单应用程序敲入阿尔茨海默病的小鼠模型

（一个) APP-Tg小鼠的内在问题。小鼠表达非生理性高水平的APP。由于APP与c-Jun - n端激酶相互作用蛋白-1 (jpp -1)相互作用，后者是肌动蛋白-1的中介，过表达的APP可能会扰乱轴突运输并产生人工表型。Aβ以外的APP片段，即。sAPP、CTF-β和AICD也过量生产。因此，在这些小鼠中观察到的各种表型是否真的由Aβ沉积引起仍然不确定。其他问题见补充表1。（b)设计新的小鼠模型。我们将小鼠Aβ序列人源化，并通过敲入技术引入瑞典和Beyreuther/Iberian突变。我们还培育了携带北极突变基因的突变小鼠。

（一个) APP野生型等位基因、靶向载体和靶向等位基因。外显子16和17的突变用闭合三角形表示。ApaLI, NotI和XbaI也显示了酶切位点。Neo表示由lox/FRT序列包围的新霉素耐药基因盒，用于阳性选择。SA和LA分别表示目标向量的短臂和长臂。Southern blot分析中使用的5'和3'探针的退火位置位于目标等位基因之外。（b)外显子16和17发生突变。描述了基因组序列和氨基酸序列的变化。外显子16包含瑞典突变和人性化序列;外显子17包含北极(在情况下)应用程序^{NL-G-F / NL-G-F}小鼠)和Beyreuther/Iberian突变。数字表示氨基酸在Aβ序列中的位置。（c)通过Southern blot分析鉴定种系传播。基因组DNA提取自应用程序^{NL-F / NL-F}用XbaI和ApaLI酶切小鼠尾巴(克隆号271)，并与图a中所示的5'和3'探针杂交，重复Southern blot分析两次以选择阳性克隆进行微量注射。（d)用PCR法对小鼠进行基因分型。上面的条带由野生型等位基因扩增而来，下面的条带由突变型等位基因扩增而来。（e) APP mRNA的Northern blot分析。使用小鼠app特异性探针检测从大脑中提取的总RNA。β-肌动蛋白作为内对照。我们通过密度测定法定量表达水平，发现野生型小鼠和突变型小鼠之间没有显著差异。数据表示平均值±s.e.m (n= 3).每组实验至少重复三次以确认结果。全长图像显示在补充图12．

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（一个)蛋白印迹分析APP及APP衍生片段应用程序^{NL-F / NL-F}老鼠。应用APP n端抗体(22C11)、人Aβ序列抗体(6E10)和APP c端抗体。全长图像显示在补充图13．（b) APP的量化及其在大脑中的碎片应用程序^问而且应用程序^NL-FKI老鼠。免疫印迹实验中免疫反应条带的强度一个用密度分析法定量。我们发现，在野生型小鼠和突变型小鼠之间，22c11反应性APP或AICD的数量没有显著差异(n= 6的应用程序^{wt / wt}， 6应用程序^{NL-F / wt}， 6应用程序^{NL-F / NL-F}， 4应用程序^{问/ wt}4个应用程序^问/问，单向方差分析)。人含a β序列(6e10反应性)APP和CTF-β信号随瑞典突变基因剂量的增加而增加;CTF-α信号降低。血清CTF-β和CTF-α水平应用程序^{NL-F / NL-F}小鼠与小鼠相似应用程序^问/问老鼠(n= 6的应用程序^{wt / wt}， 6应用程序^{NL-F / wt}， 6应用程序^{NL-F / NL-F}， 4应用程序^{问/ wt}4个应用程序^问/问， sheffield的单向方差分析F测试)。数据表示均数±s.e.m (c) 18月龄儿童Iba1和GFAP信号皮质免疫反应性应用程序^{wt / wt}，应用程序^问/问而且应用程序^{NL-F / NL-F}老鼠(图1 d)被量化。数据表示均数±s.e.m (n= 4的应用程序^{wt / wt}， 6应用程序^{NL-F / NL-F}4个应用程序^问/问， sheffield的单向方差分析F测试中,* *P< 0.01)。

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（一个)蛋白印迹分析APP及APP衍生片段应用程序^{NL-F / NL-F}和APP23小鼠。看到图1一个详情请参考图例。全长图像显示在补充图13b．（抵扣) Aβ的稳态水平₄₀和β₄₂和Aβ的比值₄₂/β₄₀在老鼠的大脑里。图B和C分别显示了ts -可溶性和guhcl -可提取的Aβ的数量。图D和E显示了Aβ的比例₄₂/β₄₀分别在TS和GuHCl组分中。数据表示均数±s.e.m (n= 5的应用程序^{wt / wt}， 4应用程序^{NL-F / wt}， 5应用程序^{NL-F / NL-F}， 4应用程序^{问/ wt}4个应用程序^问/问APP23的3个为Scheffe的单因素方差分析F测试中,* *P< 0.01)。

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（一个) Aβ斑块免疫组化染色应用程序^{NL-F / NL-F}老鼠。6个月大的大脑切片应用程序^{NL-F / NL-F}老鼠(n= 4)用抗a β抗体6E10免疫染色。右侧面板显示了左侧面板中正方形所指示区域的放大图像。我们检测到大约1 - 2个斑块应用程序^{NL-F / NL-F}这个年龄段的皮层切片。（b)中Aβ物种的N端和c端结构应用程序^{NL-F / NL-F}的大脑。6个月大的大脑切片应用程序^{NL-F / NL-F}老鼠(n= 4)用4G8抗体联合Aβ抗体双染色_{1 - x}，生成Aβ_{3 pe-x}，生成Aβ_×40和Aβ_X-42．比例尺为100 μm (一个(左面板)，25 μm (一个(右侧)和50 μm (b),分别。

（一个) Aβ的定量₄₀和β₄₂在APP23小鼠大脑中。结果表明，不同年龄guhcl可提取Aβ物种的数量不同。（b) APP23脑Aβ沉积。9月龄、12月龄和15月龄APP23小鼠脑切片用抗a β抗体4G8免疫染色。从12个月大开始检测到免疫反应性Aβ沉积(n= 4/时间点)。虽然敲入小鼠像人类一样开始在皮层中积累Aβ，但在Thy-1启动子的控制下，APP23小鼠同时在皮层和海马中积累Aβ。（c) APP23小鼠大脑中Aβ物种的N端和c端结构。18个月大的APP23小鼠大脑序列切片(n= 4) Aβ抗体免疫染色_{1 - x}，生成Aβ_{3 pe-x}，生成Aβ_×40和Aβ_X-42．比例尺为500 μm (b)和100 μm (c）.

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24月龄和30月龄小鼠脑切片用抗a β免疫染色_{1 - x}抗体(n= 6)。Aβ斑块可见于脑皮层应用程序^{NL-F / wt}24月龄以上的小鼠，而在小鼠中未检测到斑块应用程序^{wt / wt}而且应用程序^问/问小鼠(数据未显示)。比例尺为200 μm。

（一个)散发性AD脑组织中Aβ物种的N端和c端结构。零星AD患者的连续皮质切片(n= 4)用Aβ抗体免疫染色_{1 - x}，生成Aβ_{3 pe-x}，生成Aβ_×40和Aβ_X-42．（b)散发性AD脑的神经炎症。采用FSB、抗gfap抗体和抗iba1抗体三染色法分别检测Aβ斑块、星形细胞增生和微胶质细胞增生的炎症反应。（c)散发性AD的突触前改变。脑切片分别用4G8抗体和抗突触素抗体双染色。（d)散发性AD的突触后改变。脑切片分别用4G8抗体和抗psd95抗体双染色。我们在核心斑块观察到突触中断，但在弥漫性斑块未观察到。比例尺为50 μm (一个)， 20 μm (b)和10 μm (c，d),分别。

（一个钙钙蛋白缺乏对小鼠生存的影响应用程序^{NL-F / NL-F}，应用程序^问/问以及60周龄以上的APP-Tg小鼠。所有的小鼠系都被安置在相同的条件下。（n= 22的应用程序^{NL-F / NL-F}， 24应用程序^问/问， 25应用程序^{NL-F / NL-F}x投^{- / -}20个应用程序^问/问x投^{- / -}) (b加速Aβ沉积应用程序^{NL-F / NL-F}x投^{- / -}的大脑。使用针对Aβ不同n端结构的抗体对15月龄小鼠的脑切片进行免疫染色。比例尺为500 μm。（c)神经炎症增加应用程序^{NL-F / NL-F}x投^{- / -}的大脑。使用抗iba1和抗gfap抗体对12个月大的小鼠的大脑切片进行双重染色。皮层免疫反应定量如图所示(n= 3，谢氏单因素方差分析F测试中,*P< 0.05和**P< 0.01)。比例尺为100 μm。（d) Aβ的生化量应用程序^{NL-F / NL-F}x投^{- / -}的大脑。Aβ水平₄₀和β₄₂采用夹心ELISA法测定15月龄小鼠皮层TS和GuHCl组分的含量。数据表示均数±s.e.m (n= 5的应用程序^问/问， 5应用程序^问/问x投^{- / -}， 6应用程序^{NL-F / NL-F}4个应用程序^{NL-F / NL-F}x投^{- / -}， Student-t test， *P< 0.05和**P< 0.01)。（e)记忆力减退应用程序^{NL-F / NL-F}x投^{- / -}老鼠。y迷宫测试是用15个月大的老鼠进行的。数据表示均数±s.e.m (n= 9的应用程序^问/问， 10应用程序^问/问x投^{- / -}， 9应用程序^{NL-F / NL-F}11个应用程序^{NL-F / NL-F}x投^{- / -}， sheffield的单向方差分析F测试中,*P< 0.05)。

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（一个)蛋白印迹分析APP及APP衍生片段应用程序^{NL-G-F / NL-G-F}老鼠。详见图1A图例。全长图像显示在补充图13c．（b) APP及其在大脑中的片段量化应用程序^NL-G-FKI老鼠。免疫印迹的免疫反应条带强度显示在一个用密度分析法定量。我们发现，在野生型小鼠和突变型小鼠之间，22c11反应性APP或AICD的数量没有显著差异(n= 4，单向方差分析)。人含a β序列(6e10反应性)APP和CTF-β信号随瑞典突变基因剂量的增加而增加;CTF-α信号降低。血清CTF-β和CTF-α水平应用程序^{NL-G-F / NL-G-F}小鼠与对照组相似应用程序^{NL-F / NL-F}小鼠(n = 4，谢氏单因素方差分析F测试)。与中提供的数据一致补充图10d， APP的6E10免疫反应性应用程序^NL-G-F老鼠比那只小应用程序^NL-F老鼠(n= 4，谢氏单因素方差分析F测试中,* *P< 0.01)。数据表示均数±s.e.m (c) 6月龄儿童Iba1和GFAP信号的皮质免疫反应应用程序^{wt / wt}，应用程序^{NL-F / NL-F}，应用程序^{NL-G-F / NL-G-F}和18个月大的APPNL-F / NL-F对小鼠(图3d)进行定量。数据表示均数±s.e.m (n= 3的应用程序^{wt / wt}， 4应用程序^{NL-F / NL-F}(6个月)，6个应用程序^{NL-G-F / NL-G-F}5个应用程序^{Nl-F / Nl-F}(18个月)，谢菲单因素方差分析F测试中,*P< 0.05， **P< 0.01)。

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（一个)抗ap抗体表位图。（b)使用BNT77作为捕获抗体对北极AP种进行定量。BNT77与Aβ的中间部分结合。采用夹心ELISA试剂盒(Wako, Japan)。（c)使用BAN50作为捕获抗体对北极a β物种进行定量。BAN50与Aβ的n端区结合。BNT77和BAN50对北极Aβ的捕获能力弱于野生型Aβ。（d)免疫组化使用各种抗a β抗体。24个月大的大脑切片应用程序^{NL-F / NL-F}小鼠按指示提取抗原后，使用不同表位的抗体进行免疫染色(上图);9个月大的婴儿应用程序^{NL-G-F / NL-G-F}小鼠同样进行免疫染色(下图)。

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（一个) Aβ的定量₄₀和β₄₂在杂合的APPNL-G-F / wt老鼠的大脑。一个β₄₀和β₄₂采用基于Arctic a β的标准曲线ELISA法定量2- 12月龄小鼠皮层TS和GuHCl组分的含量。BNT77作为捕获抗体。数据表示均数±s.e.m (n= 3,4,4,4和4/指定的时间点)。（b) Aβ沉积应用程序^{NL-G-F / wt}的大脑。2个月，4个月，6个月，9个月和12个月大的大脑切片APPNL-G-F / wt用抗a β免疫染色小鼠_x-42抗体比例尺为500 μm。斑块面积的定量方法与图1和图3中描述的方法相同。数据表示均数±s.e.m (n= 3,4,4,4和4/指定的时间点)。

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（一个)全长印迹补充图3a．（b)全长印迹补充图4a．（c)全长印迹补充图9a．