麦克米兰-和CARD9-dependent耦合的先天免疫诱导的T辅助细胞产生白介素17gydF4y2Ba

CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞是适应性免疫的主要监管机构。响应由interferon-γ第CD4 (IFN-γ)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba辅助T 1型(TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1)细胞促进免疫病毒、细胞内的细菌和原生动物寄生虫,而TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba2细胞白介素4 (il - 4)、IL-5 IL-13直接免疫后生动物的寄生虫gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba}。免疫病理也常与CD4的特定类gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba效应T细胞:TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba2细胞是重要的过敏,TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1细胞被认为推动自身免疫。最后结论质疑了发现IFN-γ信号缺陷加剧自身免疫性疾病小鼠模型gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。现在认识到,以前许多自身免疫性疾病归因于TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1细胞是由效应CD4的第三类gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞产生IL-17而不是IFN-γ,因此称为“TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17的细胞gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}。IL-17和/或其受体也与阻力由胞外细菌感染等gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2Ba以及真菌等gydF4y2Ba白色念珠菌gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}。然而,导致T的生成机制gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17个细胞在感染仍知之甚少。gydF4y2Ba

T的分化gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1、TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17个细胞是由接触IFN-γ或转换增长factor-β(TGF-β)和il - 6,分别gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}。这些细胞因子作用于新CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞诱导表达的转录因子T-bet,促进TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1反应gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba或RORγt T的分化所需的转录因子gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17个细胞gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。T-bet RORγt控制表达的il - 12和IL-23受体,分别gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba},并使T细胞容易白介素或IL-23, T细胞因子,维持和扩大gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba细胞分化过程。这些细胞因子的重要性所强调的是,老鼠缺乏细胞因子il - 12或IL-23子单元无法挂载TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1、TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年响应,分别gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。影响T细胞il - 12、IL-23和其他因素效应的命运是由树突细胞(dc)激活的信号模式识别受体(PRRs),识别组件的微生物或病毒gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。toll样受体(TLR)家族成员与白介素生产的感应DCs和T的起始gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1反应gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。是否其他模式识别途径控制T的替代形式gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba细胞分化是不清楚。gydF4y2Ba

另一种模式识别途径由c型凝集素的订婚,dectin-1真菌β-glucans被描述gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba。Dectin-1信号通过一个“hemITAM”主题,immunoreceptor tyrosine-based激活motif-like序列包含一个“YxxL”主题(“x”是任何氨基酸)gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba后由Src家族,成为磷酸化激酶受体参与gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba。这允许脾酪氨酸激酶麦克米兰的招聘,然后激活下游信号组件,包括转录因子NF-κBgydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}。激活的NF-κB dectin-1需要CARMA1-related适配器蛋白质CARD9,结合适配器MALT1和Bcl-10和促进活化的IKK激酶复杂gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

Dectin-1-Syk信号在DCs迄今为止只有有关il - 10和(ref - 2的生产。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba),通常细胞因子模式不伴有T的感应gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba细胞的反应。因此,目前尚不清楚是否dectin-1行为在某种程度上类似于通常,允许“翻译”成适应性免疫或天生的信息,或者,是否它的作用主要是为了从其他PRRs调制信号。在这里,我们表明,dectin-1-Syk-CARD9信号促进DC的成熟和诱导促炎细胞因子的分泌,包括IL-23,但小il - 12。值得注意的是,DCs激活T dectin-1接触强烈的偏见gydF4y2Ba_HgydF4y2BaT细胞分化gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年的命运,和dectin-1受体激动剂作为佐剂的使用促进了TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年,TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1反应gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。此外,TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba在实验感染自然-17个细胞发达gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba在野生型而不是gydF4y2BaCard9gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠。因此,Syk-CARD9-coupled天生的信号通路可能促进通常独立直流激活和调节TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年对某些感染的反应。gydF4y2Ba

Dectin-1-Syk-CARD9信号激活DCsgydF4y2Ba

酵母聚糖,β-glucan-containing制备酵母细胞壁,广泛用于“探索”dectin-1-mediated天生的反应。然而,zymosan-induced生产dectin-1-knockout DCs的il - 10和2几乎是正常,表明受体冗余gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}(数据没有显示)。因此,我们试图确定一个选择性dectin-1受体激动剂。农业,纯β-glucan刺激DCs已被证明缺乏TLR适配器MyD88 (gydF4y2BaMyd88gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}DCs)gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba,引起更多的生产il - 10 - 2和骨骨髓来源DCs (BMDCs)比toll样受体激动剂的选择滴定的诱导类似数量的il - 6 (gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba在线)。值得注意的是,il - 10和生产主要是独立于TLR - 2适配器MyD88 TRIF而是依赖dectin-1,麦克米兰和CARD9,表明农业作为dectin-1信号通路的选择性受体激动剂(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。因此我们使用了农业来描绘的后果dectin-1-Syk-CARD9 DC表型和功能的信号。gydF4y2Ba

农业刺激诱导增殖快速Syk-dependent磷酸化的蛋白激酶p38, Erk和物和激活NF-κB BMDCs (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。符合增殖蛋白激酶和NF-κB调节相关基因的表达在先天反应,农业也刺激导致Syk-dependent但MyD88-independent upregulation CD86的CD40和CD80表面蛋白,类似于通过刺激通过与CpG oligodeoxynucleotides TLR9-MyD88通路(gydF4y2Ba图3 a, bgydF4y2Ba)。此外,农业刺激导致的生产大量的促炎细胞因子,包括白介素、肿瘤坏死因子(TNF)和IL-12p40 (il - 12和IL-23单元;gydF4y2Ba图3汉英gydF4y2Ba)。值得注意的是,大多数DCs生产IL-12p40农业同时产生TNF和il - 6,而DCs生产只IL-12p40 CpG刺激(后成为主流gydF4y2Ba图3 fgydF4y2Ba和数据未显示)。诱导il - 12 p40通过生产、农业是伴随着记录编码IL-12p19 IL-23(子单元)和IL-23蛋白质的分泌;然而,在CpG刺激相比,农业引起的生产记录编码IL-12p35 (il - 12)的亚基或IL-12p70蛋白(gydF4y2Ba图3 ggydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba在线)。细胞因子诱导的农业是独立MyD88但取决于dectin-1,麦克米兰和CARD9 (gydF4y2Ba图3汉英,ggydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba)。相比之下,CpG-induced细胞因子的生产依赖于MyD88麦克米兰和独立,除了生产IL-12p35 IL-12p70,依赖于MyD88和麦克米兰(gydF4y2Ba图3 ggydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

作为一种替代方法来检查dectin-1信号的影响,我们用逆转录病毒转导BMDCs编码dectin-1分子轴承streptavidin-binding肽标记gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba并与streptavidin-sepharose刺激细胞。Streptavidin-sepharose触发表型和细胞因子生产的成熟BMDCs表达全长dectin-1但不是那些表达signaling-deficient dectin-1突变(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。这些反应是影响缺乏MyD88 TRIF,排除的可能性贡献的污染toll样受体激动剂和证实,触发的DC活化dectin-1单独是充分的。TLR信号一样,我们认为选择触发DCs诱发dectin-1-Syk-CARD9信号通路的激活,但结果在一个细胞因子改变的特点是大量的2,il - 10、il - 6和TNF和生产IL-23偏见而不是il - 12。gydF4y2Ba

Dectin-1-activated DCs ' TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1和TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17个细胞gydF4y2Ba

评估dectin-1-stimulated DCs能否CD4“指导”gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞增殖和分化效应,我们培养ovalbumin-specific OT-II CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞抗原和BMDCs农业或CpG的存在。农业和CpG导致更多比抗原T细胞增殖(数据未显示)。然而,而CpG诱导分化倾斜主要向代IFN-γ-producing TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1细胞,农业的存在也导致的累积IL-17-producing T细胞(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。与一系列特定的toll样受体激动剂相比,农业,并在较小程度上,酵母聚糖,诱导一个更高比例的IL-17生产IFN-γ生产(gydF4y2Ba补充图3gydF4y2Ba在线)。既不刺激诱导的发展IL-4-producing T细胞(数据没有显示)。的影响、农业和CpG介导的抗原递呈细胞和T细胞,效果是废除使用BMDCs缺乏麦克米兰或MyD88,分别(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba)。此外,细胞因子引起的偏差、农业与CpG不仅仅是定量的反映直流激活的差异,作为滴定的化合物不允许互换现象的效果(gydF4y2Ba补充图4gydF4y2Ba在线)。gydF4y2Ba

值得注意的是,OT-II CD4耗尽gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞CD25的准备gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba调节性T细胞(TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}T细胞)分化了gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1细胞即使在农业的存在(gydF4y2Ba图5度gydF4y2Ba)。作为TLR-stimulated DCs的报道gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba只有当TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞被‘添加’T细胞开始人口IFN-γ-dominated反应消失,IL-17-producing细胞出现(gydF4y2Ba图5度gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图3gydF4y2Ba)。同样地,我们发现记录编码IL-17A IL-17F,只在curdlan-containing RORγt文化当TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞(gydF4y2Ba图5 dgydF4y2Ba)。T的影响gydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}不仅仅是阻止T细胞gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1细胞分化,因为它无法模仿的中和IFN-γ(gydF4y2Ba补充图5gydF4y2Ba在线)。相反,正如之前报道gydF4y2Ba^8gydF4y2BaTgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞为至少部分的TGF-β;他们的效果可以被抗体TGF-β(anti-TGF-β)和可以模仿,虽然只是部分,由外生TGF-β(gydF4y2Ba图5 e, fgydF4y2Ba)。T的分化gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年由农业和T细胞gydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞也依赖IL-23和TNF,这种区分被抗体中和细胞因子(gydF4y2Ba图5 g, hgydF4y2Ba)。最后,添加过量IL-12p70阻止T的分化gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17个细胞诱导curdlan-stimulated DCs,而添加IL-23导致TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年文化的扭曲CpG-stimulated DCs (gydF4y2Ba补充图6gydF4y2Ba在线)。我们得出结论,DCs刺激农业可以偏见CD4细胞的分化gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞对TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年命运通过途径要求TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞和涉及TGF-β、TNF和IL-23。gydF4y2Ba

Dectin-1受体激动剂是T的佐剂gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1和TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年启动gydF4y2Ba

评估是否dectin-1刺激也会导致T的感应gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年响应gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,我们测试了农业作为辅助。过继转移OT-II细胞扩散更广泛的反应抗原与农业或混合CpG比仅在反应抗原(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。细胞淋巴结的老鼠,收到了抗原和CpG产生相当大的IFN-γ但IL-17后引发刺激抗原gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。相比之下,大量IL-17以及IFN-γ,是由细胞与抗原免疫小鼠和农业(gydF4y2Ba图6 b, cgydF4y2Ba)。细胞内细胞因子染色显示T的存在gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1和TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17个细胞,存在一起作为单独的数量(数据未显示)。值得注意的是,TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年,TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1抗原引起的反应和农业gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba是依赖dectin-1,他们废除包含dectin-1-knockout造血细胞嵌合体小鼠(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba)。相比之下,TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1 CpG引起的反应是影响dectin-1缺乏(数据未显示)。一致的发现、农业和CpG诱导TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1细胞,刺激引发的生产ovalbumin-specific免疫球蛋白G2c (IgG2c)抗体(gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba)。然而,农业也促进了生产高滴度的ovalbumin-specific IgG1抗体(gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba)。此外,老鼠接受农业发达anti-β-glucan IgM,可用于污渍gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba酵母(gydF4y2Ba补充图7gydF4y2Ba在线)。我们得出这样的结论:dectin-1选择性参与gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba能够链接先天免疫诱导T细胞和B细胞的反应。gydF4y2Ba

CARD9调节TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年响应gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba

最后,我们试图确定是否CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年在真菌感染会引起细胞反应,这在多大程度上取决于dectin-1-Syk-CARD9信号通路。大量的IFN-γIL-17 CD4细胞产生的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba脾细胞从老鼠感染gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba与heat-killed生物(引发刺激后gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。Dectin-1是冗余的响应(数据未显示),符合事实,也不是酵母聚糖对直流反应至关重要gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}。相比之下,CARD9 T是不可或缺的gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17响应和部分导致了TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1反应(gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba)。我们得出结论,适应性免疫反应gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba感染包括T的感应gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17个细胞,这个过程是通过CARD9依靠天生的信号。gydF4y2Ba

模式识别是至关重要的国防动员机制入侵后潜在的病原体gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。除了刺激骨髓细胞的杀菌剂的效应功能,某些类PRRs的信号来调节基因的表达参与先天反应和促进dc诱导适应性免疫反应gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。然而,许多可能的PRRs的表达在细胞表面,只有TLR家族成员最终被证明产生免疫原性DCs。这里我们有添加Syk-coupled c型凝集素PRRs列表,以及表明通过Syk-CARD9 dectin-1信号通路诱导dc的成熟效应抗原递呈细胞诱发T的分化的能力gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年,TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1细胞。此外,我们表明,相同的信号通路T的发展是至关重要的gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年在感染的反应gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba。因此,我们的研究结果确定Syk-CARD9轴作为TLR-independent天生的信号通路激活DCs nonredundant的指挥的TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年对感染的反应。gydF4y2Ba

Dectin-1信号在DCs导致成熟的生产不同的细胞因子组合,包括相当多的2、TNF和il - 10, IL-23。直流dectin-1受体激动剂的反应都是严格依赖于麦克米兰,区分他们从反应TLR信号,是独立于麦克米兰。一个明显的例外是IL-12p35和IL-12p70 CpG的感应,这似乎是依赖麦克米兰。IL-12p35生产管理在许多方面和强烈增强协同相互作用通常不同,聚集有关,IFN-γCD40配体或I型干扰素受体信号gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba。生产的麦克米兰依赖IL-12p35和IL-12p70 CpG因此可能表明Syk-coupled细胞受体,可以参与协同和TLR9识别IL-12p35归纳。此外,为细胞因子的生产依赖于CARD9 dectin-1信号,再从TLR信号区分,这是CARD9独立gydF4y2Ba^{18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}。CARD9依赖性的细胞因子诱导是一致的重要性这个适配器耦合dectin-1-Syk NF-κB激活信号gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。然而,CARD9也一直与连接信号的受体Nod2激活p38和物gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba。也因此可能CARD9坐标的激活增殖蛋白激酶级联dectin-1-Syk的“下游”。实验、农业CARD9-deficient细胞的刺激将有助于解决这个问题。gydF4y2Ba

TLR DCs的刺激可以诱发TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年响应gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba,但激活通过dectin-1-Syk-CARD9通路诱导大TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17扭曲。然而,在这两个案例中所涉及的机理相似,被依赖的存在TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞和要求TGF-βgydF4y2Ba^8gydF4y2Ba。这是符合报告表明TGF-β(与il - 6)在T的第一步gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17指令gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}其次,IL-23行为支持T的增殖和分化gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17个细胞gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}。DCs刺激通过dectin-1-Syk-CARD9途径生成IL-23而不是il - 12倾向。缺乏il - 12、il - 10的一起生产,可能限制TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1扭曲,从而减少负面反馈的数量在TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17细胞分化。事实上,除了IL-12p70废除T的感应gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba由curdlan-stimulated DCs -17个细胞,可能是因为白介素促进T的分化gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba1细胞,产生IFN-γ和抑制T的分化gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17个细胞gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}。然而,IL-23-versus-IL-12p70平衡是不足以解释农业的影响,,例如,gydF4y2Ba麦克米兰gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}DCs与CpG刺激,也使IL-23但IL-12p70,引起小TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17细胞分化。在这种背景下,发现DCs生产大量的TNF, IL-12p40和il - 6、农业刺激是引人注目,IL-23、TNF和il - 6都有协同效应诱导的TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17个细胞gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba。与这一想法一致,TNF的封锁或IL-23减少curdlan-dependent T的分化gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17个细胞。值得注意的是,尽管酵母聚糖通过巨噬细胞诱导TGF-β生产gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba和DCs可以分泌TGF-βgydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba}单靠农业,TGF-β诱导不足以促进T的分化gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17细胞在缺乏TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞。TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞行为提供TGF-β或者信号加强DCs分泌的细胞因子的能力gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba。此外,curdlan-stimulated DCs产生相当大的- 2,这可能有助于维持TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞功能并建立一个积极的反馈回路gydF4y2Ba^{30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba}。的结合,所有这些因素可以解释为什么DCs刺激比TLR-stimulated DCs通过dectin-1-Syk-CARD9途径更有效诱导T的分化gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17个细胞。gydF4y2Ba

适应性免疫保护的重要性gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba强调了显著的免疫缺陷患者的易感性否则不致病的共生生物吗gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba。此外,保护T细胞反应gydF4y2Ba来自烟曲霉属真菌gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}部分MyD88独立gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba符合的可能性,许多抗真菌可以通过Syk-CARD9通路诱导的反应。然而,诱导TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年对真菌感染的反应还没有报道之前,据我们所知,即使对于抵抗TGF-β和IL-17都是至关重要的gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba感染gydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba}。T如何gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17个细胞可能导致真菌间隙是未知的,但值得注意的是,IL-17是一个有效的招聘因素对中性粒细胞和嗜中性白血球减少症是一种侵袭性念珠菌病的主要危险因素gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。值得注意的是,T的感应gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17个细胞通过Syk-CARD9途径也可能解释为什么亚临床真菌感染和真菌β-glucans沉淀疾病小鼠模型的类风湿性关节炎gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}和其他自身免疫性疾病gydF4y2Ba^{40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}。这符合观察酵母聚糖还可以促进免疫耐受还不清楚吗gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

DCs的发现dectin-1-Syk-CARD9信号作为一个自治模式识别途径能够连接先天和适应性免疫系统有显著的影响。越来越明显,dectin-1不是唯一能信号通过麦克米兰的c型凝集素gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba。其他的可能性Syk-coupled受体作为PRRs髓细胞可能有助于解释T的发展gydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17反应不仅在感染真菌,而且在细胞外细菌感染等gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba和gydF4y2Ba枸橼酸杆菌属rodentiumgydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}。所有这些生物接触许多受体,尤其是TLR家族的,所以它会有用的研究信号通过c型凝集素是如何结合其他PRRs的信号gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba。然而,PRR家族的身份,完成了一个功能类似于通常的更强大的“指示”TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba-17年细胞发展强化了想法,天生的识别是免疫调节的核心并打开治疗干预的可能性。因此,受体激动剂Syk-CARD9通路可能是有用的在疫苗研发,而对手可能会发现在免疫病理的治疗。最后,麦克米兰的中央功能在DC活化的c型凝集素PRRs引出了这样的问题,是否其他麦克米兰参与骨髓细胞的受体,如调节蛋白质gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba,Fc受体gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba和整合蛋白gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba,也可以几个先天和适应性免疫。麦克米兰由骨髓受体可以扩展的功能耦合immunoreceptor tyrosine-based激活主题信号,中央主适应性免疫的,越早一步天生的认可gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

老鼠。gydF4y2Ba

从查尔斯河C57BL / 6小鼠。老鼠缺乏MyD88 TRIF MyD88-knockout杂交的生成和TRIF-knockout老鼠。OT-II TCR-transgenic B6小鼠。SJL背景(句CD45.1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)是由相互交叉的OT-II TCR-transgenic与B6小鼠C57BL / 6背景。SJL老鼠。所有的这些老鼠,以及MyD88-knockout TRIF-knockout和OT-II TCR-transgenic在C57BL / 6小鼠的背景,是在特定的无菌条件下孕育了英国癌症研究所。Dectin-1-knockout老鼠gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba被饲养在开普敦大学,南非。CARD9-knockout老鼠gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba德国慕尼黑技术大学培育的。辐射嵌合体生成的所述gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba。动物实验都是按照国家和机构动物保健指南。gydF4y2Ba

试剂。gydF4y2Ba

培养基RPMI 1640中补充谷氨酰胺、青霉素、链霉素、2-mercaptoethanol(从英杰公司)和10%(卷/期)heat-inactivated FCS (Bioclear)。和光)农业(kouichi是悬浮在PBS的浓度为10毫克/毫升。酵母聚糖MALP2,目前和PamgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba埋头gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba来自Invivogen。1668年CpG寡核苷酸合成了σ。Streptavidin-sepharose来自通用电气医疗集团。卵白蛋白肽(残留323 - 339)是合成和在英国癌症研究中心的高效液相色谱纯化。卵白蛋白蛋白质用于gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba从Calbiochem化验是,sterile-filtered蛋白gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba使用是所准备的gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba。这里介绍的蛋白量总是代表了卵清蛋白。集落刺激因子(gm - csf)是由英国癌症研究蛋白质纯化服务和批次的滴定BMDCs产生最佳生长条件。抗体用于流式细胞术来自BD Pharmingen和包括这些特定CD11c(克隆HL3)、CD86 GL1、CD80 (16-10A1), CD40 (3/23), CD4 (RM4-5)、CD25 (PC61) CD45.1(样子),IFN-γ(XMG1.2)和IL-17 (TC11-18H10.1)。中和抗体anti-TGF-β(1这里;研发系统),anti-p19 (G23.8;eBioscience), anti-TNF (MP6-XT3;BD Pharmingen)和anti-IFN-γ(XMG1.2;BD Pharmingen)。纯化2.4 g2 (anti-FcγRIII / II用来阻止非特异性抗体绑定)是英国癌症研究抗体的生产服务。 Antibodies used for immunoblot analysis were rabbit polyclonal antibodies, except the p38-specific antibody (L53F8), and were from Cell Signaling.

BMDC文化和刺激。gydF4y2Ba

BMDCs生成所述gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba,DCs纯化从散装文化anti-CD11c微使用前(Miltenyi研究)。BMDC纯度检查通过流式细胞术和总是超过98%(数据未显示)。为表达streptavidin-binding peptide-tagged dectin-1 (ref。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)在BMDCs streptavidin-binding肽标记gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba融合是野生型的羧基末端dectin-1或dectin-1替换的信号域(Y15F)和被克隆到向量pFB-IRES-GFP逆转录病毒。逆转录病毒生产和BMDC感染进行描述gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba。的CD11cgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞,80 - 95%的人经常为绿色荧光蛋白阳性(数据没有显示)。分析细胞因子的生产和表面标记表达式,5×10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba10×10gydF4y2Ba^4gydF4y2BaBMDCs每口井被培养18 - 24 h在96 - 200年圆底板块μl培养基含有gm - csf的农业(100μg /毫升),CpG (500 ng / ml)和/或脂多糖(50 ng / ml)或传说中描述gydF4y2Ba图1 b, d, egydF4y2Ba和gydF4y2Ba3 d, e, ggydF4y2Ba。使用Streptavidin-sepharose 25μl /毫升的浓度。附近的所有刺激都“pretitrated”和使用他们的最佳浓度,由最大细胞因子诱导生产和DC的成熟。上层清液中细胞因子由夹心ELISA测定。RNA隔离,4×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba每培养了3 h BMDCs 48-well盘子0.5毫升培养基含有gm - csf和各种刺激如传说中所述gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba。生化检测,1×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba2×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba每一夜之间被培养在BMDCs 24-well盘子1毫升培养基含有gm - csf在刺激不同时期有或没有农业(500μg /毫升)或CpG(10μg /毫升)。gydF4y2Ba

流式细胞术。gydF4y2Ba

细胞悬浊液染色在冰冷的PBS补充2毫米EDTA, 1% FCS(卷/期)和0.02% (wt /卷)叠氮化钠。细胞内细胞因子染色,染色anti-CD4或anti-CD11c,细胞固定修复和烫试剂(Caltag实验室)然后在修复和烫resuspended试剂B (Caltag实验室)包含标记抗体。数据获得在FACSCalibur (BD生物科学)和FlowJo软件(TreeStar)进行了分析。gydF4y2Ba

RNA隔离和实时rt - pcr。gydF4y2Ba

总RNA与试剂盒制备试剂(表达载体)。六聚体的总RNA的互补脱氧核糖核酸合成随机和上标II逆转录酶(表达载体)。定量实时PCR与SYBR绿色公司(成绩单编码IL-17A、IL-17F RORγt, IL-23p19, 2、il - 6和TNF)或Taqman(成绩单编码IL-12p35 IL-12p40和il - 10)。SYBR绿色反应,引物序列描述gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba,gydF4y2Ba51gydF4y2Ba};il - 6,引物序列如下:向前,5′-GTTCTCTGGGAAATCGTGGA-3′;相反,5′-TGTACTCCAGGTAGCTATGG-3′。Taqman反应,引物和探针来自应用生物系统公司。在重复测量井ABI棱镜7700序列检测系统(应用生物系统公司)。结果归一化同18 s rRNA(引物和探针应用生物系统公司)和结果作为信使rna的相对数量。gydF4y2Ba

免疫印迹分析和NF-κB化验。gydF4y2Ba

收集的细胞被刮进冰冷的PBS补充5毫米EDTA。离心后,细胞颗粒细胞溶解为30分钟在冰上缓冲区(50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5,1% Nonidet-P40(卷/卷),0.5% (wt /卷)脱氧胆酸,0.1% SDS (wt /卷),150毫米氯化钠,氟化钠10毫米,1毫米NagydF4y2Ba_3gydF4y2Ba签证官gydF4y2Ba_4gydF4y2BaNa和2毫米gydF4y2Ba_4gydF4y2BaPgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_7gydF4y2Ba加蛋白酶抑制剂的混合物;罗氏分子生化药剂)。细胞碎片被离心分离和提取被蛋白质定量测定(生物Rad)。免疫印迹分析,一个固定数量的总蛋白质混合样品缓冲(0.125米三,pH值6.8,4% SDS (wt /卷),20%(卷/期)甘油,5%(卷/期)2-mercaptoethanol)和解决了SDS - page(4 - 20%的丙烯酰胺梯度,Tris-glycine;英杰公司)。后转到polyvinyldifluoride膜(微孔),蛋白质被免疫印迹分析和可视化的增强化学发光(皮尔斯)。NF-κB测定提取物中总蛋白质的固定量的分析NF-κB p65转录因子分析工具根据制造商的指示(皮尔斯)。gydF4y2Ba

在体外gydF4y2BaT细胞分化。gydF4y2Ba

CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从淋巴结OT-II小鼠T细胞(C57BL / 6背景)被一个两步纯化过程与mac珠子(Miltenyi研究),其中包括损耗CD4抗原递呈细胞”其次是浓缩的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞。另外,CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11cgydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11cgydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从OT-II小鼠的脾脏细胞排序(C57BL / 6背景)通过流式细胞术MoFlo (Dako Cytomation)或FACSAria (BD生物科学)。纯化OT-II T细胞(5×10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba)培养一起BMDCs (1×10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba)和10 - 50μg /毫升的卵白蛋白蛋白质或2 - 10 nM卵白蛋白肽(323 - 339)残留物的存在与否、农业(50μg /毫升)或CpG(0.5μg /毫升)在完全培养基进一步补充丙酮酸钠,不必要的氨基酸和玫瑰从英杰公司(所有)。在一些实验中,中和抗体(10μg /毫升)或重组细胞因子(TGF-β,1 - 10 ng / ml(σ);白介素p70 5 ng / ml (Biosource);IL-23 10 ng / ml (eBioscience))补充道。文化被分割在1:2的比例在3天,重振5天5 h和佛波醇12-myristate 13-acetate (10 ng / ml;σ),ionomycin(1μg /毫升;Calbiochem)和GolgiStop (BD Pharmingen)、流式细胞术和细胞内细胞因子进行了分析。另外,整个内容的重振在第五天在plate-bound anti-CD3ε(英国癌症研究抗体生产服务)48 h后上层清液中细胞因子被夹心ELISA分析。gydF4y2Ba

免疫接种。gydF4y2Ba

天真的C57BL / 6小鼠腹腔免疫与5毫克、农业单独或与50μg蛋清+ 2毫克、农业或5μg CpG或脚垫获得免疫3μg蛋清+ 50 - 500μg农业μg CpG -2.5或0.5。CD4 T细胞分化化验gydF4y2Ba^+gydF4y2BaOT-II人口(从OT-II B6小鼠。SJL背景;1×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba4×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/鼠标),贫与CFSE标记的抗原呈递细胞,被转移到主机小鼠静脉注射免疫前1 d。CFSE CD4的稀释gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD45.1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba分析了脾细胞流式细胞术免疫后3 d。另外,1×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba2×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba总腘淋巴结细胞重振48 h蛋白在细胞因子在上层清液由夹心ELISA测定。gydF4y2Ba

感染。gydF4y2Ba

Card9gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠和gydF4y2BaCard9gydF4y2Ba^{+ /−gydF4y2Ba}控制感染小鼠静脉注射4×10gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba1.2×10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba菌落的gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba应变SC5314。天6 - 8感染后,小鼠死亡,总脾细胞和脾细胞CD4的样本枯竭gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞(2×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞每)在96年重新刺激——与heat-inactivated U-bottomed板块gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba(1×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba1×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba每毫升)。48小时后,IFN-γ和IL-17上层清液由夹心ELISA测定。gydF4y2Ba

抗体测定。gydF4y2Ba

的相对浓度ovalbumin-specific IgG2c和IgG1实验小鼠血清样本测量通过捕获ELISA anti-mouse IgG1 (BD Pharmingen,克隆A85-1)或anti-mouse IgG2c(杰克逊Immunoresearch)板涂以卵白蛋白的蛋白质。与anti-mouseβ-glucan-specific免疫球蛋白被ELISA检测免疫球蛋白(杰克逊Immunoresearch)、涂、农业板块溶于氢氧化钠。染色的gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba,heat-inactivated酵母细胞孵化稀释血清anti-mouse免疫球蛋白紧随其后。共焦图像获得的蔡司LSM510显微镜。gydF4y2Ba

统计数据。gydF4y2Ba

统计学意义是由小动物——一张长有未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba以及与Graphpad棱镜(Graphpad软件)。gydF4y2Ba

注意:gydF4y2Ba补充信息gydF4y2Ba可以在免疫学性质的网站吗gydF4y2Ba。gydF4y2Ba