简介

胰腺导管腺癌(PDAC)是一种破坏性疾病，只有不到9%的患者存活5年[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 1" title="1" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e653">1］．大多数患有PDAC的患者是在疾病的晚期被诊断出来的，此时肿瘤无法通过手术切除。为了改善患者的预后，早期诊断是重要的。由于目前化疗的疗效有限，需要确定新的治疗靶点[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 2" title="2" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e656">2］．在多发性实体肿瘤中，免疫治疗策略可提高总生存率，但PDAC的结果却令人失望[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 3" title="3." href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e659">3.，<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 4" title="4" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e662">4］．PDAC与强大的炎症，主要是免疫抑制浸润相关[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 5" title="5" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e665">5］．值得注意的是，与大多数其他肿瘤不同，PDAC中的细胞溶解活性与突变负荷或新表位负荷的增加无关[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 6" title="6" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e669">6］．具有高溶细胞基因特征的PDAC增加了免疫检查点的表达。PD-L1在PDAC中的表达普遍较低，提示其他免疫检查点可能更相关。

半乳糖凝集素-9是β-半乳糖苷结合凝集素家族的一员，具有多种生物学功能，如化学吸引、细胞聚集和凋亡[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 7" title="7" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e675">7，<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 8" title="8" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e678">8］．它有多种结合伙伴，在免疫调节中发挥广泛作用。Galectin-9已被证明是T细胞上T细胞免疫球蛋白粘蛋白受体3 (TIM-3)的衰竭配体[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="9" href="#ref-CR9" id="ref-link-section-d143690565e681">9，<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="10" href="#ref-CR10" id="ref-link-section-d143690565e681_1">10，<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 11" title="11" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e684">11］．此外，已有研究表明，它可以通过与CD44结合提高诱导Treg细胞的稳定性和功能[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 12" title="12" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e687">12］．Galectin-9还通过结合CD137促进淋巴细胞和髓细胞中受体复合体的聚集、信号传导和功能活性[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 13" title="13" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e691">13］．在最近的一项研究中，半乳糖凝集素-9被确定为dectin-1的配体，驱动小鼠PDAC中免疫抑制巨噬细胞的分化[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 14" title="14" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e694">14］．阻断半乳糖凝集素-9/dectin-1轴增强瘤内t细胞活化，导致肿瘤实质性消退和延长生存期。此外，半乳糖凝集素-9封锁扩大并激活肿瘤浸润CD4+和CD8+T细胞，但仅在γδ T细胞胜任的宿主中[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 15" title="15" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e701">15］．然而，半乳糖凝集素-9在人PDAC中的表达、间室分布和临床意义尚不清楚。在这项研究中，我们分析了石蜡包埋的肿瘤组织、从肿瘤和外周血中新鲜分离的免疫细胞以及PDAC患者的血清中半乳糖凝集素-9。

结果

人的PDAC有很高的LGALS9信使rna水平

为了研究半乳糖凝集-9在PDAC中相对于其他人类实体肿瘤的作用，我们分析了癌症基因组图谱(TCGA)数据库中保存的RNA表达数据。在所有检测的癌症中，PDAC表现出最高的表达LGALS9(半乳糖凝集素-9)mRNA(图。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">1)．LGALS9表达明显高于CD274(PD-L1)在PDAC样品中的表达(图。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">1 b)．值得注意的是,高LGALS9表达与t细胞基因无关(图。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">1 c)．然而，样品与高LGALS9基因的表达减少了CD163而且CD206并且增加了肿瘤坏死因子，所有这些都与较少的m2样巨噬细胞表型相关(图。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">1 d)，但骨髓衍生抑制细胞(MDSC)标记的表达升高CD15(无花果。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">1 e)．此外，与已知的致癌基因无相关性喀斯特，TP53，SMAD4，CDKN2A观察到(P16)(数据未显示)。

图1:人PDAC高LGALS9信使rna水平。
图1

一个的箱线图LGALS9(半乳糖凝集素-9)mRNA的表达通过RNA-seq评估在各种人类实体瘤(括号内的样本大小)中测定。肿瘤按中位表达减少的顺序排序LGALS9信使rna。TCGA数据库中的胰腺癌样本(n= 179)，我们只分析了PDAC (n= 146)。所有表达式值都是log2转换的。b的表达CD274(PD-L1)和LGALS9利用TCGA数据库在人PDAC组织中检测mRNA。c高、低叶的相关性LGALS9 mRNA表达和CD4, CD8A,TRGC2表达式,dCD163，CD206,肿瘤坏死因子(TNFA)和eFUT4(CD15)表达式。每个点代表一个病人的数据。数据，中位数，未配对t以及。＊p<0.05, * * * *p<0.0001。

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Galectin-9在人PDAC肿瘤细胞上表达

共聚焦显微镜显示，半乳糖凝集素-9存在于肿瘤细胞的细胞质和细胞核中。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">2)．为了进一步评估半乳糖凝集素-9在人PDAC中的表达，我们用免疫组化法评估了83个肿瘤组织切片(图。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">2 b, c，补充表<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">S1)．正常胰腺在导管细胞和腺泡细胞的细胞质中有微弱的表达。相反，半乳糖凝集素-9在大多数病例中表达较高，不仅存在于肿瘤细胞中，也存在于一些瘤内白细胞中。然而，半乳糖凝集素-9的表达与肿瘤大小、淋巴结转移或UICC分期无关。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">二维)．半乳糖凝集素-9低表达和高表达样本的分离分析显示，总生存率无显著差异(数据未显示)。年龄、性别、肿瘤部位差异无统计学意义。值得注意的是，新辅助化疗显著降低了半乳糖凝集素-9的表达。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">2 e, f)．

图2:人PDAC肿瘤细胞中Galectin-9的表达。
图2

一个石蜡包埋的人PDAC标本通过免疫荧光显微镜检测半乳糖凝集素-9和CK19的共表达。展示了具有代表性的图像。核用4 '，6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI)反染色。b人体PDAC石蜡切片的代表性图像(n= 83)和正常胰腺组织(n= 5)检测半乳糖凝集素-9的表达。c半乳糖凝集素-9的定量+每个高功率场(HPF)的单元数。d半凝素-9的数量+病理T期(左)，N期(中)和UICC期(右)的每个HPF细胞。每个点代表一个单独的标本。e未治疗的人PDAC(左)和新辅助化疗后的代表性图像(右)。每个点代表一个病人的数据。f半乳糖凝集素-9的定量+每个HPF的细胞数。柱状图，平均值±SEM，未配对t以及。点图，中位数，单因素方差分析。**p<0.01。

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与匹配的血液免疫细胞相比，pdac浸润免疫细胞表达更高水平的半乳糖凝集素-9

为了确定PDAC中表达半乳糖凝集素-9的白细胞亚群，我们对肿瘤标本和匹配的血液中的免疫细胞进行了流式细胞术检测，这些血液是从12名接受手术的PDAC患者新鲜获得的<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">S2)．与来自匹配血液的免疫细胞相比，肿瘤浸润的免疫细胞通常表现出更高的细胞表面半乳糖凝集素-9表达(图1)。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">3)．血白细胞中半乳糖凝集素-9表达极低。与匹配血液中的T细胞相比，肿瘤浸润的T细胞含有更多的半乳糖凝集素-9。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">3 b)．尤其是CD4+T细胞中半乳糖凝集素-9表达显著上调，而CD8细胞中半乳糖凝集素-9表达显著上调+T细胞在肿瘤内仅少量增加。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">3 c)．Galectin-9在γδ T细胞上表达量最高。肿瘤相关的巨噬细胞和单核细胞MDSCs几乎没有半乳糖凝集素-9的表达。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">3 d)．值得注意的是，肿瘤样本在t细胞亚群或髓样细胞上同时高表达半乳糖凝集素-9。

图3:pdac浸润免疫细胞表达的半乳糖凝集素-9水平高于匹配的血液免疫细胞。
图3

一个PDAC患者匹配的血液和肿瘤标本中指示免疫细胞半乳糖凝集素-9表达的百分比。b所有CD3细胞上半凝素-9表达的直方图和定量分析+T细胞,cCD4+T细胞(CD3+CD4+CD8−(上)，CD8+T细胞(CD3+CD4−CD8+(中)，γδ T细胞(CD3+CD4−CD8−细胞受体)γδ+底),d单核细胞/肿瘤相关巨噬细胞(TAMs, Lin−CD11b+CD14+单核细胞骨髓源性抑制细胞(M-MDSCs, Lin−CD11b+HLA-DR−CD14+,底部)。每个点代表一个病人的数据。数据,配对t以及。＊p<0.05, * *p<0.01。

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PDAC患者血液中γδ t细胞亚群中半乳糖凝集素-9的表达增加

接下来，我们比较了PDAC患者和健康对照组血t细胞亚群中半乳糖凝集素-9的表达。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">4)．半乳糖凝集素-9的百分比+T细胞和CD4细胞非常相似+和CD8+T细胞。然而，PDAC患者的血液γδ T细胞与健康对照组的血液γδ T细胞相比，显示出明显更高的半乳糖凝集素-9表达。在PDAC患者中，γδ T细胞在T细胞亚群中表达量最高。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">4 b)．此外，我们还研究了血CD4中半乳糖凝集素-9的表达+, CD8+和肿瘤大小的γδ T细胞(图。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">4摄氏度)，淋巴结转移(图。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">4 d)和UICC阶段(图。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">4 e)．尤其是CD4上的半乳糖凝集素-9的表达+T细胞在肿瘤较大的患者中显著升高(T3/4)。

图4:PDAC患者血γδ t细胞亚群中半乳糖凝集素-9表达增加。
图4

一个健康人和PDAC患者血液中指示t细胞亚群的半乳糖凝集素-9表达百分比。bPDAC患者血液中t细胞亚群的半乳糖凝集素-9表达百分比。cCD4细胞上半凝素-9表达的百分比+T细胞(左)，CD8+PDAC患者血液中的T细胞(中)，γδ T细胞(右)dN,eUICC阶段。每个点代表一个病人的数据。数据值。单因素方差分析或未配对t以及。＊p<0.05, * *p<0.01, * * * *p<0.0001。

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Galectin-9使巨噬细胞向M2表型极化

为了进一步分析半乳糖凝集素-9对免疫细胞的作用，在半乳糖凝集素-9存在的情况下，巨噬细胞与AsPC-1细胞共培养。值得注意的是，半乳糖凝集素-9降低了M1标记HLA-DR和CD86的表达(图。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">5)，下调M2标记CD206(图。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">5 b)作用于巨噬细胞。与向m2表型的转变一致，半乳糖凝集素9启动的巨噬细胞抑制t细胞细胞因子的产生。与引物巨噬细胞共培养后，T细胞分泌的TNF-α和IFN-γ明显减少(图1)。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">5度)．因此，巨噬细胞在表型和功能上趋向于原细胞M2表型，可能支持进一步的肿瘤生长。

图5:Galectin-9使巨噬细胞向M2表型方向极化。
图5

一个巨噬细胞与带有重组人半乳糖凝集素-9或对照的AsPC-1细胞(1:4比例)共培养48小时，并进行HLA-DR染色(上)、CD86染色(下)和bCD206。c共培养48 h后，巨噬细胞从与半乳糖凝集素-9或对照培养的AsPC-1细胞中分离，然后加入CD3+T细胞(1:2)培养48小时。T细胞CD4, CD8, TNF-α(上)和IFN-γ(下)染色。柱状图，平均值±SEM，未配对t以及。＊p<0.05, * *p<0.01, * * *p<0.001。

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血清中半乳糖凝集素-9水平区分PDAC患者与良性胰腺疾病和健康个体

鉴于肿瘤和免疫细胞上存在半乳糖凝集素-9，我们假设在PDAC患者中也存在一定量的可溶性半乳糖凝集素-9。我们分析了健康个体中循环的半凝素-9 (n= 28)，慢性胰腺炎患者(n= 18)，导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMN，n= 18)， PDAC (n= 70，补充表<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">S3)．健康人血清中Galectin-9水平(中位数6.68 ng/ml)与良性胰腺疾病患者(CP，中位数6.44 ng/ml;IPMN，中位数7.53 ng/ml)，但PDAC患者显示最高的血清半乳糖凝集素-9水平(中位数9.13 ng/ml)(图。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">6)．在健康个体中，年龄和性别与循环中的半凝素-9水平无关。为了探索血清中半乳糖凝集素-9水平是否预测肿瘤进展，我们根据UICC分期对PDAC患者进行了分层(图。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">6 b)．Galectin-9从I期到III期呈上升趋势，但IV期患者血清中Galectin-9水平总体最低。对于IV期患者，长期生存率(>12个月)与短期生存率(<12个月)相比，半乳糖凝集素-9血清水平显著降低(图1)。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">6摄氏度)．值得注意的是，CA19-9水平与该队列的生存率无关(数据未显示)。我们接下来的研究是，半乳糖凝集素-9是否能够区分PDAC与慢性胰腺炎、IPMN和健康正常对照(图1)。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">6 d)．Galectin-9单独检测PDAC的c-统计值为0.776。此外，半乳糖凝集素-9能区分PDAC与慢性胰腺炎和ipmn, c统计值分别为0.711和0.668(图。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">6 e)．Galectin-9在鉴别良性胰腺疾病方面的准确率并不高于CA19-9，但优于CEA。

图6:血清中半乳糖凝集素-9水平将PDAC患者与良性胰腺疾病和健康个体区分开来。
图6

一个健康人血清样本中半乳糖凝集素-9浓度的点图(健康人，n= 28例)，慢性胰腺炎(CP，n= 18)，导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMN，n= 18)， PDAC (n= 70)。bUICC分期PDAC患者血清样品中半乳糖凝集素-9浓度的点图。c生存期短(<12个月)或长(>12个月)的IV期PDAC患者血清样本中半凝素-9浓度的点图。dCP患者(左)、IPMN患者(中)和PDAC患者(右)与健康对照组(健康组)血清样品中半乳糖凝集素-9浓度的ROC曲线。ePDAC与CP(左)和IPMN(右)血清样品中半凝素-9、CA19-9和CEA浓度的ROC曲线。每个点代表一个病人的数据。数据值。单因素方差分析或未配对t以及。＊p<0.05, * *p<0.01, * * *p<0.001。

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讨论

PDAC是一种毁灭性的疾病，预计将成为癌症相关死亡的第二大原因。迫切需要更多的生物标志物和新的治疗靶点来改善患者的预后。在这项研究中，我们发现半乳糖凝集素-9在PDAC患者的血清中表达强烈，并在PDAC患者的血清中增加。考虑到半乳糖凝集素-9阻断后小鼠PDAC肿瘤生长减少，半乳糖凝集素-9作为PDAC新治疗靶点的潜力是重要的[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 14" title="14" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1293">14］．值得注意的是，尽管免疫治疗在多种癌症中取得了成功，但PDAC的反应并不好。在多个实体瘤中，PDAC最高LGALS9表达和半乳糖凝集素-9 mRNA水平明显高于PD-L1。PD-1/PD-L1阻断反应是否需要PD-L1表达尚不清楚，然而，高水平的半乳糖凝集素-9需要进一步研究半乳糖凝集素-9作为PDAC免疫治疗靶点。特别是一种免疫原性的PDAC亚型已被证明与B细胞和t细胞浸润相关的基因丰富[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 16" title="16" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1299">16］．半乳糖凝集素-9 mRNA的高表达与t细胞基因无关，但与m2样巨噬细胞极化和MDSCs相关的基因相关。最近的一项研究表明，小鼠PDAC中的半乳糖凝集素-9阻断导致t细胞激活和m1 -巨噬细胞极化[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 14" title="14" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1302">14］．随后，巨噬细胞的半乳糖凝集素-9结扎增加了m2极化和肿瘤的进展，这是由于免疫抑制肿瘤微环境。同样，我们发现高半乳糖凝集素-9 mRNA水平与几个单核细胞免疫抑制基因相关。此外，半乳糖凝集素-9极化的巨噬细胞倾向于m2表型，而半乳糖凝集素-9启动的巨噬细胞抑制了人PDAC中t细胞因子的产生。Galectin-9在人PDAC标本中的表达是可变的，但明显高于正常胰腺组织。半乳糖凝集素-9的表达增加在其他几种肿瘤中也有报道，且大多与良好的预后有关。然而，半乳糖凝集素-9的高表达与肺癌的生存率降低有关，表达增加与肝细胞癌、胃癌和结直肠癌的生存率提高有关，也与乳腺癌的低转移潜力有关[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="17" href="#ref-CR17" id="ref-link-section-d143690565e1305">17，<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="18" href="#ref-CR18" id="ref-link-section-d143690565e1305_1">18，<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="19" href="#ref-CR19" id="ref-link-section-d143690565e1305_2">19，<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="20." href="#ref-CR20" id="ref-link-section-d143690565e1305_3">20.，<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 21" title="21" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1309">21］．值得注意的是，在胰腺癌细胞中，半乳糖凝集素-9已被证明可诱导凋亡[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 22" title="22" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1312">22］．然而，半乳糖凝集素-9对AsPC-1细胞增殖无显著影响。在我们的分析中，Galectin-9的组织和血清表达与肿瘤分期和总生存期无关。事实上，我们发现新辅助化疗后组织样本中半乳糖凝集素-9的表达减少，与我们之前的发现相似，在伊马替尼治疗后胃肠道间质瘤中PD-L1的表达减少[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 23" title="23" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1315">23］．除了抗肿瘤治疗对半乳糖凝集素-9表达的直接调节作用外，肿瘤细胞的普遍减少可能有助于这一观察结果。

在人PDAC中分析的免疫细胞中，γδ T细胞显示出最高的半乳糖凝集素-9表达。其他免疫细胞仅少量表达半乳糖凝集素-9，但与匹配的血液免疫细胞相比，肿瘤内免疫细胞表达普遍增加。此外，与健康对照组相比，PDAC患者的血液免疫细胞有更高的半乳糖凝集素-9表达，提示存在一种局部和全身肿瘤依赖因子驱动人PDAC中半乳糖凝集素-9表达。我们发现血T细胞中半乳糖凝集素-9的表达与肿瘤分期无相关性。血清中半乳糖凝集素-9水平的升高与肿瘤分期无关，这表明半乳糖凝集素-9可能不能普遍反映肿瘤的进展。血清中半乳糖凝集素-9水平能够将PDAC与良性胰腺疾病和健康个体区分开来。ipmn患者血清中半乳糖凝集素-9水平未升高，提示半乳糖凝集素-9在原发肿瘤生长过程中以异质方式发生。PDAC患者血清中位值为9.125 ng/ml。在转移期，存活超过12个月的患者血清中半乳糖凝集素-9水平低于短期存活者，证明了其预后价值。

目前，CA19-9抗原是PDAC唯一被批准的生物标志物，尽管由于其适度的敏感性和特异性，只推荐用于疾病监测而不是诊断PDAC。近年来，多项研究调查了新的生物标志物和潜在的互补标记[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="24" href="#ref-CR24" id="ref-link-section-d143690565e1324">24，<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="25" href="#ref-CR25" id="ref-link-section-d143690565e1324_1">25，<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 26" title="26" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1327">26］．例如，血栓反应蛋白-2最近被确定为高度特异性的诊断标志物，在胰腺癌的检测中与CA19-9互补[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 27" title="27" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1330">27］．在我们的研究中，由于缺少健康个体的CA19-9水平，我们无法调查结合半乳糖凝集素-9和CA19-9水平的益处。未来需要对更多PDAC患者进行研究，以确认半乳糖凝集素-9作为补充生物标志物的有效性。

其他半乳糖凝集素已在PDAC的背景下进行了分析。值得注意的是，在PDAC中检测到半乳糖凝集素-1过表达[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 28" title="28" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1336">28，<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 29" title="29" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1339">29］．然而，半乳糖凝集素-1水平与肿瘤分期无关。PDAC中半凝素-1血清水平的敏感性和特异性与CA19-9相似，但慢性胰腺炎患者血清水平也升高[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 29" title="29" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1342">29］．Galectin-3的表达与PDAC的预后改善有关，特别是无远处转移[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 30" title="30." href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1345">30.］．然而，半乳糖凝集素-3也被证明通过ras激活的信号通路增加细胞迁移和增殖[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 31" title="31" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1348">31］．有趣的是，半乳糖凝集素-4的表达与减少淋巴结转移有关，并导致胰腺癌细胞迁移和转移的减少[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 32" title="32" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1352">32，<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 33" title="33" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1355">33］．galectin的多种不同机制似乎在胰腺癌中起作用。因此，我们目前正在研究胰肿瘤微环境中半乳糖凝集素-9的其他影响因素。

总之，半乳糖凝集素-9在人PDAC中高度表达。肿瘤和免疫细胞均有显著的半乳糖凝集素-9表达。PDAC患者血液免疫细胞中半乳糖凝集素-9的表达高于健康对照组。此外，血清中半乳糖凝集素-9水平能够将PDAC与良性胰腺疾病和健康个体区分开来。诊断时发生转移的PDAC患者可根据其血清半乳糖凝集素-9水平分为长期(>12个月)或短期(<12个月)生存率。因此，半乳糖凝集素-9是PDAC中一个很有前途的新生物标志物。

材料与方法

TCGA rna序列分析

LGALS9在TCGA RNA-seq数据集中，使用癌症基因组学的cbiopportal评估mRNA数量[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 34" title="34" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1376">34，<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 35" title="35" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1379">35］．LGALS9图中mRNA值为log2 (RSEM+1)-转换。<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">1．使用GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA)进行临床相关性分析。数据以中位数表示。

患者样本

肿瘤标本和血液样本来自于在我们机构接受手术的PDAC患者，并得到德累斯顿工业大学伦理委员会批准的方案的同意。组织取自83例PDAC患者的切除标本，采用福尔马林固定和石蜡包埋。每个标本的连续切片用H&E染色进行组织学评估。手术切口前抽血，外周血单个核细胞经bioccol分离液(默克)密度离心分离。使用IV型胶原酶、脱氧核糖核酸酶(Thermo Fisher)和胰蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)分离肿瘤组织以获得单细胞悬液。然后用流式细胞仪对细胞进行分析。肿瘤的临床分期是根据国际癌症控制联盟(UICC;患者特征见补充表<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">S1- - - - - -<一个d一个t一个-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7">S3．

免疫荧光和免疫组化

组织切片进行脱蜡、复水和封闭(5%山羊血清、1% BSA、1.5 M Tris HCl) 30分钟。抗半乳糖凝集素-9 (ab69630)和抗细胞角蛋白19 (ab192751，均为abcam)在4℃下涂抹过夜。使用Alexa Fluor 488标记的兔IgG和Alexa Fluor 568标记的豚鼠IgG(均为Invitrogen)的二抗。细胞核用4 '，6-二胺基-2-苯林多(DAPI, Vector Labs)反染色，并嵌入Faramount安装介质(Agilent Dako)。图像在共焦徕卡SP5 MP上获得，放大倍率为×40。免疫组化时，抗半乳糖凝集素-9应用12小时，然后与SignalStain Boost IHC检测试剂(细胞信号)孵育30分钟。ImmPACTTMDAB过氧化物酶(Vector Labs)是根据制造商的说明使用的。载玻片在Primovert光场和相位对比显微镜(蔡司)上成像。通过评估十个高功率场(HPF;×40)每一张幻灯片用盲法。

流式细胞术及细胞因子检测

如前所述，制备用于流式细胞术的单细胞悬液[<一个d一个t一个-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 36" title="36" href="//www.marcconsult.com/articles/s41388-020-1186-7" id="ref-link-section-d143690565e1420">36］．用靶向CD45 (HI30)、CD3 (SK7)、CD4 (RPA-T4)、CD8 (SK1)、TCR γδ (B1)、CD56 (B159)、CD19 (SJ25C1)、CD14 (M5E2)、CD206(19.2)、HLA-DR (G46-6)、IFN-γ (4S.B3)和TNF-α (MAb11，均为BD Biosciences)、CD11b (M1/70)、CD86 (IT2.2)和半乳糖凝集素-9 (9M1-3，均为BioLegend)的单抗对样品进行染色。对于细胞内细胞因子染色，细胞被phorbol 12-肉豆蔻酸13-醋酸酯(PMA, 50 ng/mL)和离子霉素(750 ng/mL)刺激在37°C, 5% CO 4 h2在1 mg/mL brefeldin A (BD Biosciences)的存在下。进行表面染色，用BD Cytofix/ cytooperm Kit对细胞进行固定和渗透，并对IFN-γ和TNF-α进行染色。流式细胞术在LSR Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上进行。数据分析使用FlowJo v10 (Treestar, Ashland, OR)。

共培养和治疗

人PDAC细胞系AsPC-1(来自ATCC)在37°C和5% CO中保持2在添加10% FCS、葡萄糖、10 mmol/L Hepes和1 mmol/L丙酮酸钠的RPMI培养基中。细胞在使用前进行支原体污染检测。使用人CD14和CD3微珠(Miltenyi Biotec)从PDAC患者的外周血中纯化单核细胞和T细胞。使用两个连续的MACS列进行正选择。流式细胞术检测纯度<95%。CD14+用100 ng/mL M-CSF (PHC9504, Thermo Fisher Scientific)处理细胞7天进行细胞分化。巨噬细胞与AsPC-1细胞(1:4)共培养，与重组人半乳糖凝集素-9(10µg/mL;9064-GA-050, R&D Systems)或对照96孔板(BD Biosciences)，三份48小时。CD3+T细胞与巨噬细胞(如上所述)在抗cd3包被的96孔板中(2:1的比例)共培养48小时。所有实验至少重复两次。

酶联免疫吸附测定

根据制造商的协议，使用Quantikine ELISA人Galectin-9免疫分析试剂盒(DGAL90, R&D Systems)， ELISA检测PDAC患者和对照健康供体血清中的Galectin-9。

统计分析

数据以平均值±SEM或中位数表示。没有配对，双尾学生t适用时进行检验或单因素方差分析比较。相关分析采用Spearman相关检验。使用GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA)。p≤0.05被认为是显著的。