条文本

原始研究
保护性和侵袭性细菌亚群和代谢产物在PSC小鼠模型中修饰肝胆炎症和纤维化
  1. Muyiwa Awoniyi12
  2. 杰里米·王23.
  3. 比利的非政府组织2
  4. 维克梅多斯4
  5. 杰森Tam5
  6. 安巴Viswanathan2
  7. Yunjia赖6
  8. 斯蒂芬妮·蒙哥马利7
  9. 摩根的农民2
  10. 马丁Kummen89
  11. 路易丝Thingholm10
  12. Christoph施拉姆11
  13. 科琳娜爆炸12
  14. 安德烈因特网12
  15. 库恩陆613
  16. 惠普周141516
  17. Jasmohan年代巴贾杰141516
  18. 菲利普·B Hylemon141516
  19. 珍妮Ting517
  20. 尤里·V波波夫18
  21. 约翰内斯Roksund共919
  22. 希瑟·L·弗朗西斯20.21
  23. 瑞安贝尔福裁缝125
  1. 1肠胃病与肝病科北卡罗来纳大学系统教堂山分校北卡罗莱纳美国
  2. 2胃肠生物学与疾病中心北卡罗来纳大学系统教堂山分校北卡罗莱纳美国
  3. 3.部门的遗传学北卡罗来纳大学系统教堂山分校北卡罗莱纳美国
  4. 4美国胃肠病学印第安纳大学医学院印第安纳波利斯印第安纳州美国
  5. 5微生物学与免疫学学系“,北卡罗来纳大学系统教堂山分校北卡罗莱纳美国
  6. 6全球公共卫生学院吉利斯学院环境科学与工程系北卡罗来纳大学系统教堂山分校北卡罗莱纳美国
  7. 7病理科,比较医学部,莱恩伯格综合癌症中心北卡罗来纳大学系统教堂山分校北卡罗莱纳美国
  8. 8挪威PSC研究中心奥斯陆大学医院奥斯陆、挪威
  9. 9临床医学研究所奥斯陆大学的奥斯陆、挪威
  10. 10临床分子生物学研究所Zentrums für Molekulare Biowissenschaften基尔石勒苏益格-荷尔斯泰因州、德国
  11. 11汉堡-埃彭多夫大学医学中心汉堡、德国
  12. 12临床分子生物学研究所Christian-Albrechts-University的基尔基尔、德国
  13. 13环境科学与工程系北卡罗来纳大学教堂山分校教堂山分校北卡罗莱纳美国
  14. 14微生物学与免疫学学系“,弗吉尼亚联邦大学医学院里士满维吉尼亚州美国
  15. 15部门的研究麦奎尔退伍军人事务医疗中心里士满维吉尼亚州美国
  16. 16弗吉尼亚联邦大学医学中心里士满维吉尼亚州美国
  17. 17北卡罗来纳大学莱因伯格综合癌症中心,转化免疫学中心北卡罗来纳大学教堂山分校教堂山分校北卡罗莱纳美国
  18. 18美国胃肠病学贝斯以色列女执事医疗中心/哈佛医学院波士顿麻萨诸塞州美国
  19. 19挪威PSC研究中心,移植医学系奥斯陆大学医院奥斯陆、挪威
  20. 20.印第安纳大学医学院印第安纳波利斯印第安纳州美国
  21. 21Richard L. Roudebush VA医疗中心印第安纳波利斯印第安纳州美国
  1. 对应到Ryan Balfour Sartor博士,美国北卡罗来纳大学系统胃肠生物学和疾病中心,北卡罗来纳州教堂山27517;ryan_balfour_sartor在}{med.unc.edu

摘要

客观的原发性硬化性胆管炎(PSC)和实验模型的菌群数据存在冲突。目的:通过研究无菌(GF)和抗生素治疗的特异性病原体无(SPF)多药耐药2缺陷(mdr2−−/)小鼠和PSC患者队列中的微生物图谱。

设计我们测量了体重、肝酶、RNA表达、组织学、免疫组化和纤维化生化参数、粪便16S rRNA基因谱和抗生素处理SPF的代谢组学终点mdr2−−/小鼠和PSC患者的靶向宏基因组分析。

结果女朋友mdr2−−/随着肝胆汁酸(BA)积累和胆汁淤积的增加,小鼠8周死亡率为100%。早期SPF自体粪便移植挽救了肝脏相关的死亡率。抑制回肠BA运输减弱抗生素加速的肝病,降低血清和肝脏总BA。万古霉素敏感菌群的缺失加重了肝胆疾病。万古霉素选择性地减少了螺旋菌科和短链脂肪酸(SCFAs),但增加了肠球菌和肠杆菌科。抗生素增加粪肠球菌而且大肠杆菌肝脏易位。殖民的女朋友mdr2−−/小鼠发生易位粪大肠而且大肠杆菌菌株加速肝胆炎症和死亡率。抗生素预处理的螺旋菌定植mdr2−−/小鼠减少了肝脏纤维化、炎症和病原体的易位,产生SCFA的Lachnospiraceae和纯化SCFA减少了纤维化。粪螺科负相关,和粪大肠/肠杆菌科通过Mayo风险评分,与PSC患者的临床严重程度呈正相关。

结论我们发现了新的功能保护和有害的居住细菌种类mdr2−−/小鼠与PSC患者具有相关的临床风险评分。这些发现可以指导对PSC患者进行个性化的靶向治疗干预。

  • 肠道微生物
  • 原发性硬化性胆管炎
  • 抗生素
  • 短链脂肪酸
  • 淤胆型肝炎

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关于这个问题,我们已经知道了什么?

  • 微生物改变与特发性原发性硬化性胆管炎(PSC)相关,但对驻留菌及其代谢物的功能活性和机制的认识有限。

  • 无菌小鼠和抗生素导致胆汁酸再吸收增加,提示微生物控制胆汁酸稳态。

  • 在临床和实验研究中,抗生素的保护和有害结果各不相同,但缺乏统一的机制解释。

新的发现是什么?

  • 无菌mdr2−−/PSC小鼠模型在8周时死亡率为100%,原因是由于毒性进展性肝脏和血浆胆汁积累缺乏微生物调节,除非在4周龄时用来自同基因特异性致病粪便的粪便菌群转移进行挽救,证实了该模型中驻留菌群的整体保护作用。

  • 抗生素诱导的特异性无病原体(SPF)生物异常mdr2−−/非细菌性肝易位加重肝胆疾病粪肠球菌而且大肠杆菌并导致加速有害的肝胆汁酸积累,而不改变回肠FXR信号。抑制回肠胆盐转运蛋白,Asbt,导致抗生素处理SPF的肝炎症和纤维化减弱mdr2−−/小鼠,验证微生物调节胆汁酸稳态。

新的发现是什么?

  • 抗生素诱导的SPF型mdr2−/−增强型肝胆疾病的生物异常和肝易位粪大肠而且大肠杆菌胆盐水解酶活性增加。

  • 在mdr2-−/−-小鼠中进行微生物操作和代谢组学分析,发现有肝保护作用的Lachnospiraceae可以抑制病原菌(粪大肠而且大肠杆菌)的肠肝转位,并通过产生短链脂肪酸介导其抗纤维化作用。

  • 在人类队列中,粪便粪大肠/肠杆菌科和螺旋菌科与PSC临床严重程度呈负相关(Mayo风险评分)。

在可预见的未来,它会对临床实践产生怎样的影响?

  • 这些微生物的见解有可能通过评估有害和保护居住微生物种群的丰度,更好地预测个体患者的临床疾病过程;通过匹配供体和受体的选择来改善PSC粪便移植的结果;并指导个性化治疗方法的选择性微生物操作。

简介

原发性硬化性胆管炎(PSC)的特征是慢性胆道炎症、肝硬化和肝衰竭的变化进展。1由于PSC发病和进展的机制尚不清楚,目前尚无阻止疾病进展的治疗方法。几项研究表明,PSC患者中微生物多样性降低,肠道病原体如肠杆菌科(大肠杆菌而且克雷伯氏菌肺炎),肠球菌(粪肠球菌)韦永氏球菌属和胆道粪大肠,与对照组相比,提示可能发生易位。2 - 5白细胞介素(IL)-17介导的粘膜免疫促进在PSC病理生理中发挥作用。2 - 7与此同时,PSC患者显示出推定具有保护作用的粪便Lachnospiraceae的丰度下降,4 8具有胆汁酸(BA)代谢活性和抗胆汁酸生成的特性9但不清楚肝胆功能影响。短期传统益生菌治疗(乳酸菌和双歧杆菌)10或单一供体粪便微生物转移(FMT)11对PSC患者无效,可能与这些细菌没有本地定植有关。3 4 8这些研究表明了微生物群与PSC的复杂性和强相关性,说明有必要进一步了解肠道微生物群的致病和保护作用。

临床前研究证明了未分离肠道菌群在实验性PSC中的保护作用。在两种化学诱导下12和基因(FVB / Nmdr2−−13在小鼠PSC模型中,无菌(GF)小鼠与常规饲养的对照组相比显示出加速的肝脏疾病。GF条件导致肠内BAs的大量再吸收,12强调了微生物调节BA稳态的重要性。微生物损耗增加肝脏非胶束BA浓度,导致胆管细胞炎症、导管破坏和实质疾病mdr2−−/老鼠。13 - 15PSC患者的生物异常导致BA池的改变,这可能有助于PSC的病理生理学。3 14此外,PSC患者胆汁中微生物胆盐水解酶(BSH)活性增加,3.可能与高BSH活性有关粪大肠,在PSC患者的粪便和胆汁中大量存在。3 4 16 17这些观察结果表明,PSC中细菌BSH活性具有潜在的致病作用。功能性微生物或代谢研究需要进一步阐明不同肠道细菌对PSC肝胆损伤、炎症和纤维化影响的机制差异。

在这项研究中,我们在特定的无病原体(SPF)中使用了gnotobiology和抗生素方法。mdr2−−/研究驻留菌在胆汁淤积性肝病中的功能作用。我们鉴定了功能性保护(Lachnospiraceae)和致病性(粪大肠而且大肠杆菌),并通过互补研究确定体内机制。在PSC患者粪便的宏基因组分析中发现,这些细菌相对丰度保守,与PSC患者的Mayo临床风险评分有中度关联,表明微生物在实验和临床疾病中的作用平行。这些见解可以在未来的PSC-FMT试验中针对供体选择,并指导选择性粪便富集/耗尽方法,以提高未来个性化微生物疗法的疗效。

方法

道德声明/畜牧业

Popov实验室生成C57Bl/6 SPF值mdr2 (abcb4−−/老鼠。18Mdr2−−/和WT - SPF对照C57BL/6小鼠分别饲养在不超过5只/笼的vivaria微隔离笼或GF - Trexlar隔离笼中。北卡罗来纳大学国家生物啮齿动物资源中心派生出GFmdr2−−/小鼠剖腹产。我们饲养的女朋友mdr2+ /−±小鼠由于早期死亡的GFmdr2−−/老鼠。年龄和性别匹配的小鼠不受限制地饮用高压灭菌水和5v0F Purina LabDiet食物,并进行12小时的明暗循环。人类微生物组数据分析了之前的一项研究。4

抗生素治疗

不禁食的3-4周龄雌雄小鼠,在饮用水中任意加入联合或单一抗生素(0.5 mg/mL万古霉素(Hospira), 1 mg/mL新霉素(meddisca)和50 mg/kg甲硝唑(G.D. Searle)),每日摄取量为6-7 mL/只/天。19日20用去离子化H稀释抗生素混合物2O,通过0.2 μ m过滤器灭菌,每周更换两次,持续7-14天。

患者和公众的参与

没有参与。

统计分析

小鼠数据以平均值±SEM表示,“n”表示图例中显示的小鼠数量。一个点代表一只老鼠。在GraphPad Prism中进行线性拟合和归一化。除非在图例中有特殊说明,两组之间的统计学显著性由未配对的双尾Student 's t检验确定;使用单因素方差分析和使用GraphPad Prism默认设置的Fisher’s LSD检验确定>2组之间的显著性。我们比较了泊松广义线性模型的CFU数,估计的马尔可夫链蒙特卡罗方法对小样本量稳健。误差条表示平均值±SEM, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, n.s.无显著性。进一步详细的组织学染色,IHC染色和分析,细菌或代谢物接种,培养和易位,生化,肝酶,代谢组学和16S rRNA测序/分析在在线补充材料和方法

结果

自体粪便移植可减轻无菌患者肝脏非微细胞BA积累、肝胆炎症、纤维化和死亡率mdr2−−/老鼠

为了评估该实验小鼠模型中驻留菌群的作用,我们生成了GF C57BL/6并对其进行了表征mdr2−−/与同窝C57BL/6 WT小鼠比较。相对于SPF条件,6-7周大的GFmdr2−−/小鼠体重增加减少,碱性磷酸酶(ALP)增加2×,总胆红素(TB)增加15× (图1 a - c).女朋友mdr2−−/断奶5周的小鼠肝脏组织学正常(数据未显示),TB正常(图1 c).GF中迅速出现胆汁淤积mdr2−−/发生在6周以后,在年龄匹配的SPF中没有发现mdr2−−/小鼠,在GF WT C57BL/6或更老的GFmdr2+ /−±(≤70周)(图1 c在线补充图S1A,D).微生物群的损失mdr2−−/>导致肝脏和血清BAs逐步增加3-5倍,与体重浪费和胆汁淤积损伤的生物标志物密切相关(图1汉英).大多数肝脏BA为1oBA(胆酸和胆酸,S1B-C)。女朋友mdr2−−/野生型(WT) C57BL/6小鼠肝脏BA升高,肝脏cyp7a1基因表达减弱(图1 e在线补充图S1H),尽管回肠ASBT、FXR或FGF15无差异(图1 g在线补充图S1E-G)与SPF对照进行比较。

Clinical, biochemical and liver histological indicators of germ-free (GF) mdr2−/− mice with or without faecal microbiotal transplant compared with control mice. Mouse body weight (A) and serum alkaline phosphatase (AP), (B) of 6–8 week old GF (n=6–10) and SPF (n=20) mdr2−/− mice. Longitudinal total bilirubin (TB) (C) or total serum bile acids (TBA) (D) assessment in GF mdr2−/− mice from 4–5 week old (n=7) to 6–8 week old (n=8), compared 6–8 week old SPF mdr2−/− and C57/BL6 WT GF mice and older (26–70 week old) mdr2+/− ±. Total liver bile acids (Bas) in mdr2−/− or WT mice in GF or SPF environments (E, n=5–9/mice per group). Liver cyp7a1 expression (F) and liver FGF-15 expression (G). Relative expression (fold change) of liver cyp7a1, terminal Ileal FGF-15, Rorγt and tnf-α (F–I) of 6–8 week old GF (n=5–7) and SPF (n=5–7) mdr2−/− mice. Hepatic collagen deposition expressed as total hepatic hydroxyproline (HYP) expressed in ug HYP/whole liver, calculated by multiplying individual liver weight with relative HYP content (J). Relative expression (fold change) of collagen I alpha-1 (col1α1) and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP) 1 (K–L) in livers of 6–8 week old GF (n=5–12) and SPF (n=5–8) mdr2−/− mice. Experimental design of autologous faecal microbiota transplant (FMT) study (M) Kaplan-Meyer survival curves of pooled SP mdr2−/ donor stool orally gavaged into GF mdr2−/− C57Bl/6 mice twice in the first 2 days at age 3–4 weeks (n=8) or 5.5–7 weeks (n=6) compared with untreated GF (n=23) or SPF (n=14) mdr2−/− mice monitored for survival for 42 weeks (N). Experimental design of GF mdr2−/− given autologous GF (n=7) or SPF donor (n=6) stool for 14 days (O) monitoring serum TB (P). Results are expressed as means±SEM. Survival data are analysed by log-rank (Mantel-Cox) test, group or pairwise comparisons performed by analysis of variance or Student’s t-test, respectively. Welch correction was applied to histological scoring analysis. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. SPF, specific pathogen free.
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
图1

无菌菌(GF)的临床、生化和肝脏组织学指标mdr2−−/接受或不接受粪便微生物移植的小鼠与对照组小鼠比较。小鼠体重(A)和血清碱性磷酸酶(AP), (B) 6-8周龄GF (n= 6-10)和SPF (n=20)mdr2−−/老鼠。GF中总胆红素(TB) (C)或总血清胆汁酸(TBA) (D)的纵向评估mdr2−−/4-5周龄(n=7)至6-8周龄(n=8)的小鼠,比较6-8周龄的SPF值mdr2−−/C57/BL6野生型GF小鼠及以上(26-70周龄)mdr2+ /−±。肝总胆汁酸(Bas)mdr2−−/或在GF或SPF环境下的WT小鼠(E, n= 5-9只/组)。肝脏cyp7a1表达(F)和肝脏FGF-15表达(G)。肝脏cyp7a1、回肠末端FGF-15、Rorγt和FGF-15的相对表达(倍变)肿瘤坏死因子-α6-8周龄的GF (n= 5-7)和SPF (n= 5-7)mdr2−−/老鼠。肝脏胶原蛋白沉积以总肝羟脯氨酸(HYP)表达,表达单位为ug /全肝,计算方法为单个肝脏重量乘以羟脯氨酸相对含量(J)。I型胶原α -1的相对表达量(倍变化)(col1α1)和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP) 1 (K-L)在6-8周龄GF (n= 5-12)和SPF (n= 5-8)的肝脏中mdr2−−/老鼠。自体粪便微生物群移植(FMT)的实验设计研究(M)合并SP的Kaplan-Meyer生存曲线mdr2−/供者大便经口灌胃GFmdr2−−/与未处理的GF (n=23)或SPF (n=14)相比,3-4周龄(n=8)或5.5-7周龄(n=6)的C57Bl/6小鼠在头2天内注射两次C57Bl/6小鼠mdr2−−/观察小鼠生存42周(N)mdr2−−/给予自体GF (n=7)或SPF供体(n=6)粪便14天(O)监测血清结核(P)。结果以均数±SEM表示。生存数据分析采用log-rank (Mantel-Cox)检验,组间或两两比较分别采用方差分析或Student 's t检验。组织学评分分析采用Welch校正法。*P<0.05, ** P< 0.01, *** P< 0.001, **** P< 0.0001。SPF级,无特定病原体。

女朋友mdr2−−/肝脏中IL-17/IL-22主调控因子、Rorγt和炎症细胞因子的RNA表达是否增加肿瘤坏死因子-α(图1 h,我).肝脏中胶原蛋白生化标志物羟脯氨酸含量增加mdr2−−/以及纤维原标志物的RNA表达,co1α1而且timp-1图1 j-l).女朋友和防晒系数mdr2−−/与WT对照相比,小鼠出现肝肿大(在线补充图S1F).

女朋友mdr2−−/与SPF组相比,小鼠存活率显著降低(中位死亡率7.5周和8周100%死亡率)mdr2−−/老鼠(图1 n).SPF的粪便移植(FMT)mdr2−−/粪便到3-4周大的GFmdr2−−/小鼠存活率提高(400天75%;图1 n)和结核病减少(图1 p)移植后2周。生命后期(5.5-7周)的FMT没有提供保护(图1 n).虽然兼具SPF和GF的女性mdr2−−/与雄性相比,小鼠的门脉周围炎症更为明显,GF的死亡率与性别无关mdr2−−/老鼠。FMT不影响GF的死亡率mdr2+/−,防晒系数mdr2−−/或WT小鼠(在线补充图S1J).

女朋友mdr2−−/小鼠显示门静脉周围炎症、导管周围巨噬细胞、小叶中心坏死和导管增生加重(图2A,B和E,F)和更明显的巨噬细胞(图2 c - d)比中性粒细胞(S1K-L)浸润比SPFmdr2−−/老鼠。防晒系数mdr2−−/与GF小鼠的导管周围定位相比,SPF供体fmt处理的GF小鼠显示出更明显的窦状巨噬细胞分布mdr2−−/有混合的表现型。明显的肝脏病变(图2A, E和G从有空泡性和囊性变性的肝细胞到被炎症包围的凝固性坏死。这些病变的原因尚不明显,但在胆道结扎中也有类似的病变报道21和antibiotic-induced淤胆型14研究认为是胆盐渗漏的结果,描述为胆汁梗死。在女朋友mdr2−−/老鼠。防晒系数mdr2−−/小鼠出现导管周纤维化,局灶性实质扩张mdr2−−/小鼠的组织学纤维化评分翻倍,广泛的导管周围纤维化很好地延伸到实质,并频繁连接到门静脉,类似3-4期Ishak纤维化模式(图2 g).早期FMT可减轻GF门静脉周围炎症和纤维化mdr2−−/老鼠(图2B及H).在GF或SPF WT组或对照组均未出现肝脏或回结肠组织学炎症mdr2+ /−±(数据未显示)。因此,早期生命暴露于GF的驻留菌群mdr2−−/促进小鼠生存,减少肝脏炎症,导管反应和纤维化。

图2

GF中驻留微生物的缺失和重建对组织学的影响mdr2−−/老鼠。6-8周龄GF的代表性显微照片mdr2−−/与年龄匹配的SPF值相比,3-4周龄小鼠±粪便菌群移植mdr2−−/肝炎症(A、B)、巨噬细胞(4-4/80免疫组化染色)(C、D)、导管反应(CK-19免疫组化染色)(E、F)、纤维化(G、H) H&E染色(200×)、F4/80抗体(200×)、CK-19抗体(200×)、天狼星红抗体(100×)盲分小鼠。箭头显示肝细胞变性和坏死灶,周围有炎症(胆汁梗死)。CK-19染色在D和F板计数阳性细胞在5个高功率场/幻灯片。结果以均数±SEM表示。组间比较或两两比较分别采用方差分析或学生t检验。组织学评分分析采用Welch校正法。*P<0.05, ** P< 0.01, *** P< 0.001, **** P< 0.0001。简历,中央静脉;PV,门静脉。

mdr2−−/小鼠的微生物环境异常,抗生素加剧了代谢途径的改变

SPF值内居民粪便微生物群落结构呈分化mdr2−−/WT小鼠β-多样性分析(图3一),推测保护性梭状芽胞杆菌家族的数量减少(图3 b).为了验证宿主菌群的保护作用,并确定潜在的有益菌群和代谢物,我们开发了SPF中的抗生素消耗模型mdr2−−/通过给小鼠服用广谱抗生素鸡尾酒(Abx),靶向革兰氏阳性、革兰氏阴性和厌氧菌19日20为期14天(图3 c).正如预测的那样,Abx同样消耗了微生物的丰度mdr2−−/用α-多样性和粪便qPCR (图3 d).β-多样性分析表明,两种寄主的微生物群落差异显著,Abx (图3 h,我).

Faecal microbiome and metabolite profiles of preantibiotic/postantibiotic treated mdr2−/− and wild-type (WT) mice on C57BL/6 background. Pooled baseline untreated SPF mdr2−/− and WT C57BL/6 16S sequencing faecal beta diversity (Permanova test) (A) and linear discriminant analysis plot showing differential enrichment of taxa (B). Experimental design of broad-spectrum antibiotic (Abx) study, 3–5 week old SPF mdr2−/− or WT mice exposed ad libitum to broad-spectrum antibiotics (metronidazole: 30 mg/mL; vancomycin: 0.5 mg/mL; and neomycin: 1 mg/mL) in drinking H2O or H2O alone (n=10 mice/group) for 14 days (pooled from three experiments) (C). Effect of 14 days of Abx assessing pooled baseline alpha diversity (Faith’s PD) and faecal universal 16S qCR (expressed in ΔΔCT differences) in mdr2−/− (D and E) and WT BL/6 (F and G) mice, respectively. Principal coordinates analysis (PcoA) plots assessing beta diversity (Permanova test) antibiotic exposure between genotypes (WT and mdr2−/− mice) (H) and antibiotic exposure in mdr2−/− mice (I). 3D-PCA plot shows the separation of cecal (J) and serum (K) metabolites from mdr2−/− with and without antibiotics. Mummichog pathway cloud plot of potential pathway differences with exposure of broad antibiotics in SPF mdr2−/− mice (L). The radius of each circle represents the number of metabolites relative to the number of metabolites represented by other circles. Darker circles mean more pathways are represented (mdr2−/− no Abx: n=13, mdr2−/− with Abx: n=25). Group or pairwise comparisons performed by analysis of variance or Student’s t-test, respectively. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. SPF, specific pathogen free.
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
图3

抗生素前/抗生素后处理的粪便微生物组和代谢物概况mdr2−−/和野生型(WT)小鼠的C57BL/6背景。合并基线未处理SPF值mdr2−−/WT C57BL/6 16S测序粪便beta多样性(Permanova检验)(A)和显示类群差异富集的线性判别分析图(B)。广谱抗生素(Abx)研究的实验设计,3-5周龄SPFmdr2−−/或WT小鼠自由暴露于广谱抗生素(甲硝唑:30 mg/mL;万古霉素:0.5毫克/毫升;新霉素:1 mg/mL)2O或H214天的Abx评估合并基线alpha多样性(Faith’s PD)和粪便通用16S qCR(表示为ΔΔCT差异)的效果(C)mdr2−−/(D、E)和WT BL/6 (F、G)小鼠。主坐标分析(PcoA)图评估beta多样性(Permanova检验)在基因型(WT和mdr2−−/小鼠)(H)和抗生素暴露mdr2−−/3D-PCA图显示盲肠(J)和血清(K)代谢物的分离mdr2−−/使用或不使用抗生素。Mummichog途径云图显示了SPF中广泛抗生素暴露的潜在途径差异mdr2−−/小鼠(L)。每个圆的半径表示代谢物的数量相对于其他圆所代表的代谢物的数量。深色的圆圈表示有更多的路径(mdr2−−/没有Abx: n = 13,mdr2−−/Abx: n = 25)。分别用方差分析或学生t检验进行组间或两两比较。*P<0.05, ** P< 0.01, *** P< 0.001, **** P< 0.0001。SPF级,无特定病原体。

确定潜在的代谢谱,反映保护性微生物作用mdr2−−/我们分析了abx处理和未处理小鼠的血清和盲肠内容物的代谢组mdr2−−/用液相色谱-质谱联用(LC/MS) (图3 j-l).Abx减少了多种化合物,跨越BA、醇、吲哚、氧甾体、胆红素和甲基支化脂肪酸途径(图3 l).我们使用这些代谢组学图谱来确定保护性候选细菌的推定功能特性,梭状芽胞杆菌科和拉克诺螺旋菌科可能挽救由保护性微生物亚群Abx耗尽引起的炎症/纤维化。

抗生素消耗的常驻菌群增加肠通透性,肝脏炎症,胆管上皮反应性和纤维化,并限制体重增加mdr2−−/老鼠

Abx明显减少推定的保护性梭状芽孢杆菌科和螺旋菌科(图4 b)和增加肠通透性(图4 c).减肥的mdr2−−/小鼠将Abx治疗限制在14天(图4 d)伴有血清碱性磷酸酶升高和临床疾病(嗜睡、驼背、毛发蓬乱和腹膜黄疸),血清胆红素轻微升高(图4 e, F),在Abx-WT小鼠中未见(在线补充图m1 - o).就像女朋友mdr2−−/abx诱导的小鼠肝脏炎症加重肿瘤坏死因子-α表达(图4 g).abx处理后的组织学评价mdr2−−/表现出类似于GF的加速胆管病变损伤mdr2−−/门脉/胆周炎症扩大及导管反应的小鼠(图4 k - n).

" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
图4

广谱抗生素治疗的临床、生化和肝脏组织学指标mdr2−−/老鼠。实验设计广谱抗生素(Abx)研究,SPF值为3-5周龄mdr2−−/小鼠随意接触广谱抗生素饮用H2O (n=15)或H2(A)。Abx暴露对各种结果的影响,包括所选细菌门的相对丰度,以未经调整的原始平均操作分类单位(OTU)相对丰度(B)表示,结肠/TI渗透率(WT和mdr2−−/小鼠)(C), 14天体重变化(D),血清ALP、TB (E、F),肝脏RNA表达肿瘤坏死因子-α(G),col1α1(我),timp-1 (J)和肝脏胶原沉积表达为ug HYP/全肝(H)。未处理(n=15)和abx处理(n=15)的小鼠肝脏的代表性显微照片和盲目复合组织学评分,H&E (K-L), CK-19 (M-N)和天狼星红(O-P)染色mdr2−−/老鼠(n = 15)。结果以均数±SEM表示。生物化学和分子研究用学生t检验进行两两比较;组织学评分分析采用Welch校正法。细菌组的未经调整的原始平均OTU相对丰度和SEs相对于通过微生物组成分析检测到的具有显著影响的变量)。* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001。高山,碱性磷酸酶;SPF级,无特异性病原体;结核病,总胆红素。

Abx-treatedmdr2−−/与未经SPF处理的小鼠相比,小鼠的桥性纤维化增加mdr2−−/老鼠(图4 o-p).羟脯氨酸含量不变(图4 h)可能是由于研究持续时间短,但肝RNA表达增加co1α1而且timp-1发生在Abx-treatedmdr2−−/小鼠与未经治疗的对照组(图4 i, J).Abx的消耗验证了我们的GFmdr2−−/结果证实,在这种胆汁淤积模型中,保护性驻留菌的减少增强了疾病。

抗生素治疗后,回肠BA转运抑制减弱肝脏BA池大小和肝胆炎症/胆汁淤积mdr2−−/老鼠

为了测试干预机制,我们确定了加速肝胆炎症/纤维化的Abx治疗的最短持续时间,但为微生物转移实验保持了2周的实验窗口。有趣的是,较短的7天治疗增强了肝脏炎症和ALP升高(在线补充图S2B、C)与14天治疗相比,没有显著改变纤维化评分(在线补充图S2D,E).

为了进一步研究该模型中微生物介导的BA池大小改变和肝胆疾病的作用,我们在加速抗生素模型中确定了一种根尖钠依赖性胆汁酸抑制剂(ASBTi)的作用(图5一个).ASBTi恢复了与年龄相符的体重增加,并减轻了胆汁淤积、炎症和纤维化(图5B,C和G,H在线补充图S2F).Abx增加血清TBA肝分流,与GF小鼠一样,被ASBTi (图5 d).预测的asbti诱导的粪便BA增加持续了2周的治疗(图5我).代偿诱导cyp7a1代谢物,肝脏C4 (图5 e, F),支持肝脏BA池呈下降趋势。此外,我们发现粪便中初级不结合BAs(胆酸(CA)和胆酸(MCA)增加(图5 i (k).这些研究表明,在易感小鼠中,驻菌耗损增加了非微细胞BA的肝胆毒性,这是由肠肝BA转运介导的。

图5

评估Abx治疗组胆汁酸稳态和肝胆损伤mdr2−−/小鼠ASBT阻塞。饮用H随意暴露实验设计2O ASBT抑制剂(GSK23306, 10 mg/kg) 14天与7天广泛的抗生素预处理在4-5周龄SPFmdr2−−/(A). ASBT抑制对体重变化(B)、TB (C)、血清和肝脏总BA (D-E)、肝脏C4 (F, Cyp7a1激活代谢产物)、组织性肝炎症和纤维化(G和H)的影响。评估开始ASBT抑制后0、7和14天的粪胆汁酸稳态,评估TBA、胆酸(CA)和α+β MCA (I-K)。分别用方差分析或学生t检验进行组间或两两比较。*P<0.05, ** P< 0.01, *** P< 0.001, **** P< 0.0001。根尖钠依赖性胆汁酸抑制剂ASBTi;SPF级,无特异性病原体;结核病,总胆红素。

选择性抗生素对mdr2−−/肝胆管的疾病

确定负责保护的微生物种群mdr2−−/我们测试了个别Abx成分:万古霉素、新霉素和甲硝唑,分别针对革兰氏阳性、革兰氏阴性和厌氧菌(图6).万古霉素最显著地降低了粪便细菌α-多样性(图6 b)并保持了与未处理对照组最大的β-多样性分离的最多样化的细菌种群(图6 c).万古霉素和甲硝唑降低了假定的保护性梭状芽胞杆菌科,但只有万古霉素减弱了螺旋菌科。新霉素对这两个家族均无显著影响(图6 d).万古霉素治疗不影响血清总BA水平(图6克),类似于Abx,但体重增加受限,血清ALP、肝脏TNF-α表达升高,组织学炎症和导管反应(图6E,F和H-J).

Differential effects of selective antibiotics on mdr2−/− microbial, clinical, biochemical and histological outcomes. Experimental design of selective antibiotic treatment (A): SPF mdr2−/− mice were given individual antibiotics (vancomycin (V; 0.5 mg/mL, n=16), neomycin (N; 1 mg/mL, n=12) or metronidazole (M; 30 mg/mL, n=16) in autoclaved drinking water ad libitum and control mdr2−/− mice received autoclaved water alone (n=16) for 14 days. Alpha diversity, beta diversity (Permanova test) and differential abundance (centred log-ratio (CLR) transformation from CoDA methods) of Clostridiaceae and Lachnospiraceae from 14d faecal samples (B–D). Measured parameters include: 14-day weight change (E), serum ALP (F) and serumtotal bile acids (TBA) (G), and liver RNA expression of tnf-α (H); along with blinded composite histologic scoring murine liver stained with H&E (I) and CK-19 (J). Fibrosis readouts include hepatic collagen deposition (K), RNA expression of col1α1 (L) and timp-1 (M) along with Sirius Red composite staining (N) cyp7a1 liver expression (O) as well as pooled cecal content bile acids (BAs) differences in surrogate bile salt hydrolase activity indicator based on ratios of total unconjugated/conjugated BA (P) and total BA (R) of selective antibiotic treated mdr2−/− compared with H2O control. (V=9, N=8, M=8, H2O=8). CK-19+ represented of 5HPF/liver/mouse. Group or pairwise comparisons performed by analysis of variance or Student’s t-test, respectively. Welch correction was applied to histological scoring analysis. Unadjusted raw average OTU relative abundance and SEs of bacterial groups against the variables detected with significant effects by analysis of composition of microbes. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. ALP, alkaline phosphatase; SPF, specific pathogen free.
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
图6

选择性抗生素的差异效应mdr2−−/微生物,临床,生化和组织学结果。选择性抗生素治疗实验设计(A): SPFmdr2−−/给小鼠服用个别抗生素(万古霉素(V;0.5 mg/mL, n=16),新霉素(n;1 mg/mL, n=12)或甲硝唑(M;30 mg/mL, n=16)mdr2−−/小鼠单独接受蒸压水处理14天(n=16)。梭状芽孢杆菌科(Clostridiaceae)和拉克诺螺旋菌科(Lachnospiraceae) 14d粪便样本的α多样性、β多样性(Permanova检验)和差异丰度(CoDA方法的中心对数比(CLR)转换)(B-D)。测量参数包括:14天体重变化(E),血清ALP (F)和血清总胆汁酸(TBA) (G),肝RNA表达肿瘤坏死因子-α(H);以及用H&E (I)和CK-19 (J)染色的小鼠肝脏的盲法复合组织学评分。纤维化读数包括肝脏胶原沉积(K), RNA表达col1α1(左)和timp-1 (M)和天狼星红复合染色(N)cyp7a1基于选择性抗生素的总非偶联/偶联BA (P)和总BA (R)比值的替代胆汁酸水解酶活性指标的肝脏表达(O)和盲肠总含量胆汁酸(BAs)差异mdr2−−/相比之下,H2O控制。(v =9, n =8, m =8, h2O = 8)。CK-19+代表5HPF/肝脏/小鼠。分别用方差分析或学生t检验进行组间或两两比较。组织学评分分析采用Welch校正法。细菌组的未经调整的原始平均OTU相对丰度和SEs相对于微生物组成分析中检测到的具有显著影响的变量。*P<0.05, ** P< 0.01, *** P< 0.001, **** P< 0.0001。高山,碱性磷酸酶;SPF级,无特定病原体。

在肝胆损伤和炎症的同时,万古霉素加重了肝纤维化。相对于对照组小鼠,只有万古霉素显著增加组织学肝纤维化评分(图6 n),肝profibroticco1α1而且timp-1表达式(图6 l, M)而不是肝脏羟脯氨酸(图6 k).

选择性Abx对BA代谢的研究表明,分离的甲硝唑减弱肝cyp7a1在防晒系数表达式mdr2/−老鼠(图6 o).万古霉素显著增加BSH活性,通过未共轭BA /共轭BA比值(图6 p),尽管没有改变与对照组相比的总粪便残留量(图6 r).这些结果表明,万古霉素敏感菌群的减少,包括梭状芽胞杆菌科和拉克诺螺旋菌科,导致严重的肝胆反应。

给药可减弱抗生素处理SPF的表型效应mdr2−−/并抑制小鼠肝脏细菌易位

我们在加速的7d Abx模型(在线补充图S2A-E).因为Abx耗尽了保护粪便的梭状芽胞杆菌簇IV和XIVa22日23日在SPF WT和mdr2−−/老鼠(在线补充图S2K,L),我们最初测试了一个17株保护性人类梭状芽胞杆菌联合体。22尽管这些梭状芽孢杆菌菌株对多种结肠炎模型有效,22它们都是抗生素预处理过的mdr2−−/小鼠没有改变体重或肝酶(在线补充图S2M-P).因此,我们评估了被Abx和万古霉素(图6 d).保护性结肠23株Lachnospiraceae菌群的串行治疗24图7)恢复体重增加,减少组织性肝炎症、导管反应和纤维化(图7B和E-G)但并没有减少血清生化(图7 c在线补充图S2Q).Lachno暴露对粪便和血清总BA、肝脏cyp7a1和回肠FGF15基因表达的影响最小(在线补充图S2R-U).GF中毛螺旋科植物的重组mdr2−−/与非定植的GF相比,小鼠的肝纤维化减少,不影响死亡率或肝脏炎症mdr2−−/老鼠(在线补充图S3F-H).

Lachnospiraceae phenotypic and metabolic effects on dysbiosis in mdr2−/− mice. Using the 7-day broad-spectrum antibiotic pretreatment model, followed by a 1-day washout, 21 Lachnospiraceae strains (Lachno) versus H2O were administered to SPF mdr2−/− mice on days 8, 10 and 12 (A). Changes following Lachno treatment included Δweight over 7 days (B), serum ALP (C), liver RNA col1α1 expression (D), blinded histological inflammation, ductal reaction and hepatic fibrosis scoring (E–G). Differential abundance expression of 16S rRNA analysis (H) (N, mdr2−/− untreated=24, Abx=36, H2O=11, Lachnospiraceae=13, pooled from two experiments. Presence of universal 16S, Enterococcus and Klebsiella pneumoniae (K. pneum) faecal DNA by qPCR (I–K) (one of two representative experiment, n=6 mice/group). Hepatic bacterial translocation (L), % of mice with Enterococcus faecalis liver translocation (M). Experimental design of treatment of 3–4 week old SPF mdr2−/− mice treated with broad-spectrum antibiotic cocktail (vancomycin, neomycin and metronidazole) for 7 days followed by a 1-day washout, then inoculated with mdr2/− resident Ec/Ef isolates, versus Ec/Ef+23-Lachno combination or water only controls (N) assessing translocated bacteria cultured from homogenised liver (O) (n=4 mice/group). Experiment design (P) and Kaplan-Meyer survival curves (Q) of orally inoculated 108 pooled Ec/Ef hepatic isolates±Lachnospiraceae (Lachno) or H2O controls in GF mdr2−/−mice (H2O: n=12; Ec/Ef: n=7; Lachno: n=6). GF mdr2−/− mice were administered 108 pooled Ec/Ef hepatic isolates and euthanized at 5 weeks in order to measure translocated bacteria to liver, spleen or blood (S–U). Longitudinal measurements of serum TBA and bilirubin conducted in GF mdr2−/−±Ec/Ef hepatic isolates (V and W). Group or pairwise comparisons performed by analysis of variance or Student’s t-test, respectively. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. GF, germ free; SPF, specific pathogen free.
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
图7

山螺科植物表型和代谢对植物失调的影响mdr2−−/老鼠。使用7天广谱抗生素预处理模型,然后1天洗脱,21株Lachnospiraceae菌株与H2O给SPFmdr2−−/Lachno治疗后的变化包括7天内Δweight (B)、血清ALP (C)、肝脏RNA col1α1表达(D)、盲目组织炎症、导管反应和肝纤维化评分(E-G)。16S rRNA分析差异丰度表达(H) (N,mdr2−−/Abx = 36治疗= 24日,H2O=11, Lachnospiraceae=13,来自两个实验。普遍存在16S,肠球菌和肺炎克雷伯菌k . pneum)粪便DNA的qPCR (I-K)(两个代表性实验之一,n=6只/组)。肝脏细菌易位(L), %的小鼠粪肠球菌肝易位(M). 3-4周龄SPF的治疗实验设计mdr2−−/小鼠用广谱抗生素鸡尾酒(万古霉素,新霉素和甲硝唑)治疗7天,然后1天洗脱,然后接种mdr2/−居民Ec /英孚隔离,而Ec /英孚+23-Lachno组合或仅水对照(N)评估从均质肝(O)培养的易位细菌(N =4只/组)。实验设计(P)和Kaplan-Meyer生存曲线(Q)8Ec /英孚肝分离株±Lachnospiraceae (Lachno)或H2GF中的O控制mdr2−−/老鼠(H2O, n = 12;Ec /英孚: n = 7;Lachno: n = 6)。女朋友mdr2−−/小鼠被注射108Ec /英孚5周后进行肝脏分离和安乐死,以测量转移到肝脏、脾脏或血液的细菌(S-U)。在GF中进行血清TBA和胆红素的纵向测定mdr2−−/±Ec /英孚肝分离物(V和W)。分别通过方差分析或Student 's t检验进行组间或两两比较。*P<0.05, ** P< 0.01, *** P< 0.001, **** P< 0.0001。女朋友,无菌;SPF级,无特定病原体。

用扩大的瘤胃球菌科、肠杆菌科和肠球菌(图7 h).补充Lachno类似于abx前状态,与对照组相比,肠球菌的扩张尤其受到抑制(图7 h),经粪便样本qPCR证实(图7 i, J).Lachno治疗没有减少粪便肺炎克雷伯菌2图7 k).重要的是,Lachnospiraceae治疗减少了abx后可培养的肝易位细菌(图7 l).Sanger测序鉴定迁移菌株为粪大肠(英孚),大肠杆菌(Ec),英孚abx处理的SPF中有60%的易位蛋白mdr2−−/老鼠(图7米);所有肝英孚分离株表达胞溶素(在线补充图S3A-D).25

抗生素增加肝易位粪大肠而且大肠杆菌在没有败血症的情况下,这会加速死亡率

更直接地评估肝脏变化所引起的英孚的nd电子商务3-4周龄spf -抗生素预处理或GFmdr2−−/小鼠定植选定的Ec /英孚肝分离株或H2O及在五周龄时实施安乐死(图7 n).肝转移Ec /英孚在抗生素预处理和免疫条件下分离(图7O和S)和未经治疗的对照。Lachno治疗预防Ec /英孚肝脏易位(图5啊),英孚粪便浓度(图7J和H).我们评估了这些细菌在gnotobio中的致死率mdr2−−/小鼠口服接种Ec /英孚含/不含Lachno (图7 p, Q).的Ec /英孚与对照组相比,双相关小鼠表现出更早的死亡率(图7问),但与对照GF相比,Lachno共殖组存活率提高mdr2−−/老鼠。Ec /英孚隔离殖民的女朋友mdr2−−/小鼠无菌血症或脾脏易位的证据(图7 t, U).此外,Ec /英孚双关联加速血清BA分流和相关的胆汁淤积mdr2−−/老鼠(图7 v, W).这些结果表明Ec /英孚易位诱导肝胆损伤和死亡,由独立于败血症和全身细菌播散的机制驱动,而Lachnospiraceae可保护其Ec /英孚肝脏易位与死亡率。

短链脂肪酸(SCFAs)是一种具有抗肝纤维化作用的植物

我们假设这些抗炎和抗纤维化作用是由螺旋菌科的代谢产物介导的,包括被选择性抗生素消耗的SCFAs (图8 b).万古霉素最有效地减少SCFA (图8 b),表明对万古霉素敏感的驻留菌(如乳酸菌科)是主要的SCFA生产者。口服补充SCFAs(乙酸,丙酸和丁酸)在万古霉素治疗mdr2−−/小鼠肝纤维化减弱(图8 d).将23株产SCFA变化的Lachno菌株分为3株产SCFA相对较低(8,9和21-lo)或较高(52,60和70-hi)的菌株(图8 h,我).我们将产生Hi或Lo scfa的Lachno连续灌胃给SPFmdr2−−/接受抗生素预处理和冲洗的小鼠(图8我).Hi scfa - Lachno减毒组织学肝纤维化(图8 j)而不是肝脏炎症(图8 k)与生产Lo scfa的Lachno相比。这些结果提供了一种我们的螺旋菌科群落的保护机制。

图8

短链脂肪酸(SCFAs)对mdr2−−/抗生素的模型。试验设计14天选择性抗生素治疗(A)与测量盲肠含量SCFA在SPFmdr2−−/(B). SPF值的设计mdr2−−/使用万古霉素(0.5 mg/mL饮用水,n=10)和或不加SCFA (67.5 mM醋酸酯,25.9 mM丙酸,40 mM丁酸和3%蔗糖,n=13)处理的小鼠,自由(C),从两个实验中收集万古霉素与万古霉素+SCFA SPF的代表性Sirius Red显微镜照片mdr2−−/小鼠,箭头突出桥接纤维化(D),盲目组织学纤维化评分(E)以及肝RNA col1α1和timp1表达式(做减法)。三种产scfa相对较低和较高的菌株(Lo品系:8、9和21;用质谱法对21株联合菌株中筛选的拉克诺螺旋体科菌株进行了鉴定(H)。SPF抗菌药物加速预处理实验设计mdr2−−/在第8、9和10天灌胃产生Hi或Lo scfa的拉赫螺旋菌菌株,然后随访6天(I),测量Hi与产生Lo scfa的菌株的组织学肝纤维化(J)和炎症(K)。分别用方差分析或学生t检验进行组间或两两比较。*P<0.05, ** P< 0.01, *** P< 0.001, **** P< 0.0001。

粪大肠和Lachnospiraceae与不同的PSC临床疾病活性相关

来自多国仓库(挪威和德国)的宏基因组数据分析4对PSC粪便样本进行了富集粪大肠和肠杆菌科(图9 a, B)及山螺科植物的减少(图9 c)与健康对照组比较。这两个粪大肠(种)和肠杆菌科(科)与PSC患者的Mayo风险评分呈正相关(n=51, rho均为0.28,p<0.05), Lachnospiraceae Blautia(属),Lachnospiraceae细菌1 _4_56faa与Mayo风险评分呈负相关(rho= - 0.34, p<0.05),仅在家庭水平有趋势(rho - 0.2)。粪大肠PSC患者比对照组更常见(17% vs 5%) (图9 d),在过去6个月接受抗生素治疗的患者中扩增(图9 d).与未使用抗生素的患者相比,使用抗生素患者的肠杆菌科有增加和减少的趋势。这些临床结果反映了我们的观察mdr2−−/为我们的小鼠实验结果提供了临床相关性。

图9

PSC患者的选择性粪便细菌分布和抗生素接触的影响。相对丰富的粪便粪肠球菌粪大肠) (A)、肠杆菌科(B)和Lachnospiraceae (C)在健康对照组(hc;n=158)与PSC患者(n=136)比较。(D)粪便的流行粪大肠与过去6个月暴露于抗生素(n=24)和未暴露于抗生素(n=112)的PSC患者相比,HC(无论抗生素使用情况)的差异显著。图A-C部分数据与Mann-Whitney U检验比较,(D)与Fisher精确检验比较。图解总结了抗生素诱导的SPF菌群失调的效果mdr2−−/小鼠肝易位增强肝胆疾病粪大肠而且大肠杆菌,增加胆盐水解酶活性(共轭/非共轭BA),肝胆汁酸池大小,减少SCFA产量(E)。*P<0.05, ** P< 0.01, *** P< 0.001, **** P< 0.0001。英航,胆汁酸;PSC,原发性硬化性胆管炎;短链脂肪酸。

讨论

我们发现了驻留腔内细菌的功能亚群,它们可以增强肝脏炎症和纤维化(粪大肠而且大肠杆菌)或通过不同的机制(图7 e).我们证实了GF对常驻菌群的整体保护作用mdr2−−/老鼠14日26日27日在更具侵袭性的遗传背景下(C57BL/6)。28我们观察到GF的早期死亡和严重的胆汁淤积mdr2−−/小鼠(中位生存期:7.5周)由微生物介导的毒性非微细胞胆盐的肝脏积累损失驱动,12 29 30刺激强大的肝胆巨噬细胞募集,炎症,导管反应和纤维化。ASBTi治疗可支持进行性肝脏BA积累诱导的毒性胆管病,导致粪便BA损失、血清TBA减弱、改善胆汁淤积性肝脏和独立于回肠FGF-15表达的临床终点mdr2−−/抗生素预处理模型。早期(<5周)而非后期(>6周)自体SPF FMT挽救了这种致命表型和胆汁郁积,证实了SPF的强大保护作用mdr2−−/短治疗窗口内的菌群。有效的微生物介导保护的治疗窗口期很短,这排除了可能需要较长时间的微生物植入来介导下游事件,并要求在早期炎症阶段进行干预。这些临床前研究意味着需要进行早期临床微生物治疗干预。

我们使用广谱和选择性抗生素治疗来验证宿主菌群的保护作用,更重要的是,通过鸟枪粪便宏基因组学和代谢组学分析来描述该模型系统中功能性治疗性和有害性微生物亚群。我们将保护性微生物群落缩小到对万古霉素敏感的群体和代谢物:9Clostridaeceae,22英航和短链脂肪酸。用人梭状芽胞杆菌菌群在结肠炎模型中选择性定植GF和衰竭小鼠具有保护作用22在我们的模型中没有给予保护。然而,一个螺旋菌科的财团24在未改变粪便总BA或FXR/Cyp7a1信号的情况下,抗生素预处理小鼠的肝炎症和纤维化减弱,提示有其他非BA机制。在我们的万古霉素- lachnospiraceae耗损SPF模型中,直接补充scfasa降低了肝纤维化的发生。高scfa产生菌株的抗纤维形成作用表明SCFAs在一定程度上介导了螺旋菌的保护作用。我们的观察表明,螺旋菌科的GF单配mdr2−−/与GF小鼠相比,小鼠减少了肝纤维化,但没有炎症或延长了寿命,但炎症减少了,减少了大肠杆菌而且粪大肠经抗生素处理的SPF小鼠的腔内浓度和肝脏细菌易位表明,螺旋菌科具有直接的抗纤维化作用,但它们的抗炎作用是通过抑制侵略性物种介导的。粪便宏基因组分析4从PSC患者队列中发现了我们的研究结果的临床相关性,并显示PSC患者中Lachnospiraceae物种减少,Lachnospiraceae的存在与较低的Mayo风险评分相关。

其他研究显示FXR激动在肝、胆道方面有不同的结果mdr2−−/老鼠。14日31日这些差异可能是由于在每只小鼠模型中存在或不存在微生物消耗介导的肝脏BA积累扩张。我们发现,与SPF相比,GF中肝脏cyp7a1基因表达减弱20倍,肝脏BA积累增加mdr2−−/小鼠,尽管回肠FGF15表达(FXR下游关键靶点)没有差异。尽管血清总BA增加,但最近Schneider也同样报道了回肠FGF-15表达的差异14抗生素治疗和未治疗之间的差异mdr2−−/这表明在该模型中,以微生物为基础的、不依赖fxr的肝脏BA积累驱动因素。12

我们展示了两种常驻病原体与Mayo风险评分呈正相关和负相关的临床证据(粪大肠和肠杆菌科)和保护性Lachnospiraceae。此外,粪大肠在暴露于抗生素的PSC患者中扩大。不幸的是,我们的临床数据集中没有抗生素的类型和谱。万古霉素临床研究显示PSC患者存在异质性生化反应,32提示万古霉素对保护菌和致病菌的个别治疗作用。这些研究缺乏评估抗生素微生物靶点所需的基线和干预后微生物图谱评估。我们的mdr2−−/结果提示广谱抗生素在PSC患者中应谨慎使用,因为广谱抗生素可能会加重疾病,并通过促进肠肝细菌易位而导致胆管炎复发。

这项研究有几个局限性。GF的早期致死率和广谱抗生素耗竭mdr2−−/小鼠排除了纵向研究,以评估螺旋菌科或SCFA对慢性疾病进展的延迟效应。其次,我们认识到关于小鼠AP是否适合监测胆汁淤积的持续争议。33 34因此,我们以TB和胆管反应性作为胆汁淤积损伤的附加标记来证实我们的发现。最后,因为女朋友mdr2−−/老鼠在受孕前就会死亡,我们的杂合子耐多药+ /−小凋落物繁殖策略延迟了实验,限制了更深入的机制研究,但允许凋落物对照比较。

我们的机制研究对未来PSC患者的个性化细菌操作具有直接的翻译意义。例如,仔细筛选的PSC患者队列可能对致病亚群的选择性减少和/或保护细菌或分泌代谢物的增加产生最佳反应。此外,我们的gnotobiology模型可以探索人类粪便转移和WT和基因工程细菌菌株的选择性定植对肝胆、微生物和代谢组学的影响,从而剖析微生物的保护和致病机制。本研究还强调了细菌在体内的特定作用,如长螺旋菌科,需要额外的保护驻留菌来再现粪便菌群移植所转移的各种保护作用。未来的研究方向将决定巨噬细胞表型的影响,35下游SCFA靶点和其他推定的保护菌对实验性肝胆炎症和纤维化的活性。总之,我们的灵知菌和抗生素mdr2−−/PSC小鼠模型发现了与病原体平衡的新型肝保护驻留菌之间复杂的相互作用,在PSC患者队列中复制。驻留菌亚群通过抗菌活性和改变细菌代谢产物发挥积极和消极影响。

数据可用性声明

根据合理的要求提供数据。所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。

伦理语句

病人同意发表

伦理批准

获得了各地方伦理委员会的伦理批准(挪威:挪威东南部医疗和卫生研究伦理区域委员会(参考编号2015/2140);德国:汉堡(参考编号MC-111/15)和基尔(参考编号A148/14, A117-13和A156-03)。我们在NIH实验室动物护理和使用指南下进行了小鼠研究,该指南由北卡罗来纳大学教堂山学院动物护理和使用委员会(议定书ID 18-266)批准和监督。参与者在参与研究前给予知情同意。

致谢

Liu Bo, DVM, PhD,和Akihiko Oka, MD, PhD提供技术支持;北卡罗来纳大学灵知生物研究支持设施经理乔希·弗罗斯特;李凤玲,医学博士,和Allison Rogala, DVM,无菌衍生mdr2−−/老鼠;Lisa Holt负责实验室管理,Cary Cotton负责统计支持。特别感谢密歇根大学的Vincent Young博士提供了拉克诺螺旋体科的原始菌株,以及东京理研研究所的Kenya Honda博士提供了梭状芽孢杆菌群落物种。特别感谢北卡罗来纳大学临床化学和CGIBD病理核心在肝酶分析和组织准备和染色方面的帮助。

参考文献

补充材料

脚注

  • 推特@hov_jer

  • 贡献者MA和RBS是该债券的担保人。MA和RBS制定了这项研究的概念。MA、BN、AV和MF对样品的收集有贡献。JT和JPYT生长并贡献了螺旋菌科菌株。KL和YL负责代谢组学。JW进行测序后数据处理。SM进行盲法H&E和Sirius Red组织学评分。VM和HLF进行IHC染色并进行图像分析。HZ、PBH、JSB、MA进行胆汁酸分析。MA执行统计分析和数据整理。 MK, LT, SC, CB, AF and JRH collected and analysed human faecal metagenomic data. MA, VM, JW, JT, MK, YL, KL, JPYT, HLF and RBS performed data curation. YVP provided murine resources and technical advice. MA, JW and RBS planned the analysis reviewed data and edited the results. MA, JW, MK, JRH and RBS performed formal analysis. MA and RBS interpreted data. RBS supervised the study, and MA was responsible for project administration. MA and RBS wrote the original draft. MA, JW and RBS contributed to the writing of the manuscript. All authors read, critically revised for important intellectual content, and approved the final manuscript. RBS and MA acquired funding.

  • 资金国家卫生研究所(NIH)授予P01DK094779、P40OD10995和P30DK034987(授予RBS)、K01DK119582(授予JW);T32DK07737和T322A1007273(致MA),克罗恩病和结肠炎基金会#2434(致RBS);CA232109, DK094779和AI067798(到JT);VA 1I01BX003031和IK6BX005226;DK108959和DK119421(到HLF)。JRH由欧洲研究理事会资助,批准号为。802544.CS得到了DFG、CRU306、Helmut和Hannelore Greve基金会的支持,并得到了BiomX和Galapagos的资助。VA优秀奖I01BX004033;研究职业科学家奖(IK6BX004477); VA ShEEP Grant (1 IS1 BX004777); NIH Grants R01 DK104893, R01DK-057543 (to HZ). VA Merit Review 2I0CX001076, R21TR003095 (NCATS) (to JSB). VA Merit Award BX001328 (to PBH).

  • 相互竞争的利益RBS咨询并获得了武田、Janssen、Second Genome、Vedanta、BiomX、Biomica、SERES和Artizan的资助;JRH曾担任Orkla Health、诺华、安进和罗氏的顾问委员会成员和/或演讲,并获得了Biogen的研究支持,所有这些都与本研究无关。

  • 患者和公众的参与患者和/或公众未参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。

  • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。

  • 补充材料本内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查,也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是那些作者(s)和不被BMJ认可。BMJ放弃从放在内容上的任何依赖产生的所有责任和责任。如果内容包含任何翻译材料,BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量),并且不对翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。

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