单细胞信使RNA测序揭示了罕见的肠细胞类型gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，每个细胞测序转录本数量的直方图。中位数(红线)是8559。288个细胞在两个通道上进行测序，总深度为106,950,038个reads。其中，32,694,069(31%)用有效的细胞特异性条形码进行了映射。gydF4y2BabgydF4y2Ba，每个细胞的总读数除以用唯一分子标识符计数的测序转录本总数的直方图。所有基因的平均过测序水平是6.9倍(红线)。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，使用欧几里得距离度量对所有过滤步骤中存活的238个肠道细胞的转录组相关矩阵进行分层聚类获得的树状图。至少有三组不同的细胞可以被识别。gydF4y2BabgydF4y2Ba，差距统计量gydF4y2BakgydF4y2Ba-表示相关矩阵作为聚类数函数的聚类。差距统计量反映了均匀分布数据中各点在聚类距离内的平均值与实际数据之间的差异。第一个局部最大值可以很好地估计出集群的数量，从而实现将数据最佳地分离到集群中gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。数据点和误差条表示50个自举样本的平均值和标准偏差。对于肠细胞，在间隙统计的基础上预测了6个簇数。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba在t-SNE图谱中，已知标记基因的转录数是用颜色编码的。所示为肠上皮细胞特异性基因图谱gydF4y2Ba支队伍gydF4y2Ba（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)，即肠内分泌标志物gydF4y2BaChgagydF4y2Ba（gydF4y2BabgydF4y2Ba)，即杯状细胞标记gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba（gydF4y2BacgydF4y2Ba)，即潘氏细胞标记gydF4y2BaLyz1gydF4y2Ba（gydF4y2BadgydF4y2Ba)，计算所有核糖体基因的转录数(gydF4y2BaegydF4y2Ba)和干细胞标记gydF4y2BaLgr5就gydF4y2Ba（gydF4y2BafgydF4y2Ba)．后两者在聚类2的细胞中上调，没有其他特异性的标记可以识别。这些细胞很可能对应于转运扩增细胞。所示的插图gydF4y2BabgydF4y2Ba描述的转录本计数gydF4y2BaChgagydF4y2Ba在对数尺度上，由于该基因的动态范围非常大。昏暗的,维度。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，转录本计数方差在整个肠道细胞测序集合作为平均表达的函数。红线表示与数据拟合的二阶多项式(左上角)。假设大量基因在不同细胞类型中遵循相似的转录数分布，该函数可用于估计负二项的参数，该负二项表示给定平均表达下预期转录数可变性的背景模型。在集群的特定细胞中观察给定转录计数的概率可以使用该分布并将该集群内的平均表达作为输入来计算。如果至少两个基因的表达概率<10gydF4y2Ba^{−4gydF4y2Ba}经过多次测试校正后，一个单元被认为是异常值。gydF4y2BabgydF4y2Ba，离群单元数作为概率阈值的函数。本研究中使用的阈值(10gydF4y2Ba^{−4gydF4y2Ba})表示(红色虚线)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba， pool-and-split对照的RaceID反映了较低的假阳性率(见gydF4y2Ba补充说明gydF4y2Ba)．gydF4y2BacgydF4y2Ba， 93个pool-and-split控件的t-SNE映射。RaceID仅标识没有异常值的单个大型集群。gydF4y2BadgydF4y2Ba，所有池和分割控制的离群值概率。所有单元格的p值都高于异常值识别的默认阈值(10gydF4y2Ba^{−4gydF4y2Ba})．gydF4y2BaegydF4y2Ba在定义的细胞混合物上，RaceID显示出高特异性(见gydF4y2Ba补充说明gydF4y2Ba)．由75个随机类器官细胞、5个小鼠胚胎干细胞(mESCs)和5个小鼠胚胎成纤维细胞(mef)组成的细胞混合物的RaceID集群。五分之二的mef没有通过过滤标准(每个细胞有>个转录本)。电子商务,肠上皮细胞;ECpr，肠细胞前体;TA，转运扩增细胞;EE，肠内分泌细胞;EEpr，肠内分泌前体;P，潘氏细胞。昏暗的,维度。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba为了对RaceID算法进行基准测试，我们将其与之前发表的用于区分脾脏细胞类型的方法进行了比较gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba在成千上万的测序单细胞中。我们根据原论文提供的规范实现了该方法。该方法的一个缺点是必须用预期的数字进行初始化gydF4y2BaKgydF4y2Ba细胞类型。运行算法gydF4y2BaKgydF4y2Ba= 6 (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)的结果与gydF4y2BakgydF4y2Ba-均值聚类gydF4y2BaKgydF4y2Ba= 6 (gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)．然而，当算法运行与大量的单元格类型，例如。gydF4y2BaKgydF4y2Ba= 20 (gydF4y2BabgydF4y2Ba)，分泌谱系的罕见细胞仍然不能分离，而相对统一的细胞类型对应的簇则会分裂。我们得出结论，该算法对更丰富的细胞类型表现良好，但不能识别罕见的细胞类型。gydF4y2BacgydF4y2Ba转录组相似性的主成分分析(PCA)。由RaceID标识的单元格类型突出显示。前两个主成分只能划分肠细胞、转运放大细胞和分泌细胞的主要类群。gydF4y2BadgydF4y2Ba为了证明我们的方法不受技术噪声的影响，因为单个细胞的检测效率不同，我们对所有具有> 3000个转录本的细胞的转录组进行了下采样，使其大小相同，这是通过过滤的所有细胞的最低总转录本计数，并重复了离群值识别。t-SNE图显示了该策略识别的所有细胞类型，结果与基于归一化的方法高度一致。gydF4y2BaegydF4y2Bat-SNE图显示了RaceID在放宽过滤约束下运行的结果(每个细胞有>个转录本，至少一个细胞中只有三个转录本以上的基因)gydF4y2BaReg4gydF4y2Ba阳性类器官细胞。所有与原始设置鉴定的罕见分泌细胞类型都被恢复。肠细胞分化的不同阶段也很明显。电子商务,肠上皮细胞;EClpr，晚期肠细胞前体;ECepr，早期肠细胞前体;TA，转运扩增细胞;G，杯状细胞;EE，肠内分泌细胞;EElpr，晚期肠内分泌前体; EEepr, early enteroendocrine precursors; P, Paneth cells; T, tuft cells.fgydF4y2Ba，同gydF4y2Ba扩展数据图4agydF4y2Ba，但与细胞周期相关的基因以蓝色圆圈突出显示。这组基因包括所有包含“细胞周期”的基因及其相关的“生物过程”基因本体术语。细胞周期相关基因没有表现出增加的变异性，因此不太可能导致RaceID异常值检测中的假阳性。昏暗的,维度。gydF4y2Ba

总共有288个细胞被测序。从两个独立的分选实验中分析了96个和192个细胞。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，从野生型(WT，上面板)和Reg4-dsRed(下面板)小鼠中提取的单个小肠细胞通过FACS进行分类。活细胞被门控为dsred -阳性(下面板，门用黑色矩形表示，DsRed-High)。SSC-W，侧散射宽度，DsRed- h, DsRed高度。每个细胞的中位数为2,813个转录本。在过滤掉所有细胞中转录本< 1000的细胞和所有细胞中转录本<3的基因或单个细胞中转录本为> 2000的基因后，剩下161个细胞进行分析。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba的t-SNE图中gydF4y2BaReg4gydF4y2Ba-阳性细胞的dsRed转录计数，由agydF4y2BaReg4gydF4y2Ba启动子(gydF4y2BabgydF4y2Ba)和内生的gydF4y2BaReg4gydF4y2Ba（gydF4y2BacgydF4y2Ba)在对数(log .)上用颜色编码gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)规模。假设我们之前估计的测序方案的敏感性gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba，我们测量gydF4y2Ba∼gydF4y2Ba所有表达的转录本的10%。与内源性相比，报告基因表达减少了约八分之一gydF4y2BaReg4gydF4y2Ba，但同时表达报告基因和gydF4y2BaReg4gydF4y2Ba是最强的gydF4y2BaTac1gydF4y2Ba/gydF4y2BaTph1gydF4y2Ba表达肠内分泌细胞，而paneth样细胞表达减少。值得注意的是gydF4y2BaReg4gydF4y2Ba而报告基因在gydF4y2BaCckgydF4y2Ba-阳性肠内分泌细胞，类似gydF4y2BaChgagydF4y2Ba。gydF4y2BadgydF4y2Ba， t-SNE图显示了对随机类器官细胞使用更严格的过滤约束(每个细胞> 3000个转录本，至少一个细胞中只有至少5个转录本的基因)的RaceID结果。尽管细胞总数减少到135个，大多数亚型和罕见的细胞在宽松的设置下仍然被观察到，包括gydF4y2Ba法新社gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba铝青铜gydF4y2Ba表示子类型时gydF4y2BaUcn3gydF4y2Ba阳性细胞gydF4y2BaCckgydF4y2Ba-阳性细胞、肠细胞和转运扩增细胞的污染以及不同的潘氏细胞状态。gydF4y2BaegydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BahgydF4y2Ba中，标记基因表达揭示肠细胞类型gydF4y2BaReg4gydF4y2Ba阳性细胞。的t-SNE映射gydF4y2BaReg4gydF4y2Ba-阳性细胞，已知标记基因的转录计数在对数(loggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)规模。所示为Paneth细胞中高度表达的所有防御素基因转录本计数图(gydF4y2BaegydF4y2Ba)，计算所有核糖体基因的转录数(gydF4y2BafgydF4y2Ba)，作为肠上皮细胞标记物gydF4y2BaApoa1gydF4y2Ba（gydF4y2BaggydF4y2Ba)和肠内分泌标志物gydF4y2BaChgagydF4y2Ba（gydF4y2BahgydF4y2Ba)．昏暗的,维度。gydF4y2Ba

的t-SNE映射gydF4y2BaReg4gydF4y2Ba在阳性细胞中，激素编码基因的转录数以对数(loggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)规模。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba，显示胆囊收缩素(gydF4y2BaCckgydF4y2Ba） (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)、胃饥饿素(gydF4y2BaGhrlgydF4y2Ba） (gydF4y2BabgydF4y2Ba)， secretein (gydF4y2Ba蛇口集装箱码头gydF4y2Ba） (gydF4y2BacgydF4y2Ba)、神经紧张素(gydF4y2BantgydF4y2Ba） (gydF4y2BadgydF4y2Ba)、胰高血糖素原(gydF4y2BaGcggydF4y2Ba） (gydF4y2BaegydF4y2Ba)和生长抑素(gydF4y2Ba风场gydF4y2Ba） (gydF4y2BafgydF4y2Ba)．昏暗的,维度。gydF4y2Ba

的t-SNE映射gydF4y2BaReg4gydF4y2Ba在肠内分泌细胞亚型中特异性表达的基因转录计数在对数(loggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)规模。所示为速激肽(gydF4y2BaTac1gydF4y2Ba)，编码物质P， (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)、色氨酸羟化酶1 (gydF4y2BaTph1gydF4y2Ba） (gydF4y2BabgydF4y2Ba)、尿皮素3 (gydF4y2BaUcn3gydF4y2Ba） (gydF4y2BacgydF4y2Ba)、甲胎蛋白(gydF4y2Ba法新社gydF4y2Ba） (gydF4y2BadgydF4y2Ba)和VGF神经生长因子诱导(gydF4y2BaVgfgydF4y2Ba） (gydF4y2BaegydF4y2Ba)．gydF4y2BafgydF4y2Ba，该热图显示了推测的肠嗜铬酶亚型(聚类2、3和7)标记基因的平均表达量。为了在同一尺度上显示所有基因，将三个聚类中的平均表达量之和归一化为1。表达水平显示6个簇2标记和6个簇7标记。聚3的不同之处在于这两个集合的下调。簇5(未在这里显示)没有特定的标记，与其他簇的不同之处在于成熟肠染色质标记的低表达(gydF4y2BaChgagydF4y2Ba，gydF4y2BaChgbgydF4y2Ba，gydF4y2BaTac1gydF4y2Ba，gydF4y2BaTph1gydF4y2Ba)．该簇可能包括未成熟的肠染色质细胞。昏暗的,维度。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba小肠冷冻切片与smFISH探针文库杂交。比例尺，10 μm。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，新奇的标记gydF4y2BaUcn3gydF4y2Ba发现了少量的gydF4y2BaTac1gydF4y2Ba阳性细胞。探针对gydF4y2BaTac1gydF4y2Ba，与TMR接合(上面板，红色)，并与之相对gydF4y2BaUcn3gydF4y2Ba，与Cy5(下面板，绿色)缀合，杂交到组织切片。虚线表示单元格边界。共同表达这两种标记的细胞(gydF4y2BaTac1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BaUcn3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)显示在左栏。细胞表达gydF4y2BaTac1gydF4y2Ba，但不是gydF4y2BaUcn3gydF4y2Ba（gydF4y2BaTac1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BaUcn3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)，显示在右栏。gydF4y2BabgydF4y2Ba，新奇的标记gydF4y2BaVgfgydF4y2Ba的亚总体表示gydF4y2BaTph1gydF4y2Ba阳性细胞。探针对gydF4y2BaTph1gydF4y2Ba，共轭到TMR(上面板，红色)，并对着gydF4y2BaVgfgydF4y2Ba，共轭为gydF4y2BaCy5gydF4y2Ba(下图绿色)，用于杂交。细胞边缘用phalloidin-AlexaFluor 488染色(未显示)。虚线划分单元格边界。一个gydF4y2BaTph1gydF4y2Ba阳性细胞，表达gydF4y2BaVgfgydF4y2Ba（gydF4y2BaTph1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BaVgfgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)显示在左栏。一个例子gydF4y2BaTph1gydF4y2Ba-阳性细胞，表示nogydF4y2BaVgfgydF4y2Ba（gydF4y2BaTph energygydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BaVgfgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)显示在右栏。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，对小鼠小肠组织冷冻切片进行免疫染色。比例尺，20 μm。gydF4y2BacgydF4y2Ba空肠内少数tac1阳性细胞可见UCN3表达。冷冻组织切片间接用抗ucn3抗体(左边红色)和抗tac1抗体(中间浅蓝色)染色。DAPI显示细胞核(深蓝色)。表达两种标记的细胞(TAC1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ UCN3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)，显示在上一行。一个细胞，阳性TAC1，但没有UCN3 (TAC1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ UCN3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)，显示在下一行。箭头指向ucn3阴性细胞。gydF4y2BadgydF4y2Ba， VGF由tac1阳性空肠和回肠细胞亚群表达。间接免疫染色可见VGF(左边红色)和TAC1(左边第二块灰色)的表达。使用直接偶联抗体检测AFP的表达(右起第二组，绿色)。核用DAPI反染色(蓝色)。TAC1阳性细胞，表达VGF和AFP (TAC1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ VGFgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/法新社gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)显示在上面的面板上。一个TAC1阳性细胞的例子，表达没有VGF或AFP (TAC1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ VGFgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/法新社gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)显示在下面的面板。箭头指向VGF和afp阴性细胞。gydF4y2Ba

单个小肠类器官细胞，来源于gydF4y2BaLgr5就gydF4y2Ba-GFP小鼠采用流式细胞仪分类。单次实验共对96个细胞进行了4个通路测序，共获得31,065,854个reads，其中33%可映射到转录组。每个umi衍生的转录本平均测序6.4次。每个细胞的中位数为9,626个转录本。在筛选了转录本< 3000的细胞和所有细胞中转录本<5的基因或单细胞中转录本< >500的基因后，剩下74个细胞进行分析。gydF4y2Ba一个gydF4y2Bat-SNE图显示了由RaceID识别的细胞类型。只有单一的优势细胞类型和少数异常值被观察到。簇1包括肠干细胞，少数异常值代表Paneth细胞和肠内分泌细胞。gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Bat-SNE图显示干细胞标记物的表达gydF4y2BaLgr5就gydF4y2Ba（gydF4y2BabgydF4y2Ba)，即干细胞标记物gydF4y2BaLrig1gydF4y2Ba（gydF4y2BacgydF4y2Ba)，以及+4生态位标记gydF4y2BaHopxgydF4y2Ba（gydF4y2BadgydF4y2Ba)．所有标记在低转录计数的所有细胞中均质表达。我们只观察到干细胞标记物的边缘表达gydF4y2BaBmi1gydF4y2Ba在少数细胞中，我们没有观察到表达gydF4y2Ba叔gydF4y2Ba在任何细胞中，这可能是由于该方法的灵敏度有限。RaceID的结果表明了这一点gydF4y2BaLgr5就gydF4y2Ba-阳性的肠干细胞代表了统一的细胞群。gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，结合随机类器官和gydF4y2BaLgr5就gydF4y2Ba-阳性细胞使用RaceID。随机类器官细胞的初始簇是保守的。的gydF4y2BaLgr5就gydF4y2Ba-阳性细胞形成一个统一的组，该组与随机类器官细胞的CBC/TA聚类(聚类2)合并。所示为热图表示(gydF4y2BaegydF4y2Ba)和t-SNE地图(gydF4y2BafgydF4y2Ba)表示细胞与细胞之间的转录组距离。在热点图的轴线上，以相同的颜色表示集群(gydF4y2BaegydF4y2Ba)和t-SNE图中的个别数据点(gydF4y2BafgydF4y2Ba)．昏暗的,维度。gydF4y2Ba