SARS-CoV-2受体识别的结构基础gydF4y2Ba

的突然出现和快速传播SARS-CoV-2危及全球卫生和经济gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba}。SARS-CoV-2造成更多的感染、死亡和经济比2002 - 2003年冠中断gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}。SARS-CoV-2的起源尚不清楚。蝙蝠被认为是原始的SARS-CoV-2因为冠状病毒密切相关,RaTG13,已经与蝙蝠gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba。然而,可能的蝙蝠向人类传播的分子事件,导致SARS-CoV-2是未知的。临床批准疫苗或药物,专门针对SARS-CoV-2也缺乏。受体识别的病毒传染性的冠状病毒是一个重要的决定因素,发病机理和宿主范围gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}。它提供了一个疫苗和抗病毒策略的主要目标gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba。在这里我们阐明受体的结构和生化机制由SARS-CoV-2识别。gydF4y2Ba

受体识别由冠一直得到广泛的研究。一个病毒表面突起蛋白介导冠状病毒进入宿主细胞。冠状的突起蛋白包含一个RBD,专门识别ACE2作为它的受体gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}。一系列冠RBD的晶体结构不同菌株在复杂ACE2与不同的主机曾被确定gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}。这些结构表明,冠RBD包含一个核心和一个受体结合主题(元);与ACE2疟疾行动协调联系。ACE2的表面包含两个病毒结合热点,为冠绑定至关重要。几个自然选择突变冠元围绕这些热点和调节传染性,发病机理,跨物种和人与人之间传输的冠gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

因为蛋白质序列相似性的增加冠状和SARS-CoV-2最近预测,SARS-CoV-2也使用ACE2作为它的受体gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba,它已经被其他研究证实gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}。我们决定由SARS-CoV-2受体识别的结构基础,比较了ACE2-binding SARS-CoV-2之间亲和力,冠和RaTG13。我们的发现识别的分子和结构特点SARS-CoV-2遏制,导致紧ACE2绑定。他们提供洞察SARS-CoV-2的动物源,并且可以帮助指导干预策略目标SARS-CoV-2-ACE2交互。gydF4y2Ba

理解SARS-CoV-2 ACE2识别的结构基础,我们旨在结晶SARS-CoV-2 RBD-ACE2复杂。我们的策略是根据以前的结晶冠RBD-ACE2复杂gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。在这个晶体形式,冠RBD的核心(连同ACE2表面)主要是参与晶格接触;冠元的基本ACE2-binding残留物被埋在RBD-ACE2接口,不影响结晶。促进结晶,我们设计使用的核心的嵌合RBD冠RBD结晶脚手架和遏制从SARS-CoV-2单元(图相关的功能。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。进一步加强结晶,我们改进了ACE2-binding亲和力的嵌合RBD冠元通过保持短循环,维护Arg426之间强烈的盐桥的RBD和ACE2 Glu329(扩展数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。这个循环坐在一边的绑定接口,远离主绑定接口。我们表达和纯化嵌合RBD和ACE2,和复杂的结晶在相同条件下和在同一晶体形式用于冠RBD-ACE2复杂。x射线衍射数据的基础上,我们确定嵌合RBD-ACE2复杂的分子结构的替代使用的结构冠RBD-ACE2复杂的搜索模板。我们精制2.68(扩展数据表的结构gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。这个嵌合RBD-ACE2复杂的结构,特别是遏制疟疾地区,非常类似于另一个最近SARS-CoV-2野生型RBD-ACE2复杂的结构决定的gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba,确认嵌合RBD是一个成功的设计。gydF4y2Ba

嵌合RBD-ACE2复杂的总体结构是类似于冠RBD-ACE2复杂(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。形成一个类似于冠元,SARS-CoV-2元轻轻凹面岭一侧;的暴露外表面结合ACE2的爪状结构(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。冠之间的强盐桥RBD和ACE2成为弱(根据交互)的距离越长,但仍积极有利,N-O Arg439之间的桥梁的嵌合RBD和ACE2 Glu329gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。冠元相比,SARS-CoV-2元形式绑定接口和更大更多的接触ACE2(扩展数据图。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba)。我们的结构模型还包含聚糖连着四个ACE2网站和一个RBD网站(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。的多糖连着Asn90 ACE2形成氢键的Arg408 RBD核心(扩展数据图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba);这glycan-interacting精氨酸是守恒的SARS-CoV-2与冠(扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。整体结构相似性ACE2绑定SARS-CoV-2和冠支持两种病毒进化关系密切。gydF4y2Ba

我们测量了绑定之间的紧密联系的三个rbd (SARS-CoV-2、嵌合、冠状和ACE2使用表面等离子体共振(SPR)(扩展数据无花果。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。我们发现嵌合RBD ACE2-binding亲和力高于SARS-CoV-2 RBD,符合了N-O嵌合RBD和ACE2之间的桥梁。嵌合和SARS-CoV-2 RBD ACE2-binding亲和力显著高于冠RBD。这些离解常数gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba值与其他SPR的研究是一致的gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba},虽然确切的gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba值取决于每个SPR实验的具体方法(扩展的数据表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。这里我们探讨结构性差异的遏制SARS-CoV-2 ACE2-binding亲和力和冠,占他们的不同。gydF4y2Ba

明显的结构性差异SARS-CoV-2的遏制和冠状循环的构象在ACE2-binding脊(无花果。gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba)。在遏制,脊循环包含一个基本的二硫键和该地区disulfide-bond-forming半胱氨酸之间的变量(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。具体来说,人类和猫冠状病毒和蝙蝠冠状病毒Rs3367所有包含在这个循环proline-proline-alanine three-residue图案;串联势函数允许循环急转弯。相比之下,SARS-CoV-2和蝙蝠冠状病毒RaTG13都包含一个four-residue主题glycine-valine / glutamine-glutamate / threonine-glycine;两个相对笨重的残留物和两个灵活的甘氨酸循环使不同的构象(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。由于这些结构上的差异,一个额外的主链之间的氢键形式Asn487和Ala475 SARS-CoV-2遏制,导致脊以更紧凑的构象和循环包含Ala475靠近ACE2(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。因此,脊SARS-CoV-2元形式更多接触ACE2的氨基端螺旋(扩展数据图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。例如,氨基残Ser19 ACE2形式一个新的氢键与主链的Ala475 SARS-CoV-2遏制,和Gln24 ACE2的氨基端螺旋也形成了一个新的接触SARS-CoV-2遏制(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。此外,与相应的Leu472冠元相比,Phe486 SARS-CoV-2元点在不同的方向,插入一个疏水口袋涉及Met82 Leu79和Tyr83 ACE2(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba,gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba)。冠元相比,这些结构性变化SARS-CoV-2遏制更有利于ACE2绑定。gydF4y2Ba

相比冠RBM-ACE2接口,微妙但功能重要的结构性变化发生在两个病毒结合热点SARS-CoV-2 RBM-ACE2界面(图。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba)。SARS-CoV-ACE2界面,两个病毒结合热点以前确认gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}Lys31:热点(hotspot 31)由一个盐桥Lys31和Glu35之间和热点Lys353(也就是说,热点353)由盐Lys353和Asp38之间的桥梁。盐桥都弱,根据这些交互的相对较长的距离。埋葬这些弱疏水性环境中的盐桥病毒绑定将增强他们的能源,由于介电常数降低。这个过程是通过热点地区和附近的RBD残留之间的相互作用。首先,在冠RBM-ACE2接口,热点31日需要支持从Tyr442冠元(无花果。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。相比之下,在SARS-CoV-2 RBM-ACE2接口,Leu455 SARS-CoV-2的遏制(对应于Tyr442冠遏制不那么笨重的侧链,提供更少的支持Lys31 ACE2。因此,热点31的结构重新排列:盐Lys31之间的桥梁,Glu35分裂,和每一个残基形成氢键的Gln493 SARS-CoV-2遏制(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。第二,在冠RBM-ACE2接口,热点353需要支持的侧链甲基Thr487冠元,而侧链羟基Thr487形成氢键的遏制主链的构象(修复Thr487侧链)(图gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。相比之下,在SARS-CoV-2 RBM-ACE2接口,Asn501 SARS-CoV-2元也有它的构象固定其侧链之间通过氢键和遏制疟疾主链;相应地,其侧链提供了更少的支持比353热点的相应Thr487冠元(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。因此,Lys353 ACE2的需要一个稍微不同的构象,形成氢键的主链SARS-CoV-2遏制,同时保持Asp38的盐桥ACE2(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。因此,热点都调整减少附近RBD残留的支持,但仍然成为屹立不倒SARS-CoV-2 RBM-ACE2接口。gydF4y2Ba

确证结构的观察,我们ACE2-binding特征关联性SARS-CoV-2飙升,其中包含突变的临界ACE2-interacting残留。为此,与纯化重组蛋白下拉进行了化验,ACE2诱饵和细胞相关SARS-CoV-2峰值作为目标(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。对于交叉验证,我们使用ACE2与两个不同的标签,他的gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba和Fc。SARS-CoV-2上涨包含下列遏制变化之一:481 - 487 (481 - ngvegfn - 487在SARS-CoV-2突变TPPALN如冠,Q493N (Gln493 SARS-CoV-2突变是天冬酰胺作为人类冠状,Q493Y (Gln493 SARS-CoV-2是酪氨酸在蝙蝠RaTG13突变)和N501T (Asn501 SARS-CoV-2突变是一个苏氨酸在人类冠状。结果表明,所有的这些介绍突变降低ACE2-binding SARS-CoV-2飙升的亲和力。他们确认SARS-CoV-2元的结构特点,包括ACE2-binding脊和hotspots-stabilizing残留,导致SARS-CoV-2 ACE2-binding亲和力高。gydF4y2Ba

有ACE2识别SARS-CoV-2和冠相比,我们进一步研究了人类由蝙蝠RaTG13 ACE2绑定。为此,我们进行了pseudovirus条目分析中,逆转录病毒准型与RaTG13飙升(即RaTG13假)被用来输入ACE2-expressing人类细胞(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。结果表明,RaTG13 pseudovirus取决于ACE2进入细胞。此外,RaTG13高峰并非pseudovirus表面裂解。SARS-CoV-2 pseudovirus条目还取决于ACE2,但其峰值是裂解S2 pseudovirus表面(可能是因为furin网站插入gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。此外,我们进行了蛋白质拉试验使用ACE2作为诱饵,细胞相关RaTG13峰值作为目标(图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)。我们发现RaTG13高峰被ACE2推倒。因此,类似于SARS-CoV-2,蝙蝠RaTG13结合人类ACE2与受体可以使用人类ACE2的条目。gydF4y2Ba

当前SARS-CoV-2疫情已成为全球大流行。以前的结构研究冠状建立了冠传染性的受体识别作为一个重要的决定因素,发病机理和宿主范围gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。本文提供的结构信息的基础上,随着生化数据,我们讨论SARS-CoV-2的受体识别和演化。gydF4y2Ba

我们将首先讨论如何SARS-CoV-2承认ACE2冠相比。我们表明,与冠相比,SARS-CoV-2元包含ACE2-binding脊结构变化,很大程度上由于four-residue主题(残留482 - 485:Gly-Val-Glu-Gly)。这种结构性变化允许岭变得更加紧凑,形成更好的接触ACE2的氨基端螺旋(无花果。gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba)。此外,Phe486 SARS-CoV-2元插入到疏水口袋(图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。中相应的残冠元是一个亮氨酸,可能形成一个较弱的接触ACE2由于其较小的侧链。最后,这两种病毒结合热点更稳定在RBM-ACE2通过与SARS-CoV-2元的交互界面。先前的研究显示gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}为冠状病毒绑定,这些热点ACE2是重要的,因为它们涉及两个赖氨酸残基需要适应适当的疏水性环境中。中和赖氨酸的指控是绑定的冠状病毒rbd ACE2的关键。SARS-CoV-2元发展策略来稳定这两个热点:Gln493和Leu455稳定热点31日而Asn501稳定热点353(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。我们生化数据确认SARS-CoV-2 RBD ACE2-binding亲和力显著高于冠RBD和上述结构特点的SARS-CoV-2遏制导致SARS-CoV-2 ACE2-binding亲和力高RBD(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。因此,结构和生化数据表明SARS-CoV-2 RBD承认ACE2比冠RBD的功能。gydF4y2Ba

接下来,我们研究如何SARS-CoV-2可能是蝙蝠传染给人类。首先,我们发现蝙蝠RaTG13使用人类ACE2作为其受体(图。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba),这表明RaTG13可能感染人类。第二,与SARS-CoV-2,蝙蝠RaTG13遏制包含一个类似four-residue主题ACE2-binding岭,支持认为SARS-CoV-2可能是从RaTG13或RaTG13-related蝙蝠冠状病毒(扩展数据表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。第三,L486F, Y493Q D501N残留变化从RaTG13 SARS-CoV-2增强ACE2识别和可能促进SARS-CoV-2(扩展数据表的蝙蝠向人类传播gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。lysine-to-asparagine突变在479年非典冠状RBD的位置(对应于493年在SARS-CoV-2 RBD)使冠感染人类gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。第四,Leu455积极有助于ACE2识别,它是守恒的RaTG13和SARS-CoV-2之间;其在SARS-CoV-2元可能蝙蝠向人类传播的重要SARS-CoV-2(扩展数据表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。宿主和病毒受体识别以外的因素也有冠状病毒跨物种传播的重要作用gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}。然而,识别受体结合特性的SARS-CoV-2遏制可能促进SARS-CoV-2传输从蝙蝠到人类(扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

然后我们检查中间宿主是否参与了潜在的SARS-CoV-2蝙蝠向人类传播。因为蝙蝠冠状病毒RaTG13结合人类ACE2,一种可能性是,没有中间宿主。另外,提出了穿山甲是一个中间宿主gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba。本研究中提供的结构信息使我们检查和理解重要的遏制残留在冠状病毒隔离穿山甲。两个冠状病毒,CoV-pangolin / GD和CoV-pangolin / GX,被隔绝穿山甲在中国从两个不同的位置:广东(GD)、广西(GX),分别。遏制疟疾CoV-pangolin / GD包含Leu455, 482 - 485年的循环,Phe486, Gln493和Asn501(扩展的数据表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),所有这些都有利于ACE2的认可。遏制疟疾CoV-pangolin / GX包含Leu455和482 - 485年的循环,这两者都是有利于ACE2的识别,它还包含Leu486、Glu493 Thr501(扩展数据表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba少),所有这些都有利于ACE2的认可。因此,CoV-pangolin / GD可能承认人类ACE2,而CoV-pangolin / GX不。因此,穿山甲来自广东,但不是从广西穿山甲,可能通过人类冠状病毒。然而,许多其他因素确定冠状病毒跨物种传播的gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}和上面的分析需要实验验证。gydF4y2Ba

最后,本研究有助于通知干预策略。首先,单克隆抗体中和目标SARS-CoV-2元可以防止病毒从绑定到ACE2,因此有前途的抗病毒药物。我们已经制定了所有的功能结构重要的抗原表位的SARS-CoV-2元可以中和抗体药物的目标。因此,这项研究可以帮助指导这些抗体药物的开发和优化。第二,RBD本身可以作为亚单位疫苗gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}。SARS-CoV-2元功能重要的抗原表位,被确定在本研究可以指导基于结构的设计高度有效的RBD疫苗。这样一个小亚单位疫苗战略设计曾被开发出来gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。这种策略可能有助于设计SARS-CoV-2 RBD疫苗。总的来说,这项研究可以帮助通知基于结构的干预策略,在SARS-CoV-2受体识别目标。gydF4y2Ba

数据报告gydF4y2Ba

没有统计方法被用来预先确定样本容量。实验并不随机,调查人员没有被分配在实验和结果评估。gydF4y2Ba

质粒gydF4y2Ba

SARS-CoV-2(加入基因库QHD43416.1),冠(加入基因库AFR58740.1), RaTG13飙升(加入基因库QHR63300.2)和ACE2(加入基因库NM_021804)都是合成(GenScript生物技术)。冠,SARS-CoV-2嵌合rbd(见扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba残留范围rbd)和ACE2 ectodomain(残留1 - 615)subcloned进pFastBac向量(技术)n端蜜蜂蜂毒肽信号肽和c端gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba标签。ACE2的ectodomain(残留1 - 615),c端Fc-tag也是构造。gydF4y2Ba

蛋白表达和纯化gydF4y2Ba

所有的蛋白质都是由Sf9昆虫细胞使用Bac-to-Bac系统(技术)如前所述gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。总之,他的gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba收集标记蛋白质从细胞培养介质,使用Ni-NTA柱纯化,纯化进一步使用Superdex200凝胶过滤柱(通用电气医疗集团)和存储在缓冲区包含20毫米三pH值7.2和200毫米氯化钠。Fc-tagged蛋白纯化的一样gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba标记蛋白,除了蛋白质取代了过程中的Ni-NTA列一列。gydF4y2Ba

结晶和结构测定gydF4y2Ba

净化RBD-ACE2复杂,ACE2 RBD一起孵化,复杂的纯化使用Superdex200凝胶过滤色谱法。RBD-ACE2晶体在室温下生长在坐滴在包含100毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值8.5)液井,18 - 20% PEG 6000和100毫米氯化钠。晶体被浸泡在100毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值8.5)液,30% PEG 6000、100毫米氯化钠和30%乙二醇在液态氮被迅速冻结。在先进的x射线衍射数据收集光子源beamline 24-ID-E。结构是由分子替换使用的结构冠RBD包裹着ACE2的搜索模板(蛋白质数据库(PDB)gydF4y2Ba2 ajfgydF4y2Ba)。结构和细化统计数据扩展数据表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

蛋白质绑定化验gydF4y2Ba

SPR检测使用Biacore 2000系统(通用电气医疗集团)进行了如前所述gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。总之,不同的rbd共价固定化CM5传感器芯片通过胺组(通用电气医疗集团)。运行缓冲区包含10毫米消息灵通的pH值7.4,150毫米氯化钠,3毫米Tween-20 EDTA和0.05%。连续稀释纯化重组ACE2的注入浓度从5到80 nM SARS-CoV-2 RBD和嵌合RBD和冠RBD从20到320海里。生成的数据适合1:1绑定模型使用Biacore评估软件(通用电气医疗集团)。gydF4y2Ba

下拉的蛋白质测定进行了使用Dynabeads他隔离和下拉工具(表达载体)和Dynabeads蛋白为免疫沉淀反应工具包(英杰公司)根据制造商的手册。简而言之,150年μl表示Dynabeads洗了磷酸盐(PBS)和孵化与5μg ACE2-HisgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba(ACE2 c端gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba标记)或5μg ACE2-Fc (ACE2 c端Fc-tag)辊在室温下30分钟。孵化后,ACE2-bound珠子被洗了三次1毫升PBST缓冲区(PBS和0.05% Tween-20)辊整除了10分钟,然后到不同管使用。准备细胞相关冠状病毒蛋白质,HEK293T细胞转染与pcDNA3.1(+)质粒编码冠状病毒高峰(包含c端C9-tag);转染后48 h, spike-expressing细胞细胞溶解使用超声发生器免疫沉淀反应分析缓冲区(20毫米Tris-HCl, pH值7.4,150毫米氯化钠,1毫米EDTA和1% Triton x - 100,补充了蛋白酶抑制剂)和离心机,享年12000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba为2分钟。上层清液(含可溶性SARS-CoV-2飙升)被转移到混合分别与2毫升ACE2-bound珠管(飙升超过ACE2)。1小时孵化后在室温下辊,珠子都洗了三次PBST缓冲和绑定蛋白筛选了使用洗脱缓冲(300毫米咪唑,50 mM磷酸钠pH值8.0,300毫米氯化钠,ACE2-His Tween-20 0.01%gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba绑定珠子;0.1 M柠檬酸ACE2-Fc-bound珠子的pH值2.7)。样本然后进行sds - page分析使用一个anti-C9标记抗体免疫印迹。gydF4y2Ba

Coronavirus-spike-mediated pseudovirus条目分析gydF4y2Ba

pseudovirus条目分析如前所述gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba。总之,HEK293T细胞co-transfected luciferase-expressing hiv - 1基因质粒(pnl4 - 3. luc.re)和质粒编码SARS-CoV-2飙升或RaTG13飙升。假病毒转染后收集72 h,并被用来进入受体细胞(HEK293T细胞体内ACE2表达)。孵化后的假病毒与受体细胞37°C 6 h,介质的改变,细胞孵化了一个额外的60 h。然后用PBS缓冲和细胞溶解。整除的细胞溶解产物被转移到optiplate - 96 (PerkinElmer),其次是荧光素酶的底物。相对光测量单位使用EnSpire板读者(PerkinElmer)。所有测量数据进行了至少三个独立的生物样本。gydF4y2Ba

分析蛋白质接触残留物和埋表面区域gydF4y2Ba

使用LigPlot蛋白质接触残留进行分析gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba程序(v.1.4.5) (gydF4y2Bahttps://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/gydF4y2Ba)。蛋白质埋表面积分析使用PDBePISA工具(gydF4y2Bahttp://pdbe.org/pisa/gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba与本文有关。gydF4y2Ba