脂肪组织NAPE-PLD控制脂肪量发展通过改变褐变过程中,肠道微生物群gydF4y2Ba

ECS及其相关生物活性脂质如na能量稳态的调控中起着关键作用。在本文中,我们发现了欧洲央行的重要作用合成的酶NAPE-PLD在脂肪组织(总结gydF4y2Ba图10gydF4y2Ba)。老鼠缺乏gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba基因在脂肪组织容易肥胖和代谢紊乱有关。值得注意的是,cKO小鼠的表型发展生理状态(即CT饮食)。这表明NAPE-PLD基础代谢的调节中起着重要的作用,能量体内平衡和炎症。令人惊讶的是,gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba删除老鼠HFD下有更高的体重和胰岛素抵抗指数,而其他不加剧了这种病态条件下代谢参数。因为脂肪组织的水平na WT, cKO老鼠在HFD之间是相似的,这或许可以解释为什么我们不观察增加炎症和HFD下改变脂质代谢。尽管如此,gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba删除将脂肪组织分化时有效完成,因此之前HFD治疗的开始。因此增加体重增加,胰岛素抵抗可能直接归因于gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba删除而其他代谢的改变可能是由于长期减少na。gydF4y2Ba

使用不同的方法(微阵列,qPCR和组织学),我们认为cKO老鼠发展明显炎症。这种表型可能通过不同的机制来解释,包括这一事实gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba删除抗炎豌豆的水平下降。事实上,豌豆前面已被确认为抗炎作用的生物活性脂质gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba}。此外,改变监管的几个后卫,磷脂、磷脂质、二十烷类可能导致改变炎症通路的调控gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba。有趣的是,它已经表明,炎症刺激如有限合伙人可以减少gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba在RAW264.7巨噬细胞表达和豌豆生产gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba}。这些gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba数据,我们一起gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba发现,支持NAPE-PLD的作用在调节正常的炎症反应。gydF4y2Ba

ECS起着重要的作用在调节葡萄糖体内平衡gydF4y2Ba^{32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}。因此,我们的研究结果表明脂肪组织的影响gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba葡萄糖代谢。扰动的葡萄糖稳态与脂肪组织炎症gydF4y2Ba^{35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}在我们的模型中,这表明炎症发展导致的观察葡萄糖和胰岛素抵抗。我们还发现,胰岛素抵抗主要发生在肝脏而不是骨骼肌和脂肪组织。然而,我们不能排除,胰岛素抵抗可能影响这些器官在稍后的时间自磷酸化IRβ也显著影响骨骼肌和有一个重要的趋势减少IRβinsulin-induced磷酸化的脂肪组织。因此,胰岛素抵抗的具体动力的发展需要进一步调查。gydF4y2Ba

此外,我们发现gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba删除在脂肪组织会导致循环标签和胆固醇水平,增加潜在干扰脂质代谢。进一步阐明NAPE-PLD产生的机制与生物活性脂质和其他脂质候选人在炎症和胰岛素抵抗中发挥重要作用,我们进行了彻底lipidomic分析,包括神经酰胺、二十烷类和动力。磷脂质炎症与胰岛素抵抗gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba。此外,最近的一项研究报告长链磷脂质间的直接联系,央行在肝脏和胰岛素的行动gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。有趣的是我们发现cKO的老鼠表现出水平的提高长链脂肪组织磷脂质,建议改变美国生产脂肪组织可能会影响神经酰胺水平和随后导致其他代谢紊乱。欧洲央行和类二十烷酸代谢密切相关gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}。类花生酸和PG合成通过COX通路从花生四烯酸(AA),也可代谢央行gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba。此外,在cKO-CT老鼠,我们发现一个upregulation几个基因参与调节炎症和免疫以及生物活性脂质代谢(gydF4y2BaAlox5ap, Pla2g5gydF4y2Ba和gydF4y2BaPlce1gydF4y2Ba;gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。相比之下,我们观察到减少二十烷类和PG cKO老鼠的脂肪组织以及HFD-treated老鼠的脂肪组织,增加这些炎性脂质介质是可以预料的gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba。然而,最近的数据表明,这些脂质可能出现赞成和消炎作用根据病理情况。另一方面,PG金融衍生品可以是合成了央行通过COX2通路的新陈代谢,导致PG-glycerol酯或PG-ethanolamides的形成,起到抗炎作用gydF4y2Ba^{40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}。此外,这些生物活性脂质可能充当resolvin,从而导致了复杂的解决炎症gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba。在PGD是否下降gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba观察到的调制有助于这些复杂交互需要进一步调查。最后,AA水平不变cKO-CT老鼠和HFD下减少而WT-CT老鼠(gydF4y2Ba补充图7gydF4y2Ba)。全球改变血脂中观察到我们的模型表明,底物的减少水平(AA)或许可以解释为什么后卫并不增加。综上所述,这些数据的影响阐明NAPE-PLD在脂肪组织和生物活性脂质水平明显改变脂肪组织脂质代谢在我们的小鼠模型。此外,我们发现水平的提高午睡(na前体,gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba)在cKO小鼠脂肪组织与WT老鼠相比,确认在以前的研究中获得的数据gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}。这些脂质也可以潜在贡献者所示的表型观察一些午睡一直以来存在代谢特性,即能源体内平衡gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba。然而,这句话在我们的模型需要进一步调查。gydF4y2Ba

cKO老鼠也会展出mRNA水平的下降gydF4y2BaUcp1gydF4y2Ba和其他富含棕色脂肪的基因,如gydF4y2BaCideagydF4y2Ba和gydF4y2BaPpargc1agydF4y2Ba,在他们窟,这表明他们的脂肪组织失去了产热的潜力。这一发现进一步支持的微阵列分析,这表明减少相关的几个基因的表达通常棕色/米色脂肪细胞,如Eva1(也称为髓鞘蛋白的0 2,gydF4y2BaMpzl2gydF4y2Ba)和线粒体基因gydF4y2BaCox7a1gydF4y2Ba和gydF4y2BaCox8bgydF4y2Ba。它最近建议一个子集坐存款可以激活脂肪细胞的产热的项目,即米色或闪亮细胞gydF4y2Ba^{43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba}。动物缺乏功能性米色细胞培养肥胖,结合大量增加存款gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba。值得注意的是,我们观察到10多个基因参与这些代谢过程的监管没有NAPE-PLD有显著影响。根据这些观察,我们建议增加脂肪量发展与脂肪组织的改变褐变过程和降低开发能力正常的产热的计划。有趣的是,微阵列的差别分析还揭示了对这些gydF4y2BaFabp3gydF4y2Ba和线粒体脂肪酸氧化基因,如gydF4y2BaAcss1gydF4y2Ba,gydF4y2BaAcsl5gydF4y2Ba和gydF4y2BaCpt1bgydF4y2Ba。这些酶被发现调节寒冷暴露或β-adrenergic刺激后,则联系窟的转换gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba。可能会进一步反映β-oxidation减少由于差别他们对这些损失的BAT-characteristics窟。这个缺陷在β-oxidation可能导致流通的脂质水平升高的。此外,药理CB的封锁gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba受体诱发蝙蝠生热作用的激活与增强葡萄糖和脂质利用率gydF4y2Ba^{47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba}最近,《奥亚报》现已涉及老鼠β-adrenergic-mediated生热作用的增强gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba,连接ECS和生热作用。在我们的模型中,观察到的改变脂质代谢改变有关褐变过程。例如,铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba最近被认定为一个重要的监管机构的white-to-brown脂肪生成gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba和减少铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba窟中观察到的水平可能会因此参与减少褐变。进一步探索的影响gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba删除在褐变过程中,我们接触cKO WT老鼠寒冷暴露和发现gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba删除老鼠显然存在诱导的改变诱使褐变过程。这个过程似乎是由于gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba删除独立以来同情驱动器的脂肪组织外植体从cKO捐助者往往开发相同的表型。总的来说,这些数据清楚地表明,脂肪组织NAPE-PLD是能量的一种关键酶参与调节体内平衡调节的褐变过程。然而,因果关系的影响gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba删除褐变过程的优点进一步调查以确定直接影响褐变,独立于一个热损失的机制或交感神经系统的激活gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

使用454 -焦磷酸测序,我们发现,改变美国在脂肪组织合成深刻改变了肠道微生物群组成。例如,属gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba和gydF4y2BaAllobaculumgydF4y2Ba减少在cKO-CT老鼠而WT-CT老鼠(gydF4y2Ba补充表5gydF4y2Ba)。我们以前报道,HFD喂养降低了大量的gydF4y2BaAllobaculumgydF4y2Ba这个属,而益生元增加;减少脂肪,代谢和炎症gydF4y2Ba枸杞多糖gydF4y2Ba信使rna表达;并增加胰岛素敏感性gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。同样的,丰富的gydF4y2BaAllobaculumgydF4y2Ba增加与小檗碱喂养的老鼠,防止肥胖和胰岛素抵抗在HFD治疗gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba。几株gydF4y2BaLactobacillugydF4y2Bas是常用的益生菌gydF4y2Ba^{52gydF4y2Ba,gydF4y2Ba53gydF4y2Ba}。因此,不是不能想像的的影响gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba删除在脂肪组织产生代谢变化与假定的肠道微生物的代谢功能。我们还观察到一个明显的影响HFD治疗肠道微生物群组成,证实了先前公布的数据gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。此外,gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba删除会导致增加门户有限合伙人,暗示一种改变肠道屏障功能gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba。我们因此假定减少生产na的脂肪组织会影响肠道微生物群和肠道屏障功能gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

用抗生素治疗cKO老鼠和肠道微生物从cKO转移和WT老鼠GF收件人,我们可以展示的贡献肠道微生物群的表型观察cKO老鼠。这些结果承认肠道微生物群的一个重要的角色,似乎是独立于体重,adipocyte-specificgydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba删除导致HFD条件下获得不同的肠道微生物群组成,以及转移的肠道微生物群body-weight-matched捐助者能充分有效地转移表型的一部分。然而,我们可能不完全排除补充体重和协会的肠道微生物群调制以来长期抗生素治疗减少体重和改善葡萄糖稳态cKO老鼠。要注意,只有4周随访肠道微生物群的转移(相比之下,8周后gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba研究)足以重现表型的部分原因。相反,胰岛素敏感性和葡萄糖耐量或许尚未影响4周后肠道微生物群转移小鼠模型,而是观察长期调制后肠道微生物群(也就是说,抗生素治疗)。同时,是否一个或几个特定的肠道微生物造成这一表型需要进一步调查。gydF4y2Ba

总之,我们的研究强调了脂肪组织美国合成途径的重要贡献,全身能量代谢和生理机能。没有这个功能合成通路的基础状态,老鼠发展肥胖,脂肪组织炎症、胰岛素抵抗,葡萄糖耐受不良和扰动的脂质代谢。这种表型改变部分介导的肠道微生物群组成和褐变的改变计划(gydF4y2Ba图10gydF4y2Ba)。综上所述,这些数据背后的组织差异的重要性ECS的规定,特别强调脂肪组织。gydF4y2Ba

老鼠gydF4y2Ba

代的脂肪组织Napepld cKO老鼠gydF4y2Ba。脂肪组织gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba删除老鼠老鼠(cKO)生成的跨越老鼠轴承gydF4y2BaCregydF4y2Ba重组酶表达的控制下gydF4y2BaFabp4gydF4y2Ba启动子(gydF4y2BaFabp4-CregydF4y2Ba)(C57BL / 6背景,杰克逊实验室,巴尔港,我,美国)窝藏老鼠gydF4y2BaloxPgydF4y2Ba在gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba等位基因。gydF4y2BaNapepldgydF4y2Ba液态氧小鼠生成的如前所述gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba。删除是有效当脂肪组织达到成熟和老鼠出生在正常孟德尔比率。gydF4y2Ba

所有老鼠实验是批准和执行按照当地伦理委员会的指导方针为动物保健卫生部门的伦敦大学学院教授的监督下f . Lemaigre和JP Dehoux教授和特定数量2010 /伦敦/ MD / 022。住房条件是比利时法律规定2013年5月29日关于保护实验动物(协议号LA1230314)。gydF4y2Ba

cKO实验gydF4y2Ba。群8-week-old男性cKO老鼠和WT的同胞被安置在组每个笼子里的两只老鼠(filter-top笼子)免费的食物和水。老鼠采用CT (AIN93Mi,研究饮食)或HFD(60%的脂肪,D12492,研究饮食)。治疗持续了8周。这个实验是独立进行三次。控制老鼠WT同窝出生的庇护gydF4y2BaNapepld loxPgydF4y2Ba在等位基因而不是gydF4y2BaCregydF4y2Ba重组酶。体重、食物摄取和水消费记录一周一次。身体成分是评估每周使用7.5 mhz时域NMR (TD-NMR) (LF50 Minispec,力量,Rheinstetten,德国)。gydF4y2Ba

7周的治疗后,进行OGTT如前所述在自由移动的老鼠gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}。分析胰岛素信号通路,老鼠收到5 U胰岛素(Actrapid;丹麦诺和诺德公司A / S)麻醉(Queenborough Forene异氟烷,雅培,肯特郡英格兰),或同等体积的PBS进入门静脉分析信号响应胰岛素。注射三分钟后,老鼠死亡,肝脏,坐和腓肠肌骨骼肌快速切割。gydF4y2Ba

在治疗结束时,老鼠与异氟烷麻醉后6小时禁食时期。门户和静脉静脉血液采集样本进行进一步分析。放血后,老鼠被颈椎错位。组织是精确的解剖,称重和立即snap-frozen NgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba并存储在−80°C进行进一步分析。gydF4y2Ba

寒冷暴露实验gydF4y2Ba。群8-week-old男性cKO老鼠和WT同窝出生长大在室温下标准住房条件(filter-top笼子)10周的免费获取食物和水。老鼠CT的饮食(AIN93Mi研究饮食,新布伦瑞克,新泽西州,美国)。体重、食物摄取和水消费记录一周一次。身体成分是评估每周使用7.5 mhz TD-NMR。10周后随访,两组年龄和身体weight-matched cKO WT小鼠分离和单独住。一半的动物从每个基因型被转移到一个寒冷的房间在8°C,而另一半保持在室温下(gydF4y2BangydF4y2Ba= 7 - 9 /组)。老鼠在白天禁食期和美联储gydF4y2Ba随意gydF4y2Ba在夜间。老鼠在寒冷的房间为72 h和18 h后适应在寒冷的房间里,体温监测与直肠探头在不同间隔两天(RET-3,世界精密仪器,阿斯顿斯蒂夫尼奇,英国)。72 h后,所有老鼠都牺牲了如上所述。gydF4y2Ba

抗生素治疗实验gydF4y2Ba。群8-week-old C57 / Bl6女性cKO老鼠住在2或3组小鼠/笼(filter-top笼子)免费的食物和水。12周的老鼠CT的饮食。一半的老鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba每组= 5)接受抗生素(1.0 g lgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}氨苄青霉素(σ,圣路易斯,密苏里州)和0.5 g lgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}新霉素(σ))在他们的饮用水在实验期间gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。体重记录一周一次。身体成分是评估每周使用7.5 mhz TD-NMR。11周后,进行OGTT如上所述。随访12周后,小鼠死亡如上所述。gydF4y2Ba

肠道微生物群移植实验gydF4y2Ba。3 cKO老鼠和3 WT的盲肠的内容同窝出生(体重匹配)移植到老鼠14 GF (7-week-old Swiss-Webster男性,泰康利,哈德逊,纽约,美国)如前所述gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba。每个捐赠者被用来移植两个或三个女朋友。每个盲肠的样本(150毫克)在厌氧室取样,悬浮在PBS(1.5毫升/盲肠)。盲肠的内容然后立即接种(0.15毫升/鼠标)女朋友老鼠。GF老鼠单独住在通风的笼子里(Tecnilab-BMI,印度河流域文明AERO GM500 Someren、荷兰)和美联储CT饮食为4周。体重、食物摄取和水消费记录一周一次。身体成分是评估每周使用7.5 mhz TD-NMR。4周随访后,老鼠杀了如上所述。gydF4y2Ba

胰岛素抵抗指数gydF4y2Ba

血浆胰岛素浓度测定在等离子体从尾巴血液收集OGTT使用酶联免疫试剂盒(Mercodia,乌普萨拉,瑞典)根据制造商的指示。胰岛素抵抗指数由曲线下的面积相乘的血糖(−30到120分钟)和血浆胰岛素(−30到15分钟)从OGTT获得。gydF4y2Ba

RNA提取和实时qPCR分析gydF4y2Ba

从组织总RNA制备使用TriPure试剂(罗氏)。的量化和完整性分析总RNA进行了通过运行1μl每个样本的安捷伦2100生物分析仪(安捷伦RNA 6000纳米装备,安捷伦)。互补DNA是由逆转录和实时qPCR如前所述gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。gydF4y2BaRPL19gydF4y2BaRNA被选为看家基因。引物序列中提供gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

微阵列分析gydF4y2Ba

等量的RNA从五个老鼠每组每组内汇集。微阵列进行如前所述gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba。老鼠基因圣微阵列芯片被用于杂交(MoGene第1.0,Affymetrix)。WT表达式工具包(Ambion)是用于补充总RNA的RNA制备。杂交、清洗和扫描是根据Affymetrix套件和程序特定于鼠标ST基因芯片。扫描后,杂交的质量控制检查使用Affymetrix基因表达控制台软件。使用Affymetrix APT套件工具,我们RMA-Sketch规范化数据的过程,计算信号检测gydF4y2BaPgydF4y2Ba值使用DABG算法。所有的探针集DABGgydF4y2BaPgydF4y2Ba值> 0.05的所有条件都丢弃的分析。其余的探针集都叠化分析。功能注释和路径分析是使用大卫web工具完成的gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba。工具都是美联储的列表选择官方基因名称作为输入,和意义是默认设置的阈值gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.05。gydF4y2Ba

DNA分离小鼠盲肠的样品和qPCR和测序gydF4y2Ba

盲肠的内容收集和保存冻结在−80°C到使用。宏基因组DNA从使用QIAamp盲肠的内容中提取DNA凳子mini-kit(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示。细菌的V1-V3地区16 s rRNA放大使用编码基因引物27 f - 534 r (ref。gydF4y2Ba59gydF4y2Ba)和高通量测序结果分析了纯化扩增子的罗氏FLX基因组定序器使用钛化学(DNAVision, Gosselies,比利时)。结果读取处理通过QIIME v1.7.0管道gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba。丰富的识别和未分类类群后改变了使用车辆疾驰的方法去除类群代表<总丰度的0.01%。主坐标分析使用加权UniFrac距离计算。操作分类单位被确定使用uclust共识分类法分类器阈值对绿色煤电0.97数据库。系统发育树生成使用QIIME 1.7.0和可视化使用iTOL v2.2.2。gydF4y2Ba

sds - page及免疫印迹gydF4y2Ba

总溶解产物,组织与TissueLyser II(试剂盒)均质里帕缓冲区gydF4y2Ba^{61年gydF4y2Ba}补充鸡尾酒的蛋白酶抑制剂(σ)和磷酸酶抑制剂。等量的蛋白质被sds - page分离和转移到硝化纤维膜。检测蛋白质的胰岛素途径、组织均质在ERK缓冲区(Triton x - 100 0.1%,消息灵通的50 mM,氯化钠5 M,甘油10%,MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba1.5毫米和德勤1毫米)补充了蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的鸡尾酒。一夜之间,膜被孵化在4°C以下抗体稀释Tris-buffered盐水tween-20包含1%脱脂奶粉:NAPE-PLD (1:200;ab95397 Abcam,剑桥,妈,美国),p-IRβ(1:1,000;sc - 25103,圣克鲁斯、钙、美国),p-AktgydF4y2Ba^{Thr308gydF4y2Ba}(1:1,000;# 2965 l,细胞信号,丹佛,美国马)和p-AktgydF4y2Ba^{Ser473gydF4y2Ba}(1:1,000;# 4060 l,细胞信号)。量化的phospho-proteins进行每组六个动物胰岛素注射。加载控制β-actin (1:10,000;ab6276)或β-tubulin对于骨骼肌(1:800;sc - 9104)。完整的未编辑的墨迹中可用gydF4y2Ba补充图8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

组织学分析和免疫组织化学gydF4y2Ba

组织固定在4%的甲醛。苏木精和伊红染色使用标准协议执行5-μm脂肪组织部分。脂肪细胞大小(苏木精和eosin-stained部分)、巨噬细胞浸润(F4/80: ab6640 Abcam)和UCP1染色(ab23841, Abcam)测定使用ImageJ(版本1.48 r、美国国立卫生研究院的贝塞斯达,马里兰州,美国)。gydF4y2Ba

脂肪细胞和SVF分离gydF4y2Ba

约150 - 300毫克的坐存款被切割,切成小块,用胶原酶消化(罗氏)15分钟37°C。消化组织过滤和离心1分钟的400克。包含SVF infranatant和上层清液含脂肪细胞被洗了三次Krebs-BSA1%解决方案和存储在Tripure−80°C试剂(罗氏)进一步RNA的提取。gydF4y2Ba

原发性腹膜巨噬细胞隔离gydF4y2Ba

小鼠腹腔巨噬细胞是通过诱发急性腹腔注射thioglycolate周围炎症反应gydF4y2Ba^{62年gydF4y2Ba}。孤立的主要巨噬细胞在37°C孵化4 h,用PBS洗净,然后冻结在Tripure试剂进一步RNA的提取。gydF4y2Ba

脂肪组织移植组织文化gydF4y2Ba

小鼠皮下脂肪仓库从20 (10 WT 10 cKO老鼠和老鼠)精确切割,和所有可见的血管,粒子和连接组织被移除。脂肪组织是然后切成小块(4毫米gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba),每个基因型和集中放入柠檬酸缓冲(pH值7.4)含有0.5% (w / v)脂肪无酸的BSA,青霉素和链霉素(1:10 0)和二性霉素b(1:10 0)(表达载体)。总共200毫克脂肪组织在PBS和孵化冲洗100毫米培养皿包含10毫升αMEM(表达载体)补充0.5% (w / v)脂肪无酸的BSA,青霉素和链霉素(1:10 0)和二性霉素b (1:10 0)。所有条件都重复在六个不同的菜。菜讲究的是24小时在37°C公司5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba的气氛。基葡萄糖浓度的新媒体是5更易与lgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。在实验的最后,脂肪物质收集并立即在液态氮冷冻,并存储在−80°C到随后的mRNA分析。gydF4y2Ba

生化分析gydF4y2Ba

循环瘦素决定使用多路复用免疫(默克密理博,布鲁塞尔,比利时)和测量使用Luminex技术(Bioplex, Bio-Rad,比利时)后,制造商的指示。gydF4y2Ba

对于肝脏G6Pase活动,肝组织均质在裂解缓冲(消息灵通的20毫米,蔗糖250 mM,氯化钾10 mM, MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba1.5毫米,EDTA 1毫米和德勤1毫米),用释放膜结合G6Pase。匀浆分别被孵化与20毫米G6P(σ)或20毫米β-glycerophosphate(σ)来衡量非特异性磷酸酶活性。无机磷酸盐化验在每个条件在时间0和10分钟孵化37°C。G6Pase活动是由计算特定G6Pase-phosphate释放如前所述gydF4y2Ba^{63年gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

肝糖原含量的测量,肝脏在氢氧化钠(1米)和消化消化停止了盐酸(1米)。消化肝脏被稀释在乙酸钠(1:4卷/期)unsupplemented或补充淀粉转葡糖苷酶(50 U mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba};默克密理博)和孵化55°C 1 h将糖原转化为葡萄糖。释放葡萄糖是上帝量化使用葡萄糖FS(动画诊断和系统、Holzheim德国)根据制造商的指示。gydF4y2Ba

等离子体non-esterified脂肪酸,胆固醇和甘油三酯浓度测量使用工具包耦合与分光光度检测反应的一种酶反应产物(动画诊断和系统)根据制造商的指示。gydF4y2Ba

门户血浆LPS浓度测量使用Endosafe-MCS(查尔斯河实验室,里昂,法国)如前所述gydF4y2Ba^{64年gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

Lipidomics分析gydF4y2Ba

Lipidomics进行合作Biocrates(奥地利因斯布鲁克)。生物种类最丰富的磷脂,磷脂质和类花生酸定量分析了大规模流动注射电喷射ionization-tandem质谱谱/ MS)检测方法或HPLC-MS /女士(质/ MS)。gydF4y2Ba

测量的央行和午睡的水平gydF4y2Ba

组织在CHCl均质gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba(10毫升),然后甲醇(5毫升),HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO(2.5毫升)和盐酸2 N被剧烈的混合添加和脂质提取。有机层是恢复和干下NgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。由此产生的脂质分数是由固相萃取pre-purified二氧化硅,并与CHCl午睡被筛选了gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba甲醇(6:4,v / v)。分析了由此产生的脂质分数HPLC-MS使用LTQ Orbitrap质谱仪(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)耦合Accela高效液相色谱系统(热费希尔科学)。分析物的分离是通过使用一个C-18 Kinetex C-18列(5μm, 4.6×150毫米;Phenomenex,荷兰乌得勒支)和C-18 pre-column。A和B是由MeOH-H移动阶段gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO-NHgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba哦(75:25:0.1,v / v / v)和MeOH-NHgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba哦(100:0.1,v / v),分别。梯度(0.5毫升分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})如下:在15分钟从100%到100%,其次是10分钟100% B和后续re-equilibration A 100%在负模式进行质谱分析用ESI源。欧洲央行的测量产生的如前所述gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba,数据标准化组织样本的重量。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据表示为均值±s.e.m。组之间的差异评估使用单向方差分析(方差分析),其次是图基gydF4y2Ba因果gydF4y2Ba测试。双向方差分析分析与Bonferonni测试后的演变进行了重复测量体重,脂肪量和glycaemia OGTT。数据分析使用GraphPad Prism 5.00版本Windows (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。数据用不同的上标字母或符号是明显不同的gydF4y2BaP 0.05根据gydF4y2Ba因果gydF4y2Ba方差分析统计分析。对比WT-CE cKO-CE, cKO和cKO-Abx组,和GF-WT GF-KO组进行使用的小动物——一张长有学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。时被认为具有统计学意义的结果gydF4y2BaP 0.05。gydF4y2Ba