粘膜和粘膜下结肠组织的蛋白质组学分析产生了区分炎性结肠炎的蛋白质特征

背景

鉴别溃疡性结肠炎(UC)与克罗恩结肠炎(CC)可能很困难，并且可能导致高达30%的炎症性肠病(IBD)患者诊断不准确。许多诊断的不确定性来自于临床和组织学特征的重叠。基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)允许对组织进行组织学指导的细胞蛋白分析。作为一项初步研究，我们评估了组织学指导的MALDI-MS确定CC和UC标本之间潜在差异的蛋白质组学模式的能力。

方法

在组织学评估后，对CC和UC结肠切除术样本的粘膜和粘膜下层进行分析。为了确定MALDI-MS是否能区分炎症，未炎症的(n= 21)与粘膜下层炎症(n= 22)，比较UC和非炎症(n= 17)与粘膜下层炎症(n= 20)。为了确定结肠炎之间是否存在蛋白质组学差异，未炎症的UC粘膜下层(n= 21)与未炎症的CC粘膜下层(n= 17)，炎症的UC粘膜下层(n= 22)与炎症的CC粘膜下层(n= 20)，炎症的UC粘膜和炎症的CC粘膜。对子集进行两两统计比较。

结果

临床组的两两比较分析允许识别对分类重要的特征子集。CC粘膜下层炎症与非炎症的比较显示出两个显著的峰值:m / z6445 (P= 0.0003)和12692 (P= 0.003)。在炎症和非炎症的UC粘膜下，发现了几个显著的分化峰，但分类较差。UC和CC之间炎症粘膜下层蛋白质组学光谱的比较确定了两个离散的显著峰值:m / z8773 (P= 0.006)和9245 (P= 0.0009)。UC和CC之间未炎症的粘膜下层蛋白质组学光谱的比较确定了三个离散的显著峰值:m / z2778 (P= 0.005)， 9232 (P= 0.005)， 9519 (P= 0.005)。UC和CC炎症黏膜无明显差异。

结论

MALDI-MS能够区分CC和UC标本，同时分析结肠粘膜下层。对差异蛋白峰的进一步分析和蛋白鉴定可能有助于准确诊断IBD和开发适当的个性化治疗。(炎症肠病2011;)

目前的治疗方案炎症性结肠炎，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩结肠炎(CC)，涉及药物治疗¹或者手术切除，或者两者兼有。^2，3.CC和UC之间的区别是至关重要的，特别是在确定患者是否适合恢复性直肠结肠切除术(RPC)时。即使结合临床、放射学、内窥镜和组织病理学检查，有时也很难鉴别CC和UC。高达15%的结肠炎病例被标记为“不确定结肠炎”(IC)时，已作出非确定的评估。此外，高达15%的接受RPC的UC患者将根据最终病理或回肠袋克罗恩病的发展将其诊断更改为CC。^2，4，5这种诊断困境以及不正确的诊断和不适当的手术治疗所带来的潜在发病率，强调了进行旨在准确诊断结肠炎的研究工作的必要性。^{6，- - - - - -9}炎症性结肠炎的早期诊断准确性将导致适当的治疗医疗选择，并将有助于确定RPC的合适候选人。

导致生物病理生理的细胞功能障碍可能导致受影响组织中蛋白质微环境的改变。¹⁰这一广义前提适用于炎性结肠炎，包括结肠粘膜和粘膜下蛋白质微环境。结肠组织中任何差异表达蛋白的鉴定对补充目前用于区分结肠炎的已知临床病理变量具有重要的潜力。

基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)允许对组织进行组织学指导的细胞蛋白分析。利用MALDI-MS，我们评估了结肠粘膜和粘膜下组织中的蛋白质微环境，以确定两种炎症结肠炎之间是否存在分子差异。我们假设MALDI-MS可以有效区分CC和UC标本中结肠粘膜和粘膜下层是否存在炎症。我们还假设CC和UC是不同的病理，可以根据特定的蛋白质组学峰值根据蛋白质表达进行区分。

材料与方法

患者和样本选择

51例炎性结肠炎患者冰冻(- 80°C)结肠标本(n= 24 CC和n= 27 UC)可从范德比尔特胃肠道生物标本库或合作人体组织网络获得。每个患者的诊断是基于标准的临床和病理特征^{11，- - - - - -13}代表了治疗医师的共识。一名对临床诊断不了解的胃肠病理学家使用未鉴定的最终手术病理报告和苏木精和伊红(H&E)玻片确认了每位患者的结肠炎诊断。对每个样品进行粘膜层和粘膜下层分析。

这项研究是根据第二次国际赫尔辛基宣言进行的¹⁴并由范德比尔特机构伦理审查委员会批准(文件号080898)。

组织准备

组织学定向蛋白质分析^{6，7，15，- - - - - -17}用于制备组织进行分析。这种质谱数据采集方法允许在单个组织切片内从粘膜或粘膜下层区域获得光谱，而不需要额外的样品制备，如细胞分选或激光捕获显微解剖。MALDI-MS的组织学定向分析方法概述在图1．简单地说，UC和CC标本鉴定后，使用Leica CM1900低温恒温器(Leica Microsystems, Bannockburn, IL)收集每个样品的两个12 μm厚切片。将一个切片放在导电MALDI-MS靶板上，分别浸泡在分级乙醇(70%、90%和95%)中固定30秒。将第二个连续切片置于标准显微镜载玻片上，用H&E染色，并使用Mirax Desk Scan (Mirax, Budapest, Hungary)数码显微镜在40倍放大倍率下获得数字图像。病理学家检查数字图像并确定感兴趣的区域。在每个组织制剂上标注这些区域(200 μm)。这些标记分别对应于粘膜的炎症区和非炎症区，以及粘膜下层的炎症区和非炎症区。“炎症”的分类是基于粘膜或粘膜下层存在中性粒细胞或粘膜下层单个核细胞增多。“无炎症”的分类是由中性粒细胞的缺失和正常数量的单个核细胞的存在。每个组织样本制备可能有多个标记，表明感兴趣的粘膜和粘膜下发炎或未发炎区域。 The annotated histology images were exported and overlaid on a digital image of the MALDI target using Adobe PhotoShop (San Jose, CA).¹³然后确定感兴趣的注释区域的坐标，并通过使用数字图像中可见的基准点和直接在板上可见的基准点，将其转移到声学机器人微斑点仪(LabCyte, Sunnyvale, CA)。机器人微斑点器在所需位置沉积辛芦皮酸(20毫克/毫升，50%乙腈，0.1%三氟乙酸)。然后将矩阵点坐标转移到Bruker Autoflex II (Bruker Daltonik, Billerica, MA)质谱仪上，配备了SmartBeam激光器(Nd:YAG, 355 nm)。光谱在线性正离子模式下收集，作为每个矩阵点的400个激光点的总和。光谱进行外部校准，峰值列表导出为ASCII文件进行进一步处理。光谱峰是一种独特的指纹(或波)，它对应于蛋白质的质量强度，并标记为m / z(质荷比)值。

为了确定MALDI-MS是否能够区分粘膜下层的炎症，我们比较了UC中未发炎区域与发炎区域，以及CC中未发炎区域与发炎区域。为了确定炎症结肠炎之间是否存在蛋白质组学差异，将未发炎的UC粘膜下层与未发炎的CC粘膜下层进行比较，并将发炎的UC粘膜下层与发炎的CC粘膜下层进行比较。此外，为了评估任何蛋白质组学黏膜差异，将炎症的UC黏膜与炎症的CC黏膜进行比较。在所有患者样本中均未观察到发炎或未发炎的组织。中描述了这些比较表1．由于无炎症标本数量不足，CC和UC之间未炎症粘膜层未进行比较。

光谱预处理

原始光谱被发送到Biodesix (Steamboat Springs, CO)进行分析。预处理使用Biodesix (Broomfield, CO)开发的专有分析工具进行。简而言之，使用ProTS’-Marker (Biodesix)对MALDI-MS光谱进行基线校正、归一化和对齐。

特征定义与选择

每一个MALDI-MS光谱都被分析为在所选光谱上的积分、背景减去和归一化光谱强度m / z包含峰值的范围。选择的特征子集和分类算法(及其参数)的组合，将临床标签分配给频谱，构成分类器。所使用的分类算法是k-最近邻(KNN)算法的直接实现。^20.为了对新谱进行分类，KNN算法首先计算新谱特征值与训练集谱特征值的欧氏距离。这个计算产生了从测试光谱到每个代表光谱的距离列表。对于KNN(距离最小k个的)标签进行比较。分配的标签是一个简单的多数投票超过KNN标签。最近邻居的数字“k”是唯一使用的分类器参数。分类算法的候选特征被识别为差异表达m / z来自感兴趣的组的值。分类器的显著特征的初始选择是基于单变量的计算P-来自Mann-Whitney的值U-tests (Wilcoxon秩和检验，WIP)，然后应用浮动搜索方法的变体。²¹作为优化准则，我们使用了训练集上的遗漏交叉验证(LOOCV)误差。最后，利用群平均谱图对特征进行了可视化检查。

分类器的交叉验证

由于样本数量有限，无法将样本分离为独立的和训练的测试集，并且分类的评估仅限于LOOCV或遗留交叉验证(LNOCV)。从训练集中去除固定数量的谱(LOOCV为1,LNOCV为规定数量N)，使用剩余的实例生成分类器，将该分类器应用于剩余的实例，并将分类器与真标签进行比较，以评估该分类器的性能。分类器参数和所选特征集使用这些交叉验证程序进行优化。

结果

为了评估MALDI-MS鉴别炎症的能力，我们比较了CC粘膜下层炎症和未炎症的光谱，以及UC粘膜下层炎症和未炎症的光谱。几个信号在质谱上是离散的m / z在CC和UC标本的发炎和未发炎的粘膜和粘膜下层中确定了价值。炎症与非炎症CC粘膜下层之间的最佳分类是在m / z6445和12692，在制品P= 0.0003和P= 0.003，分别(表2)．这些峰值表明LNOCV分类错误率稳定在14%，准确率为86%。当对炎症和未炎症的UC粘膜下层进行分析时，有四种差异m / z签名被识别为:4627、4024、27848和25289。P-values范围从P= 0.001到P= 0.005，允许分类准确率为75% (表3)．

然后分别比较UC和CC炎症和未炎症黏膜下层的MALDI-MS蛋白组谱。UC和CC之间炎症粘膜下层蛋白质组学光谱的比较确定了两个显著的差异峰:m / z8773 (P= 0.006)和9245 (P= 0.0009) (表4)．当比较UC和CC中未炎症黏膜下层的蛋白质组学光谱时，发现了三个离散的显著差异峰:m / z2778 (P= 0.005)， 9232 (P= 0.005)， 9519 (P= 0.005) (表5)．交叉验证分析显示错误率为20%，因此五个峰值的准确率均为80%。感兴趣的特征在图2，3.,4．

炎症粘膜的MALDI-MS分析识别出CC与UC之间的三个鉴别信号(m / z31752、4939和5677)P-值分别为0.016、0.046和0.054。对这些峰的交叉验证分析的准确度为70%。

讨论

迄今为止，UC和CC的描述是基于临床、内窥镜、组织学和/或放射学评估的结合，这些评估用于指导药物和手术治疗。尽管我们对基因的理解有了进步，^22，23免疫,^23，24和环境²⁵目前还没有足够敏感的病理指标能够准确、一致地区分CC与UC。MALDI-MS已被证明是评估组织层蛋白质微环境的有效手段。^{15，- - - - - -17}以组织学为导向的MALDI-MS方法学允许我们针对结肠组织中高度特异性的区域进行分析，而不需要大量的样品制备，例如激光捕获显微解剖所需的样品制备。¹⁵这种靶向性使我们能够使用MALDI-MS对结肠粘膜和粘膜下层进行特异性评估，因为组织的结构完整性得到了维持(与使用全厚度或粉碎的结肠组织进行蛋白质组学评估相反)。此外，以组织学为导向的方法允许对粘膜和粘膜下层的炎症和非炎症区域进行特定的病理评估。我们的研究是第一个使用组织学指导的MALDI-MS来比较结肠组织层中的蛋白质组学模式，以区分两种炎症结肠炎的差异的报告。

组织学定向质谱蛋白分析能够识别结肠蛋白特征，在统计学上区分CC粘膜下层的炎症，其分类(LNOCV和LOOCV)准确度为86%，在UC标本中准确度为75%。这种较低的准确性可能是由于UC与CC的炎症程度较低，不同类型的疾病活动或炎症，或由于本研究的样本数较低。另一种可能是由于基于交叉验证结果的疾病分子特征的统计高维变量选择。²⁶目前正在进行更多样本的进一步验证研究，以更好地评估MALDI-MS区分UC粘膜下层炎症和CC标本的能力。在我们的比较中加入正常结肠粘膜下层作为对照，可以更好地评估蛋白质组学差异，真正了解MALDI-MS是否可以区分炎症和非炎症的粘膜下层。

当使用组织学定向MALDI-MS比较CC和UC炎症和未炎症粘膜下层的蛋白质组学谱时，有5个差异表达m / z确定了可以区分结肠炎的值。这些蛋白组学峰在CC黏膜下层表现出更强的强度，可能表明粘膜下层组织的炎症程度更大或类型不同。这些不同的峰值可能代表候选生物标志物，可用于描述炎性结肠炎。这项试点研究是第一个利用MALDI-MS组织评估来描述CC和UC的研究。

人们对试图识别可能描绘炎性结肠炎的蛋白质生物标志物有很大的兴趣。这些研究在使用血清，^27，28粘膜活检,^29，30.和粪便^31，32生物标志物作为预后指标或评估IBD是处于静止状态还是活跃状态。然而，这些生物标志物并没有被证明可以区分UC和CC，而是作为已知诊断疾病的预后，如静止或活跃。^{27，- - - - - -34}最近，Meuwis等人³⁵报道了第一个使用表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱技术对IBD患者血清进行的蛋白质组学研究，他们确定了四个感兴趣的生物标志物(PF4, MRP8, FIBA和Hpα2)。这些生物标志物之前已经在IBD的设置中被识别出来^36，37并且只能用于确认IBD的存在，而不能区分疾病的表型。事实上，这些生物标志物是从大量潜在的血清学标志物中通过可靠的统计过程选择的，这突出了它们在IBD病理生理学和诊断确认中的潜在重要性。他们发现的潜在生物标志物是小蛋白质或蛋白质片段(或可能具有可变翻译后修饰的小蛋白质异构体)，除了蛋白质组学分析和质谱之外，不一定容易被其他策略检测到。安萨里等人，³⁸在最近的另一项研究中，与CC患者相比，UC患者的血清RANTES(活化，正常T细胞表达和分泌调节)表达明显更高。目前尚不清楚，这些报道的研究中的蛋白质是否与我们目前正在使用MALDI-MS研究中识别的蛋白质组学峰值相对应。

我们的研究有许多局限性。主要的一个是51例患者的小样本量(n= 24 CC和n= 27 UC)，使得组间差异的统计显著性估计近似。它还限制了在没有测试集独立验证的情况下对LNOCV性能的分类评估。而数据显示，的差异有统计学意义m / z用于分类的峰值，需要对大量患者进行研究，以在独立样本队列上验证这些结果。

在我们的研究中，UC粘膜下层的炎症表现出一般的特征P-取值范围为1.5 ~ 5.5 × 10⁻³(准确率为75%)可能是由于(除了样本量不足等其他原因外)炎症程度仅限于粘膜，³⁸虽然粘膜下层也经常发炎^{10，- - - - - -12}正如我们在研究中提到的^6，7并证实在这一层中存在一定程度的炎症和免疫反应，可以通过质谱分析进行研究。^{6，- - - - - -9}我们的研究也受到了目前H&E组织学金标准对UC和CC的潜在诊断的限制。正如导言中提到的，这种诊断方法(结合其他临床和诊断技术)在高达15%的病例中可能是不正确的，使CC看起来像UC。即使我们检查的UC样本中有15%实际上是CC，当比较两个结肠炎粘膜下层炎症和未炎症的蛋白质组学模式时，这实际上会使数据偏向原假设，但在我们的研究中仍然确定了具有统计学意义的差异峰。另一个限制是缺乏正常结肠粘膜下对照进行比较。虽然我们希望关注结肠炎之间的蛋白质组学差异(不需要正常对照)，但我们进一步验证MALDI-MS作为一种识别组织炎症的有效技术将包括正常对照，以更好地确定其有效性。

的独特m / z我们鉴定的值仅在分析粘膜下层时显示CC和UC之间有统计学差异。炎症粘膜的蛋白特征显示UC和CC之间存在差异，但LNOCV估计分类的准确性较低。然而，有可能在更大的样本集上获得更好的结果。这可能会限制我们的结果在评估结肠内镜活检时的临床有用性，因为这些内镜活检大部分包括粘膜。然而，粘膜下层活检，尽管有限，也可以通过标准偏差内窥镜获得。^{39，- - - - - -41}因此，需要用MALDI-MS评估粘膜下层以区分UC和CC是一个潜在的限制，除了评估结肠切除术标本外，因为手术后粘膜下层组织大量可用。

我们的研究为未来的分析提供了潜在的机会。虽然蛋白质组学表达模式和/或蛋白质定位模式可能具有诊断潜力，但单个蛋白质可能无法通过分子量(m / z单独)。研究人员正在进行分析，以识别这些信号，看看它们是否代表有区别的蛋白质。鉴定出的蛋白质可用于内镜活检研究，如果得到证实，可作为区分CC和UC的血清生物标志物(甚至可作为不确定结肠炎的鉴别指标)。蛋白质的鉴定和验证可以提供鉴别生物标志物，不仅可以提高诊断的准确性，而且可能有助于UC和CC患者更合适的个性化治疗，还可能为未来研究IBD的潜在病理生理学提供基础。

总之，我们发现MALDI-MS组织谱能显著区分炎性结肠炎。明显的歧视性m / z在这些来自UC和CC的炎症和未炎症的结肠粘膜下层的先导蛋白质组学分析中发现了峰值。组织学导向的MALDI-MS分析可以分析高富集的细胞类型，并具有预测蛋白分化的能力，可以通过粘膜下层分析来描述炎症性结肠炎。研究方法揭示了m / z感兴趣的峰，其中，五个峰被单独认为是“良好的分类器”。进一步的分析和蛋白质鉴定可能提供区分生物标志物，不仅可以提高诊断的准确性，而且可能有助于UC和CC的个性化治疗。

确认

我们感谢Kerry R. Wiles和Anthony L. Frazier对样本收集的协调和指导。我们感谢Jamie L. Allen在样品制备方面的帮助，感谢Wael El-Rifai医学博士和Phillip E. Williams的科学指导，感谢Deming Mi和Julia Grigorieva博士在统计分析方面的帮助。

参考文献

作者指出