图一个gydF4y2Ba

简介gydF4y2Ba

胃肠道菌群是一个复杂的共生细菌系统,在宿主代谢中起着至关重要的作用[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和免疫系统的成熟[gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba].其结构适应疾病条件[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba],包括肥胖和2型糖尿病[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba],以及糖尿病治疗,如药物治疗和减肥手术[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba].旨在诱导肥胖患者减轻体重的减肥手术技术[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba也与改善葡萄糖内稳态,甚至糖尿病缓解有关[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba],但人们对其潜在的生物过程仍知之甚少。有人建议改变肠道微生物组来调节减肥手术后的体重减轻和改善葡萄糖稳态[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

在限制个体间表型变异的条件下维持的近交系临床前模型是评估肠道菌群和宿主生理之间功能关系的强大实验系统。Goto-Kakizaki (GK)大鼠是一种通过选择性丰富自然发生的遗传多态性获得的自发性糖尿病自交系模型[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba从而在没有肥胖的情况下产生与2型糖尿病相关的多方面病理特征。尽管糖尿病的致病基因已经被定位到GK基因组(综述在[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)) (gydF4y2Ba12gydF4y2Ba],减肥手术改善了该菌株的血糖控制[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba通过未知的机制。gydF4y2Ba

为了理清胃切除术和改善葡萄糖稳态之间的关系,我们在GK大鼠中进行了一系列宏基因组和生理实验,以测试两者之间的联系gydF4y2Ba普氏菌coprigydF4y2Ba垂直袖状胃切除术(VSG)刺激的优势菌株,胆汁酸代谢和法梨样X受体(FXR)信号。这些数据为肠道菌群对与增强胆汁酸代谢和FXR信号有关的血糖控制的影响提供了新的见解。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

具体方法请参见电子补充材料(ESM)。gydF4y2Ba

动物gydF4y2Ba

在Inserm UMR 1124实验室培育的Goto-Kakizaki (GK/Ox)大鼠被维持在受控环境中(22-24°C的12小时暗光循环;湿度50 - 60%)。他们可以随意获得水和标准食物(SAFE,奥吉,法国)。实验组和对照组的动物被安置在不同的笼子里,以避免通过粪噬发生的无意的微生物群移植。使用GK大鼠进行一系列实验,如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.该程序由大学动物实验伦理委员会审查,并由法国研究部根据许可证4231201602231507187交付。gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

实验设计大纲gydF4y2Ba

变速装置gydF4y2Ba

VSG在16周龄雄性GK大鼠中进行。胃外侧80%用切割器切除(TLC55, Ethicon, Issy, France)。对照组GK大鼠采用食管括约肌与幽门之间加压的方法进行假手术。术后13周处死大鼠。采集盲肠和结肠内容物,速冻保存在−80°C。gydF4y2Ba

Pair-feeding研究gydF4y2Ba

术后30天,假手术大鼠按自由喂养VSG GK大鼠的摄食量进行配对喂养。使用Accu-Check, Performa (Roche Diagnostics, Meylan, France)测定血糖。gydF4y2Ba

肠道微生物群的转移gydF4y2Ba

5月龄雄性GK大鼠口服Inexium(奥美拉唑,阿斯利康,Courbevoie,法国)和Moviprep (Norgine, Rueil-Malmaison,法国)[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba],并接种vsg处理或假手术的GK大鼠盲肠菌群。gydF4y2Ba

肠道菌群的富集gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba

5月龄雄性GK大鼠分别给予万古霉素(0.5 g/l)和卡那霉素(1 g/l)治疗10 d。GK对照组保持在无抗生素条件下。gydF4y2Ba

p . coprigydF4y2Ba补充gydF4y2Ba

5月龄雄性GK大鼠分别给予万古霉素(0.5 g/l)、新霉素(1 g/l)、甲硝唑(1 g/l)、氨苄西林(1 g/l) 10 d杀灭肠道细菌,促进肠道健康gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba殖民。然后用5 × 10次灌胃给药gydF4y2Ba8gydF4y2BaCFUgydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba(DSM18205, DSMZ, brunschweig, Germany)或热杀gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba在控制。gydF4y2Ba

葡萄糖耐量测试和样品收集和分析gydF4y2Ba

ogtt(实验1在图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和ipgtt(图中实验2、3和4)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)在清醒的夜间禁食的大鼠身上进行。在给药前(1克/公斤体重)从尾静脉采集血液,之后依次用于测定血糖(罗氏诊断公司)和胰岛素水平(Mercodia, Uppsala,瑞典)。gydF4y2Ba

三天后,隔夜禁食的老鼠被杀死。血浆、脂肪组织、肝脏和盲肠内容物速冻保存在−80°C。用比色法测定甘油三酰(ab65336;Abcam,巴黎,法国)和糖原(Sigma-Aldrich, Saint-Quentin,法国)含量。gydF4y2Ba

Metagenome测序gydF4y2Ba

从盲肠和结肠样本中制备细菌DNA (DNAStool迷你试剂盒,QIAGEN, Courtaboeuf, France)。全基因组鸟枪测序在Illumina HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, USA)上进行。细菌16S rRNA可变区1-3的55个核苷酸片段对应的序列基序被用来估计样本的生物多样性。gydF4y2Ba

定量聚合酶链反应gydF4y2Ba

p . coprigydF4y2Ba用定量PCR法检测盲肠细菌DNA的富集情况。按照所述方法制备肝脏和脂肪组织RNA和定量RT-PCR [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba].寡核苷酸序列在ESM表中给出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.gydF4y2Ba

血浆胆汁酸定量分析gydF4y2Ba

胆汁酸的定量如所述[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]使用ACQUITY BEH C8色谱柱和Xevo TQ-S质谱计(均来自英国曼彻斯特沃特斯)。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

R包用于评估16S rDNA基序频率的差异。gydF4y2BapgydF4y2Ba使用Benjamini-Hochberg方法对多次测试的值进行校正[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba].用Kruskal-Wallis试验分析糖耐量试验期间的血糖和胰岛素数据。非参数Mann-WhitneygydF4y2BaUgydF4y2Ba试验用于分析生理表型、胆汁酸数据和基因表达。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

胃切除的GK大鼠表现出改善的血糖控制gydF4y2Ba

验证减肥手术对GK大鼠血糖控制的影响[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,我们在我们的GK菌落中进行VSG(实验1见图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).VSG引起体重立即下降(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)和食物摄入量(ESM图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和降低血糖水平(图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)与假手术GK大鼠比较。切除胃的大鼠在术后4至6周恢复了与对照组相似的体重,但在VSG后的12周内血糖仍然显著降低(图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba),当执行ogtt时。gydF4y2Ba

图2gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba

VSG对去胃GK大鼠肠道菌群转移的影响。体重的变化(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba)、血糖(gydF4y2BabgydF4y2Ba)和葡萄糖耐量(gydF4y2BacgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba;gydF4y2BaggydF4y2Ba-i)在VSG或假手术后的GK大鼠中(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba),然后接种GK大鼠与切除胃的GK大鼠或假对照的肠道菌群(gydF4y2BafgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba我gydF4y2Ba).ogtt (gydF4y2BacgydF4y2Ba)在一夜(16小时)禁食后、VSG前(术前)和VSG后91天(gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)或假手术(gydF4y2BangydF4y2Ba= 9) (gydF4y2BacgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba).IPGTTs (gydF4y2BaggydF4y2Ba)在vmg处理的GK大鼠盲肠菌群转移(CMT) 12天后进行(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)或假手术GK大鼠(对照组;gydF4y2BangydF4y2Ba= 3 - 4) (gydF4y2BaggydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba我gydF4y2Ba).数据为平均值±SEM。采用Kruskal-Wallis试验分析糖耐量数据。的非参数Mann-WhitneygydF4y2BaUgydF4y2Ba采用检验方法对其他变量进行分析。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba与假手术GK大鼠相比< 0.001 (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba)或注射假手术的GK大鼠的菌群(gydF4y2BaggydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba我gydF4y2Ba).CumG:糖耐量试验期间的累积血糖水平;ΔG,累积血糖水平高于基线gydF4y2Ba

由于VSG继发于腹腔内结缔组织的广泛发展,ogtt优于ipgtt。GK大鼠在VSG前和假手术GK中葡萄糖耐量相似,说明假手术不影响葡萄糖稳态(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba).VSG可改善葡萄糖耐量(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba),通过OGTT期间两种累积血糖水平的显著降低进行评估(图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)和ΔG参数(图5。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)与假GK大鼠比较。与对照组相比,切除胃的GK大鼠基础胰岛素水平升高,葡萄糖诱导的胰岛素分泌增加(ESM图)。gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

GK大鼠接种切除胃的GK大鼠的肠道菌群可提高糖耐量gydF4y2Ba

为了测试肠道菌群是否可能介导VSG的代谢作用,我们将切除胃或假手术GK大鼠的盲肠菌群接种给GK大鼠(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).体重既不受菌群移植前抗生素治疗的影响,也不受肠道菌群移植的影响(图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba).接种vsg处理大鼠的菌群的大鼠,从葡萄糖注射后60分钟到IPGTT结束,血糖显著降低(图。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba),结果两种累积血糖水平均显著降低(图5。gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba)和ΔG参数(图5。gydF4y2Ba2我gydF4y2Ba)与从假手术动物体内接种菌群的GK大鼠进行比较。两组胰岛素分泌无差异(ESM图)。gydF4y2Ba2 gydF4y2Bab).这些数据表明,VSG诱导糖尿病GK大鼠的肠道菌群变化有助于提高移植到糖尿病受体的糖耐量。gydF4y2Ba

VSG和饮食限制对降低GK大鼠高血糖的效果相同gydF4y2Ba

为了评价VSG对GK大鼠葡萄糖稳态的改善作用,我们在假手术30天后对GK大鼠进行了配对喂养实验。与自由喂养的假手术GK大鼠相比,限制热量的假手术GK大鼠的血糖系统显著降低。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba).有趣的是,假手术的GK大鼠和GK大鼠的VSG在限制热量摄入后血糖水平下降的幅度非常相似,证明了VSG在改善葡萄糖稳态方面的效率。gydF4y2Ba

图3gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

热量限制对假手术GK大鼠血糖的影响。假手术组GK大鼠随意测定血糖(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)配对饲养试验开始后3、5、7 d,与自由饲养的假手术(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)和胃切除术(VSG;gydF4y2BangydF4y2Ba= 9) GK大鼠。非参数Mann-WhitneygydF4y2BaUgydF4y2Ba采用检验方法进行统计数据分析。**gydF4y2Bap 0.01,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba与假手术GK大鼠相比< 0.001gydF4y2Ba

VSG改变了肠道菌群结构gydF4y2Ba

为了确定肠道菌群结构的变化,这可能解释vsg诱导的葡萄糖稳态改善,我们对胃切除和假手术的GK大鼠进行了宏基因组测序。我们对VSG后14周收集的盲肠和结肠内容物的细菌DNA进行了测序,此时切除胃的GK大鼠葡萄糖耐受性降低,体重恢复到对照值(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).这些肠道部位的细菌最丰富,对营养吸收最活跃。27个菌群样本产生了一致数量的测序数据,从vsg处理大鼠结肠中的每个样本21.6 Gb到对照大鼠盲肠中的22.9 Gb(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).考虑到四次测序过程中每个样品的高技术重现性(ESM图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)技术复制的数据被汇集在一起。gydF4y2Ba

表1切除胃和假手术GK大鼠盲肠和结肠样本宏基因组测序细节gydF4y2Ba

测序的深度允许对每个盲肠和结肠样本进行超过16000个rDNA基序的观察gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),从而为检测1:5000或更好的细菌种类提供了信心。在每个样本中识别出超过1200个独特的rDNA基序(范围1281-1427)(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).总的来说,所有样本和所有肠道位点的测序数据确定了8767个独特的rDNA基序(517,697次)。gydF4y2Ba

我们使用这些数据来评估单个动物盲肠和结肠的测序数据一致性,以及随后在同一组动物之间的盲肠-结肠、盲肠-盲肠和结肠-结肠的测序数据一致性。100个最常见的16S rDNA序列的平均值和标准差说明了盲肠和结肠中最常见的基序数据的较大变异性(ESM图gydF4y2Ba4gydF4y2Baa、b、gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, b).来自同一动物的盲肠和结肠的数据通常比来自不同动物的任何组合的数据更相似(高达99%)(ESM图gydF4y2Ba4gydF4y2Bac和gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).对于具有盲肠-结肠微生物组配对测序数据集的样本,对所有样本中最常见的10个rDNA基序的比较表明,个体内相似性高于个体间相似性(ESM图)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

我们从V13A反向引物的序列开始进行了55mer序列的精确匹配搜索,并选择了至少50%的个体中出现>0.005%的232个rDNA基序,而不管样本的肠道来源(ESM表)gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba).尽管数据集中发现了大量独特的rDNA基元,但52个最普遍的rDNA基元占了总数据的80%。鉴于宏基因组测序的深度和盲肠和结肠中rDNA基序在个体内广泛的相似性,盲肠序列数据被用于16S rDNA基序富集分析。在胃切除大鼠和对照大鼠中,每个个体微生物组由少量rDNA主导,出现频率为>5%(图。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba, ESM表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba, ESM无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba),仅占基序的0.31-1.25%,但在整体基序丰度中占很大比例(在切除胃的大鼠盲肠中高达38.38%)(见表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).相比之下,微生物组中最大的多样性(超过88%的不同基序)是由频率极低(<0.5%)的基序所占,总共只覆盖了测序微生物组的18.78-23.98%(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

图4gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba

VSG对GK大鼠肠道菌群结构的影响。计算GK大鼠VSG后盲肠和结肠样本中宏基因组测序衍生的16S rDNA基序的频率(gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)或假手术(gydF4y2BangydF4y2Ba= 8) (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).计算两组大鼠盲肠、结肠及盲肠和结肠联合数据的rDNA motif频率均值(gydF4y2BabgydF4y2Ba).数据显示了84个最丰富的主题。(中的每一行gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)表示不同的母题颜色,根据其频率和(gydF4y2BabgydF4y2Ba)表示各母题的相对比例;箭头在(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和(gydF4y2BabgydF4y2Ba)代表V13A7759。定量RT-PCR检测序列V13A7759 (gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba)在GK大鼠VSG后(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6) (gydF4y2BacgydF4y2Ba)和GK大鼠盲肠菌群转移(CMT)后(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3) (gydF4y2BadgydF4y2Ba);gydF4y2BangydF4y2Ba两个实验中sham/control = 4。所有rDNA基序、相关频率和大鼠组间的统计差异详见ESM表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba.数据为平均值±SEM。非参数Mann-WhitneygydF4y2BaUgydF4y2Ba采用检验方法进行统计分析gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba丰富。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05 vs假手术GK大鼠(gydF4y2BacgydF4y2Ba)或注射假手术的GK大鼠的菌群(gydF4y2BadgydF4y2Ba)gydF4y2Ba

p . coprigydF4y2Ba在GK肠道菌群中占主导地位,并被VSG富集gydF4y2Ba

我们接下来在胃切除大鼠和对照大鼠中寻找差异富集的rDNA基序。我们确定了10个基序在vsg处理的大鼠中过度表达,16个基序在对照组中过度表达(表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba).两个基序只存在于sham (V13A9832)和VSG (V13A7019)大鼠肠道菌群中。最常见的rDNA motif (V13A7759)占个体样品微生物组的54.5%,在胃切除的GK大鼠中显著高于对照组(9.07%)(22.71%)。gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.046)(表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba).在微生物基因组数据库中进行序列同源性搜索,发现只有9个rDNA基序与单个(V13A7759、V13A9569、V13A12536、V13A6709、V13A399、V13A234、V13A622)或多个(V13A1861、V13A12857)细菌的DNA序列具有最大的序列相似性(100%)(见表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba).GK大鼠中最主要的基序(V13A7759)与支架组件同源gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba(表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba).其在去胃GK大鼠和接种去胃GK大鼠的菌群后显著富集,经盲肠DNA定量PCR证实(图5)。gydF4y2Ba4 c, dgydF4y2Ba).gydF4y2Ba

表2切除胃(A)或假手术(B) GK大鼠肠道菌群中显著富集rDNA基序的频率gydF4y2Ba

肠gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba富集改善GK大鼠的葡萄糖调节gydF4y2Ba

由于有争议的作用gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba关于心脏代谢表型[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]的研究中,我们将重点放在了这种细菌的功能研究上,它是我们的模型系统中为数不多的商业可用物种之一。验证对…作用的假设gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba在改善血糖调节方面,我们用抗生素(万古霉素和卡那霉素)治疗GK大鼠,使其生长并导致gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba肠道浓缩(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba(Fig.实验三。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).我们证实抗生素显著降低了粪便中的细菌DNA浓度(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),从而抑制肠道细菌生态系统,并显著增加gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba).抗生素不影响体重(ESM图。gydF4y2Ba8gydF4y2BaA),但显著改善了葡萄糖耐量。抗生素治疗导致腹腔内葡萄糖注射后15和30分钟血糖显著降低(图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba),在累积血糖(图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)和ΔG参数(图5。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)与未治疗的GK对照组相比。两组大鼠葡萄糖诱导的胰岛素分泌相似(ESM图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

图5gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba

肠道菌群富集的影响gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba对GK大鼠葡萄糖稳态的影响GK大鼠用允许的抗生素治疗gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba或保持在无抗生素的条件下(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba).另一组GK大鼠接种gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba或heat-inactivatedgydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba(gydF4y2BafgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BajgydF4y2Ba).粪便DNA浓度和gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba在抗生素处理过的(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3-6)和控制(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4-6只大鼠(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba).粪便DNA浓度和gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba在接种前(抗生素后)联合使用广谱抗生素治疗的GK大鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5),大鼠接种gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6)或热灭活gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba(控制)gydF4y2BangydF4y2Ba= 3 - 4) (gydF4y2BafgydF4y2Ba,gydF4y2BaggydF4y2Ba).葡萄糖耐量(gydF4y2BacgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2BahgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BajgydF4y2Ba)在抗生素治疗后10天禁食(16 h)的GK大鼠进行IPGTT后测定gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba接种。数据为平均值±SEM。采用Kruskal-Wallis试验分析糖耐量数据。的非参数Mann-WhitneygydF4y2BaUgydF4y2Ba采用检验方法对其他变量进行分析。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05 vs对照组。CumG: IPGTT期间的累积血糖水平;ΔG,累积血糖水平高于基线gydF4y2Ba

p . coprigydF4y2Ba接种改善GK大鼠的葡萄糖调节gydF4y2Ba

进一步评估的影响gydF4y2Bap . coprigydF4y2BaGK大鼠接种5 × 10gydF4y2Ba8gydF4y2BaCFUgydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba或与heat-killedgydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba(Fig.实验4。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).我们初步测定了粪便DNA浓度,以验证抗生素对菌群的杀灭作用。然后通过PCR验证了肠道菌群的富集gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba在接种细菌12天后进行(图5)。gydF4y2Ba5 f, ggydF4y2Ba).gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba治疗对体重没有影响(ESM图。gydF4y2Ba8gydF4y2Bab),但与热灭活处理的GK大鼠相比,与葡萄糖不耐受的显著降低有关gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba.腹腔内注射葡萄糖后血糖较低gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba与对照组相比(图5。gydF4y2Ba5 hgydF4y2Ba).gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba在葡萄糖耐量试验期间,接种可使累积血糖水平显著降低(图1)。gydF4y2Ba5我gydF4y2Ba)和ΔG参数(图5。gydF4y2Ba5 jgydF4y2Ba).gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba对胰岛素分泌没有显著影响(ESM图。gydF4y2Ba9gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

我们的数据显示肠的代表性增加gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba改善葡萄糖稳态。gydF4y2Ba

肠道菌群丰富的肠道菌群gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba刺激胆汁酸代谢gydF4y2Ba

鉴于减肥手术在改善人体葡萄糖耐量和增加循环胆汁酸方面的一致效果[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,我们假设gydF4y2Bap . coprigydF4y2BaGK大鼠肠道富集刺激胆汁酸代谢。质谱分析允许定量27-35胆汁酸在所有大鼠组的血浆中,作为单个分子分析(ESM表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)和总胆汁酸、一级胆汁酸和二级胆汁酸(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba).VSG使GK大鼠的熊胆酸、牛磺酸-熊去氧胆酸(5β-胆酸-3α,7β-二醇)浓度显著升高gydF4y2BaNgydF4y2Ba-(2-磺基))和牛磺酸脱氧胆酸(5β-胆酸-3α,6α-二醇gydF4y2BaNgydF4y2Ba-(2-巯基)-酰胺)酸(ESM表)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba).胃切除和假手术大鼠的总胆汁酸和初级胆汁酸浓度相似。gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba).二次胆汁酸水平,特别是脱氧胆酸,在VSG大鼠中增加2.8倍,导致胃切除大鼠的一次胆汁酸与二次胆汁酸的比率显著下降(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.030)。gydF4y2Ba

图6gydF4y2Ba
图6gydF4y2Ba

肠道的影响gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba对GK大鼠血浆胆汁酸浓度的影响。采用质谱法测定GK大鼠VSG后血浆胆汁酸浓度(gydF4y2BangydF4y2Ba= 8)或假手术(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5) (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba),在GK大鼠盲肠菌群转移(CMT)后,vsg处理的GK大鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)或假手术GK大鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4) (gydF4y2BaegydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BahgydF4y2Ba),在接受卡那霉素和万古霉素联合抗生素治疗的GK大鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)或对照组中未使用抗生素(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4) (gydF4y2Ba我gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BalgydF4y2Ba),或在GK大鼠接种gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6)或热灭活gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3) (gydF4y2Ba米gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BapgydF4y2Ba).非参数Mann-WhitneygydF4y2BaUgydF4y2Ba采用检验进行统计分析。数据为平均值±SEM。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,gydF4y2Ba__gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.05,gydF4y2Ba‡gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.06,gydF4y2Ba§gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.07 vs相关对照。英航,胆汁酸gydF4y2Ba

同样,从胃切除的GK大鼠到GK大鼠的盲肠菌群转移与熊胆酸、牛磺酸-熊胆酸(5β-胆酸)浓度显著升高相关gydF4y2BaNgydF4y2Ba-(2-巯基)-酰胺))和异石胆酸(ESM表)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba).治疗后的GK大鼠显示总胆汁酸(+239%)、初级胆汁酸(+214%)和次级胆汁酸(+260%)显著刺激。gydF4y2Ba6 eggydF4y2Ba).相反,许多胆汁酸被下调gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba导致总胆汁酸、一级和二级胆汁酸的下调,一级和二级胆汁酸的比值增加5.5倍(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.007) (ESM表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba6 i (kgydF4y2Ba).最后,gydF4y2Bap . coprigydF4y2BaGK大鼠的多种胆汁酸的浓度增加,包括胆酸(+518%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.008), allolithocholic (+454%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.016),脱氧胆碱(+341%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.048)和ω- muricic (+810%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.027)酸,导致总含量显著增加(+460%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.047)和初级(+492%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.010)胆汁酸(ESM表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba;无花果。gydF4y2Ba6 m, ngydF4y2Ba).gydF4y2Ba

总的来说,胆汁酸在肠道富集时受到刺激gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba.有趣的是gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba接种与初级胆汁酸-脱氧胆酸(+341%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.048)和胆酸(+610%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.009) (ESM表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),激活FXR [gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

FXR在肝脏的表达增强与胆汁酸代谢的刺激和葡萄糖耐量的改善有关gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba浓缩gydF4y2Ba

在减肥手术和循环胆汁酸相关刺激的反应中,FXR的激活一直有报道[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba].我们分析了gydF4y2BaFxrgydF4y2Ba(也称为gydF4y2BaNr1h4gydF4y2Ba)和与其功能相关的基因在我们的研究中产生的四个模型的肝脏和脂肪组织。肝脏的表达gydF4y2BaFxrgydF4y2Ba在切除胃的GK大鼠和接种VSG GK大鼠肠道菌群或gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba,与相应的对照进行比较(图。gydF4y2Ba7模拟gydF4y2Ba).FXR的主要目标(gydF4y2Ba轴马力gydF4y2Ba(也被称为gydF4y2BaNr0b2gydF4y2Ba])和gydF4y2BaG6pcgydF4y2Ba编码葡萄糖6磷酸酶的,其表达方向发生了类似于gydF4y2BaFxrgydF4y2Ba在四组大鼠中。的表达gydF4y2BaPepckgydF4y2Ba(编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)和gydF4y2BaCyp7a1gydF4y2Ba(编码胆固醇7α-羟化酶[CYP7A1]/细胞色素P450),它们通常被胆油酸和FXR下调,但在去胃GK大鼠中被抑制(gydF4y2BaPepckgydF4y2Ba而且gydF4y2BaCyp7a1gydF4y2Ba),用VSG GK大鼠肠道菌群处理的GK大鼠(gydF4y2BaPepckgydF4y2Ba)和GK大鼠接种gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba(gydF4y2BaCyp7a1gydF4y2Ba).转录因子的表达gydF4y2BaChrebpgydF4y2Ba(也称为gydF4y2BaMlxiplgydF4y2Ba),gydF4y2BaSrebf1gydF4y2Ba对VSG大鼠、GK大鼠均有显著刺激作用gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba在GK大鼠中接种gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba7 a、c、dgydF4y2Ba).的表达gydF4y2BaSorbs1gydF4y2Ba,这与胰岛素信号传递有关gydF4y2BaPyglgydF4y2BaVSG和肠道增加对糖原磷酸化酶无影响gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba的水平。gydF4y2Ba

图7gydF4y2Ba
图7gydF4y2Ba

GK大鼠和对照组肝脏基因表达和肝脏三酰甘油和糖原的储存。肝脏基因表达(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba)用定量RT-PCR和肝三酰甘油含量定量(gydF4y2BaegydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BahgydF4y2Ba)和糖原储存(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BalgydF4y2Ba)在GK大鼠VSG后测定(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2Ba我gydF4y2Ba),在GK大鼠盲肠菌群转移(CMT)后,vsg处理的GK大鼠(gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba,gydF4y2BajgydF4y2Ba),在GK大鼠治疗后gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba宽容的抗生素(gydF4y2BacgydF4y2Ba,gydF4y2BaggydF4y2Ba,gydF4y2BakgydF4y2Ba)和GK大鼠接种gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba(gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BahgydF4y2Ba,gydF4y2BalgydF4y2Ba).gydF4y2BangydF4y2Ba=每组4-10人。数据为平均值±SEM。非参数Mann-WhitneygydF4y2BaUgydF4y2Ba采用检验进行统计分析。*gydF4y2BapgydF4y2Bavs假手术大鼠/对照组< 0.05gydF4y2Ba

测试被刺激的功能相关性gydF4y2BaFxrgydF4y2Ba在大鼠模型中,我们分析了三酰甘油的肝脏浓度(图。gydF4y2Ba7情况gydF4y2Ba)和糖原(图。gydF4y2Ba7我gydF4y2Ba),两者均受FXR规管。三酰甘油水平在实验组中没有变化(图。gydF4y2Ba7情况gydF4y2Ba).相比之下,去胃GK大鼠的肝糖原含量明显升高(图1)。gydF4y2Ba7我gydF4y2Ba)和GK大鼠gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba宽容的抗生素(图。gydF4y2Ba7 kgydF4y2Ba)而不是相应的对照组。gydF4y2Ba

最后,考虑到减肥手术和FXR激活对脂肪组织代谢和炎症的功能影响[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba],我们分析了GK大鼠对VSG和增强肠道反应的脂肪组织中相关基因的表达gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba(ESM无花果。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba).与肝脏数据一致gydF4y2BaFxrgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSrebf1gydF4y2BaVSG后脂肪组织中的表达协调上调(ESM图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba一)治疗gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba允许使用抗生素和接种gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba对GK大鼠也有刺激作用gydF4y2BaFxrgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSrebf1gydF4y2Ba表达式(ESM无花果。gydF4y2Ba10gydF4y2Bac, d).的表达式gydF4y2BaTnfagydF4y2Ba在四个实验组中都没有变化。相比之下,表达下调gydF4y2Ba白细胞介素6gydF4y2Ba在GK大鼠中接种去胃GK大鼠的菌群(ESM图。gydF4y2Ba10gydF4y2Bab)或gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba(ESM无花果。gydF4y2Ba10gydF4y2BaD)和表达上调gydF4y2BaIl10gydF4y2Ba四种大鼠模型均无明显差异(ESM图。gydF4y2Ba10gydF4y2BaA-d),提示抗炎作用gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba.gydF4y2Ba

总的来说,这些数据强调了肠道的作用gydF4y2Bap . coprigydF4y2BaFXR信号的转录调控,有助于改善葡萄糖和脂质稳态。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

我们的数据强调了VSG对多基因型2型糖尿病非肥胖GK大鼠模型肠道菌群结构重塑和葡萄糖不耐受的长期影响,因此避免了糖尿病和肥胖个体胃切除引起的体重减轻的混杂效应。我们的数据表明,VSG可能等同于,甚至优于热量限制,通常只导致糖尿病患者葡萄糖稳态的短暂改善[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba].我们的结果有助于我们理解胃切除和改善葡萄糖稳态之间的关系,通过证明一种特定的细菌种类(gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba),在GK株糖耐量的调节、FXR和胆汁酸代谢的激活等过程中受到VSG的刺激。gydF4y2Ba

通过降低疾病风险与增加细菌多样性和基因丰富度之间的联系,推断出心脏代谢疾病与胃肠道微生物群之间的因果关系[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]和鉴定与肥胖患者糖尿病手术缓解相关的细菌[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]和临床前模型[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba].在胃切除的GK大鼠中富集最多的rDNA基序排列与的草图基因组组装一致gydF4y2Bap . copri。gydF4y2Ba考虑到gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba在GK和切除胃的GK大鼠中,基因丰富度不太可能显著解释VSG后葡萄糖稳态的改善。另一方面,我们在GK大鼠携带丰富的肠道gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba大量支持肠道之间的因果关系gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba改善了葡萄糖代谢。gydF4y2Ba

对其病理生理作用的研究gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba导致了明显矛盾的结果,这可能是由于宿主的饮食依赖效应和几个gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba演化支(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba].干预研究表明,粪便水平gydF4y2Ba普氏菌gydF4y2Ba与高纤维和高碳水化合物饮食摄入量有关[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba].高纤维饮食改善葡萄糖稳态和增加粪便gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba水平,导致肝脏糖原增加的小鼠接种的人类菌群富集gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba].另一方面,gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba与人类和高脂小鼠的胰岛素抵抗有关[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba].粪便gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba在2型糖尿病中升高[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba].GK大鼠肠道后葡萄糖耐量改善,循环胆汁酸增加gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba富集与其有益的代谢作用一致。我们假设自然增加了肠道gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba通过抵消永久性高血糖的不良影响,以及刺激胰岛素分泌的基因序列变异,这有助于该品系糖尿病的复杂病因学[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,并下调心力衰竭相关基因的表达[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

血浆胆汁酸组成的变化,加上改变的肠道菌群生态,是人类和临床前模型中适应减肥手术的标志[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba].胆汁酸激活FXR刺激核受体SHP的表达,从而下调肝CYP7A1的表达,CYP7A1是胆汁酸生物合成过程中的关键酶,可将胆固醇转化为7α-羟基胆固醇[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba].鉴于减肥手术对胆汁酸代谢和FXR信号的影响[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba两者之间的联系增加了gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba丰度与葡萄糖代谢[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,我们推断葡萄糖耐量的提高与肠道的增加有关gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba与FXR信号通路有关。调节的表达gydF4y2BaFxrgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba轴马力gydF4y2Ba的表达下调gydF4y2BaCyp7a1gydF4y2Ba结合胆汁酸合成和实验诱导的肠道微生物富集gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba,支持我们的假设。gydF4y2Ba

平行的超表达的gydF4y2BaFxrgydF4y2Ba以及转录因子gydF4y2BaChrebpgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSrebp1cgydF4y2Ba(也称为gydF4y2BaSrebf1gydF4y2Ba),调节三酰甘油、脂肪酸和磷脂的代谢[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba],在vsg处理大鼠和GK大鼠接种gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba,可能是这些模型中发现的肝糖原含量增加的原因。一致的过度gydF4y2BaFxrgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSrebp1cgydF4y2Ba在切除胃的GK大鼠脂肪组织和我们的模型中gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba富集与系统性增加有关gydF4y2BaIl10gydF4y2Ba表达,提示激活抗炎机制。gydF4y2Ba

我们的发现值得进一步调查。细菌种类在GK肠道中出现频率较低,但在VSG后显著差异富集,可能有助于改善葡萄糖稳态,无论是单独存在还是作为细菌生态系统的一部分。相反,抗生素治疗增加肠道gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba丰度可能导致调节葡萄糖耐量的细菌种类的丰度发生协调变化,这些细菌种类的丰度还有待确定。此外,包括肠道激素在内的其他分子系统也可能是切除胃的GK大鼠葡萄糖稳态恢复的原因。如GK大鼠Roux-en-Y胃旁路术(RYGB)可增强胰岛素分泌,抑制胰高血糖素分泌,并通过刺激肽酪氨酸(PYY)恢复胰岛结构[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的结果说明了糖尿病手术治疗后肠道微生物群和宿主代谢之间的相互作用。我们证明gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba是多基因型2型糖尿病GK非肥胖模型中的优势肠道细菌种类,胃切除术进一步刺激该模型,它的肠道富集模拟了减肥手术的效果,提高循环胆汁酸和刺激FXR表达,以减少葡萄糖不耐受。gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba代表了发展基于益生菌的糖尿病疗法的一个有吸引力的候选人。确切的基因组结构和基因含量gydF4y2Bap . coprigydF4y2Ba尚待确定,以阐明其基因组编码的生物功能,解释其发酵膳食多糖的能力[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba],在炎症中的作用[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba,gydF4y2Ba51gydF4y2Ba及其对宿主代谢的影响。gydF4y2Ba