通过直接克隆和测序16S rRNA基因比较人类肠道细菌多样性

摘要

采用pcr扩增16S rDNA克隆文库，比较空肠、回肠远端、升结肠和直肠黏膜活检标本的细菌多样性。从粘膜活检中获得的347个克隆被部分测序，并被分配到该结构域的6个系统发育门细菌：厚壁菌门，拟杆菌门，变形菌门，Fusobacteria，疣微菌门,放线菌。与其他样品相比，空肠样品的微生物多样性最低，升结肠的微生物多样性最高。回肠远端、升结肠和直肠的克隆文库差异无统计学意义(P> 0.0043)，但与空肠库(P= 0.001)。从空肠活检中检索到的序列主要由与链球菌(67%)，而来自远端回肠、升结肠和直肠的序列居群以拟杆菌门(27 - 49%)梭状芽胞杆菌XIVa组(20-34%)和IV组(7-13%)。结果表明，空肠的微生物群落与回肠远端、升结肠和直肠不同，主要系统发育类群从回肠远端到直肠相似。

1介绍

人体胃肠道的微生物群是一个复杂的微生物生态系统，该生态系统中的细菌组成随着肠道长度的不同而不同。胃和小肠上三分之二的细菌浓度为10²-10年⁴细菌毫升⁻¹胃或肠道内容物[1］．这些区域的微生物数量受酸性pH值、含量的短运输时间、胆汁和胰液分泌的控制。小肠的末端，回肠，其浓度为10⁷-10年⁸细菌毫升⁻¹通常含有与结肠中发现的细菌相似的细菌[1，2］．人类的结肠中有大量的细菌(10¹⁰-10年¹¹细菌g⁻¹肠内容物)和专性厌氧菌的数量是兼性厌氧菌的100-1000倍[1，2］．肠道菌群的组成和活性因其在营养、免疫系统发育和定植抵抗等方面的贡献而在人体健康中发挥重要作用[3 - 7］．某些种类的肠道细菌已被用作益生菌，为人类健康提供有益的影响[8 - 10］．肠道微生物也与疾病有关，如炎症性肠病[11，12]、结肠癌[13，14]，以及多器官功能衰竭[15］．我们对肠道细菌多样性的了解对于理解这些现象和评估旨在调节肠道细菌菌群的饮食治疗的效果至关重要。

目前关于细菌多样性的知识主要是基于经典的培养依赖技术的使用。很明显，培养技术有缺点。有强有力的证据表明，基于培养的方法只能检测到肠道中存在的一小部分细菌，因为一些细菌是不可培养的[16］．此外，用经典方法鉴定和鉴定分离物费时且有时缺乏准确性[17］．近年来，基于16S rRNA的分子工具，如PCR克隆[18]、变性凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳(分别为DGGE和TGGE) [19，20.]和荧光原位杂交(FISH) [16]已成功应用于微生物生态学，使无需培养即可研究肠道菌群的组成和多样性成为可能。随机pcr扩增的16S rDNA克隆测序已用于分析肠道菌群，并为人类肠道细菌多样性提供了有价值的信息[18，21，22］．然而，大多数研究都是基于粪便样本的分析，很少有作者试图比较同一个体内人类肠道不同部位的细菌多样性[23］．

据我们所知，目前的工作是第一次尝试利用16S rRNA基因的分子分析来检测人类空肠粘膜中的微生物区系，并比较一个健康个体空肠、远端回肠、升结肠和直肠粘膜活检中的细菌多样性。

2材料与方法

2.1受试者和样本的收集

本研究对象为54岁女性，既往健康状况良好，未做过手术，无药物治疗，胃肠道无身体不适。患者饮食正常，取样前4周未服用益生菌和抗生素。她接受了常规食管-胃-十二指肠镜检查，结果正常。

在结肠镜检查前一天，通过饮用45毫升磷酸钠(磷^®，费林，瑞典)两次。使用Watson肠活检胶囊(Ferraris开发和工程有限公司，埃德蒙顿，伦敦，英国)从空肠上部、Treitz韧带远端进行口服活检。在结肠镜检查中使用活检钳(PCF 160 AL结肠镜和FB24 41活检钳，Olympus, GmbH，德国)对远端回肠、升结肠和直肠进行活检。两种方法取活检和取标本之间的时间间隔都在10到20秒之间。胶囊和活检钳在使用前都经过消毒。取每个样本后用无菌生理盐水冲洗活检通道。在每个位置收集两个活检组织，直接置于1.5 ml TE缓冲液(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)中。样品立即在液氮中冷冻，并保存在−80°C。这项研究得到了隆德大学人类伦理委员会的批准。

2.2 DNA提取

活检总DNA用QIAamp DNA Mini Kit(组织方案;Qiagen, Hilden，德国)结合玻璃珠敲打。简单地说，在TE缓冲液中冷冻的活检组织(2份)在冰上解冻，离心并在60 μl磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.3, OXOID, Basingstoke, UK)中重悬。根据制造商的说明，用缓冲ALT，蛋白酶K, RNase A和缓冲AL处理样品。将15个玻璃珠(直径2毫米)加入样品管中，在Eppendorf混合器5432 (Eppendorf, Hamburg, Germany)中，在4°C下摇45分钟，以进一步分解细胞。DNA用乙醇沉淀，QIAamp旋转柱纯化，用50 μl AE缓冲液(10 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, ph9.0)洗脱。在每个提取过程中以相同的方式处理60微升PBS作为阴性对照。

2.3 PCR扩增和克隆

用通用引物ENV1(5’-AGA GTT TGA TII TGG CTC AG-3’扩增16S rRNA基因。大肠杆菌编号8-27)和ENV2 (5 ' -CGG ITA CCT TGT TAC GAC TT-3 '，大肠杆菌编号1511-1492)[24］．引物质量为0.2 μM，模板DNA质量为1 ~ 3 μl, 10× PCR反应缓冲液(Tris-HCl 100 mM, KCl 500 mM, pH 8.3)质量为5 μl，脱氧核糖核酸三磷酸200 μM, MgCl 2.5 mM₂2.5 U Taq DNA聚合酶(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)，最终体积为50 μl。PCR在DNA热循环仪(Perkin-Elmer, Norwalk, USA)中进行，流程如下:在94°C下进行1个周期，持续3分钟，然后在96°C下进行25个周期，持续15秒，50°C下持续30秒，72°C下持续90秒，再在72°C下延长10分钟。溴化乙矾染色后，PCR产物在TBE缓冲液(89 mM Tris, 89 mM硼酸，2.5 mM EDTA, pH 8.3)中1%(重量/体积)琼脂糖凝胶中进行检查。

每个样品进行6次反应，同一样品的PCR产物合并以减少PCR偏差[25］．聚合后的PCR产物在TAE缓冲液(40 mM Tris, 20 mM乙酸，1 mM EDTA, pH 8.3)中的1% (wt./vol.)琼脂糖上运行。从凝胶中切除条带，并用GENECLEAN II Kit (Bio 101, Carlsbad, USA)纯化DNA。纯化的PCR产物被连接到pGEM-T载体体系II中，然后转化为大肠杆菌JM109高效有效电池根据制造商的说明(Promega, Madison, USA)。在添加氨苄西林(100 μg ml)的Luria-Bertani (LB)琼脂上筛选菌落，菌落呈蓝色/白色⁻¹；Sigma, St. Louis, USA)， X-gal (100 μg ml⁻¹)和IPTG (0.5 mM;Promega，麦迪逊，美国)。从每个样品中随机选取白色菌落，储存在−80°C的甘油缓冲液中。

2.4无性系的测序和系统发育关系

质粒DNA由Nucleospin MWG-Plasmid Prep 96 (MWG-Biotech, Ebersberg, Germany)从所选克隆中分离。插入DNA由MWG-Biotech公司使用自动化ABI 3700测序仪(Applied Biosystems, Darmstadt, Germany)测序。引物S-*- univ -0519-a- 18和S-*- univ -0915-a- a- 16 [26]和ABI PRISM BigDye Terminators v3.0周期测序试剂盒(应用生物系统公司)。

使用程序CHIMERA_CHECK [27]和柏勒洛丰[28］．从两个独立的文库检索相同的序列被认为是非嵌合序列的证据[21］．16S rDNA序列(大多在850个碱基对左右)根据BLAST被划分为主要的系统发育类群[29]搜索GenBank。来自粘膜活检和已知系统发育关系的公共数据库的序列与CLUSTAL X计划一致[30.]，并使用Bioedit Sequence alignment Editor version 5.0.9手动检查和校正对齐[31］．系统发育分析采用PHYLIP包(version 3.5c;由J. Felsenstein分发，华盛顿大学，西雅图)。这些课程可以在http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/phylogeny/phylip-fr.html．根据Jukes-Cantor模型，用DNADIST程序计算距离矩阵和相似矩阵。采用邻居连接算法构建系统发育树[32］．使用Bootstrap分析(100次重复)来估计树拓扑的置信度，并使用CONSENSE程序生成共识树。TREEVIEW程序用于绘制树木[33］．

最初对粘膜活检的克隆进行部分测序，对与GenBank条目16S rDNA序列相似性<97%的克隆进行近全长测序。近全长16S rDNA序列和用于系统发育分析的序列已存入GenBank数据库，登录号为AY684365-AY684431和AY862393-AY862394。用于系统发育分析的参考菌株和克隆序列也来自GenBank。

2.5统计分析

稀疏分析[34]， Shannon指数，Simpson指数的倒数[35]和Chao-1估计量[36]来表征粘膜样品的微生物多样性。稀有度是在采样不均等的地点、处理或栖息地之间比较观察到的物种丰富度[37］．稀薄度曲线是用analytical rarefaction 1.3软件制作的，该软件可在http://www.uga.edu/~strata/software/index.html．香农指数(H’)是一般的多样性指数，与物种丰富度和均匀度呈正相关，对稀有物种的丰度变化更为敏感[35，37］．辛普森氏指数(D)是优势度的量度，显示随机选取的两个无性系来自同一物种的概率[37］．该指数是根据最常见物种的丰度进行加权的。使用1/D代替了辛普森指数的原始公式，保证了指数的值(1/D)随着物种多样性的增加而增加[35］．Chao-1可用于从样品中估计微生物群落的总丰富度。Chao-1特别有用，因为存在一个有效的方差表达式，可用于计算置信区间(ci) [36］．

利用Sorensen指数比较文库的系统型组成，C_年代= 2j／（一个+b),j为样本A和样本B中发现的系型数，一个样本A中系统型的数量，和b为样本B中系统型的数量[35］．通过Singleton等人所描述的LIBSHUFF程序，对克隆库之间组成差异的重要性进行了检查。[38］．Cramér-von采用Mises统计量计算同源和异源覆盖曲线的差异，采用蒙特卡罗重采样法推断统计显著性。由于LIBSHUFF不纠正多个库比较的实验误差，Bonferroni修正被用于计算临界值p价值。如果两个库中较低的一个被认为彼此有显著不同P-由LIBSHUFF生成的值小于或等于临界值p-value(临界值p四个克隆库的-value为0.0043)。克隆库的覆盖率由公式[1−(n/N)]正如古德[39),n系统型的数量是否由一个无性系和表示N是克隆的总数。使用中描述的方法生成LIBSHUFF分析的距离矩阵2.4节．

3的结果

通过计算多样性指标，比较各文库的系统型组成，分析各文库16S rDNA克隆的系统发育分布，检测空肠、远端回肠、升结肠和直肠文库的细菌多样性。

3.1多样性措施

为了计算多样性度量，对16S rDNA克隆进行部分测序，按照Suau等人的定义，将序列相似性≥98%的克隆归为相同的系统型。[21］．共分析了347个粘膜活检克隆，其中空肠88个，回肠远端85个，升结肠86个，直肠88个。共鉴定出76种系统型，分别从空肠、远端回肠、升结肠和直肠活检中检测出22、33、37和32种(表1)．

将观察到的系型数量与测序的无性系数量(图1)．曲线图上的系统型检出率下降，表明文库的大部分多样性已被检测到。使用好公式[39]，空肠、远端回肠、升结肠和直肠库的覆盖率分别为86%、80%、76%和80%。稀疏曲线还表明，序列种群在空肠中多样性最低，在升结肠中多样性最高。通过计算Shannon指数和Simpson指数的倒数(表1)．Chao-1估算器显示，从空肠到回肠远端，再到升结肠，物种丰富度有增加的趋势，从升结肠到直肠，物种丰富度略有下降(表1)．由于Chao-1估计量在每个肠道区域的95%置信区间(ci)重叠，因此在0.05的显著水平下，不能拒绝四个肠道区域的丰富度无差异的原假设。

3.2克隆文库微生物组成比较

通过计算相似指数和LIBSHUFF分析比较了克隆文库中的细菌组成。这些无性系库的类群相似度为0 ~ 0.6078 (表2)．空肠文库与远端回肠文库和升结肠文库的相似度为0.0727，与直肠文库的相似度为0.0339。空肠文库与远端回肠文库的相似度为0.0727。远端回肠文库与升结肠和直肠文库具有相似数量的系统型。升结肠库与直肠库相似指数最高(0.6078)，回肠远端库与升结肠库、回肠远端库与直肠库相似指数较高(分别为0.5714和0.5846)。利用LIBSHUFF分析对空肠文库和其他文库的同源和异源覆盖曲线进行配对比较，结果为低P值(P= 0.001;表3)，表明空肠文库与远端回肠、升结肠和直肠的文库存在显著差异。回肠远端、升结肠、直肠文库比较，两者无显著性差异(P> 0.0043,表3)．

3.3 16S rDNA序列的系统发育相关性

从粘膜样本中产生的所有16S rDNA序列都在GenBank上进行BLAST搜索。在总共347个克隆中，9.5%的克隆(18个系型)与它们最近的数据库条目的序列相似度低于97%，可能属于迄今未知的系型[40］．根据BLAST结果，所有序列均归属于该结构域的6个系统发育门细菌：厚壁菌门，拟杆菌门，变形菌门，Fusobacteria，疣微菌门,放线菌（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html)．大部分(88%)恢复序列属于厚壁菌门而且拟杆菌门门。各克隆库中不同系统发育类群的相对丰度如图所示图2．序列的系统发育分析表明，空肠文库以与大肠杆菌密切相关的序列为主链球菌属，而拟杆菌门,梭状芽胞杆菌Collins等的XIVa和IV簇[41]为从远端回肠、升结肠和直肠文库中鉴定出的优势菌群。分别有49%、27%和43%的远端回肠、升结肠和直肠文库检索到的序列被分配到拟杆菌门门。使用Fisher精确检验的统计分析显示，与远端回肠和直肠文库相比，与该门相关的序列在升结肠文库中较少(p= 0.003和p= 0.027)，回肠远端文库与直肠文库间该门相对丰度无明显差异(p= 0.448)。

3.3.1壁厚菌门

57%的序列与厚壁菌门．该门的大部分序列与属的亲缘关系密切链球菌而且梭状芽胞杆菌Collins等人的群集[41］．

在空肠文库中，59个序列与链球菌物种(序列相似性≥98%)，包括美国缓和的克隆(51),唾液链球菌克隆(3),美国oralis(2)克隆,美国parasanguis(2个克隆)和美国anginosus(1)克隆)。两个序列来源于远端回肠最接近美国缓和的(99.1%序列相似性)和美国oralis(序列相似性98.2%)。没有链球菌在升结肠和直肠的文库中发现了克隆。

的大多数序列厚壁菌门门属于梭状芽胞杆菌集群(41］．71个克隆掉进了梭状芽胞杆菌第十四组(图3)．在回肠远端、升结肠和直肠的文库中发现了该簇的克隆，但在空肠文库中没有发现(图2)．63个克隆与先前培养的细菌或已报道的来自人类肠道、粪便和猪肠道的细菌克隆的序列相似性≥97% [19，研讨会，42，43］．24个克隆被分配给梭状芽胞杆菌第四组(图4)．除了空肠(图2)．分别鉴定为3个和14个无性系orbiscindens梭状芽胞杆菌而且Faecalibacterium prausnitzii(>99%序列相似度)。聚类IV中的其余序列与GenBank数据库条目的序列相似性<97%。

许多序列也与梭状芽胞杆菌图4)．22个克隆被归为IX簇，其中14个克隆被鉴定为Dialister invisus(>99%序列相似度)与6个克隆密切相关韦永氏球菌属Spp .(>98%序列相似性)。该集群中的所有克隆与GenBank数据库条目的序列相似度为> 98%。在XIVb簇中，有8个克隆与未培养的细菌克隆p-4247-4Wa3最接近(>序列相似性97%)[432个克隆与GenBank数据库条目序列相似度<94%。

在厚壁菌门， 7个克隆无法分配给链球菌或梭状芽胞杆菌上面提到的集群。其中三个被确认为真细菌dolichum，Gemella haemolysans而且Abiotrophia para-adiacens(>99%序列相似性)。剩下的克隆体与Peptococcus尼日尔(序列相似性90-91%)或与猪肠克隆p-5389-2wb5(序列相似性91-92%)[43］．

3.3.2拟杆菌

106个克隆(占克隆总数的31%)被放入拟杆菌门（图5)．95个克隆来自远端回肠、升结肠和直肠的文库脆弱拟杆菌子组(RDP注册号2.15.1.2.8)。该子组中的克隆与GenBank数据库条目的序列相似度≥98%。21个克隆被鉴定为拟杆菌均匀化(序列相似度≥99)，最接近的有28个叫多形拟杆菌(序列相似度≥98%)。3个系型(27个克隆)与人类结肠样本的未培养细菌克隆密切相关，如HuCB3、HuCC30和HuCA21 [22］．19个克隆与Suau等报道的未培养细菌adhufec367序列相似度≥99%。[21］．

在剩下的克隆中，从直肠中恢复的一个序列最接近拟杆菌distasonis(97%序列相似度)。将7个序列归为一类Rikenella microfusus与两种相似的未培养细菌adhufec52.25(>99%序列相似性)[44]和五个与未培养的细菌克隆HuCB 23最接近(>95%相似度)[22］．从空肠分离得到的3个无性系均与猪的亲缘关系密切普氏菌属(>97%序列相似性)。

3.3.3变形菌门

17个序列(占克隆总数的5%)被放入其中变形菌门（图6)．β-内变形菌门， 3个序列被鉴定为奈瑟氏菌属subflava(>99%序列相似度)与两个序列密切相关Sutterella wadsworthensis(序列相似性分别为96%和99%)。在γ-中鉴定出12个克隆变形菌门组及该组所有克隆均与先前培养的细菌密切相关(>序列相似性为98.5%)，包括嗜血杆菌56，大肠杆菌，不动杆菌johnsonii，不动杆菌haemolyticus，不动杆菌lwoffii而且假单胞菌putida．

3.3.4其他门

其余的门占从黏膜活检中恢复的总序列数的7%。七个序列被分配给Fusobacteria门和17个无性系放入疣微菌门门(图6)．克隆在疣微菌门门在远端回肠、升结肠和直肠中检出，而在空肠中未检出(图2)．只有一个克隆被聚成放线菌（图6)，这个克隆体被鉴定为微球菌mucilaginosus(99%序列相似度)。

4讨论

本研究采用16S rDNA序列分析比较了人体肠道不同部位的细菌多样性。虽然其他基于16S rrna的技术，如DGGE和FISH，已被证明是描述人类肠道细菌多样性的有价值的工具，但序列分析的一个巨大优势是，序列数据的生成可用于设计群体特异性探针和引物，用于进一步研究。本研究中来自空肠和回肠粘膜活检的数据尤其重要，因为之前报道的这两个区域的16S rDNA序列信息很少。尽管近年来人们为确定肠道微生物的多样性做出了许多努力[研讨会]，本研究仍显示9.5%的克隆与任何数据库条目的序列相似度低于97%。

我们研究的一个结论性结果是，空肠的细菌群落在多样性指数、16S rDNA克隆的系统型组成和系统发育分布上与远端回肠、升结肠和直肠有显著差异。空肠库的多样性最低(表1)，与其他库有少数或没有共同的系型(表2)，以与属密切相关的序列为主(67%)链球菌（图2)．回肠远端、升结肠和直肠的文库更多样化(表1)，并由与拟杆菌门(27 - 49%),梭状芽胞杆菌XIVa组(20-34%)和IV组(7-13%)(图2)．本研究中发现的差异不太可能仅仅是由于PCR和克隆偏见，因为我们的发现与已知的微生物栖息的生理环境是一致的，而且以前的调查证据也支持这一点。使用传统培养方法进行的研究显示，小肠上三分之二(十二指肠和空肠)的主要微生物类型是耐酸细菌，如链球菌和乳酸杆菌[1］．Hold等人。22]分析了从三位老年受试者的结肠组织中获得的16S rDNA克隆文库，并表明梭状芽胞杆菌XIVa是最主要的群体(43-49%)，其次是拟杆菌门(20 - 35%)梭状芽胞杆菌IV类(11-18%)。最近一项对一名35岁女性的粘膜活检进行的调查显示，在人类远端回肠和结肠中最具代表性的组织是拟杆菌门(38%)和梭状芽胞杆菌第XIVa组(34%)[23］．用寡核苷酸探针杂交技术对27名健康成人粪便样本进行了研究，结果表明拟杆菌门在粪便菌群中，个体之间的差异可达20%至52% [45］．

几项研究比较了人类肠道不同部位的细菌群落。王等。[23]，利用16S rRNA基因克隆和测序分析比较了一人回肠末端、近端结肠和远端结肠的微生物区系，发现近端到远端存在内部一致的梯度，其中手术分类单位(OTUs)的数量增加，在最远的位点之间共享OTUs最少。Zoetendal等。[20.]使用DGGE对10名志愿者的升结肠、横结肠和降结肠的细菌群落进行比较，发现粘膜相关细菌沿结肠均匀分布。在我们的研究中，回肠远端、升结肠和直肠的克隆文库在多样性指数和系统型组成比较时是相似的，但系统发育分析表明这些序列属于拟杆菌门升结肠文库中门的含量(27%)低于远端回肠文库(43%)和直肠文库(49%)。然而，由于我们只比较了一个人的样本，我们发现的一般性质需要在更多个体的研究中进行测试。

基于pcr的分析可以引入不同类型的偏差[25，46，47]而这些偏差可能导致对微生物多样性的高估或低估。因此，16S rRNA基因克隆文库中的微生物多样性并不一定反映自然微生物系统的多样性。例如，在一个生物体内嵌合体和16S rRNA基因异质性的形成可能导致多样性被高估。另一方面，由于引物结合效率的差异导致细胞裂解不足和PCR扩增差异，可能导致对多样性的低估[47］．以往的研究表明，高G + C革兰氏阳性菌，如双歧杆菌属而且Atopobium当使用针对这些群体的探针FISH时，发现这些群体的数量显著增加[48]，但在人类粪便或黏膜样本的16S rRNA基因克隆文库中几乎检测不到[研讨会］．但是，我们的研究中所有的克隆文库都是在相同的条件下创建的，以确保所有样本的偏差都是相同的，因此可以通过统计分析来对肠道不同部位的细菌多样性进行相对比较。此外，在PCR扩增混合物中加入低模板DNA浓度，并结合多个PCR扩增，以减少PCR选择和漂移[49］．

综上所述，通过16S rDNA克隆文库分析，我们比较了人类肠道不同部位粘膜样品的细菌多样性。我们的结果显示，空肠的微生物群落与回肠远端、升结肠和直肠的微生物群落存在显著差异，从回肠远端到直肠的主要系统发育类群相似。此外，我们还发现了明显的减少拟杆菌门在升结肠与远端回肠和直肠比较。这些发现表明，要研究发生在胃肠道不同区域的疾病的纤维发酵或微生物群的参与等功能，从实际区域采集样本是很重要的。这是首次尝试比较空肠、远端回肠、升结肠和直肠粘膜活检中的微生物群落，并通过16S rRNA基因分子分析来描述人空肠中的细菌种群。

确认

我们感谢隆德大学医院临床研究能力中心的生物统计学家Jonas Björk，就数据的统计分析进行讨论。我们也感谢志愿者提供的粘膜活检。

参考文献