生产丁酸的赖氨酸和Amadori产品fructoselysine人类肠道共生的gydF4y2Ba

我们的肠道包含数以万亿计的微生物,影响我们的健康gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。这些微生物的代谢能力是巨大的gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba,包括生产短链脂肪酸、丁酸等作为主要的能源来源肠肠上皮细胞和信号到主机gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。Butyrogenic肠道细菌属于Lachnospiraceae RuminococcaceaegydF4y2Ba^4gydF4y2Ba,最近的研究显示,一个逆相关性这些butyrogenic厚壁菌门和炎症性肠病,2型糖尿病和其他疾病gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}。此外,这些butyrogens有相当大的兴趣,因为丁酸减少促炎的信号gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba和在结肠保持健康具有保护作用gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}。因此,它是至关重要的识别微生物能够产生生产丁酸和理解机制。gydF4y2Ba

大多数丁酸盐产生在人类肠道被认为来源于碳水化合物,而一些特殊的细菌被发现,将乳酸+醋酸丁酸gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}。所有这些通过乙酰辅酶a通路产生丁酸gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba(将乙酰辅酶a转换为丁酸),涉及到一个复杂的级联反应,而丁酸- CoA转移酶(但是)或丁酸激酶(鼓)是关键酶。(元)genome-based最近的一项研究,它是预测的,而是受介体的路线比由鼓10倍多,而这两个酶显示高多样性butyrogens之一gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。其他三个的丁酸的合成路线,谷氨酸,琥珀酸和赖氨酸通路,有被描述。基因的分布的基础上,在肠道metagenome库、乙酰辅酶a通路是最普遍的赖氨酸通路紧随其后。然而,没有报道,肠道细菌包含所有基因编码butyrogenesis氨基酸gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

除了碳水化合物,蛋白质饮食至关重要化合物正在接受更加重视其使用特殊饮食。蛋白水解酶在肠道产生氨基酸,迅速被主机,但也可能到达结肠,部分取决于摄入量。此外,蛋白质回收在结肠内被描述,增加了对结肠氨基酸发酵的兴趣。Amadori产品(果糖胺),形成通过non-enzymatic还原糖和自由氨基酸组之间反应的蛋白质在食品加热过程中,是重要的利益,因为他们已经证明与衰老的过程和一些慢性疾病gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。Fructoselysine是晚期糖基化终末产物形成的一个关键中间体(年龄)gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba并没有任何生物已经知道fructoselysine转换成丁酸。已报告只有少数微生物代谢赖氨酸丁酸盐,他们来自非肠道生态系统。赖氨酸降解途径是描述在50年前gydF4y2Basticklandii梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba孤立的从黑泥gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。最近,这个途径中检测出gydF4y2Basubterminale梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba从污水和SB4孤立gydF4y2Ba梭菌属nucleatumgydF4y2Ba孤立于口腔,八个基因编码赖氨酸发酵途径被确定的基因组gydF4y2Baf . nucleatumgydF4y2Ba^16gydF4y2Ba。几个酶参与butyrogenesis赖氨酸生化特征gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba},但到目前为止没有发现含有肠道微生物整个通路尽管预测的赖氨酸发酵途径在人类肠道gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}。这里我们描述赖氨酸的butyrogenic转换和Amadori产品fructoselysine小说gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2Ba应变从一个健康的志愿者,描述其丁酸合成途径通过结合生理、生化和proteogenomic方法。gydF4y2Ba

赖氨酸降解gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211gydF4y2Ba

在寻找新的butyrogens,应变AF211健康主题的粪便中分离出使用矿物bicarbonate-buffered中乳酸和乙酸,在严格的缺氧条件下(发现丁酸作为主要的最终产品)。应变AF211包含16 s rRNA不同基因的两个副本在一个单核苷酸,以及随后的系统发育分析表明,这一毒株属于梭菌的集群IV (Lachnospiraceae)壁厚菌门的门。进一步分析表明,这个16 s rRNA序列非常类似于鼠标肠道分离gydF4y2BaIntestinimonas butyriciproducensgydF4y2BaDSM26588gydF4y2Ba^TgydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba),这表明新分离的菌株AF211属于属gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)。然而,应变gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211人类隔离并显示生理差异gydF4y2Ba即butyriciproducensgydF4y2Ba从鼠标(报告其他地方)。丁酸盐被发现一个主要代谢物从所有基质生长观察(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba)。gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211几乎增长在矿物中葡萄糖(一代时间为88天),但其增长率两倍的醋酸和酵母提取物。在媒体包含20毫米葡萄糖与20毫米醋酸和2%的酵母提取物,gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211生产出4.4毫米丁酸和微量的乳酸和乙醇(孵化2周)。值得注意的是,压力变得更好(世代时间7.5小时)gydF4y2BalgydF4y2Ba赖氨酸而不是其他任何天然氨基酸或gydF4y2BaDgydF4y2Ba赖氨酸(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

研究赖氨酸转化为丁酸盐的能力,gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211是生长在bicarbonate-buffered中包含gydF4y2BalgydF4y2Ba赖氨酸为唯一碳和能量来源。总共16.8±0.4毫米赖氨酸转化为14.2±0.6毫米丁酸、乙酸15.6±0.7毫米和22.1±0.5毫米NHgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba当细胞达到固定相在37°C(2天后gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。这表明,部分释放氨是隔离成蛋白质的合成代谢gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211。因此,我们建议发酵反应为:CgydF4y2Ba_6gydF4y2BaHgydF4y2Ba_14gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2BaNgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba+ 2 hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO C→gydF4y2Ba_4gydF4y2BaHgydF4y2Ba_8gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba+ CgydF4y2Ba_2gydF4y2BaHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba+ 2 nhgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba。很明显,gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211能够生长在定义的媒体gydF4y2BalgydF4y2Ba赖氨酸作为唯一的碳和能源最大增长速率为0.1 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

的增长gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211 fructoselysine上gydF4y2Ba

作为fructoselysine是一个关键的中间的形成年龄,我们解决它的降解gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211和发现它是容易代谢(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba;一代时间24小时)。丁酸盐,在北半球gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba和乳酸形成为主要产品。提出了转换公式为:CgydF4y2Ba_12gydF4y2BaHgydF4y2Ba_24gydF4y2BaOgydF4y2Ba_7gydF4y2BaNgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba+ 2 HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO→2摄氏度gydF4y2Ba_4gydF4y2BaHgydF4y2Ba_8gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba+ 2 NHgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba+ 1有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2BaC + 1gydF4y2Ba_3gydF4y2BaHgydF4y2Ba_6gydF4y2BaOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba。我们预料fructoselysine通路包括赖氨酸和糖的同时降解一半在两个分支(称为赖氨酸通路和乙酰辅酶a通路;gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。一些观察丁酸盐/ fructoselysine比率偏差(gydF4y2Ba补充表1和2gydF4y2Ba)。这些可能是由于不同的环境条件,但也会造成细胞内平衡的两个分支fructoselysine通路(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。然而,初始浓度的醋酸丁酸预测是一个主要的因素影响/ fructoselysine比率。我们实验验证和观察到的额外的醋酸,fructoselysine完全转化为丁酸和北半球gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba)根据方程:CgydF4y2Ba_12gydF4y2BaHgydF4y2Ba_24gydF4y2BaOgydF4y2Ba_7gydF4y2BaNgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba+ CgydF4y2Ba_2gydF4y2BaHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba+ HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO→3 CgydF4y2Ba_4gydF4y2BaHgydF4y2Ba_8gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba+ 2 NHgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba+ 2有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。fructoselysine +醋酸的增长率明显高于仅在fructoselysine (gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba),这可能是由于醋酸丁酸盐生产通过外部的刺激,导致增加能源获得通过生成一个质子动力通过膜相关Rnf复杂,因此,不需要额外的NADH形成乳酸(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。醋酸的影响的成长fructoselysine醋酸类似于人类肠道环境中大量存在gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba。以前,转换fructoselysine已经报道了一些细菌,包括gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,这也将psicoselysinegydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}。然而,这些细菌能够butyrogenesis。为butyrogenic通路提供进一步支持我们关注赖氨酸和葡萄糖降解利用核磁共振(NMR)相结合的方法,proteogenome和酶活性测定。gydF4y2Ba

使用说明赖氨酸的降解途径gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba理化性质gydF4y2Ba

阐明butyrogenic通路gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211,我们应用gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH-decoupledgydF4y2Ba^13gydF4y2Ba理化性质分析文化的上层清液与L -[2 -细胞生长gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC]赖氨酸,L - (6 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC]赖氨酸、赖氨酸+ [2 -gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba醋酸C]如前所述gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。的增长gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211上gydF4y2BalgydF4y2Ba——[6gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC]赖氨酸导致其完全转换成[4 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC]丁酸,[2 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC][2 -乙酸酯gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC)丁酸和[2,4 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC)丁酸盐(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba(左)。Proton-detected多重键光谱也执行上层清液和基于杂环的多重键的相关性(HMBCs)我们可以估计[4 -的百分比gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC]丁酸,[2 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC)丁酸和[2,4 -gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba丁酸(C)丁酸的标签gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba(左)。组合的定量和动力学分析表明,在所有时间点形成的主要产品gydF4y2BalgydF4y2Ba——[6gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC][4 -赖氨酸gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC)丁酸(71%;gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba),这表明之间的赖氨酸发生解理C2和C3残留物。两个[4 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC]丁酸,[2 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC)丁酸和[2,4 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC)中被发现含有丁酸赖氨酸+(2 -细胞生长gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC]乙酸(gydF4y2Ba图3 a, bgydF4y2Ba,对吧)。这是表明乙酰辅酶a和赖氨酸降解途径的同时操作(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)并解释了少量的[2 -的形成gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC][2 -乙酸酯gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC)丁酸和[2,4 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC)丁酸gydF4y2BalgydF4y2Ba——[6gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC]赖氨酸。总之,这些数据提供了分子证据表明赖氨酸途径大大活跃和生成的中间体乙酰辅酶a通路gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211。类似的结果支持的同时操作两个途径获得通过gydF4y2BaDgydF4y2Ba,gydF4y2BalgydF4y2Ba- (2 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC]赖氨酸在细胞增长gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211和NMR分析也证实了独家选择性gydF4y2BalgydF4y2Ba赖氨酸(gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba)。高效液相色谱法(HPLC)分析证实了几乎完全转换赖氨酸克分子数相等的醋酸丁酸和如上所示(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。解释观察到的分子事件isotopomers源于(gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC]赖氨酸重建(gydF4y2Ba补充图3gydF4y2Ba)和推导出代谢途径显示10酶反应,进一步以基因组,蛋白质组学和酶的研究(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

Proteogenomic代谢途径的分析gydF4y2Ba

完整的基因组gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211确定使用单分子下一代测序揭示3376476个基点的环状染色体,预测编码3359个基因(NCBI加入CP011307数量;其他报告)。基因候选人fructoselysine和赖氨酸发电转换有关的代谢途径和确定的基因组注释gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211 (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图4gydF4y2Ba)。其中包括一个operon-like集群(af_00949 - 00955)与基因fructoselysine psicoselysine吸收和降解gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba和赖氨酸利用操纵子(af_00976 - 00982)编码的六个关键酶参与赖氨酸转化为丁酸盐(gydF4y2Ba补充图4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

确认存在和赖氨酸降解途径的基因表达gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211、蛋白质从细胞中提取赖氨酸或葡萄糖和乙酸被半定量蛋白质组学分析(gydF4y2Ba补充图4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充数据1gydF4y2Ba)。gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211被发现生产蛋白质参与葡萄糖的转化和醋酸丁酸和乙酰辅酶a通路,类似于其他成员Ruminococcaceae LachnospiraceaegydF4y2Ba^8gydF4y2Ba。此外,参与蛋白质赖氨酸通路(由集群af_00976编码- 00982)不仅是高度丰富但也不同gydF4y2Ba∼gydF4y2Ba在增长10倍诱导赖氨酸与葡萄糖和乙酸相比,除了3-aminobutyryl-CoA ammonia-lyase AF_00976(编码),并没有检测到。后者蛋白质是很小(kDa 14日),可能已经失去了在蛋白质提取。另一个注释Kce候选人(AF_02981)被发现在赖氨酸的增长降低了10倍,出现在非常低的水平,指着另一个函数而不是参与赖氨酸的途径。两个预测3-ketoacyl-CoA硫解酶(AF_03338和AF_00601)是1.3倍和1.8倍比葡萄糖和acetate-grown lysine-grown细胞丰富的细胞。AF_03338位于相同的基因簇与AtoD-A操纵子(af_03339 - 03340;见下文),这是一个lysine-inducible赖氨酸通路中的关键酶gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。因此,AF_03338可能发生在赖氨酸增长条件下,虽然AF601可能参与的产品同时转换醋酸丁酸。几个预测butyryl-CoA脱氢酶(gydF4y2BabcdgydF4y2Ba)基因检测基因组中只有其中一个(AF_02889)形成一个集群operon-like Etf的复杂的基因gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba(af_02890 - 02891)。铁氧还蛋白反应催化了氧化还原酶和放能NADH-dependent减少crotonyl-CoA butyryl-CoA显示可能通过Rnf复杂chemi-osmotic节能gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba。这是必要的所有增长的条件下,因此由这个基因编码的蛋白质集群总是发现(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。磷酸转乙酰酶(AF_00212)和醋酸诱导激酶(AF_01052)被发现gydF4y2Ba∼gydF4y2Ba三倍lysine-grown细胞与葡萄糖和acetate-grown细胞相比,表明赖氨酸通路中的这两个酶的参与。值得注意的是,蛋白质组分析揭示了fructoselysine operon-like基因被诱导到25倍增长中赖氨酸(gydF4y2Ba补充图4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充数据1gydF4y2Ba),最有可能由于大量的赖氨酸,也是一个中间fructoselysine通路(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

发展史的辅酶a转移酶和酶活性gydF4y2Ba

关键反应参与丁酸盐形成从赖氨酸- CoA一半的转移从一个分子转移到另一个,催化了辅酶A转移酶家族的成员。值得注意的是,分析的基因组gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211预计14这些酶的存在,和种系发生树生成基于这些从肠道细菌与环境隔离和辅酶a转移酶(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。其中包括辅酶a转移酶AtoD-A 4 hbt,但是,实验证据为他们参与丁酸合成被描述在一些厌氧菌,包括gydF4y2BaSB4梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2BaRoseburiagydF4y2Baspp。gydF4y2BaFaecalibacterium prausnitziigydF4y2Ba和gydF4y2BaClostridum acetobutylicumgydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}。五布置得井然有序演化支的酶可能是杰出的。一个进化枝包括但酶从主丁酸生产商在人类肠道,属于gydF4y2BaLachnospiraceaegydF4y2Ba,gydF4y2BaRuminococcaceaegydF4y2Ba^4gydF4y2Ba都能够butyrogenesis从葡萄糖或乳酸+醋酸gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}。的gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211酶由AF_02986编码属于这个但是支系,发现经济增长条件下蛋白质组,表明它参与了乙酰辅酶a途径而不是4-aminobutyrate或谷氨酸途径。第二个进化枝怀有4 hbt酶和包括几个预测辅酶a转移酶gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211但没有被发现在蛋白质水平。第三和第四演化支举行AtoD-A的α和β亚基酶,分别由两个并列的基因编码在充分研究厌氧菌:gydF4y2Baf . nucleatumgydF4y2Ba,gydF4y2Bac . sticklandiigydF4y2Ba和gydF4y2Bac . acetobutylicumgydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}。在这两个AtoD-A单元演化支,三对基因gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211集群。然而,只有其中之一,由af_03339编码- 03340,非常丰富,导致双重赖氨酸增长条件下,表明其参与丁酸盐形成通过赖氨酸通路(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。五分之一的乙酰辅酶A:乙酰乙酸盐- CoA转移酶(AtoC)包含酶不仅从gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211 (AF_00155 AF_02540和AF_01396)也gydF4y2BaAnaerostipes rhamnosivoransgydF4y2Ba能够butyrogenesis从葡萄糖和乙酸+乳酸gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba。4倍的蛋白质诱导AtoC赖氨酸(AF_00155)增长表明这种CoA转移酶参与赖氨酸退化。我们建议其乙酰辅酶a的平衡作用,释放乙酰辅酶a通路和提供额外的乙酰乙酸盐或acetoacetyl-CoA,符合同时活动的赖氨酸和乙酰辅酶a通路在butyrogenesis赖氨酸(见上图)。gydF4y2Ba

进一步提供支持关键AtoD-A转化催化了,它的活动gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211研究孵化提取游离在厌氧条件下乙酰乙酸盐和butyryl-CoA和监控acetoacetyl-CoA的生产gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}。我们发现可再生的和高活动的酶活性在细胞生长赖氨酸(每毫克蛋白237单位),在细胞生长减少3.5倍与葡萄糖和乙酸(71单位/毫克蛋白;gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。观察活动感应恰逢蛋白质的定量蛋白质组分析,我们推断出AtoD-A(由af_03339编码- 03340)可能是butyryl-CoA:乙酰乙酸盐- CoA转移酶参与butyrogenic赖氨酸通路。gydF4y2Ba

IntestinimonasgydF4y2Ba和fructoselysine基因在人类肠道gydF4y2Ba

metagenome分析表明赖氨酸通路具有较高丰度在人类肠道gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba我们研究的存在gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211有关的一系列健康受试者使用特定的16 s rRNA-based定量PCR (qPCR) (gydF4y2Ba补充表3gydF4y2Ba)。5个中的10个主题,0.2 -10%的16 s rRNA序列来自gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2Ba种虫害以来所有qPCR产品显示预期的核苷酸序列。从粪便DNA,其余的五个主题,扩增子生成,但序列分析显示四个来自gydF4y2Ba瘤胃球菌属gydF4y2Ba种虫害的16 s rrna意外地放大与引物使用,指示正确估计的水平是不可能的gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2Ba种虫害在这些主题(gydF4y2Ba补充表3gydF4y2Ba)。在分析深metagenome信息获得65年学科特点在人类微生物组项目gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba,我们可以识别许多赖氨酸的基因退化在超过一半的科目但fructoselysine降解的基因只有六个人中观察到的关键基因的存在fructoselysine激酶(gydF4y2Ba补充图5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

观察到的丰富和流行gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2Ba种虫害水平是在良好的协议与metagenome-predicted赖氨酸降解通路的存在gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba,这表明gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2Ba是关键物种将赖氨酸和fructoselysine转化为人类肠道中的丁酸。这是由最近的隔离相似但耐抗生素菌株的健康的话题gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba。然而,很显然,并不是所有的人类肠道基因组,配有fructoselysine基因转换,主要Amadori产品。gydF4y2Ba

在这里,我们描述的隔离butyrate-producing细菌,gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211,大量存在于小肠的人类。细菌可以使用fructoselysine,关键中间体的形成年龄,将这转化为唯一碳和能源的主要丁酸和北半球gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba。预测fructoselysine通路包括同时退化的赖氨酸和糖一半。通过确定的代谢途径gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC-labelled赖氨酸转换通过核磁共振,结合酶测量和proteogenomic分析,赖氨酸的butyrogenic途径是充分阐明,还表示fructoselysine通路的存在gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211。使用fructoselysine作为butyrogenesis碳和能源是独一无二的,和gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211肠道细菌首次港口的完整路径的转换赖氨酸为丁酸盐(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba基于宏基因组数据),此前预测gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba。赖氨酸是一种必需氨基酸,从膳食蛋白质胰腺癌胰蛋白酶裂解,生成肽链c端精氨酸和赖氨酸残留物gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba,生成的lysine-containing通过蛋白水解活性肽可以利用gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211就是明证经济增长在不同protein-derived基质(gydF4y2Ba补充表4gydF4y2Ba)和多方面的感应赖氨酸增长条件下各种氨基肽酶(gydF4y2Ba补充表5gydF4y2Ba)。集体,一个可以考虑的赖氨酸butyrogenic转换gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211宿主相互作用的具体的例子。gydF4y2Ba

退化gydF4y2BalgydF4y2Ba赖氨酸以前观察到复杂的媒体gydF4y2Baf . nucleatumgydF4y2Ba,这表明这种革兰氏阴性细菌和潜在的病原体可以使用gydF4y2BalgydF4y2Ba赖氨酸作为能量来源,但其作为碳源还不清楚gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba}。gydF4y2Bac . sticklandiigydF4y2Ba使用gydF4y2BalgydF4y2Ba赖氨酸作为电子供体Stickland反应和赖氨酸只有退化的固定相当其他氨基酸被耗尽gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba}。尽管一些细菌降解已报告赖氨酸丁酸,最近(元)基因组分析,其中包括从这些分离株基因组,表明没有一个基因组分析整个通路的基因gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba。此外,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba被发现能够降解fructoselysine但没有人产生丁酸盐吗gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。然而,gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211包含所有基因退化fructoselysine丁酸盐(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba),而蛋白质组学分析显示,这些基因被诱导在赖氨酸增长条件。gydF4y2Ba

值得注意的是,不像其他butyrogenic细菌,gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211被发现包含十几个基因编码辅酶a转移酶(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。我们假设这可能帮助细菌更灵活广泛的底物。的综合分析gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211基因组、蛋白质组和活动测量显示一个特定acetoacetyl-CoA转移酶AtoD-A (af_03339 - 03340)赖氨酸退化条件下大量表达,因此预测丁酸合成的关键酶。这是第一个描述赖氨酸通路的肠道生态系统,赖氨酸利用操纵子和确定AtoD-A基因可能应用程序作为butyrogenesis从赖氨酸的标记。gydF4y2Ba

丰富的面前的一个重要推论lysine-degrading butyrogenicgydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211和亲戚在一些人类的肠道是丁酸盐形成的氨基酸可以作为来源。丁酸以来推测colonocytes健康福利作为能源,是一种重要的分子维持肠道的完整性,这可能细微建议蛋白质发酵,特别是在远端结肠,负面的健康影响gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba。值得注意的是,我们观察到gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211也能够增长fructoselysine作为唯一的碳和能源导致的转换fructoselysine丁酸盐(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba)。Amadori产品fructoselysine形成丰富的熟食和通过non-enzymatic美拉德反应在加热过程中还原糖和氨基酸。作为人类是独一无二的在做产品的消费,这将是确定fructoselysine感兴趣的基因簇中发现gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211最近收购了,而不是出现在其他灵长类动物的肠道微生物。熟食的生产fructoselysine各种影响,包括必需氨基酸和蛋白质消化率降低。Fructoselysine是关键产品形成的年龄在人体内与慢性疾病和糖尿病并发症的发展gydF4y2Ba^{40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba}。此外,最近的食品干预小鼠显示年龄有关这些主题和其他疾病的有害影响gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba。fructoselysine butyrogenic转换的gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211说明了重要的角色在人类肠道厌氧菌,而观察到一些,但并不是所有的人类携带的基因fructoselysine退化表明潜在的特定的干预措施与这个新发现的菌株。总之,我们的研究强调了培养新型微生物需要全面了解肠道代谢过程和对人类宿主有益的影响。此外,gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211和相关的细菌可能扮演重要的角色在保持蛋白质平衡的肠道和肠内稳态。gydF4y2Ba

浓缩、隔离和增长gydF4y2Ba

应变gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211健康成人的粪便中分离出。厌氧的粪便样本丰富bicarbonate-buffered矿物盐介质gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba包含40毫米乳酸和醋酸40毫米能源和碳源。头部空间充满了有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/ NgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(1:4)1.5 atm和孵化是在37°C。随后,浓缩文化被转移到强化梭状芽孢杆菌培养基(RCM Difco)在连续稀释和RCM琼脂板至少三次,这导致了无菌培养。应变的纯度,指定为应变AF211,证实了16 s rRNA基因测序和显微镜。RCM介质的压力总是保持在37°C。系统发育树的16 s rRNAgydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211(加入基因库JX273469)和菌株建于如前所述密切相关gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

生理特征,不同的氨基酸和氨基酸衍生品进行测试,包括20毫米gydF4y2BalgydF4y2Ba赖氨酸,fructoselysine(美国USBiological)、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸和蛋氨酸添加到bicarbonate-buffered介质从1 M无菌缺氧股票的解决方案。糖利用20毫米葡萄糖+ 20毫米醋酸加入bicarbonate-buffered介质从1 M股票的解决方案。增长。通过产品形成高效液相色谱法测定gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba和光学密度测量的分光光度计波长600纳米。一代时间用人龚帕兹模型计算gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

分析方法gydF4y2Ba

赖氨酸在高效液相色谱使用量化北极星C18-A列(安捷伦)运行在45°C和紫外可见光检测器的波长436 nm。流量为0.5毫升mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。洗脱液流动相由24毫米醋酸:8%乙腈(pH值6.6)作为溶剂和乙腈:丙胺(比例)作为溶剂B . 95%洗脱液的使用梯度洗脱,洗脱液洗脱液洗脱液B 25% 5%和75% B前15分钟。列随后用100%洗脱液B 7分钟前下一个进样。正亮氨酸(4毫米)被用来作为内部标准。挥发性脂肪酸的形成是在热科学测量光谱高效液相色谱系统配备一个安捷伦Metacarb 67 h 300×6.5毫米列保持在37°C和运行与10毫米树胶醛醣作为洗脱液。探测器是一个示差折光检测器。洗脱液流为0.8毫升mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。天然气生产如前所述gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba。所有分析都是在重复执行。决定使用铵Spectroquant检测组件根据生产的指令。Fructoselysine被离子交换色谱分离和量化邮寄列与茚三酮反应使用光度检测570海里(国际标准化组织(ISO) 13903)。gydF4y2Ba

核磁共振gydF4y2Ba

应变AF211种植在bicarbonate-buffered中包含(2 - 20毫米的gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC]gydF4y2BalgydF4y2Ba赖氨酸或[6 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC]gydF4y2BalgydF4y2Ba赖氨酸、赖氨酸+ (2 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC)醋酸。生长条件是如上所述。gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC-labelled赖氨酸是购自Campro科学(Veenendaal、荷兰)。样本取自一夜文化和离心机,享年10000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba。DgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO(50μl;99.9原子%,西格玛奥德里奇)添加到上层清液(0.5毫升),随后转移在NMR管(Campro科学)。gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH-decoupledgydF4y2Ba^13gydF4y2Ba理化性质光谱被记录在一个探测器温度300 K的力量皇冠- iii - 500光谱仪位于瓦赫宁根核磁共振中心(WNMRC),荷兰瓦赫宁根。化学变化中表达p.p.m.相对于其他的添加[6 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC]赖氨酸为41.75件分,添加[2 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC]赖氨酸为57.19件分,形成[2 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC)丁酸为42.33件分,形成[4 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC)丁酸为15.95件分和形成[2 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC)乙酸为25.99件分(生物核磁共振数据银行,gydF4y2Bahttp://www.bmrb.wisc.edu/metabolomics/metabolomics_standardsgydF4y2Ba)。400年HBMC光谱实验的扫描记录导致的测量时间50分钟,使用一个标准的力量脉冲序列。基于标识的产品是化学变化与数据库如上所述。在HMBC实验中没有使用(解耦gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。因此,单键耦合将导致大的单键耦合双交叉峰的分裂。活动5和10 Hz之间的耦合的两,三批公债联轴器仍在交叉峰的宽度HMBC谱,导致单一交叉峰的。当碳与质子参与三批公债耦合也丰富,这种交叉峰的分裂的大与这个碳单键耦合。这些分裂是可见的额外的山峰旁边单一交叉峰的2和c - 4之间H-4与c - 2(箭头)的数字,表明双浓缩c - 2和c - 4。计算中所示gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba。分裂和non-split HMBC交叉峰的c - 4在2和c - 2在H-4整合。的积分分离和non-split交叉峰的一个质子具有可比性,因为它们是基于相同的三批公债联轴器和经验类似的弛豫行为。2的交叉峰的分裂与c - 4和H-4与c - 2显示一个小差异由于HMBC实验的灵敏度差异在放松和耦合值的差异。因为这些交叉峰的分裂指相同的人口(2,4 -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC)丁酸,平衡所需的因素也可以用来正确的价值non-split值,从而揭示所有三种可能的分数的百分比标签丁酸。gydF4y2Ba

蛋白质组学gydF4y2Ba

蛋白质丰度文化发展与不同基质与液相色谱-光谱/质谱进行调查。应变AF211生长在500毫升的一式三份bicarbonate-buffered介质包含20毫米赖氨酸和40毫米葡萄糖+ 40毫米醋酸钠作为碳和能源。酵母提取物在文化的补充葡萄糖+乙酸(2 g lgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})。在对数生长期细胞收集离心,享年10000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 20分钟。细胞球洗两次在100毫米Tris-HCl (pH值7.5),1毫米dithioerythreitol和悬浮在1毫升SDT-lysis缓冲区,装有100毫米Tris-HCl (pH值7.5),4% SDS和0.1 dithiotreitol。蛋白质的提取、分离、胰蛋白酶的消化和分析进行了如前所述gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba。一个gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2Ba从Uniprot AF211数据库下载(gydF4y2Bahttp://www.uniprot.orggydF4y2Ba)与污染物数据库一起使用,其中包含常见污染物的序列;例如,胰蛋白酶,角蛋白,牛血清白蛋白。蛋白质组学的结果包含肽和蛋白质的错误发现率< 1%,蛋白质与至少两个肽识别应该是唯一的,一个应该修改的没有任何逆转。正常的对数来自蛋白质label-free定量(LFQ;归一化蛋白质的总量和所有的肽)强度。零的日志LFQ价值观取代值为5.4(略低于最小值),使合理的比率的计算成为可能。蛋白质相对定量控制做了样品的珀尔修斯1.3.0.4通过应用两个样本gydF4y2BatgydF4y2Ba以及用“LFQ强度”列获得错误发现率设置为0.05和S0设置为1。gydF4y2Ba

的制备gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211细胞提取gydF4y2Ba

应变AF211是生长在150毫升厌氧bicarbonate-buffered介质包含20毫米赖氨酸或40毫米葡萄糖+ 40毫米醋酸作为碳和能源。细胞的应变gydF4y2Ba答:rhamnosivoransgydF4y2BaDSM26241 (ref。gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)生长在150毫升厌氧bicarbonate-buffered介质包含20毫米葡萄糖被用作消极控制酶的测定。在对数生长期细胞收集离心,享年10000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 20分钟。在厌氧细胞球洗两次缓冲区包含100毫米Tris-HCl (pH7.5), 1毫米dithioerythreitol和悬浮在1毫升相同的缓冲区。细胞受到声波降解法5××30年代和细胞悬液是在冰上冷却30年代。最后,悬挂在8000年离心10分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba。通过提取被转移到血清瓶,刷新NgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和储存在−20°C或直接用于酶活性测定。所有步骤进行厌氧室的NgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(96:4;v / v)气氛,流传在钯催化剂消除氧气的痕迹。gydF4y2Ba

检测acetoacetyl-CoA转移酶的活动gydF4y2Ba

辅酶a转移酶活动是使用分光光度测定gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba在310 nm, 25°C和100毫米Tris-Cl (pH值8.1),20毫米MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和50μM butyryl-CoA + 10毫米乙酰乙酸锂酯作为底物。酶活性测定acetoacetyl-CoA的形成(gydF4y2BaEgydF4y2Ba_{310海里gydF4y2Ba}= 15.1毫米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})从butyryl-CoA和乙酰乙酸盐之后,测量的增加gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_{310海里gydF4y2Ba}通过一个absorbance-recording分光光度计。混合物的总量为1.0毫升。活动被表示为U毫克gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}总蛋白(U =μmol分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})。所有化验都是用生物复制和4 - 6测量进行复制。总蛋白量化使用Qubit2.0荧光计(英杰公司)根据制造商的指示。gydF4y2Ba

辅酶a转移酶系统发育分析gydF4y2Ba

建设的辅酶a转移酶系统发育树,所有butyryl-CoA:醋酸- CoA转移酶(Ato)和butyryl-CoA: 4-hydroxybutyrate辅酶a转移酶(4 hbt)已知的肠道细菌butyrate-producing参据。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba从NCBI数据库中检索(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。选择4-hydroxybutyrate辅酶a转移酶gydF4y2Bakluyveri梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Bac . acetobutyricumgydF4y2Ba和gydF4y2Bac .有毒物质造成gydF4y2Ba也包括gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba。Butyryl-CoA-acetoacetate辅酶a tranferases (Ato)gydF4y2Bac . sticklandiigydF4y2BaDSM519,gydF4y2Baf . nucleatumgydF4y2BaATCC25586和gydF4y2Bac . acetobutylicumgydF4y2Ba从他们的基因组ATCC824收集gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba}。这些辅酶a转移酶催化丁酸盐或丁醇的形成。所有氨基酸序列4 hbt和AtoA / C / D的压力gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211 CLUSTAL_X序列检索与使用计划。系统发育树构建使用neighbour-joining算法通过大型5 1000接连获得信心水平分支。gydF4y2Ba

量化的gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2Ba在人类结肠gydF4y2Ba

粪便样本10荷兰健康志愿者收集在不同的年龄和性别(gydF4y2Ba补充表3gydF4y2Ba)。基因组DNA通过bead-beating协议前面描述的是孤立的gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba。系统相关物种的16 s rRNA序列从基因库中检索(gydF4y2Bawww.ncbi.nlm.nih.govgydF4y2Ba)和用于执行多个使用CLUSTALW比对。引物使用DNASTAR qPCR设计项目根据沃尔特gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba引物是PFF590f: 5′-AAAACTATGGGCTCAACCCA-3′和PFF702r: 5′-GTCAGTTAATGTCCAGCAGG-3′量化gydF4y2BaIntestinimonasgydF4y2BaAF211,导致100 - bp扩增子。总细菌使用BAC1396F和PROK1492R底漆对量化gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba。应变AF211的16 s rRNA基因是用于优化温度和引物浓度,和制作标准曲线。该项目用于应变放大部分16 s rRNA基因AF211如下:95°C 5分钟和35周期组成的95°C 30年代,56.7°C 10和72°C 30年代;95°C为1分钟1分钟和60°C和总细菌之后:95°C 10分钟或95°C 20年代,56.3°C 30年代和30年代的72°C;95°C为1分钟和60°C 1分钟。两人都跟着融化曲线分析。DNA复制从标准曲线计算,随后用于变形量。gydF4y2Ba

Metagenome分析gydF4y2Ba

宏基因组蛋白质序列数据从粪便样本65个人类微生物组项目从MG-RAST获得受试者(gydF4y2Bahttp://metagenomics.anl.gov/gydF4y2Ba)。以下样本包括:SRR063550、SRR063552 SRR063553, SRR063555, SRR063556, SRR063558, SRR063561, SRR063562, SRR063564, SRR063565, SRR061730, SRR063567, SRR063568, SRR063570, SRR063571, SRR063573, SRR063574, SRR063576, SRR063577, SRR063579, SRR063580, SRR063538, SRR063582, SRR063585, SRR063586, SRR063588, SRR063589, SRR063802, SRR063899, SRR063900, SRR063902, SRR063903, SRR063540, SRR063905, SRR063906, SRR063908, SRR063909, SRR063539, SRR063542, SRR063545, SRR063548, SRR063551, SRR063554, SRR063541, SRR063557, SRR063560, SRR063563, SRR063566, SRR063569, SRR063572, SRR063575, SRR063578, SRR063581, SRR063584, SRR063543, SRR063587, SRR063801, SRR063898, SRR063901, SRR063904, SRR063907, SRR063544, SRR063546, SRR063547 SRR063549。gydF4y2Ba

AF211 butyrogenic通路蛋白同系物从宏基因组数据通过使用搜索Usearch诉8.0.1517设置usearch_global和id = 0.6。结果分析了在R诉3.1.1软件环境(gydF4y2Bahttp://www.R-project.orggydF4y2Ba)gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

如何引用这篇文章gydF4y2Ba:中方,T.P.N.gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba生产丁酸的赖氨酸和Amadori产品fructoselysine人类肠道共生的。gydF4y2BaCommun Nat。gydF4y2Ba6:10062 doi: 10.1038 / ncomms10062 (2015)。gydF4y2Ba