主要

典型的人类肠道微生物群包含100 - 1000细菌物种个体间巨大的成分的多样性,这样每个人的指纹一样独特的微生物群1,4。尽管分类学多样性、宏基因组测序已经强调,health-associated肠道微生物组编码高度保守的基因家族和途径与基本细菌生理和生长有关2。然而,许多基本的微生物群功能相关的体内平衡,免疫系统开发、消化、抗病原体和微生物群继承尚未被发现5。这个艰巨的挑战来验证和解释功能微生物群的属性被阻碍,因为大多数肠道细菌被广泛认为是“unculturable”,从来没有被隔离在实验室3,6。

我们试图建立一个genomic-based工作流可以作为一个平台,有针对性的培养特定的细菌的表型(扩展数据图1)。因此,我们收集了六个健康的新鲜粪便样本人类和定义了细菌社区居民与宏基因组测序和细菌培养的方法。应用猎枪宏基因组测序,我们描述和比较细菌物种呈现在原始的粪便样本,增长不同的殖民地在琼脂板包含复杂,广泛细菌学的媒介,YCFA7。重要的是,我们观察到一个强大的物种的两个样本之间的相关性(枪兵的水平ρ= 0.75,P< 0.01)(图1一个)。测序时,最初的粪便样本和培养细菌社区共享的平均93%的原始读取六个捐助者。这个重叠是72%新创大会扩展数据图2)。比较全面的基因目录所派生的文化无关意味着从318人的肠道菌群4更大的数据库中发现39.4%的基因都代表我们的队列和73.5%的741计算导出宏基因组物种通过这种分析也确定培养样本检测。

图1:有针对性的表型培养促进细菌的发现从健康人类粪便微生物群。
图1

一个相对大量的粪便样品中细菌(x轴)相比,相对丰富的细菌生长在YCFA琼脂板(y轴),由宏基因组测序。细菌生长在YCFA琼脂是代表完整的粪便样本的枪兵ρ= 0.75 (n= 6)。b、主成分分析的16 s rRNA基因序列从六个捐赠者粪便样本中发现(n= 6),代表完整的粪便样品中细菌(绿色),粪便细菌菌落恢复YCFA琼脂板没有乙醇预处理(黑色)或用乙醇预处理选择ethanol-resistant孢子形成的细菌(红色)。培养没有乙醇的选择是代表完整的粪便样本,乙醇治疗转变形象,丰富ethanol-resistant孢子形成的细菌,并允许他们随后的隔离。c,系统发育树的细菌培养六个捐助者由全长16 s rRNA基因序列。新型候选物种(红色),属(蓝色)和家庭(绿色)所示的点的颜色。主要类群和家庭的名字。变形菌门没有培养,但包括上下文。

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总之,这些结果表明,相当比例的粪便中的细菌可以与单个生长培养基培养的微生物群。然而,超过8×106不同的殖民地需要从YCFA琼脂板与宏基因组测序的物种的检测灵敏度。因此,我们建立了一个广泛培养方法,结合高通量存档或特定表型选择时,可以用来分离和识别小说从胃肠道细菌。

人类肠道微生物群是由严格的厌氧细菌,对周围的氧气非常敏感,所以不知道如何将这些细菌生存环境暴露在个体间传播。厚壁菌门的某些成员门,包括腹泻病原艰难梭状芽胞杆菌殖民期间,产生新陈代谢休眠和高度耐孢子能同时促进持久性宿主和环境中的传播8,9,10。相对很少有肠道孢子形成的细菌培养到目前为止,虽然宏基因组研究表明其他意想不到的肠道微生物群的成员拥有潜在的孢子形成基因,这些细菌特征仍然不佳11,12,13,14。

我们假设孢子形成是一个未被欣赏的基本人类肠道微生物群的表型可能对微生物群产生深远影响持久性和人类之间传播。孢子从梭状芽孢杆菌对乙醇和这种表型可以选择用于孢子混合人口的孢子和ethanol-sensitive营养细胞15。粪便样本有或没有乙醇治疗处理使用我们的结合文化和宏基因组工作流(扩展数据图1)。主成分分析表明,乙醇治疗可耕种的细菌组成和发生了深刻的变化,相比原来的形象,有效地丰富ethanol-resistant细菌,促进他们的隔离(图1 b)。我们选择~ 2000个体细菌菌落ethanol-treated和non-ethanol-treated条件,re-streaked他们纯洁,并执行完整的16 s rrna启用分类特征基因测序。独特的类群被存档冻结的股票未来的表型分析。

总的来说,我们存档细菌占96%的细菌丰度在属级和90%的细菌丰度在物种水平基于平均相对丰度在六个捐助者(扩展数据图3 a, b)。甚至属出席平均相对丰度较低(< 0.1%)被孤立的(扩展数据图3 c)。总的来说,我们存档的137种不同的细菌包括45候选人小说物种(图1 c,扩展数据图3 d和补充表1),隔离代表20候选人小说属2候选人小说的家庭。我们集合包含90种人类微生物组项目的“通缉犯”名单之前未耕作的和unsequenced微生物16(补充表1)。因此,我们广泛YCFA-based培养方法导致大量细菌的发现,和挑战的概念,大多数unculturable肠道菌群。

我们分离和纯化细菌代表66种不同ethanol-resistant物种分布在5知道家庭和2新发现候选人家庭(扩展数据图3 d和扩展数据图4)。识别这些新的和意外spore-formers亮点的广泛的分类分布表型在肠道壁厚菌门的物种。定义中的守恒的基因通路基础孢子形成和萌发肠道微生物群,我们测序,组装和注释的整个基因组234存档ethanol-resistant ethanol-sensitive细菌。以前,这种基因标记用于识别孢子形成细菌物种都是基于潜在基因的假设13,17,18;这里我们应用客观的计算方法来定义66守恒和一个ethanol-resistance有关的基因表型(扩展数据图5和补充表1)。这组基因允许预测的孢子形成细菌物种隔离来自不同环境的能力,高度的准确性(扩展数据图6和补充表1),由基因从一个广泛的功能类(扩展数据图6 b和补充表1)。

测试是否共生的孢子形成促进长期的环境生存,我们暴露了过去的同桌的孢子形成和non-spore-forming细菌和多样化的选择梭状芽孢杆菌为增加时间周围的氧气。在这种情况下,non-spore-forming细菌仍然可行的2 - 6天(48 - 144 h) (图2一个)。相比之下,同桌的孢子形成的细菌,梭状芽孢杆菌和兼性厌氧菌大肠杆菌能够稳定地生存实验的最后21天(504小时)。此外,孢子形成的共生体梭状芽孢杆菌,但不是non-spore-forming共生体,幸存下来的长时间暴露于公共消毒剂乙醇(扩展数据图7所示)。这些结果说明共生体spore-formers和梭状芽孢杆菌分享一组核心的孢子形成基因赋予一个高度耐药表型与环境相关联在人类之间传播。

图2:系统不同的表型鉴定肠道孢子形成的细菌。
图2

一个,比non-spore-formers aero-tolerant Spore-formers,预计可以实现主机到主机的信息传播。一旦暴露于氧气,只有1%的原培养液non-spore-forming 96 h后细菌(虚线)是可行的(4天)和144 h后没有一个可行的(6天)。孢子形成的细菌(实线)持续由于孢子的形成。实验504 h(21天)后停止。分类的家庭每一物种测试显示在方括号(n为每个应变)= 3生物复制。b肠道spore-formers回应胆汁酸发芽的。菌落的数量(c.f.u)。(表示发芽孢子)出现在盘子的存在表示为一个特定的开端的褶皱变化对c.f.u.恢复的数量在盘子里没有发芽的。Spore-formers和non-spore-formers受到乙醇冲击镀前(n为每个应变)= 6生物复制。只有spore-formers幸存下来。的褶皱变化(虚线)表明,发芽的没有影响c.f.u.恢复的数量。示意图总结了cholate-derived哺乳动物肠道中胆汁酸代谢。意味着和范围,韦尔奇的未配对的双尾t以及(*P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001,* * * *P< 0.0001)。

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梭状芽孢杆菌孢子进化机制恢复新陈代谢和营养生长发芽后肠道殖民的反应消化胆汁酸释放到小肠的胆囊9。我们接触肠spore-formers和non-spore-formers胆酸(牛磺胆酸盐,glycocholate和胆盐)来评估他们的反应后发芽的ethanol-shock治疗(图2 b)。牛磺胆酸盐是一种强有力的开端的spore-formers,增加从共生的细菌孢子的culturability(8 -至70000倍P所有spore-formers测试< 0.05),而其他的胆盐衍生物有不同功效的发芽共生体spore-formers (图2 b)。牛磺胆酸盐和其他胆汁酸non-spore-formers culturability没有影响,证明效果是特定于spore-formers (扩展数据图8所示)。我们建议这个bile-acid-triggered殖民萌发的机理是守恒的在活的有机体内提示促进肠道孢子形成的细菌的入侵。因此,存在一个二元性的目的做法肠道细菌孢子形成的;孢子形成确保他们的生存和传播而萌发的回应在活的有机体内线索可以确保他们坚持人类的人口。

我们下一个试图估计孢子形成的细菌在肠道菌群的比例。审讯孢子基因签名的宏基因组数据集的预测,平均60%的属包含孢子形成的细菌(图3)。肠道菌群(这些属代表总数的30%图3 b)。我们独立验证这些观察与16 s rRNA基因扩增子测序(扩展数据图9所示)。重要的是,这些孢子形成的细菌的比例也观察到在1351年公开的粪便从健康个体生成的宏基因组数据集19(图3 a, b)。我们还发现同样比例的spore-formers(61.3%)在“宏基因组物种”源自318年健康个体4。

图3:广泛的和动态的孢子形成能力在人类肠道微生物群。
图3

一个,b使用基因签名询问公共(n= 1351)和完整的粪便样本宏基因组数据集从这个研究(n= 6)显示的比例spore-formers数总数的属(一个)和总微生物丰度(b)。c,d宏基因组测序的捐赠者粪便样本(n= 6)1年之后表明,孢子形成的细菌比non-spore-forming更多样的细菌(c),比例显著增加显示两个或更多的物种变化在同一时期(d)。平均值±标准偏差(其中),双尾配对t以及(*P< 0.05,* * *P< 0.001)。

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而肠道菌群被认为是相对稳定的20.家庭成员的密切接触,证据表明,促进共享Ruminococcaceae和Lachnospiraceae细菌21家庭,我们描述spore-formers (扩展数据图4)。我们注意到在我们的群体中,孢子形成的细菌微生物群的多样性明显多于non-spore-forming细菌(图3 c)。孢子形成的动态测试和non-spore-forming细菌随着时间的推移,我们分析了宏基因组资料收集的粪便样本相同的健康受试者一年后原始采样。有趣的是,我们注意到变化的显著增加孢子形成的细菌的比例与non-spore-forming细菌在此期间。这意味着更高的物种周转率或更大的转变在孢子形成细菌物种相对多度(图3 d)。综上所述,我们的表型和基因分析表明,孢子形成和non-spore-forming细菌代表专业,不同的微生物群的表型组件,每个国家都有独特的殖民动力学。

我们表明,芽孢形成普遍,尽管此前未被欣赏的人类肠道微生物群的函数,与微生物群的传播和继承的重要意义。的基础上共同的发展史和共同进化和孢子形成和萌发的表型特征,我们认为丰富的共生体肠道spore-formers确定这里依靠相同的传输和殖民策略梭状芽孢杆菌22。总之,环境梭状芽孢杆菌孢子是高度传染性长时间后,通常在当地环境中传输也有可能快速远距离传播23。传输动力学和地理范围的共生体spore-formers尚未确定,但我们预计,这种类型的信息将提供伟大的见解遗传和形状的选择性因素人类肠道菌群的组成。

我们的工作流支持大规模培养,归档,基因组测序和小说细菌的表型出现人类肠道微生物群,以前认为是unculturable。我们有相当whole-genome-sequence生成数据集对应于肠道细菌基因组的总数的39%由人类微生物组计划生成。我们的流线型,单一交易媒介的方法,建立在别人的相当大的努力24,25和打开人类肠道微生物群的表型鉴定。

方法

培养

新鲜粪便样本来自六的健康成年人捐助者(1粪便样本/捐助:最低0.5 g)和1 h内被放置在厌氧条件下通过保持厌氧细菌的可行性。所有样品处理和厌氧条件下培养发生在惠特利DG250工作站在37°C。文化媒体、PBS和所有其他材料用于培养被安置在厌氧内阁24小时使用前降低厌氧条件。粪便样本被一分为二。均质在减少一部分PBS(0.1克每毫升凳子PBS)和连续稀释,直接到YCFA镀7与0.002克毫升琼脂补充−1每个葡萄糖,麦芽糖和纤维二糖在大培养皿(直径13.5厘米)。这个示例还受到宏基因组测序整个社区。另一部分是处理同等体积的70% (v / v)乙醇4 h在室温环境有氧条件下杀死营养细胞。然后,固体材料与PBS洗了三次,最终在PBS resuspended。镀了如前所述。

ethanol-treated样本,媒介是补充钠0.1%牛磺胆酸盐刺激孢子萌发。殖民地了72 h从培养皿ethanol-treated和镀后non-ethanol-treated条件窝藏non-confluent增长,(也就是说,盘子的殖民地是截然不同的,而不是触摸)。选的殖民地被re-streaked证实纯度。没有统计方法被用来预先确定样本容量。实验并不是随机的。调查人员没有被分配在实验和结果评估。

微生物群分析和排序

识别每个隔离是由PCR扩增全长16 s rRNA基因(使用7 f (5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′)正向引物和1510 r (5′-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)反向引物毛细管测序紧随其后。全长16 s rRNA基因序列读取对齐在核糖体数据库项目(RDP),手动在ARB策划26和mothur27被用来读取操作分类单位(辣子鸡)进行分类。R包seqinr 3.1版本是用于确定序列相似性辣子鸡和98.7%被用作了解截止28,29日。每个了解的全长16 s rRNA基因序列OTU与RDP参考数据库分配属级分类名称30.和BLASTn搜索定义特征或候选人小说的物种31日。

与人类微生物组计划(HMP)进行了使用97%序列相似性的16 s rRNA培养细菌的基因序列来定义一个物种,因为只有部分16 s rRNA基因序列。HMP数据关于通缉类群和测序项目下载完成http://hmpdacc.org/most_wanted/的数据和http://hmpdacc.org/HMRGD/,分别。

基因组DNA提取从至少一个代表每一个独特的OTU使用phenol-chloroform-based DNA分离过程。DNA测序Illumina公司HiSeq平台上生成读长度为100个基点,这些都是组装和注释进行进一步分析。粪便样本中直接提取的DNA为整个社区宏基因组和16 s rRNA使用MP基因扩增子测序生物医学FastDNA旋转工具的土壤。能够比较完整的社区样本,non-confluent文化从琼脂板刮72 h与最初的粪便样本和接种后从这个社区使用相同的DNA提取的DNA分离过程。16 s rRNA基因扩增子库是由PCR扩增的可变区域1和2的16 s rRNA使用Q5高保真聚合酶基因工具箱提供的新英格兰生物学实验室。引物27 f AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(第一部分,Illumina公司适配器)TATGGTAATT(第二部分,向前引物垫)CC(第三部分,向前底漆链接器)AGMGTTYGATYMTGGCTCAG(第四部分,正向引物)和338 r CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(第一部分,反向互补的3′Illumina公司适配器)ACGAGACTGATT(第二部分,戈利条码)AGTCAGTCAG(第三部分,反向引物垫)AA(第四部分,反向引物链接器)GCTGCCTCCCGTAGGAGT(第五部分,反向引物)。4每样品进行PCR扩增反应;产品被汇集并结合克分子数相等的金额使用Illumina公司MiSeq测序平台,生成150个基点。

微生物群分析

的最大似然发展史而产生的细菌是对齐的RDP序列使用FastTree 2.1.3版本(ref。32)使用以下设置:广义倒流(GTR)模型的核苷酸替换和猫近似率变化的跨站点与20个类别。ethanol-resistant发展史是直接来自整个文化发展史。所有系统发育树在ITOL编辑33。

分析部分16 s rRNA基因序列产生的16 s rRNA基因进行了扩增子库使用mothur MiSeq SOP342014年8月29日,生成7549辣子鸡所有样本。97%的序列相似性阈值被用来定义一个OTU。

宏基因组序列读取分析使用挪威海怪35分类基于自定义数据库的序列分类方法包括完整、高质量的参考细菌,病毒和古细菌基因组DNA除了基因组测序研究。分类结果读取日志2改变总丰度和标准化。宏基因组样本相比在属和种的水平和相对丰富的在基因水平对齐使用bowtie2算法36到适当的目录的基因。序列被认为是目前实现平均双重的覆盖在考虑序列的长度。截止100独特的读取应用于确定宏基因组物种检测。在适当情况下,斯皮尔曼等级相关系数是申请相关分析。逆辛普森多样性指数计算从巨妖输出R版本3.2.1使用素食:社区生态包版本2.3 0。

孢子形成的基因签名

基于启发式双向最佳冲击分析确定21342年保守基因内的694300个基因在234测序的基因组注释。基于机器的支持向量,对比组关联挖掘应用于确定最优,加权66个基因组成的基因签名。使用BLAST-based物种分类进行基因检测的检测比例加权签名贡献和扩展生成一个总分在0和1之间。分数超过0.5被认为是真正的spore-formers基于已知spore-formers相比。基于签名的丰度评估反对1351年公开可用的宏基因组数据集从健康人19挪威海怪后分类任务使用数据库。属被认为spore-formers当所有已知物种内,属孢子形成得分大于0.5。

透射电子显微镜法

孢子图像生成使用透射电子显微镜(TEM)如前所述37。细菌分离成像是由裸奔纯文化从冷冻甘油股票和后,全长16 s rRNA基因测序证实纯度一轮获得可见的文化孤立单一的殖民地。TEM图像在接种后准备从文化板块72 h。孢子体的数量明显在TEM图像表示为一个百分比的营养细胞的数量现在和这个范围从1%瘤胃球菌属flavefaciens_93% 4%Turicibacter杂志。

氧气敏感性分析

纯粹的文化是在YCFA汤在厌氧培养条件如前所述,文化被发现在一系列稀释到YCFA包含0.1%牛磺胆酸盐钠琼脂。盘子被孵化环境(有氧)条件下室温为指定的时间之前回到了厌氧内阁。菌落(c.f.u。) 72 h后计算。文化,是孵化厌氧,因此能不暴露于氧气,作为对照组。试验前,所有物种受到乙醇冲击和厌氧培养以确定他们形成孢子的能力。oxygen-exposed文化的可行性被表示为一个百分比的可行性厌氧控制文化。

萌发对肠道胆汁酸测定

纯文化是生长在YCFA肉汤在厌氧条件下,然后被洗通过反复离心法颗粒和re-suspending PBS。营养细胞被杀使用乙醇休克疗法如前所述,文化被连续稀释和镀YCFA琼脂,没有0.1%肠道胆汁盐(牛磺胆酸盐、胆盐和glycocholate)。菌落(c.f.u)被数72 h后的褶皱变化c.f.u.出现在盘子的数量在一个特定的开端的关于c.f.u.出现在盘子的数量没有发芽的计算。检测极限(200 c.f.u.毫升−1)是用于c.f.u.恢复的数量hathewayi梭状芽胞杆菌镀没有发芽的允许叠化计算。实验以确定non-spore-formers开端的是同样的反应,除了营养细胞不是乙醇处理而是连续稀释,直接镀后清洗。