低的项gydF4y2BaFaecalibacterium prausnitziigydF4y2Ba在结肠炎微生物群gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

肠道微生物群怀疑结肠炎中发挥作用,特别是在炎症性肠病(IBD)的发病机理。目的是比较结肠炎患者的粪便微生物群组成的健康受试者(HS)。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

粪便样本22活跃的克罗恩病(CD)患者,10 CD患者在缓解期(R-CD),溃疡性结肠炎13(该校)患者,4 UC患者在缓解期(R-UC), 8传染性结肠炎(IC)患者和27 HS分析定量实时聚合酶链反应(PCR)针对16 s rRNA的基因。细菌数量转化为对数(日志gydF4y2Ba_10gydF4y2BaCFU)进行统计分析。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

细菌的门壁厚菌门(gydF4y2Baleptum梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba球菌样的梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba组)并不代表A-IBD患者(9.7;gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.004)和IC (9.4;gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.02),而HS (10.8)。gydF4y2BaFaecalibacterium prausnitziigydF4y2Ba物种(一个主要的代表gydF4y2Bac . leptumgydF4y2BaA-IBD集团)较低数量和IC患者相比,HS(8.8和8.3和10.4;gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0004,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.003)。的gydF4y2Ba厚壁菌门和拟杆菌门gydF4y2Ba在A-IBD比例较低(1.3;gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0001)和IC患者(0.4;gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.002)。与商品相比,双歧杆菌并不代表在A-IBD和IC(7.9和7.7和9.2;gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.001,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.01)。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

IBD患者的粪便微生物群与商品的不同。门壁厚菌门和特别的物种gydF4y2Baf . prausnitziigydF4y2BaA-IBD患者是弱势以及IC患者。这些细菌可以从低计数的肠道内稳态的关键gydF4y2Baf . prausnitziigydF4y2Ba始终伴随着减少肠道粘膜的保护。gydF4y2Ba

肠道微生物群介绍了细胞密度最高记录为任何生态系统。两个门控制其生物多样性:拟杆菌门和厚壁菌门。gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba同桌的人类肠道微生物群对保护和体内平衡至关重要。gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba粘膜的保护包括,首先,bacteria-bacteria交互(身体排斥,营养竞争,群体感应,等等),其次,微生物群之间的串扰和专门的上皮细胞如Paneth细胞。这些相互作用导致的分泌抗菌肽(细菌素和defensins)在上皮表面,导致细菌负荷的调节在粘液和粘膜表面。这个相声包括共生体的特定识别相关的分子模式(营)模式识别分子(人口、难民和移民事务局)包括toll样受体(TLR)和核苷酸寡聚化域(点头)受体。改变或已发现这些受体多态性与风险增加有关的炎症性肠病(IBD)在动物模型和人类。gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}通常TLR识别触发先天免疫系统,导致炎症反应;然而,保护作用的TLR激活最近由共生的细菌也被认可。事实上,葡聚糖硫酸钠(DSS)模型小鼠结肠炎,激活共生的微生物群的通常是防止肠道损伤和死亡率的关键。gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba有趣的是,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaNissle 1917也发挥其益生菌通过TLR2和TLR4-dependent通路保护作用。gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba然而,微生物群之间的相互作用,通常可能是复杂的,在最近的一项研究中TLR2和TLR4似乎不影响小鼠的肠道微生物群组成。gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba

结肠炎,是否引起感染或炎症,特点是结肠组织损伤和炎症。肠道微生物群是一个至关重要的保护性因素的肠道粘膜,gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}和失调(肠道微生物群失衡与主机相关的疾病)可能导致粘膜损伤的过程。gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}此外,共生的细菌被认为有助于肠道组织修复后结肠炎等传染性结肠炎(IC)。失调在IC一直缺乏研究。另一方面,在炎症性肠病等慢性肠道炎症,失调已经观察到。gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba}因此,调查一个不平衡的肠道微生物群的构成结肠炎(IC和IBD)可以帮助确定一个较低的水平,从而增加了风险的潜在保护共生的细菌。gydF4y2Ba

当观察肠道菌群通过培养技术,70%以上的肠道微生物仍然是未知的。gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}自1990年代以来,文化无关的工具被使用,允许一个完整的肠道微生物多样性的评估,gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba并为探索微生物群偏差在IBD的上下文中。这些分子方法识别细菌比较序列分析基于他们的小亚基核糖体RNA分子(16 s rRNA)。16 s rRNA基因高度保守的还包括变量和变异度高的地区,允许设计探针或引物,检测整个域(gydF4y2Ba细菌gydF4y2Ba),一个门,一个群体,一个属,甚至一个单一的物种。gydF4y2Ba

在当前的研究中,我们使用一个实时聚合酶链反应(PCR)比较结肠炎患者的粪便微生物群组成的健康受试者。我们描述一个失调在结肠炎特别是特征项厚壁菌门和低,其中,该物种gydF4y2BaFaecalibacterium prausnitziigydF4y2Ba。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

人类志愿者gydF4y2Ba

收集粪便样本来自57个colitides患者和27名健康受试者(HS)。结肠炎患者,32名患者克罗恩病(CD)(22个活跃的CD, 10不活跃的CD), 17个患者溃疡性结肠炎(UC)(13活跃的加州大学,4不活跃的加州大学)和8个病人IC。积极的CD和加州大学定义的CD活动指数> 150gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba和加州大学活动指数> 3,gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba分别。所有的受试者抗生素或柳氮磺胺吡啶或接收清肠产品至少3个月前报名。集成电路是由gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba7例,而病原体在剩下的病人不是孤立的。整个凳子都被收集在无菌盒,立即在厌氧条件下储存在4°C使用一个Anaerocult(默克、国立苏尔马恩、法国),在4小时内和冷冻在0.2 g整除−80°C进行进一步分析。少量的粪便样本分析(gydF4y2BangydF4y2Ba= 13)已经被研究使用另一种方法(鱼)。gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba

DNA提取gydF4y2Ba

DNA提取200毫克的粪便如前所述。gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba核酸是由异丙醇沉淀在室温下10分钟,其次是孵化15分钟在冰上,离心30分钟,享年15000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba和4°C。颗粒悬浮在112μL磷酸盐缓冲剂和12μL乙酸钾。核糖核酸酶治疗和DNA降水后,核酸被离心15000恢复gydF4y2BaggydF4y2Ba和4°C 30分钟。DNA颗粒悬浮在100年终于μL TE缓冲。gydF4y2Ba

实时qPCRgydF4y2Ba

实时定量PCR (q)使用ABI 7000执行序列检测系统装置与7000系统软件诉1.2.3(应用生物系统公司,培育城市,CA)。放大和检测进行了96 -孔板和TaqMan普遍PCR 2 x大师混合(应用生物系统公司)量化总细菌和微生物群的占主导地位的细菌群体和SYBR-Green PCR 2 x大师混合量化。每个反应是在重复的在最后一卷25μL 0.2μM每个引物(除了的最终浓度gydF4y2Ba拟杆菌/普氏菌gydF4y2Ba组引物:0.4μM), 0.25μM最后每个探针的浓度,10μL适当的稀释的DNA样本。放大进行如下:95°C 10分钟,变性DNA聚合酶和激活AmpliTaq黄金,紧随其后的是40 95°C的周期为30秒,60°C 1分钟。SYBR-green扩增,增加了分离步骤和离解曲线进行分析确认身份和忠诚的放大SYBR-green产品。gydF4y2Ba

实时qPCR寡核苷酸引物gydF4y2Ba

集团和特有的16 s rRNA-targeted引物和探针用于本研究中描述gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。SYBR-Green qPCR被用来量化2细菌物种,gydF4y2BaFaecalibacterium prausnitziigydF4y2Ba和gydF4y2Ba粪肠球菌gydF4y2Ba。我们设计了引物使用Primer-Express软件(应用生物系统公司)2.0 v。所选引物目标网站(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)被提交检测特异性探针的序列匹配程序提供的核糖体数据库项目。gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba引物被使用2进行了测试gydF4y2Baf . prausnitziigydF4y2Ba菌株(L2-6和a2 - 165)和1株gydF4y2Ba粪肠球菌gydF4y2Ba(UEPSD L98)。引物是从MWG-Biotech购买(Ebersberg,德国)。gydF4y2Ba

厚壁菌门的数量是通过添加项gydF4y2Ba球菌样的梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba和gydF4y2Bac . leptumgydF4y2Ba。虽然梭状芽胞杆菌和亲戚不代表所有壁厚菌门,他们占90%以上的肠道微生物群。gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

为了比较慢性(IBD)急性结肠炎(IC),结果患者积极光盘(CD)和加州大学(该校)被集中在一个活跃的炎症性肠病组(A-IBD),而患者在缓解期的结果从CD (R-CD)和加州大学(R-UC)汇集在缓解炎症性肠病组(R-IBD)。所有的细菌计数(菌落(CFU) / g(粪便)被转换为对数(日志gydF4y2Ba_10gydF4y2BaCFU)进行统计分析。细菌群体比较,1路的方差分析(方差分析)进行了使用JMP软件(Abacus概念,伯克利,CA)。日志gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba使用学生的CFU值比较gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。厚壁菌门和拟杆菌门比率,计算从细菌中值进行数字中发现每个人使用指数数据(不是对数),和使用非参数测试中位数进行比较。统计学意义是接受gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba

偏最小二乘(PLS)回归gydF4y2Ba

请回归被用来描述Moulin-Schouleur等gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba调查病人组(变量的微生物群之间的差异gydF4y2BaYgydF4y2Ba)的基础上量化使用qPCR(变量的结果gydF4y2BaXgydF4y2Ba)。采用PLS回归预测模型使用SIMCA软件,建立了v . 8.1 (UMETRI、期刊、瑞典)。有用的数量请组件是由交叉验证(SIMCA 7.0, 1998)。组菌株被当作坐落在飞机上请定义的组件。预测模型评估使用的质量gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2BaYgydF4y2Ba系数,对应的比例变量的方差gydF4y2BaYgydF4y2Ba解释变量gydF4y2BaXgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

临床特点gydF4y2Ba

临床特点的受试者每组中所示gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba。所有的病人有无限制的西方饮食。没有一个病人受到清肠内粪便取样之前3个月。组没有随着年龄或性别比例差异(无统计差异结肠炎和HS)。gydF4y2Ba

实时聚合酶链反应分析gydF4y2Ba

平均每个病人组细菌量化进行了总结gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba。然后,结果被IC和HS组(相比gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

IC患者的细菌总数等价物低相比,炎症性肠病(主动或在缓解期)患者(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。细菌总数在HS和IBD患者类似。最普遍的门被厚壁菌门和拟杆菌门组。然而,厚壁菌门的门不代表在结肠炎患者(A-IBD: 9.66;集成电路:9.39)相比,HS (10.8;gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.004,gydF4y2BaPgydF4y2Ba分别为= 0.02;gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。这是观察到任何结肠炎的原因(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)。厚壁菌门的低数量不是因为特定的细菌集团gydF4y2Bac . leptumgydF4y2Ba和gydF4y2Bac .球菌样的gydF4y2Ba组都是担心。这个物种gydF4y2Baf . prausnitziigydF4y2Ba(的主要物种gydF4y2Bac . leptumgydF4y2Ba在结肠炎患者(集团)也减少A-IBD: 8.8;gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0004和IC: 8.3;gydF4y2BaPgydF4y2Ba比HS (10.4) = 0.003)。这并没有达到统计学意义R-IBD组(9.5;gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.11)。较低水平的gydF4y2Ba双歧杆菌属gydF4y2Ba也观察到活跃结肠炎组相比,HS (A-IBD: 7.9和IC: 7.7;与海关:9.2gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.001,gydF4y2BaPgydF4y2Ba分别为= 0.01)。我们没有观察到关于拟杆菌门和显著差异gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba物种。gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba厚壁菌门和拟杆菌门gydF4y2Ba为每个主题是如上所述计算比率(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba);HS(中位数比6.0)相比,这是减少在所有结肠炎组。我们观察到明显降低的比率从海关到集成电路,与中间值在R-IBD和A-IBD (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

请回归分析gydF4y2Ba

除了gydF4y2Ba厚壁菌门和拟杆菌门gydF4y2Ba比我们调查之间的差异结肠炎,海关根据细菌群体的形象从我们qPCR结果。基于PLS回归,HS显然可以区分从A-IBD患者(模型解释71.9%的变异;gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba),R-IBD病人(模型解释77.2%的变异;gydF4y2Ba图3gydF4y2BaB)和IC患者(模型解释75.4%的变异;gydF4y2Ba图3gydF4y2BaC)。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

我们在目前的研究表明,厚壁菌门,占主导地位的细菌类群之一,在正常粪便微生物群,gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba不代表在A-IBD (cd和该校)和IC患者相比,h。类似的结果观察有关gydF4y2Bac . leptumgydF4y2Ba组,gydF4y2Bac .球菌样的gydF4y2Ba组织,尤其是gydF4y2Baf . prausnitziigydF4y2Ba物种的gydF4y2Bac . leptumgydF4y2Ba集团是一个主要的肠道得到了。gydF4y2Ba

mucosa-associated微生物群(MAM)不同于粪便微生物群,在当前的研究中,我们探索了后者,这被证明是可再生的,相关的,非侵入性的肠道炎症的标志物。病人没有探索通过结肠镜检查前抽样,因此畸变微生物群组成的清肠是可以避免的。gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba粪便微生物群在h组的组成与文献数据是相一致的gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}和不同于基于比较的IBD或IC患者评估以及全球请回归分析。gydF4y2Ba

它仍然是辩论是否失调在IBD主要或次要的肠道炎症。一些数据显示异常在缓解IBD患者的肠道微生物群。gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}此外,斯坎兰等gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba显示时间减少粪便微生物群在CD患者在缓解期的稳定。依照我们的结果,这些数据表明,肠道微生物群的主要变化,特别是代表名额不足的gydF4y2Baf . prausnitziigydF4y2Ba可以参与IBD发病机制。gydF4y2Ba

在目前的研究数减少gydF4y2Baf . prausnitziigydF4y2Ba观察R-IBD患者(9.5±0.4)没有达到意义而HS (10.4±0.2;gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.1),可能是由于小尺寸的R-IBD集团,因此低统计力量。扭曲的组合厚壁菌门门之前描述的IBD患者。Manichanh等gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba生物多样性的限制在CD患者的粪便微生物群,特别是在gydF4y2Bac . leptumgydF4y2Ba组。此外,数量减少gydF4y2Bac . leptumgydF4y2Ba集团已与CD。gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}再一次,gydF4y2Baf . prausnitziigydF4y2Ba内的物种gydF4y2Bac . leptumgydF4y2Ba集团已被证明是特别缺乏CD患者的老妈。gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}在目前的工作、厚壁菌门和gydF4y2Baf . prausnitziigydF4y2BaIC患者数量减少以及cd和该校的病人。这些结果不支持的假设IBD-specific失调。然而,一个人可以假设主要在肠道壁厚菌门变形,R-IBD中观察到病人(请回归分析证实了),可以使炎症性肠病等病理条件。相反,一个健康的肠道微生物群的结构包括一个适当的计算壁厚菌门(尤其是gydF4y2Baf . prausnitziigydF4y2Ba)可能是肠道粘膜的保护因素无论慢性肠道炎症条件(CD或加州大学)。有趣的是,开发一个IBD的风险大于后第一年肠胃炎的一集。gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba}因此,符合我们的结果,我们可以推测细菌infection-driven失调可能会导致炎症性肠病的一个预设的话题。gydF4y2Ba

的gydF4y2Bac . leptumgydF4y2Ba集团(厚壁菌门中门)包含几个butyrate-producing细菌。丁酸是能源的主要来源为结肠上皮细胞和具有免疫调节和抗炎特性。gydF4y2Ba^{32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}因此,减少butyrate-producing细菌的gydF4y2Bac . leptumgydF4y2Ba集团可能在IBD的发病中扮演一个角色冲突。我们最近发现gydF4y2Baf . prausnitziigydF4y2Ba也对butyrate-independent对IBD的结肠炎模型抗炎作用。gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba这加强了的新范式的共享由细菌粘膜的保护作用gydF4y2Bac . leptumgydF4y2Ba集团内的硬壁菌门。这个概念说明的gydF4y2Ba厚壁菌门和拟杆菌门gydF4y2Ba比,这可能被视为一种指标的粪便微生物群失调在结肠炎。比例是按照文献数据在海关gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba和减少结肠炎组织,特别是在A-IBD和IC患者,反映出更严重的生态失衡。此外,在TNBS引发结肠炎小鼠,我们组最近能够抗衡colitis-associated失调,防止炎症。gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba

我们观察到一个较低的数的gydF4y2Ba双歧杆菌属gydF4y2Ba属在A-IBD病人的粪便微生物群,它是按照大多数以前的数据,gydF4y2Ba^{27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}尽管冲突的报道也出版了。gydF4y2Ba^{28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba}双歧杆菌属gydF4y2Ba在IC患者也减少了。数据变化的拟杆菌门在IBD患者相互矛盾的文学gydF4y2Ba^{28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba}我们没有发现任何数量变异之间的门我们的团体。gydF4y2Ba肠道菌gydF4y2Ba特别是gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在炎症性肠病深入调查。Darfeuille-Michaud等gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba描述了一个Adherent-InvasivegydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(AIEC参考应变LF82)与回肠粘膜相关专门在CD。Kotlowski et algydF4y2Ba^39gydF4y2Ba显示,老妈的IBD患者包含更高的项gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba的毒性比控制B2 + D组。在加州,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba证明是突出在活跃的微生物群与h。gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba在最近的研究中,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba水平在所有科目组相似,但这并不与上面所提到的数据,因为粪便细菌数可能不能反映当地改变的老妈,和基于dna的数量可能不反映RNA-based比例的转录活性细菌。gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba此外,定量的稳定性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba水平并不排除定性变化和更高比例的致病菌株。gydF4y2Ba

总之,粪便微生物群IBD患者和海关之间的不同。IC患者的粪便微生物群展览部分与A-IBD患者常见的修改。厚壁菌门的门尤其是物种gydF4y2Baf . prausnitziigydF4y2Ba从gydF4y2Bac . leptumgydF4y2Ba集团在结肠炎明显弱势。这些细菌可能是肠道内稳态的关键,可能被视为一种肠道粘膜的保护因素。还需要进一步的研究来确定一个较低的水平的粪便gydF4y2Baf . prausnitziigydF4y2Ba可能是一个更高的患IBD的预测指标。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba