老鼠提供饮用水含醋酸钠(67.5毫米;西格玛奥德里奇),丙酸钠(25毫米;西格玛奥德里奇)和丁酸钠(40毫米;西格玛奥德里奇)在5 - 6周的年龄开始直到30 -周。
PGE2-G治疗
PGE2-G(开曼的化学物质,10毫克/毫升)被带到室温之前使用和消毒1×PBS稀释1毫克/毫升。女朋友3×Tg老鼠收到IP立即注射稀释PGE2-G解决方案的剂量的5毫克/公斤4周每周两次。
Y-Maze行为测试
所有在国内实验老鼠笼放置在无菌生物安全罩测试室的SPF级动物设施前至少1小时测试在测试过程中压力的影响降到最低。之间的生物安全罩与Virkon彻底清洗试验。在测试期间,实验老鼠被放置在手臂年代面临远离中心和允许通过装置总段8分钟而被记录系统监控。立即试验开始和结束时定义的时间运行。得分由记录每个手臂条目(定义为所有四个爪子进入手臂)。得分进行了现场监测运动通过装置通过录音机屏幕。实验老鼠笼子回到家,许多粪便颗粒也被记录下来。竞技场审判之间Virkon打扫干净了。条目的总数不包括首先记录手臂(总是)。实验老鼠受到Y-maze行为测试30 -周的年龄。
三合会的数量=(总条目- 2)
*三元组(组三个字母)包含所有三个字母和交替得分
交替百分比=[(三合会的交替/总数)×100]。
疣状和小胶质细胞重建
Cryo-sections老鼠大脑处理3%的H2O210分钟,其次是三次洗在磷酸缓冲盐和30分钟RIA-BSA阻塞在1%,0.3% Triton x - 100一夜之间以及孵化与Iba-1抗体(1:200)和AEP抗体(b7 11日)(1:50 0)4℃。信号是用Histostain-SP开发工具包(表达载体)。检测Aβ的本地化,幻灯片是孵化Aβ抗体(1:200)4℃。检测本地化AT8和T22幻灯片与AT8孵化(1:200)T22 (1:700) 4℃。检测的本地化CEBP /β和AEP,幻灯片是孵化CEBP /β抗体(第7)(1:10 0),AEP抗体(D6S4H) (1:200) 4℃。检测AEP的本地化,AEP-derivedτ片段和磷酸化τ在老鼠大脑部分,幻灯片和AEP孵化抗体(b7 11日)(1:50 0),τN368(自制,1:1000)APPC586(自制,1:1000)在4℃。检测的本地化CEBP /β,LOX5, COX1, COX2、BLT1, BLT2,幻灯片是孵化CEBP /β抗体(第7)(1:10 0),LOX5抗体(1:200)COX1抗体(1:200),COX2抗体(1:200)BLT1抗体(1:200)和BLT2抗体(1:200)4℃。隔夜孵化后,幻灯片被洗了三次在PBS和孵化与德克萨斯Red-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白或FITC-conjugated anti-mouse免疫球蛋白在室温下1小时。幻灯片在磷酸盐缓冲盐水洗了三次,然后使用安装解决方案,覆盖着一个玻璃盖荧光显微镜下检查(奥林巴斯)。小胶质细胞重建,Z栈在1µm成像步骤,随后分析了使用伊万里瓷器软件。
Aβ菌斑染色
淀粉样斑块与Thioflavin-S染色。deparaffinised和水化部分0.25%高锰酸钾溶液中孵化了20分钟,在蒸馏水冲洗,和培养漂白溶液中含有2%的草酸和1%焦亚硫酸钾为2分钟。在蒸馏水冲洗后,部分被转移到屏蔽解决方案包含1%氢氧化钠和0.9%过氧化氢20分钟。5 s的部分被孵化0.25%酸性酸,然后在蒸馏水和染色洗5分钟Thioflavin-S 0.0125% 50%乙醇。部分用50%乙醇洗净,放在蒸馏水。然后满是玻璃盖的部分使用安装解决方案。
免疫印迹分析
小鼠脑组织细胞溶解在裂解缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4,40毫米氯化钠,1毫米EDTA,特里同x - 100 0.5%, 1.5毫米Na3签证官4焦磷酸钠,氟化钠50毫米,10毫米,10毫米钠β-glycerophosphate,补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒)和离心机在16 000克15分钟。上层清液煮在SDS加载缓冲区。sds - page后,样品被转移到硝化纤维膜。免疫印迹分析各种抗体。
AEP活动分析
组织匀浆或细胞溶解产物(10µg)在200年孵化µL反应缓冲区(Na2HPO4 20 mM柠檬酸,60毫米,1毫米EDTA, 0.1%和1毫米德勤的家伙们,pH值5.5)包含20µM AEP衬底Z-Ala-Ala-Asn-AMC (Bachem)。AMC发布的衬底乳沟是量化通过测量在460纳米荧光板读者在37°C在动力学模式。
核糖核酸测序分析
进行RNA提取使用miRNEAsy迷你包(试剂盒)和量化使用Ribogreen荧光协议于M200无限Pro (Tecan)。RNA是评估使用RNA质量6000纳米试剂2100生物分析仪(安捷伦)。RNA序列库准备进行使用NEBNext超RNA库准备包Illumina公司遵循制造商的建议(内)。测序库验证在安捷伦2100生物分析仪系统(安捷伦科技)和量化使用量子位2.0荧光计(英杰公司)以及qPCR(应用生物系统公司)。图书馆是测序的Illumina公司音序器使用2×150 Paired-End (PE)配置。(原始序列数据。基类库文件)被转化成fastq文件并使用Illumina公司bcl2fastq软件去复用。数据是一致的,正常使用星对准器。差异表达基因被DEseq2确认。基因通路分析与数据库进行注释,可视化和综合发现(KEGG和豹通路富集分析)。 We determined statistically significant differences in gene expression at the nominal level of significance (p<0.05). We also evaluated the effect of Benjamini-Hochberg correction on raw p-values to account for multiple hypothesis testing. The PANTHER (Protein Analysis THrough Evolutionary Relationships) Classification System was used to classify genes. PANTHER Classification System (http://PANTHERdb.org)75年应用分类明显表示DESeq检测到的基因分析。首先,运用基因id列表豹数据库中的记录进行分类基因导入功能组,提供生物信息功能和途径。接下来,黑豹统计结束,代表名额不足与log2褶皱变化进行了测试(log2FC)值和可用Entrez基因id。最后,它决定是否确定生物过程在统计学上)under-expressed。在线补充图5 d包含一个表显示褶皱浓缩和p值从黑豹通路富集分析。
协议为微生物群分析
DNA提取粪便样本(n = 5每组)小鼠使用PowerSoil装备从莫生物实验室(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。16 s rRNA基因扩增从每个示例使用一个复合菌进行基因-沃德底漆和反向引物包含一个独特的12 bp条码,通过戈利纠错方案进行设计,用来标记PCR产品各自的样本。我们引物用于paired-end 16 s社区测序Illumina公司平台上使用细菌/古底漆515 f / 806 r。引物是特定的V.4地区16 s rRNA基因。远期PCR引物序列的序列包含5′Illumina公司适配器,远期底漆,底漆转发链接器,正向引物序列。每个反向PCR引物序列包含的反补3′Illumina公司适配器,戈利条形码(每个序列包含不同的条形码),反向引物垫,反向引物链接器和反向引物。三个独立的每个样品进行PCR反应,结合,纯化AMPure磁珠(Agencourt)的净化。产品量化,大师DNA池产生的净化产品的克分子数相等的比率。使用一个合用的产品排序Illumina公司MiSeq测序平台。生物信息学分析使用定量微生物生态学的见解。 Sequences were assigned to OTUs with UPARSE using 97% pairwise identity and were classified taxonomically using theRibosomal Database Project classifier retrained with Greengenes. After chimaera removal, the average number of reads per sample was 21 511. A single representative sequence for each OTU was aligned using PyNAST, and a phylogenetic tree was then built using FastTree. The phylogenetic tree was used to compute the UniFrac distances. The PCoA analysis shown is unweighted.
肠commensal-specific qPCR
量化,微生物总DNA和普遍的细菌底漆集515 f - 806 r。量化特定细菌物种的丰度或属,我们使用了验证正向和反向引物16 s rRNA的特定基因。检测是通过使用一个快速SYBR绿色主人混合根据制造商的指示。以下逆转录聚合酶链反应(rt - PCR)协议之后:95°C 15分钟,40周期为15秒95°C, 66°C (bacteria-specific)和50°C(通用)40年代,30年代和72°C。融化曲线放大后进行区分目标和不属预定目标的PCR产物。所有的反应都是在重复执行。细菌丰度分析是基因组的等价物。qPCR分析,sample-specific相对大量的细菌被确定为基因组等价bacteria-specific底漆除以放大的基因组中放大了通用引物。绝对丰度每克粪便的决心通过调整稀释在DNA提取、正常化,qPCR设置和这个浓度除以总克粪便用于原始DNA提取。最后,数据被表示为一个折叠凳子的变化收集来自不同鼠标背景与WT老鼠的粪便。
体外厌氧细菌培养试验
B。fragilis(写明ATCC 25285), B。intestinalis341 (DSM17393 DSMZ)和B。xylanisolvensXB1A (DSM18836 DSMZ)在碎肉培养基培养(- 811,AnaerobeSystems)和孵化在37℃Bio-bag GasPak EZ气体生成容器系统(260001年,GasPak EZ W /指标,BD)。为AA代谢试验,上述细菌生长在培养基补充有或没有62.5µM AA。72小时后,从每个文化中收集的高效液相色谱分析或ELISA测定。
高效液相色谱定量分析的AA及其代谢物
固相萃取(SPE)样品制备:样本离心机15分钟在4000 rpm在4℃去除细菌和媒体丸。10毫升上层清液的收集和10µL甲酸和1毫升的甲醇添加媒体含有10%甲醇和甲酸1%。样本坐在冰至少15分钟,使蛋白质沉淀。样本离心机15分钟在4000转4℃过删除任何降雨。
至于控制媒体没有接种细菌,股票被添加到标准带来的标准浓度×50,X100 X1000股票的浓度。股票PGE2含量,AA, LTB4和12 hhtreµg 200 /毫升。250µg /毫升,2µg /毫升和2µg /毫升。使用SPE列中提取的化合物(热科学、CA)。列与2毫升的甲醇洗2毫升的H紧随其后2啊,10%甲醇和甲酸的1%。8毫升的样品或2毫升的控制中添加提取。应用样本后,列是用4毫升的10%甲醇洗净,和分析物被筛选了1毫升的甲醇。洗脱液的稀释与H 1:12O降低甲醇为高效液相色谱法测定50%。注射量是200µl和20µl。
AA及其代谢物、LTB4 12 hhtre, PGE2的高效液相色谱测定与光电二极管阵列autosampler 1525型二元泵和模型使用了2996光电二极管阵列检测器。分析物使用反相色谱分离水域Xbridge本·列(4.6×150毫米、5µM水域)和保护盒(3.9×5毫米,5µM水域)。分析物的识别是通过比较他们的保留时间和光谱资料已知标准。股票的解决方案在250年100%甲醇浓度µg AA /毫升,2µg /毫升LTB4和12 hhtre, 200µg /毫升PGE2,分别。工作标准溶液在50%甲醇。一系列稀释的标准准备50%甲醇标准曲线。
PGE2 ELISA
样本离心机15分钟在4000 rpm在4℃去除细菌和媒体丸。10毫升上层清液的收集和µl甲酸和1毫升的甲醇添加媒体含有10%甲醇和甲酸1%。样本坐在冰至少15分钟,使蛋白质沉淀。样本离心机15分钟在4000转4℃过删除任何降雨。分析了上层的PGE2酶联免疫试剂盒根据制造商的指示。PGE2的含量测定与标准曲线比较。
白三烯B4 ELISA
样本离心机15分钟在4000 rpm在4℃去除细菌和媒体丸。10毫升上层清液的收集和10µL甲酸和1毫升的甲醇添加媒体含有10%甲醇和甲酸1%。样本坐在冰至少15分钟,使蛋白质沉淀。样本离心机15分钟在4000转4℃过删除任何降雨。分析了上层清液LTB4酶联免疫试剂盒根据制造商的指示。的LTB4含量测定与标准曲线比较。
高尔基染色法
老鼠的大脑在10%福尔马林固定24小时,然后沉浸在黑暗中3%的重铬酸钾3天。解决方案是改变每一天。然后大脑被转移到2%硝酸银溶液和在黑暗中孵化24小时。Vibratome部分60µm被削减时,风干了10分钟,通过95%和100%乙醇脱水,二甲苯和cover-slipped清除。脊柱密度的测量,只有出现垂直于树突刺轴数。
AβELISA
8 x的老鼠的大脑被单一化的质量5 M盐酸胍/ 50毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值(8.0),并为3小时在室温下孵化。然后用冷反应样本稀释缓冲(磷酸缓冲盐Tween20 BSA为5%和0.03%,补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒),和离心机在16 000 g 20分钟4℃。分析了上层的人类Aβ40和Aβ42酶联免疫试剂盒根据制造商的指示。Aβ浓度测定与标准曲线比较。
促炎细胞因子ELISA
小鼠脑组织细胞溶解在裂解缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4,40毫米氯化钠,1毫米EDTA,特里同x - 100 0.5%, 1.5毫米Na3签证官4焦磷酸钠,氟化钠50毫米,10毫米,10毫米钠β-glycerophosphate,补充了蛋白酶抑制剂的鸡尾酒),离心机在16 000克15分钟。然后分析了上层清液il - 6, TNFα,IL-1β酶联免疫试剂盒根据制造商的指示。促炎细胞因子浓度测定与标准曲线比较。
统计分析
所有数据都表示为±SEM从三个或更多独立的实验中,两组之间的显著性水准评估学生的学习任务。两组以上,单向方差分析之后,LSD事后测试应用。值为p < 0.05被认为是具有统计学意义。
数据可用性声明
所有数据都包含在相关研究文章或上传在线补充信息。
伦理语句
病人同意出版
伦理批准
实验协议是动物保健和埃默里大学批准的机构伦理委员会(IACUC)。
确认
这项研究的部分支持由埃默里无菌的动物(EGAC),由埃默里大学医学院的补贴,是埃默里集成核心设施之一。提供额外的支持是啮齿动物行为核心(RBC),由埃默里大学医学院的补贴和埃默里是一个集成的核心设施;埃默里整合基因组学核心(EIGC),由埃默里大学医学院的补贴和埃默里是一个集成的核心设施;以及埃默里高效液相色谱分析的核心(EHBC),这是支持的药理学、埃默里大学医学院的。代谢组学分析粪便,血清和大脑样本广告和HC人性化ex-GF老鼠和GF和SPF 3 xtg老鼠的大脑是由该公司,Morrisville,美国北卡罗莱纳。
引用
脚注
CC和JL同样起到了推波助澜的作用。
贡献者肯塔基州负责整体内容作为担保人。肯塔基州和CC构思的项目,设计了实验,分析了数据,并写了手稿。CC,杰和YX设计和执行大部分的实验和分析数据。XL进行基因型和培育转基因老鼠。JH和BM人类粪便样本。RJ、TRS和AA辅助数据分析和解释和批判性阅读手稿。
资金这项工作是由国立卫生研究所的资助(RO1 AG065177)肯塔基州。提供了额外的支持格鲁吉亚临床与转化科学联盟下的美国国立卫生研究院的奖项数量UL1TR002378和埃默里ADRC格兰特P30 AG066511。
相互竞争的利益没有宣布。
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