文摘
单细胞分析的基因表达分析日益重要的复杂的组织,包括癌症、器官和成年干细胞利基市场发展。在这里,我们提出一个定量基因表达分析的详细协议在单个细胞,测序的信使rna 5′末端。96个细胞,细胞溶解,信使rna被转换为互补。通过使用一个template-switching机制,介绍了条形码和上游引物结合序列同时与反转录。所有cDNA汇集,然后准备5′末端测序,包括破碎、适配器结扎和PCR扩增。这种方法的主要优势是减少成本和时间,提供早期条形码的策略。与以前的方法相比,它更适合于大规模的定量分析,以及转录起始点的表征,但它不适合或者拼接的检测记录。样品制备需要3 d,两套96个细胞可以并行的准备。最后,测序和数据分析可以采取额外的4 d。
这是一个预览的订阅内容,通过访问你的机构
相关的文章
开放获取文章引用这篇文章。
Live-seq使颞单个细胞的转录组记录
自然开放获取2022年8月17日
人类非小细胞肺癌的分子分析单细胞RNA-seq
基因组医学开放获取2022年8月13日
循环肿瘤细胞组学时代:我们从实现“奇点”有多远?
英国癌症杂志》开放获取2022年3月10
访问选项
订阅本杂志
收到12印刷问题和网络访问
每年209.00美元
只有17.42美元的问题
本文租或购买
价格不同的文章类型
从1.95美元
来39.95美元
价格可能受当地税收计算在结帐
引用
黄,美国非基因异质性的细胞在发展:不仅仅是噪音。发展136年,3853 - 3862 (2009)。
Elowitz M.B.,Levine, A.J., Siggia, E.D. & Swain, P.S. Stochastic gene expression in a single cell.科学297年,1183 - 1186 (2002)。
李,得出et al .放大和分析DNA序列的单个人类精子和二倍体细胞。自然335年,414 - 417 (1988)。
Kurimoto, k . et al。改进的单细胞互补脱氧核糖核酸扩增方法有效的高密度寡核苷酸微阵列分析。核酸Res。34e42 (2006)。
Esumi, s . et al .单细胞微阵列分析方法和应用gaba ergic神经祖细胞的基因表达分析。>。Res。60,439 - 451 (2008)。
谷口,K。,Kajiyama, T. & Kambara, H. Quantitative analysis of gene expression in a single cell by qPCR.Nat方法。6,503 - 506 (2009)。
郭,g . et al .解决细胞命运决定了单细胞基因表达分析从受精卵到胚泡。Dev细胞。18,675 - 685 (2010)。
唐,f等人mRNA-seq whole-transcriptome单个细胞的分析。Nat方法。6,377 - 382 (2009)。
伊斯兰教,美国et al .表征的单细胞转录景观高度多元化RNA-seq。基因组Res。21,1160 - 1167 (2011)。
Salimullah, M。酒井法子,M。,Plessy, C. & Carninci, P. NanoCAGE: a high-resolution technique to discover and interrogate cell transcriptomes.冷泉哈布。Protoc。网上发表doi: 10.1101 / pdb。prot5559 (2011)。
拉吉,一个。,Peskin, C.S., Tranchina, D., Vargas, D.Y. & Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.公共科学图书馆杂志。4e309 (2006)。
丘伯保险锁,jrTrcek, T。,Shenoy, S.M. & Singer, R.H. Transcriptional pulsing of a developmental gene.咕咕叫。医学杂志。16,1018 - 1025 (2006)。
江,l . et al .合成激增RNA-seq实验标准。基因组Res。21,1543 - 1551 (2011)。
Kurimoto, K。Yabuta, Y。,Ohinata, Y. & Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.Protoc Nat。2,739 - 752 (2007)。
莫里斯,J。,Singh, J.M. & Eberwine, J.H. Transcriptome analysis of single cells.j .粘度实验。在线发表doi: 10.3791/2634 (2011)。
朱、陈文贤,Machleder, E.M., Chenchik, A., Li, R. & Siebert, P.D. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction.生物学技术30.,892 - 897 (2001)。
莱文,J.Z. et al。综合比较分析strand-specific RNA序列的方法。Nat方法。7,709 - 715 (2010)。
Kivioja, t . et al .计算分子的绝对数量使用独特的分子标识符。Nat方法。9,72 - 74 (2012)。
Maheshri: &奥谢E.K.生活在嘈杂的基因:细胞功能可靠与固有的基因表达的变化。为基础。启Biophys。Biomol。结构体。36,413 - 434 (2007)。
唐、f . et al .跟踪的胚胎干细胞来源的内细胞团单细胞RNA-Seq分析。细胞干细胞6,468 - 478 (2010)。
唐、f . et al .确定性和随机等位基因中的特定基因表达单一的鼠标卵裂球。《公共科学图书馆•综合》6e21208 (2011)。
Dalerba, p . et al .单细胞转录的解剖人类结肠肿瘤异质性。生物科技Nat。》。29日,1120 - 1127 (2011)。
Lundin年代。,Stranneheim, H., Pettersson, E., Klevebring, D. & Lundeberg, J. Increased throughput by parallelization of library preparation for massive sequencing.《公共科学图书馆•综合》5e10029 (2010)。
Langmead B。,Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, S.L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.基因组医学杂志。10R25 (2009)。
Fujita P.A. et al . UCSC基因组浏览器数据库:2011年更新。核酸Res。39D876-D882 (2011)。
Mortazavi,。,Williams, B.A., McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq.Nat方法。5,621 - 628 (2008)。
确认
我们感谢p Sekyrova(卡罗林斯卡医学院)提供培养细胞。这项工作是瑞典基金会赠款支持战略研究(mdb09 - 0052)和欧洲研究委员会(261063)。
作者信息
作者和联系
贡献
S.I.开发执行的方法和优化实验,分析数据及作者的手稿;英国执行初始实验;点进行细胞培养,流式细胞仪分选;P.Z.进行实验优化方法;J.-B.F.进行测序实验和方法开发的建议;P.L.开发生物信息学管道和分析数据;S.L.构思的方法,监督开发、开发生物信息学管道和参与了手稿。
相应的作者
道德声明
相互竞争的利益
S.L.已申请专利覆盖的部分方法。
补充信息
补充表1和2
补充表1:模板列表切换寡核苷酸多克斯(134 kb)
补充表2:方向模板切换低聚糖在96年板
权利和权限
关于这篇文章
引用这篇文章
伊斯兰教。,Kjällquist, U., Moliner, A.et al。高度多路复用和strand-specific单细胞RNA 5′末端测序。Nat Protoc7,813 - 828 (2012)。https://doi.org/10.1038/nprot.2012.022
发表:
发行日期:
DOI:https://doi.org/10.1038/nprot.2012.022
本文引用的
单细胞multi-omics的技术现状和应用程序
自然评论分子细胞生物学(2023)
人类非小细胞肺癌的分子分析单细胞RNA-seq
基因组医学(2022)
循环肿瘤细胞组学时代:我们从实现“奇点”有多远?
英国癌症杂志》(2022)
Live-seq使颞单个细胞的转录组记录
自然(2022)
最高深度空间photo-isolation的转录组分析化学
自然通讯(2021)
