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NgydF4y2Ba6gydF4y2Ba-methyladenosine (mgydF4y2Ba6gydF4y2Ba)是最流行的修改在真核信使rna (mRNA)和由其读者解读,从技术上说,比如云天化domain-containing蛋白,调节mRNA的命运。在这里,我们报告了胰岛素样生长因子2 mRNA-binding蛋白质(IGF2BPs;包括IGF2BP1/2/3)作为一种独特的家族gydF4y2Ba6gydF4y2Ba成千上万的读者,目标通过认识到共识GG mRNA转录(mgydF4y2Ba6gydF4y2BaC)序列。相比mRNA-decay-promoting功能从技术上说,云天化domain-containing家族蛋白2,IGF2BPs促进目标mrna的稳定和存储(例如,gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba在一个mgydF4y2Ba6gydF4y2Ba依赖的方式在正常和压力条件下,因此影响基因表达输出。此外,K同源域IGF2BPs所需的认可gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和至关重要的致癌作用。因此,我们的工作揭示了一个m的不同方面gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一个阅读的过程,促进mRNA稳定和翻译,强调功能的重要性IGF2BPs mgydF4y2Ba6gydF4y2Ba一个读者在转录后基因调控和癌症生物学。gydF4y2Ba
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2018年6月07gydF4y2Ba
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2020年8月27日gydF4y2Ba
这篇论文已经发表的校正:gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41556 - 020 - 00580 - ygydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们感谢辛辛那提大学蛋白质组学实验室的质谱分析;转基因动物和基因编辑核心辛辛那提儿童医院医学中心sgRNA向量的设计和施工;基因组学、表观基因组学测序核心辛辛那提大学和芝加哥大学的基因组功能下一代测序。这项工作的部分支持由美国国立卫生研究院(NIH) R01基金赠款CA214965 (J.C.) CA211614 (J.C.) CA178454 (J.C.) CA182528 (J.C.) CA163493 (J.-L.G), 1 HG008935 (C.He), 1 s10rr027015-01 (K.D.G.)和赠款2017 yfa0504400 (J.Y.), 91440110 (J.Y.)和91440110 (L.Q.)从中国的国家自然科学基金。J.C.是一个白血病和淋巴瘤协会(那)学者。C。他是一个侦探的霍华德·休斯医学研究所(霍华德·休斯医学研究所的)。B.S.Z.霍华德·休斯医学研究所的国际学生研究员。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者和联系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
第三世,H。翁J.C.构思和设计整个项目。第三世,H。翁,C。他,J.Y. J.C.设计和监督的研究。第三世,H。翁,X.Q.,H.S.,H。吴B.S.Z.上午,C。Liu C.L.Y.,J.R.S.R.S.,X.D.,硕士C。李S.N.陈怡如C。Hu, K.F. and J.C. performed the experiments and/or data analyses. H.H., H.Weng, W.S., L.D. and J.Y. performed the genome-wide or transcriptome-wide data analyses. Y.-C.H., S.H., K.D.G., X.J., M.W., L.Q., J.-L.G., C.He, J.Y. and J.C. contributed reagents/analytic tools and/or grant support. H.H., H.Weng, W.S., H.S., B.S.Z., A.M., S.N., C.He, J.Y. and J.C. wrote and revised the paper. All authors discussed the results and commented on the manuscript.
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补充图1 IGF2BP蛋白质的选择性结合mgydF4y2Ba6gydF4y2Ba甲基化的RNA。gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)点状确认mgydF4y2Ba6gydF4y2Ba单链的修改(ss) RNA探针用于RNA下拉试验。注意,ss-A探头没有米gydF4y2Ba6gydF4y2Ba修改没有米gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一个信号。亚甲蓝(MB)染色作为加载控制。(gydF4y2BabgydF4y2Ba)gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba绑定的RNA探针(0 - 1.0µm)与IGF2BP HEK293T核中提取的蛋白质。乐队在西方墨迹的灰色信号(上)被量化图像主总实验室,如下所示。(gydF4y2BacgydF4y2Ba)gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba绑定的变性(10分钟加热在99°C) ssRNA探针与内生IGF2BP蛋白质的情况下,防止(在冰上,冰)或允许(在室温下,RT) RNA折叠。(gydF4y2BadgydF4y2Ba)gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba绑定的gydF4y2Ba6gydF4y2BaA-methylated或unmethylated RNA探针与0.5µg重组IGF2BP1or IGF2BP2蛋白质或1.0µg IGF2BP3重组蛋白质的生产从HEK293T细胞。(gydF4y2BaegydF4y2Ba)凝胶转变分析测量离解常数(gydF4y2BaKgydF4y2BadgydF4y2BanM)与甲基化(ss-m IGF2BP重组蛋白质gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)或unmethylated (ss-A) ssRNA调查。(gydF4y2BafgydF4y2Ba)序列和修改的发夹RNA探针用于RNA下拉试验。注意点生命探测器没有米gydF4y2Ba6gydF4y2Ba修改没有米gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一个信号。(gydF4y2BaggydF4y2Ba)特定绑定的IGF2BP HEK293T核蛋白质提取与甲基化ssRNA hpRNA探测器探测到RNA下拉和免疫印迹。(gydF4y2BahgydF4y2Ba)数量的米gydF4y2Ba6gydF4y2BaRBPs的修改在结合位点。三个IGF2BP paralogues被显示为红色。分析两次类似的结果。(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba和gydF4y2BajgydF4y2Ba)m的浓缩gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在IGF2BP-bound RNA。米gydF4y2Ba6gydF4y2Ba的甲基化mRNP复合物分离HEK293T细胞异位表达FLAG-IGF2BP1-3 (gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)或从父母HepG2细胞(gydF4y2BajgydF4y2Ba)是评价点污点。(gydF4y2BakgydF4y2Ba和gydF4y2BalgydF4y2Ba)共识序列结合位点的内源性IGF2BPs HepG2细胞(gydF4y2BakgydF4y2Ba),为(gydF4y2BalgydF4y2Ba)检测到荷马主题与编码eCLIP数据分析。图像的点状或免疫印迹gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2BacgydF4y2Ba,gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba,gydF4y2BaggydF4y2Ba,gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,gydF4y2BajgydF4y2Ba是代表三个独立的实验。未加工的免疫印迹分析可用的扫描补充图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
补充图2的功能注释IGF2BP目标。gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba一个gydF4y2BaIGF2BPs HepG2细胞的差别)免疫印迹显示对这些基因的慢病毒感染对每个IGF2BP shrna,代表三个独立的实验。GAPDH是用作加载控制。与非特异性细胞转导控制(NS)或为每个IGF2BP # 1成分用于RNA-seq和mRNA的稳定性分析。(gydF4y2BabgydF4y2Ba)浓缩块夹+ RIP IGF2BPs的目标。NES,规范化浓缩分数;罗斯福,错误发现率。注意,罗斯福< 0.25被认为是显著的基因集富集分析(GSEA)分析。(gydF4y2BacgydF4y2Ba)代表生物过程和KEGG通路IGF2BP丰富表达下调目标。(gydF4y2BadgydF4y2Ba)GSEA分析共享下调目标IGF2BP1击倒,IGF2BP2, IGF2BP3。(gydF4y2BaegydF4y2Ba)的变化gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba和gydF4y2BaFSCN1gydF4y2Ba信使rna水平gydF4y2BaIGF2BP1gydF4y2Ba或/和gydF4y2BaYTHDF2gydF4y2Ba可拆卸的海拉细胞。值意味着南达科他州±。n = 3独立实验,双尾的学生gydF4y2BatgydF4y2Ba以及使用(* * *,P < 0.001)。(gydF4y2BafgydF4y2Ba)mRNA日志的累积频率gydF4y2Ba2gydF4y2Ba倍变化显示全球减少METTL14目标基因gydF4y2BaIGF2BPgydF4y2Ba沉默。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双面Wilcoxon和Mann-Whitney测试值计算。未加工的免疫印迹分析可用的扫描补充图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。源数据的gydF4y2BaegydF4y2Ba补充表中可以找到吗gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
补充图3 IGF2BPs调节mRNA的稳定性。gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)累积分布非目标或YTHDF2目标基因的mRNA半衰期HepG2和海拉细胞。(gydF4y2BabgydF4y2Ba)分布的mRNA半衰期IGF2BP3剪辑目标与shIGF2BP3或shNS HepG2细胞。(gydF4y2BacgydF4y2Ba)的mRNA半衰期累积分布IGF2BP3剪辑目标shIGF2BP3或shNS HepG2细胞。信使rna半衰期的分析gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2BacgydF4y2Ba重复两次。(gydF4y2BadgydF4y2Ba)mRNA稳定性试验显示减少mRNA的半衰期gydF4y2BaFSCN1gydF4y2Ba,gydF4y2BaTK1gydF4y2Ba和gydF4y2BaMARCKSL1gydF4y2BaHepG2细胞IGF2BPs击倒。(gydF4y2BaegydF4y2Ba)mRNA稳定性试验显示减少mRNA的半衰期gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba,gydF4y2BaFSCN1gydF4y2Ba,gydF4y2BaTK1gydF4y2Ba和gydF4y2BaMARCKSL1gydF4y2Ba在可拆卸的gydF4y2BaIGF2BPsgydF4y2Ba在人类脐带血CD34gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞。(gydF4y2BafgydF4y2Ba)mRNA稳定性试验显示减少mRNA的半衰期gydF4y2BaFSCN1gydF4y2Ba,gydF4y2BaTK1gydF4y2Ba和gydF4y2BaMARCKSL1gydF4y2Ba在可拆卸的gydF4y2BaMETTL3gydF4y2Ba或gydF4y2BaMETTL14gydF4y2Ba在HepG2细胞。(gydF4y2BaggydF4y2Ba和gydF4y2BahgydF4y2Ba)与压力Colocalization IGF2BP蛋白质颗粒标记裂缝(g)或P-body标记DCP1A (h)的海拉细胞热休克后42˚C 1小时。图片是代表三个独立的实验。箭头表示colocalization细胞质颗粒。酒吧= 10µm规模。gydF4y2BaPgydF4y2Ba值计算使用双面Wilcoxon Mann-Whitney测试gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2BacgydF4y2Ba。值意味着南达科他州±。n = 3独立实验,和指数回归中使用gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba。源数据的gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba补充表中可以找到吗gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
补充图4 IGF2BPs促进信使核糖核酸的翻译。gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)HEK293T细胞转染FLAG-IGF2BPs和细胞溶解。Polysome-fractionated样本分组,non-ribosome mRNPs 40年代- 80年代(可翻译)和多核糖体(积极翻译),并分析了使用标记抗体免疫印迹,户珥,翻译起始因子eIF3核心子单元eIF3A和eIF3B。(gydF4y2BabgydF4y2Ba)分布的内生IGF2BP蛋白质多核糖体HepG2细胞的分数。(gydF4y2BacgydF4y2Ba)Polysomal内生的剖析gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba信使rna在gydF4y2BaIGF2BP1gydF4y2Ba击倒或控制HEK293T细胞。值意味着南达科他州±。(n = 2独立实验。(gydF4y2BadgydF4y2Ba)海拉细胞被热震惊42°C 1小时,允许恢复不同时期。Polysomal分析进行检测内源性IGF2BP2在热休克复苏。结果a、b和d是代表两个独立的实验。未加工的免疫印迹分析可用的扫描补充图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。源数据的gydF4y2BacgydF4y2Ba补充表中可以找到吗gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
图5补充机制IGF2BP承认他们的目标mrna和抑制目标表达式。gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)RIP-qPCR内生IGF2BP1或IGF2BP2协会gydF4y2BaMYCgydF4y2BaCRD HepG2细胞。值意味着南达科他州±。n = 3独立实验,双尾学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试使用(* * *,gydF4y2BaPgydF4y2Ba;p < 0.001)。(gydF4y2BabgydF4y2Ba)示意图CRD-wt和CRD-mut萤火虫荧光素酶记者。249 - nt的野生型CRD插入DNA序列XhoI网站之前,萤火虫荧光素酶基因的终止密码子pMIR-REPORT向量产生CRD-WT记者。CRD-mut记者,t替换(红色所示)是在mgydF4y2Ba6gydF4y2Ba达成共识(在灰色背景)。注意,只有CRD序列的一部分,包含突变的网站。用于CRD RNA寡核苷酸的序列gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba结合试验被蓝色所示CRD插入的序列。箭头指示的位置引物用于RIP-qPCR化验。引物设计区分MYC-CRD记者从内生的表情gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba信使rna。(gydF4y2BacgydF4y2Ba)RNA下拉试验显示gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba绑定的IGF2BPs突变(U突变,贴上U)和mgydF4y2Ba6gydF4y2Ba甲基化(标记为mgydF4y2Ba6gydF4y2Ba3)CRD RNA探针,代表独立的实验。(gydF4y2BadgydF4y2Ba)的相对荧光素酶活性CRD-wt记者当cotransfected IGF2BPs表达向量的表示数量。HEK293T细胞和海拉细胞转染24小时和48小时后,检查。值意味着n = 2独立的实验。(gydF4y2BaegydF4y2Ba和gydF4y2BafgydF4y2Ba)RNA折叠式的化验显示gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba绑定IGF2BP2变异ssRNA寡核苷酸(gydF4y2BaegydF4y2Ba)或hpRNA寡核苷酸(gydF4y2BafgydF4y2Ba),代表三个独立的实验。未加工的免疫印迹分析可用的扫描补充图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。源数据的gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BadgydF4y2Ba补充表中可以找到吗gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
补充图6 MYC基因是一个重要的致癌IGF2BPs的目标。gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba)失调IGF2BPs在人类癌症。癌症基因组图谱的数据(TCGA)进行了分析和显示cross-cancer变更(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和RNA表达(gydF4y2BabgydF4y2Ba)使用cBioPortal IGF2BPs (www.cbioportal.org)。(gydF4y2BacgydF4y2Ba)代表三个独立实验的图片显示的效果IGF2BP击倒在细胞迁移和入侵。(gydF4y2BadgydF4y2Ba和gydF4y2BaegydF4y2Ba)量化伤口关闭(gydF4y2BadgydF4y2Ba图像()和代表gydF4y2BaegydF4y2Ba)在IGF2BPs-silenced表示时间点和控制海拉细胞。值意味着南达科他州±。n = 3独立的实验。(gydF4y2BafgydF4y2Ba)qPCR证实MYC的击倒siRNA转染后72小时。值意味着南达科他州±。n = 3独立的实验。(gydF4y2BaggydF4y2Ba)MYC siRNA对细胞增殖的影响通过MTT分析评估。值意味着南达科他州±。n = 3独立的实验。(gydF4y2BahgydF4y2Ba)代表数字图像(左)和殖民地的海拉(右)和HepG2细胞转染与控制(siNC)或MYC核(siMYC)。殖民地被数从3井2独立的复制实验。(gydF4y2Bai和jgydF4y2Ba)MYC siRNA对细胞迁移的影响和入侵transwell化验检查的海拉(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)和HepG2细胞(j)。多的迁移和入侵细胞数从3独立实验。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双尾学生t值计算gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba和gydF4y2BaggydF4y2Ba(* *,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01;* * *,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)。未加工的免疫印迹分析可用的扫描补充图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。源数据的gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba,gydF4y2BaggydF4y2Ba,gydF4y2BahgydF4y2Ba,gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,gydF4y2BajgydF4y2Ba补充表中可以找到吗gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
补充图7对比IGF2BPs YTHDF2结合位点。gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)维恩图解显示IGF2BPs的重叠和YTHDF2绑定网站。IGF2BPs的结合位点和YTHDF2被称为通过阻滞剂软件与严格的参数(最小数量的读取= 5和最小深度阅读= 5)。(gydF4y2BabgydF4y2Ba)重要的主题在YTHDF2 HomerMotif分析结合位点的所有重要的山峰YTHDF2分析gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba进行两次类似的结果。(gydF4y2BacgydF4y2Ba)箱形图显示GC含量总(上)或GGAC-containing IGF2BPs和YTHDF2结合位点(低)。最小值,最大值,中心,百分位数和n。(gydF4y2BadgydF4y2Ba)总量的累积曲线显示GC内容(上)或GGAC-containing IGF2BPs和YTHDF2结合位点(低)。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双面Wilcoxon和Mann-Whitney测试值计算。PAR-CLIP数据分析gydF4y2BacgydF4y2Ba和gydF4y2BadgydF4y2Ba3生物独立实验。gydF4y2Ba
补充图8未经加工的凝胶的屁股。gydF4y2Ba
值得注意的是,对于一些免疫印迹检测膜被切成几块孵化与不同的抗体,因此这些膜的原始图像的小尺寸。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充图1 - 8和传说为补充表1 - 3。gydF4y2Ba
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黄,H。,Weng, H., Sun, W.et al。gydF4y2Ba识别的RNAgydF4y2BaNgydF4y2Ba6gydF4y2Ba-methyladenosine IGF2BP蛋白mRNA稳定和提高翻译。gydF4y2BaNat细胞生物gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,285 - 295 (2018)。https://doi.org/10.1038/s41556 - 018 - 0045 - zgydF4y2Ba
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