地塞米松调节重度COVID-19未成熟中性粒细胞和干扰素编程gydF4y2Ba

广泛的病毒和细菌感染可导致弥漫性肺损伤、ARDS、呼吸衰竭和死亡gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba}．传统上，中性粒细胞被认为是ARDS的关键驱动因素gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}；然而，严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)期间的中性粒细胞反应仍在探索中。此外，尚不清楚在COVID-19中观察到的肺损伤和ARDS是否具有共同或不同的中性粒细胞反应和炎症途径。尽管最近的研究利用单细胞转录组学来解剖外周gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}支气管肺泡液体gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}在驱动COVID-19发病机制的免疫环境中，所使用的协议可能会无意中排除多形核粒细胞，包括中性粒细胞，因为它们是低RNA(和高RNase)含量的敏感细胞。在这项研究中，和其他专门研究中性粒细胞的研究一样gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}在美国，我们采用全血保存方案，从入住重症监护室(ICUs)的危重患者中捕获中性粒细胞(以及所有其他免疫细胞类型)(扩展数据图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

相对于细菌性ARDS, COVID-19与干扰素(IFN)优先扩增有关gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba})和前列腺素(PGgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba})中性粒细胞。细菌性ARDS中性粒细胞具有较高的抗菌分子基因表达，如gydF4y2BaPLAC8gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCD83gydF4y2Ba．尽管类固醇对其他形式的ARDS仍存在争议，但地塞米松已被证明可以降低严重COVID-19的死亡率(参考文献)。gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba)．在我们的非随机、实用的调查中，地塞米松在严重COVID-19患者中影响循环中性粒细胞，改变IFNgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}状态，下调干扰素响应基因，激活IL-1R2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba中性粒细胞。地塞米松也可诱导表达未成熟中性粒细胞的出现gydF4y2Ba__arg1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaANXA1gydF4y2Ba这些基因编码免疫抑制分子，在健康对照组中是不存在的。此外，地塞米松表现出性别依赖效应，这可能对严重COVID-19的性别依赖结果和治疗效果具有重要意义。gydF4y2Ba

COVID-19急性呼吸窘迫综合征宿主在细菌呼吸窘迫综合征背景下的反应gydF4y2Ba

需要进入ICU的危及生命的感染患者会接受侵入性手术、药物治疗和强化护理。这包括先进的有创或无创呼吸支持、广谱抗生素、镇静剂、麻醉剂、麻醉剂、麻痹剂、抗凝血剂、液体和肠内营养。患者需要有创插管，包括中心静脉和动脉导管。这些干预措施使得无法将ICU收治的危及生命的感染与轻度/中度感染(在病房或社区接受治疗)或健康人群进行比较。为了更好地了解COVID-19免疫反应，我们将入院ICU的COVID-19患者与同样入院ICU的危及生命的细菌性肺炎伴ARDS患者进行了比较，以解释ICU混杂因素。我们还将这些组与健康志愿者进行了比较。icu认可的病毒性急性呼吸窘迫综合征(例如，H1N1)将是一个有趣的对比，可以将covid -19特异性反应置于背景下;然而，消除全球流感病例gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba使它不可行。对所有COVID-19患者进行细菌感染培养评估，结果为阴性。所有COVID-19患者的RT-PCR检测结果均为SARS-CoV-2阳性。我们之前已经证实在任何循环免疫细胞中都没有病毒信使rnagydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．然而，针对sars - cov -2特异性病毒蛋白的血浆蛋白质组学在所有COVID-19患者血清中检测到一种或多种病毒蛋白(扩展数据图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．我们首先将COVID-19急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者与细菌性败血症(由呼吸道引起)患者进行比较gydF4y2Ba葡萄球菌gydF4y2Ba葡萄球菌gydF4y2Ba或gydF4y2Ba链球菌gydF4y2Ba肺炎gydF4y2Ba感染)导致急性呼吸窘迫综合征，这里称为细菌性呼吸窘迫综合征(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．在本次比较中纳入的COVID-19急性呼吸窘迫综合征供者没有接受地塞米松(或其他免疫调节剂)以获得药理学上未受干扰的情况(扩展数据图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)．我们使用了世界卫生组织发布的与covid -19相关的ARDS修正标准gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba包括急性低氧血症和双侧肺浸润，x线显示无心衰证据，伴PaOgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}/ FiOgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}在机械通气或SpO时，比率小于300 mmHggydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}无机械通气时，/FiO2比值小于或等于315 mmHg。我们的比较包括6种细菌的ARDS (gydF4y2BangydF4y2Ba在时间点1 (t1) = 5gydF4y2BangydF4y2Ba在时间点2 (t2)时= 4例)和8例非地塞米松COVID-19 ARDS (gydF4y2BangydF4y2Ba在t1和gydF4y2BangydF4y2Ba= 4 at t2)(补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)．顺序器官衰竭评估(SOFA)评分比较显示，COVID-19急性呼吸窘迫综合征与细菌性急性呼吸窘迫综合征的严重程度无统计学差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.17384)，表明这两个队列包含了疾病严重程度相似的患者。细菌性急性呼吸窘迫综合征是我们对COVID-19急性呼吸窘迫综合征的比较物，因为这是最接近的控制，因为在研究期间，由于ICU入住率异常低，严重的急性呼吸窘迫综合征病毒感染无法获得gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

患者队列的年龄、性别、维持生命的天数和住院时间相似，但COVID-19患者的种族多样性更大(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)．与COVID-19中接近正常的循环中性粒细胞数量相比，细菌性ARDS诱导明显的中性粒细胞增多和相对血小板减少，而两者的淋巴细胞减少程度相似(扩大数据图)。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．两组患者的PaO相似gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}/ FiOgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}比率是ARDS严重程度的指标gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba但细菌性急性呼吸窘迫综合征患者的肾损伤明显更严重，如较高的血清肌酐水平所示(扩展数据图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．我们比较了可溶性炎症标志物(扩展数据图。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)用于区分原型状态，包括在“细胞因子风暴”期间识别的状态(扩展数据图。gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba)和“细胞因子释放综合征”(扩展数据图。gydF4y2Ba2我gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba在感染之间显示出类似的可溶性细胞因子和趋化因子反应。因此，威胁生命的细菌性急性呼吸窘迫综合征和COVID-19急性呼吸窘迫综合征的中性粒细胞计数正常到升高，IL-6水平相似，血清肌酐水平显示的器官衰竭较少，所有这些都被认为是COVID-19严重程度的标志gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}．这促使人们对免疫细胞的状态和组成进行细致入微的研究。gydF4y2Ba

我们可查询的图谱(见“数据可用性”部分)包含t1 (ICU入院后<72小时)和t2 (t1后7天)对全血进行的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．使用统一流形近似和投影(UMAP)将21名患者和86,935个细胞的细胞识别映射到30种免疫细胞类型/状态(图1)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．直接比较COVID-19患者和细菌性ARDS患者的整体基因表达量(补充表)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，这表明在t1时差异表达的分布比在t2时更具有全局变化。基因调控的改变在t1时中性粒细胞中最为明显，与细菌性ARDS相比，COVID-19中中性粒细胞基因表达较低(图1)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba)．在t2时，将COVID-19与细菌性ARDS进行比较时，基因表达的整体改变在浆质细胞中最为明显(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 d, egydF4y2Ba)．我们量化了已知的外周血成分的比例，强调了CD4 T细胞、CD8 T细胞和自然杀伤(NK)细胞的显著差异(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．这些数据强调了COVID-19和细菌性ARDS之间的免疫图谱在全球范围内的巨大差异。gydF4y2Ba

COVID-19促进不同中性粒细胞状态的富集gydF4y2Ba

中性粒细胞是ARDS发展的主要参与者gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba；然而，尽管细菌和COVID-19队列之间的ARDS严重程度相似，但临床计数的循环中性粒细胞数量有显著差异。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．全球表达差异使我们假设中性粒细胞质的状态可能是疾病的重要决定因素。为了探究中性粒细胞动力学，我们将COVID-19和细菌性ARDS中的病原体激活中性粒细胞与健康供体中未受干扰的中性粒细胞进行了比较(扩展数据图)。gydF4y2Ba4 lgydF4y2Ba)．在健康对照中，t1和t2的细菌ARDS和t1和t2的COVID-19 ARDS显示未成熟(CD24gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba__arg1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)和IL-1R2gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba(IL-1R2gydF4y2Ba^嗨gydF4y2BaCD163gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba群集8和IL-1R2gydF4y2Ba^嗨gydF4y2BaITGAXgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba白细胞介素- 7r增多gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba健康对照组中性粒细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba4比gydF4y2Ba)．虽然干扰素gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}在健康对照组、细菌性急性呼吸窘迫综合征和COVID-19急性呼吸窘迫综合征中，中性粒细胞是保守的。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)， IFN更深的亚簇gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}中性粒细胞显示，在对COVID-19的反应中出现了离散亚状态，这在健康对照组或细菌性ARDS中均未观察到(扩展数据图)。gydF4y2Ba4 h lgydF4y2Ba)．这些亚态在干扰素诱导的基因中富集gydF4y2BaIFI44LgydF4y2Ba而且gydF4y2BaIFI44gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba4 kgydF4y2Ba)，是已知可以限制呼吸道病毒复制的分子gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba并表现出强化的1型IFN激活(扩展数据图。gydF4y2Ba4 lgydF4y2Ba)相对于非covid -19干扰素gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}中性粒细胞。gydF4y2Ba

为了以高分辨率绘制病原体激活的中性粒细胞动态，后续分析使用了顶部装载基因的主成分，以区分COVID-19和细菌性ARDS(以及非健康对照组)期间出现的不同病原体激活状态，进行下游降维。对中性粒细胞进行速度分析gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}重建成熟动力学。鲁汶集群(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)、临床队列、患者个体和速度长度叠加在速度向量场上(扩展数据图。gydF4y2Ba4 mqgydF4y2Ba)，显示三种主要的中性粒细胞状态。比较t1时中性粒细胞的比例，结果显示IFN呈发散性扩张gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}中性粒细胞(簇2、4和5)标记为gydF4y2BaIFITM1gydF4y2Ba在t2时与细菌性ARDS相似(图1)。gydF4y2Ba1 f-hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4 m-ogydF4y2Ba)．基因表达的gydF4y2BaIFITM1gydF4y2BaIFITM1蛋白(与S100A8/9共定位)和典型的中性粒细胞核形态的免疫荧光染色证实了在t1时COVID-19患者中性粒细胞中的表达。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

经典地说，外周中性粒细胞被认为是不分裂的和终末分化的;然而，速度长度的增加表明，一旦沿着特定的路径或“谱系”循环，就有能力改变表型状态。与细菌性ARDS相比，COVID-19中性粒细胞遵循独特的成熟路径，最终达到三种不同的终末状态:IFNgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}, PGgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}或细菌ARDS富集(图。gydF4y2Ba1比gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4 m-ogydF4y2Ba)．该轨迹的顶点以高速长度为标志，这是细胞分化的特征(扩展数据图。gydF4y2Ba4 p, qgydF4y2Ba)．COVID-19中性粒细胞优先从轨迹的顶点过渡，这是一个不成熟的状态(gydF4y2BaTOP2A -gydF4y2Ba表达;扩展的数据图。gydF4y2Ba4 rgydF4y2Ba)到IFNgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}国家的特点gydF4y2BaIFITM1gydF4y2Ba，gydF4y2BaIFITM2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaIFI6gydF4y2Ba表达式(集群1-4和5;无花果。gydF4y2Ba1我gydF4y2Ba；在线图谱)和I型IFN信号通路的激活(扩展数据图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．中性粒细胞向量场的拓扑和几何特征，包括吸引子和鞍点的识别，在无监督的方式下，利用Dynamo中的向量场函数求解gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba．中性粒细胞的连续状态在稳定的干扰素中达到顶峰gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}和细菌富集状态，以及不稳定PGgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}吸引子状态，见补充视频gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．富集covid -19的PG的谱系关系不太明确gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}由PG响应基因定义的簇(簇2、簇6和簇8)，显著增加gydF4y2BaPTGER4gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPTGS2gydF4y2Ba(或COX2)，它编码COVID-19中的一个拟议靶点(参考文献gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba1 kgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4 s tgydF4y2Ba；在线地图)。PGgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}中性粒细胞表现出相对富集的粘附能力，提示细胞基质连接途径的过度表现，如由gydF4y2BaTLN1gydF4y2Ba，gydF4y2BaADAM10gydF4y2Ba，gydF4y2BaRHOBgydF4y2Ba，gydF4y2BaCD46gydF4y2Ba而且gydF4y2BaADGRE5gydF4y2Ba(CD97)，它编码机械敏g蛋白偶联受体(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)．显性细菌ARDS状态的特征是编码抗菌蛋白CD83(参考文献)的基因表达。gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba)， CD177和PLAC8(参考文献。gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba)(集群3 - 0;无花果。gydF4y2Ba1 jgydF4y2Ba；在线地图)。有趣的是，细菌富集的中性粒细胞被预测含有富含ficolin-1的颗粒。gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba)．因为ficolin-1是一种识别分子，它与细菌中的碳水化合物结构结合，启动凝集素补体通路gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba在美国，它的富集表明它处于一种稳定的状态，可以针对广泛的细菌病原体。总之，这些数据表明外周中性粒细胞具有动态规划能力，导致中性粒细胞极化，即IFN的出现gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}和PGgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}重型COVID-19患者中性粒细胞状态。gydF4y2Ba

独特的调控途径控制中性粒细胞的成熟gydF4y2Ba

快速和强大的IFN反应可预防COVID-19严重疾病，而延迟的反应可能加剧全身和肺部炎症gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}．中性粒细胞IFN反应传统上不被认为在感染期间，中性粒细胞通常被认为是均匀的，具有统一的促炎能力。全球中性粒细胞表达与中性粒细胞状态特异性标记对齐，如干扰素反应基因(gydF4y2BaIFITM1gydF4y2Ba，gydF4y2BaRSAD2gydF4y2Ba，gydF4y2BaIFI6gydF4y2Ba而且gydF4y2BaISG10gydF4y2Ba)，在COVID-19中性粒细胞中表达更高(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．而编码抗菌蛋白的基因则相反gydF4y2BaPLAC8gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba；在线地图)。为了探究感染特异性中性粒细胞反应，我们列出了由一致性基因和血浆蛋白表达变化共同确定的差异表达特征(图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．有趣的是,gydF4y2BaSERPINA1gydF4y2Ba(编码蛋白酶抑制剂α-1抗胰蛋白酶)gydF4y2BaPFKFB3gydF4y2Ba(编码磷酸果糖激酶，糖酵解的关键调节因子)在COVID-19中性粒细胞中被抑制，表明颗粒相关酶的组成和代谢状态存在差异。鉴别差异中性粒细胞状态促使进一步探索驱动中性粒细胞状态极化的因素。基于单细胞调控网络推理聚类的基因调控网络重构gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba发现COVID-19中差异激活转录因子STAT1、IRF2和PRDM1(图1)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)，而细菌性ARDS中性粒细胞增加了典型的粒细胞tf，如cepa、CEBPB和STAT5B，以及较不明确的因子，如NFE2(图1)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba；在线地图)。PRDM1的激活在IFN中最为明显gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}并可能负责驱动IFN反应元件的表达(gydF4y2BaIFIT1gydF4y2Ba，gydF4y2BaISG15gydF4y2Ba而且gydF4y2BaIFI6gydF4y2Ba)和抗病毒信号，例如gydF4y2BaRSAD2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSTAT1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba7gydF4y2Ba；在线地图)。PG的标志gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}中性粒细胞极化激活E2F4，预计驱动808个基因(图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)，而细菌性ARDS过程中的中性粒细胞编程包括STAT5B的激活，据预测，STAT5B位于10个基因的上游(图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．与E2F4作为转录抑制因子介导细胞周期阻滞的作用一致gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba在该研究中，细胞周期进展的负调控在其scenic推断的靶组中是一个过度表达的通路(补充表gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．有趣的是，E2F4靶组的一个子集与调控细胞-基质连接的组装有关(补充表gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)，证实了PG中粘接能力的相对富集gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}中性粒细胞(扩展数据图;gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)．总之，在对COVID-19的反应中，中性粒细胞通过独特的转录调控向两个主要群体之一极化:IFNgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}群体或PGgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}人口(图。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

地塞米松改变免疫动力学和血浆蛋白质组学gydF4y2Ba

传统疗法对COVID-19的疗效有限，尽管地塞米松有中等效果，但RECOVERY试验报告称，在受影响最严重的患者中效果最大gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba．这种益处的潜在机制尚不清楚，也不普遍，因此有机会优化或更好地针对这种疗法。在这项研究中，我们比较了8种非地塞米松COVID-19急性呼吸窘迫综合征(gydF4y2BangydF4y2Ba在t1和gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)至6个地塞米松治疗的COVID-19急性呼吸窘迫综合征(gydF4y2BangydF4y2Ba在t1和gydF4y2BangydF4y2Bat2时= 3)例入ICU(补充表)gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)．使用ICU住院期间获得的SOFA评分对未使用地塞米松和使用地塞米松治疗的COVID-19 ARDS患者的病情严重程度进行比较，结果显示无统计学差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.33204)，提示两组间严重程度相似。地塞米松给药至第1次抽血(入ICU 72小时内)的中位数时间为31小时(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba，扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．在t1时，全球转录差异明显，与未接受治疗的患者相比，接受地塞米松治疗的COVID-19患者中性粒细胞和一些T细胞亚群中的基因明显上调(图)。gydF4y2Ba3罪犯gydF4y2Ba，扩展数据图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba)．在t1时，地塞米松处理组在幼稚B细胞、浆质胞浆体和部分T细胞中基因全局下调(扩展数据图)。gydF4y2Ba5罪犯gydF4y2Ba)．在t2时，基因上调发生在适应性免疫细胞中，包括幼稚和效应性CD8 T细胞，而先天髓系(包括中性粒细胞)的改变有限。中性粒细胞在t2时表现出明显的基因下调，CD4幼稚T细胞和中央记忆T细胞也是如此。gydF4y2Ba5 e, fgydF4y2Ba)．按比例而言，在t1时，地塞米松给药与细胞毒性CD4 T细胞、幼稚B细胞和浆质胞浆体的增加有关，与增殖NK细胞和CD4效应记忆细胞的减少有关(扩展数据图)。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)．到t2时，与未治疗的COVID-19对照组相比，地塞米松与循环中中性粒细胞比例抑制相关(13%对41%;扩展的数据图。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)．来自同一队列的血浆蛋白质组学显示，地塞米松抑制了10个宿主蛋白质(S100A8、S100A9、SERPINA1、SERPINA3、ORM1、LBP、VWF、PIGR、AZGP1和CRP)，其他人已将这些蛋白质确定为区分COVID-19严重病例与轻、中度病例的生物标志物(可通过在线图谱查询完整宿主蛋白质组;补充表gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^{37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}．血浆中钙保护蛋白(S100A8/S100A9)和中性粒细胞丝氨酸蛋白酶(SERPINA1和SERPINA3)的抑制，伴随着中性粒细胞比例的减少，提示调节中性粒细胞相关的炎症过程是地塞米松的作用方法。gydF4y2Ba

用地塞米松抑制中性粒细胞IFN程序gydF4y2Ba

由于中性粒细胞转录程序的早期和持续的差异，以及它们在使用地塞米松t2时的整体耗损，我们评估了地塞米松对中性粒细胞状态的更多颗粒效应。中性粒细胞重组再次在成熟轨迹的顶点发现了未成熟的中性粒细胞，在PG前加速并表现出最大的分化gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}和干扰素gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}状态的承诺(无花果。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 a egydF4y2Ba)．有趣的是，我们也发现了IL-7RgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba中性粒细胞(约占总中性粒细胞的8%)，其运动轨迹保持分离(图。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6克,jgydF4y2Ba)，表明这是一种完全不同的中性粒细胞状态。最初，地塞米松处理的样本PG有更高的全局转录gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}中性粒细胞,而PGgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}中性粒细胞伴随高gydF4y2BaIL1R2gydF4y2Ba表达式(IL-1R2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba在t2)。相反，地塞米松似乎减弱了IFN的全局转录gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}t1和t2时的中性粒细胞(图。gydF4y2Ba3 e, fgydF4y2Ba)．值得注意的是，在t1时，地塞米松动态变化的IFNgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}和IL-7RgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba时，中性粒细胞停止，随后IFN优先耗竭gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}(图子集。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．事实上，虽然地塞米松与全球中性粒细胞数量的减少有关，但我们也检测到IFN的特异性减少gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}与健康对照组检测到的中性粒细胞比例相似(地塞米松t2后为9%，健康对照组为10%)(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4模拟gydF4y2Ba)．尽管气道样本(即支气管肺泡灌洗液(BALF))的收集在我们的机构不可行，但我们利用了BALF最近的两个scRNA-seq数据集gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}评估IFNgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}在严重的COVID-19期间，中性粒细胞主导支气管肺泡景观。的投影CSF3RgydF4y2Ba^+gydF4y2BaS100A8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaS100A9gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba参考文献中BALF中性粒细胞显示(1)IFN的1.5倍变化(FC)膨胀gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}与中度疾病相比，重症COVID-19患者中性粒细胞增多(77% vs 52%;扩展的数据图。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba）;(2)优先激活ifn刺激基因(ISGs)，如gydF4y2BaIFITM1gydF4y2Ba，gydF4y2BaIFITM2gydF4y2Ba，gydF4y2BaIFI6gydF4y2Ba，gydF4y2BaIRF7gydF4y2Ba而且gydF4y2BaISG20gydF4y2Ba在严重的COVID-19中性粒细胞中(扩展数据图。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba）;(3) IFN高4.7 FCgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}与细菌性肺炎相比，COVID-19中性粒细胞增多(14% vs 3%;扩展的数据图。gydF4y2Ba7 d-fgydF4y2Ba)．虽然有些传闻，但在我们整个血液队列中，IFNgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}S7患者中中性粒细胞状态占主导地位(参考文献)。gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba)，一名病毒滴度极高的80岁男性，在采样后3-4 d内死于COVID-19并发症(扩大数据图)。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

一致差异表达基因(DEG)分析显示gydF4y2BaIL1R2gydF4y2Ba，它编码一个诱骗受体，隔离IL-1，并下调gydF4y2BaIFITM1gydF4y2Ba为地塞米松治疗最显著的鉴别特征(图。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)．此外，地塞米松更广泛地减弱了中性粒细胞表达的IFN途径，包括减少gydF4y2BaIFITM1-IFITM3gydF4y2Ba，gydF4y2BaIFIT1gydF4y2Ba，gydF4y2BaISG15gydF4y2Ba而且gydF4y2BaRSAD2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)．对未拼接的前mRNA与成熟拼接mRNA比值的检测支持了免疫调节系统的诱导(即，gydF4y2BaIL1R2gydF4y2Ba；无花果。gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba)和抑制IFN(即，gydF4y2BaIFITM1gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba3 jgydF4y2Ba)程序是由这些途径的上游差异调节驱动的。gydF4y2Ba

地塞米松使中性粒细胞的免疫抑制作用增强gydF4y2Ba

使用地塞米松治疗的患者中性粒细胞状态组成发生改变。虽然干扰素gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}在t2时，中性粒细胞明显减少，未成熟的中性粒细胞比未治疗的对照组扩大了两倍(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6小时,我gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)，这在健康对照组中是不存在的。虽然是间接的，但干扰素的主导地位gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}非地塞米松队列中死于COVID-19患者的中性粒细胞t1提示IFN耗损的可能性gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}中性粒细胞可能是地塞米松具有保护作用的一种机制。gydF4y2Ba8 g-jgydF4y2Ba)．对基因调控网络的评估显示，IRF7和MEF2A表现出相反的激活模式，IRF7是最受抑制的，而MEF2A是地塞米松识别出的最增强的tf，这与PG的出现有关gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}和IL-1R2gydF4y2Ba^+gydF4y2BaIFN的状态和衰减gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}中性粒细胞州(无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6为gydF4y2Ba)．为了评估我们队列中确定的地塞米松调节的deg的普遍性，我们在更大的验证队列中询问它们是否准确预测了COVID-19导致的死亡率。通过利用103名COVID-19患者的全血大容量RNA-seq数据集(参考文献)。gydF4y2Ba^{42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba})，我们通过地塞米松抑制的DEGs在t1和t2的聚合表达对每个样本进行评分(补充表gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba)．有趣的是，在t2(而不是t1)抑制的DEGs被证明是28天死亡率的一个更好的预测因子(曲线下面积(AUC) = 0.78;可信区间(CI)， 0.67 - 0.89)与SOFA (AUC = 0.67;CI, 0.51-0.82)跨越所有分类阈值(图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．多模式(转录和血浆蛋白质组)评估证实了成熟中性粒细胞程序的抑制(例如，β-2-微球蛋白编码gydF4y2BaB2MgydF4y2Ba；在线图谱)以及地塞米松后IFN抑制细胞因子(例如，IK细胞因子，IFN-γ的一种有效抑制剂)的同时激活(图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．出乎意料的是，类固醇的使用与循环中未成熟的中性粒细胞的增加有关，中性粒细胞高度表达gydF4y2BaTOP2AgydF4y2BaATF4和JDP2, tf在未分化细胞或核重编程细胞中被激活(扩展数据图。gydF4y2Ba6小时gydF4y2Ba)．因为gydF4y2BaTOP2AgydF4y2Ba标志着细胞增殖gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba，我们询问地塞米松是否增加了未成熟中性粒细胞的增殖以驱动其扩张。TOP2A的频率无变化gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba地塞米松治疗后未成熟中性粒细胞(8% TOP2AgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在t1和t2期间，地塞米松治疗组与非地塞米松治疗组的10%相比;gydF4y2BaχgydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}= 4.58,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.21)，提示地塞米松不刺激循环(未成熟)中性粒细胞的分裂。未成熟的中性粒细胞表达高水平gydF4y2Ba__arg1gydF4y2Ba，gydF4y2BaANXA1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba),gydF4y2BaCD24gydF4y2Ba(mRNA和蛋白质;扩展的数据图。gydF4y2Ba6我gydF4y2Ba)，表明额外的免疫调节功能gydF4y2Ba^{45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba}扩大与地塞米松。这两个gydF4y2Ba__arg1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaANXA1gydF4y2Ba表达糖皮质激素反应因子，强调地塞米松治疗对其直接调节的可能性gydF4y2Ba^{50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

为了进一步了解中性粒细胞在COVID-19中的作用以及地塞米松的影响，我们研究了细胞连接组。许多细胞类型(包括高度相互作用的中性粒细胞)之间的细胞相互作用被注意到(扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)，地塞米松通过抑制细胞间相互作用的数量和强度改变了全局预测的相互作用(扩展数据图)。gydF4y2Ba8 b, cgydF4y2Ba)．地塞米松增强和抑制(扩展数据图。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)几个独特的中性粒细胞驱动信号网络。膜联蛋白信号，它在未成熟的中性粒细胞中增强，是解决炎症的强大糖皮质激素靶点gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba，当患者接受地塞米松时，在中性粒细胞和其他循环免疫细胞之间增加。gydF4y2Ba4 f, ggydF4y2Ba)．值得注意的是膜联蛋白家族信号转导的方向，在地塞米松后，膜联蛋白家族信号转导的方向由向中性粒细胞的传入转变为从中性粒细胞向B中间细胞、记忆细胞和MAIT细胞的传出。gydF4y2Ba4 f, ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 e, fgydF4y2Ba)．膜联蛋白信号的重新模式主要是由地塞米松后未成熟中性粒细胞2.4倍的扩张所驱动的，而不是由于在gydF4y2BaANXA1gydF4y2Ba在未接受过地塞米松治疗和接受过地塞米松治疗的供体的未成熟亚群中表达(分别为12.4和12.0对数归一化唯一分子标识符(UMI))。地塞米松通过促进ARG1的扩增改变中性粒细胞状态gydF4y2Ba^+gydF4y2BaANXA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba未成熟状态，具有免疫抑制特征和改变的整体通讯结构，使中性粒细胞成为外周免疫细胞的积极指导者。gydF4y2Ba

中性粒细胞对地塞米松的反应是性二态的gydF4y2Ba

鉴于地塞米松的临床益处在男性中更为明显gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba因为男性更容易出现更严重的COVID-19症状和结果gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba，我们推测地塞米松刺激性二态效应。我们的回顾性审计比较了72名使用地塞米松治疗前(51名男性和21名女性)与1581名使用地塞米松治疗后(1013名男性和568名女性)的icu住院患者，证实了COVID-19男性患者的死亡率优先受益(扩展数据图)。gydF4y2Ba9 a、bgydF4y2Ba)．地塞米松治疗的患者在两性中均有525例中性粒细胞deg，而892例男性或女性中均有独特的调节(补充表)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．在联合调制的deg中，一个子集(525个中的24个)在调节的幅度或方向上表现出统计学上显著的二态性(扩展数据图)。gydF4y2Ba9 c, dgydF4y2Ba)．尽管使用地塞米松后，两性的中性粒细胞都减少了，但这在男性中尤其明显(t1时增加1.9 FC, t2时增加3.4 FC;扩展的数据图。gydF4y2Ba9 egydF4y2Ba)．在两种明显的中性粒细胞状态改变中，未成熟的(ARG1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba免疫抑制)状态优先在男性使用地塞米松扩大(扩展数据图。gydF4y2Ba9 egydF4y2Ba)，而ISGs则优先被抑制(扩展数据图。gydF4y2Ba9 fgydF4y2Ba)和干扰素gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}雌性的状态减少了(扩展数据图。gydF4y2Ba9 g hgydF4y2Ba)在t1和t2(图。gydF4y2Ba4 h,我gydF4y2Ba)．性双形态地塞米松对中性粒细胞成熟动力学的影响可能部分解释了这些变化。动力推断向量场(中性粒细胞近未来状态的预测)显示地塞米松诱导的特征在女性中优先调节。地塞米松与加速不成熟(ARG1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba免疫抑制)t1时中性粒细胞分化和IFN发育不良gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}t2时中性粒细胞转变(扩展数据图。gydF4y2Ba9 i, jgydF4y2Ba)．这表明地塞米松的性二态效应可能是由于中性粒细胞成熟的二态改变，导致IFN的优先耗竭gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}中性粒细胞伴随缺乏未成熟的中性粒细胞扩张。gydF4y2Ba

在SARS-CoV-2中存活下来取决于在早期激发病毒清除免疫程序和随后在后期抑制这些相同的程序之间取得时间平衡，以限制免疫诱导的损害。干扰素信号是抗病毒免疫和过度活跃的效应免疫程序之间的纽带，这些效应免疫程序在不经意间损害组织功能并威胁生存gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba．我们的工作发现了一种具有下游IFN信号的稳定中性粒细胞状态，在COVID-19感染晚期选择性扩大。天生的错误gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba和抑制早期gydF4y2Ba^6gydF4y2BaIFN信号可预测COVID-19的严重程度，IFN增加gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}女性中性粒细胞与死亡率降低相关gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba．因此，建议及早开始干扰素治疗以减轻疾病的严重程度gydF4y2Ba^{56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba}．根据这些观察，人们可能会认为中性粒细胞中的干扰素活性代表了宿主抗病毒程序的协调一致。gydF4y2Ba

有趣的是，使用地塞米松(一种已知可改善COVID-19住院患者死亡率的皮质类固醇)进行免疫抑制(参考文献)。gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba)，与中性粒细胞的全局性改变以及中性粒细胞IFN网络的抑制和covid -19富集IFN的优先耗竭有关gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}中性粒细胞。这些改变的中性粒细胞状态与细菌性ARDS有着惊人的相似之处，这表明，在COVID-19期间(可能在其他病毒感染期间)，安装通用杀微生物程序可以改善过度活跃的中性粒细胞反应。尽管在SARS-CoV-2感染的早期，中性粒细胞ISG的激活可能促进抗病毒免疫，但在晚期(例如，重症患者入住ICU)持续的IFN激活可能推动COVID-19的免疫病理。事实上，中性粒细胞1型IFN计划与COVID-19严重程度呈正相关gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba}，与我们观察到的IFNgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}在重症COVID-19期间，中性粒细胞主导支气管肺泡微环境(参考文献)。gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba)，支持这一观点。gydF4y2Ba

与COVID-19一起出现的另一种中性粒细胞状态(在健康对照组中不存在)是ARG1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba具有免疫调节特性的未成熟和免疫抑制状态gydF4y2Ba^{45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba}．这一状态在地塞米松的作用下明显扩大，提示地塞米松对中性粒细胞和全身固有免疫反应的第二种作用途径。尚不成熟的中性粒细胞的出现是由于骨髓中的释放增强，边缘细胞的释放，还是由于地塞米松抑制了分化，尚不清楚。尽管地塞米松似乎没有增加未成熟中性粒细胞增殖的频率，但未来的实验应该探究地塞米松诱导骨髓内粒细胞/巨噬细胞祖细胞的扩张或加速未成熟中性粒细胞的释放，以解释循环中未成熟中性粒细胞池的扩大。进一步研究地塞米松对中性粒细胞的直接和间接影响，将有助于了解地塞米松的自主效应。通过解耦ifn夸大的中性粒细胞反应，同时强化抑制状态，支持先天抗病毒免疫的免疫疗法可能限制中性粒细胞的致病性，并为严重的COVID-19提供益处。gydF4y2Ba

我们的研究有三个主要的局限性。首先，这是一项实用的回顾性队列研究，而不是一项随机对照试验。在研究登记期间，地塞米松成为护理标准，导致非地塞米松组的大小和性别固定。非随机分配和小样本量可能无意中引入选择偏倚，限制地塞米松研究结果的可泛化性。其次，与细菌性ARDS而不是另一种呼吸道病毒感染进行比较，排除了对确定的动态是否专为SARS-CoV-2的评估。最后，t1采样的患者在t2采集前从ICU出院，排除了时间变化的估计。gydF4y2Ba

仍有一些令人兴奋的研究途径，包括研究中性粒细胞极化在地塞米松和COVID-19感染的反应中发生的位置。鉴于骨髓中的前中性粒细胞变为非有丝分裂细胞，并能以早期或不成熟的形式进入血液(形态学上定义为带状细胞)，我们推测中性粒细胞状态的改变发生在它们进入循环后;然而，这需要正式的测试。由于中性粒细胞不分裂，我们认为极化亚群的增加不太可能是由于在健康对照组中观察到的低数量的已存在极化状态的扩展或复制。然而，目前还没有明确的数据来确定极化中性粒细胞是否来自骨髓中不同的谱系限制前体池。定义驱动中性粒细胞状态极化的机制将阐明中性粒细胞状态的变化是反映动态连续体还是预先设定的功能规划的结果，并将使研究人员能够针对不需要的中性粒细胞状态或增强有益的中性粒细胞状态来对抗疾病。gydF4y2Ba

病人登记表gydF4y2Ba

我们招募了六种细菌(gydF4y2BangydF4y2Ba在t1和gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)， 8例非地塞米松COVID-19急性呼吸窘迫综合征(gydF4y2BangydF4y2Ba在t1和gydF4y2BangydF4y2Ba= 4个)和6个地塞米松治疗的COVID-19急性呼吸窘迫综合征(gydF4y2BangydF4y2Ba在t1和gydF4y2BangydF4y2Bat2时= 3)例入ICU患者(补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)．所有患者在进入位于加拿大阿尔伯塔省卡尔加里的南健康校区、洛基维尤总医院、山麓医疗中心或彼得·劳德中心的四个成人icu中的任何一个后登记(扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．患者入住ICU由ICU主治医师根据维持生命干预、监测和生命支持的需要决定。研究团队不参与临床决策。研究纳入要求最低年龄为18岁，有能力提供同意，或者对大多数参与者来说，有代理决策者提供恢复能力同意的能力。所有参与者在抽血时都需要动脉导管，但导管的插入由主治医疗队酌情决定。COVID-19急性呼吸窘迫综合征患者在登记前需要临床RNA -19检测阳性，并有与急性呼吸窘迫综合征一致的双侧肺浸润和低氧血症证据。所有COVID-19急性呼吸窘迫综合征患者均接受经验性抗生素治疗。在收集样本时，所有COVID-19阳性入选患者的血液、尿液和痰中并发细菌感染培养均为阴性。细菌性急性呼吸窘迫综合征队列要求COVID-19检测呈阴性，细菌性肺炎的明确微生物学诊断与胸部成像与急性呼吸窘迫综合征诊断一致。如果患者(1)正在接受免疫抑制治疗; (2) had established autoimmune disease; or (3) had active malignancy. Because tocilizumab, remdesivir or any other immunomodulatory agents were not approved for use in patients with severe COVID-19 in Alberta over the time span of this study, participants did not receive these medications. Starting on 1 June 2020, all patients with COVID-19 received dexamethasone (6 mg per day) upon hospital admission, as dexamethasone became the standard of care at that time. Although patients with bacterial ARDS received appropriate antibiotic treatments, none was prescribed immunosuppressive or steroid therapy. All patients with bacterial ARDS had lung infections caused by Gram-positive cocci (four金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba和两个gydF4y2Ba肺炎链球菌gydF4y2Ba)．为了纳入研究，参与者被要求在进入ICU的72小时内有明确的诊断和适当的同意并收集样本。t1为第一次抽血，而t2为t1后7 d的重复抽血，如果参与者仍在ICU并有动脉导管。对每个参与者，通过动脉导管采集全血，并立即进行处理分析。通过大学范围内的广告招募健康献血者，并要求参与者(1)没有使用免疫调节药物;2例新冠肺炎无症状感染者;(3)未接种新冠病毒疫苗的;(4)没有潜在的免疫疾病。gydF4y2Ba

流行病学分析gydF4y2Ba

在本研究中，我们使用艾伯塔省关键oracle分析数据库(Tracer)来查询和提取艾伯塔省COVID-19 ICU病例和数量gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba．在研究期间，收集了16例成人icu患者的综合数据。无法在个人层面获取地塞米松给药的数据;因此，我们查询了在地塞米松成为我省护理标准之前(地塞米松前时代:2020年1月1日至2020年5月31日)入住ICU的患者与作为重症COVID-19护理标准(2020年6月1日至2021年5月31日)的患者的数据库。2021年3月11日，阿尔伯塔省批准使用托珠单抗，并在此日期之后获得了少量(150剂)用于COVID-19严重患者。gydF4y2Ba

人类研究伦理gydF4y2Ba

所有与人类有关的工作都得到了卡尔加里大学联合健康研究伦理委员会(伦理ID: REB20-0481)的批准，并符合《赫尔辛基宣言》。gydF4y2Ba

血清细胞因子评估gydF4y2Ba

细胞因子、趋化因子和可溶性细胞因子受体在多重阵列上定量，其中包括65 MILLIPLEX细胞因子/趋化因子(6Ckine, BCA-1, CTACK, EGF, ENA-78, Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3, FGF-2, Flt-3L, Fractalkine, G-CSF, GM-CSF, GRO, I-309, IFN-α2, IFN-γ， IL-1α， IL-1β， IL-1ra, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 (p40)， IL-15, IL-16, IL-17A, IL-18, IL-20, IL-21, IL-23, IL-28a, IL-10, IP-10, LIF, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4，Luminex 200光度计上的MIP-1α、MIP-1β、MIP-1d、PDGF-AA、PDGF-AB/BB、RANTES、SDF-1α、SDF-1β、sCD40L、SCF、TARC、TGFa、TNFa、TNFb、TPO、TRAIL、TSLP、VEGF)和14 MILLIPLEX可溶性细胞因子(sCD30、sEGFR、sgp130、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-2Ra、sIL-4R、sIL-6R、sRAGE、sTNF RI、sTNF RII、sVEGF R1、sVEGF R2和sVEGF R3) (Millipore Sigma)。在标准操作方案后，通过静脉穿刺从每位患者收集EDTA血浆样本，并保存在- 80°C，直到检测。每次运行都包括全套校准器。的Mann-WhitneygydF4y2BaUgydF4y2Ba-test用于组间比较，和gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用Holm−Sídak逐步下降方法对值进行多次比较调整gydF4y2BaαgydF4y2Ba设置为0.05。gydF4y2Ba

液相色谱串联质谱鸟枪蛋白质组学gydF4y2Ba

COVID-19患者(COVID-19非地塞米松= 9,COVID-19地塞米松= 4)血清和细菌性ARDS对照(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6)。总蛋白浓度由Pierce BCA蛋白测定试剂盒(23225，赛默飞世尔科学公司)测定。三氯乙酸/丙酮工艺用于每个样品100µg蛋白质颗粒(14000gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4℃，15分钟)，然后风干2分钟。样品按照供应商(赛默飞世尔科学)的建议进行定量蛋白质组学工作流程。样品在200 mM三(2-羧基乙基)膦中还原1小时，在55℃下，用50 mM碘乙酰胺溶液在室温下烷基化20分钟，还原半胱氨酸。用丙酮/甲醇沉淀样品，加入600 μl冰冷丙酮，- 20℃孵育过夜。通过离心(8000gydF4y2BaggydF4y2Ba， 10分钟，4°C)，然后丙酮干燥(2分钟)。将沉淀的颗粒重悬于100 μl的50 mM的碳酸氢铵缓冲液中，然后在37℃下胰酶消化(每100 μg蛋白质5 μg胰蛋白酶)过夜。TMT-6plex等压标记试剂(90061,Thermo Fisher Scientific)在无水乙腈中重悬，并加入到每个样品中(每100 μl样品中加入41 μl TMT-6plex)，室温孵育1 h。用2.5%羟胺在室温下猝灭TMT标记反应15min。tmt标记的样品被组合并在100%三氟乙酸中酸化至pH <3.0，并根据制造商的建议进行C18色谱(Sep-Pak)。样品在冻干前存放在−80°C，然后在1%甲酸中再悬浮，然后进行液相色谱串联质谱(LC-MS /MS)分析。gydF4y2Ba

在使用Xcalibur(版本4.0.21.10)操作的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱计(Thermo Fisher Scientific)上分析Tryptic肽，并与Thermo Fisher Scientific Easy-nLC(纳米流液相色谱)1200系统耦合。Tryptic肽(2 μg)装入C18捕集器(75 μm × 2 cm);好评PepMap 100, P/N 164946, Thermo Fisher Scientific)流速为2 μl mingydF4y2Ba^1gydF4y2Ba溶剂A(0.1%甲酸在lc - ms级水中)。采用溶剂B(0.1%甲酸，80% lc - ms级乙腈)，流速0.3 μl min，梯度从5%到40%(5%到28%，105 min，然后在15 min增加到40% B)洗脱多肽gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba用C18分析柱(75 μm × 50 cm;PepMap RSLC C18, P/N ES803A，赛默飞世尔科学公司)。然后在2.1 kV电压下将多肽电喷涂到正模式运行的Orbitrap Lumos的离子转移管(300°C)中。Orbitrap首先执行了全MS扫描，分辨率为12万，全宽度为一半最大值，以检测具有a的前体离子gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba在375到1575之间+2到+4充电。Orbitrap AGC(自动增益控制)和最大注入时间设置为4 × 10gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba和50毫秒。Orbitrap使用最高速度模式运行，前驱体选择周期为3秒。最强烈的前体离子呈现肽同位素特征，其强度阈值至少为2 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba使用四极杆(隔离窗口)进行隔离gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba)为0.7)，并在离子路由多极中使用更高能量的c阱解离(38%的碰撞能量)进行碎片化。碎片离子(MS2)在Orbitrap中以15,000的分辨率进行分析。AGC和最大注射时间设置为1 × 10gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba和105毫秒。为获得TMT报告离子，将MS2的第一质量设为100。动态排除45秒，以避免获得具有相似的相同前驱离子gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba(±10件分)。gydF4y2Ba

白细胞和淋巴细胞分离gydF4y2Ba

淋巴细胞分离使用全血肝素化真空管。在2 ml全血中加入100 μl的分离鸡尾酒和100 μl的快速球(EasySep直接人类总淋巴细胞分离试剂盒，19655,STEMCELL Technologies)，用免疫磁负选择法分离淋巴细胞。混合后，室温孵育5分钟，在PBS中添加0.04%牛血清白蛋白至2.5 ml。稀释后的样品在室温下无盖磁铁中孵育5分钟，将阴性选择的淋巴细胞倒入新的5ml聚苯乙烯管中。除了加入隔离鸡尾酒外，所有步骤都重复一次。将最后的淋巴细胞悬液转移到15 ml聚丙烯管中，在样品中加入5 ml体积的0.04% BSA in PBS。在300℃下离心5min沉淀淋巴细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba；丢弃上清液;细胞在5 ml 0.04% BSA PBS中重悬。重复此步骤，细胞在100 μl PBS + 0.04% BSA中重悬。用血细胞计量化细胞密度;台盼蓝染色检测细胞活力(T8154, Sigma-Aldrich);7500个活淋巴细胞转移到无菌1.5 ml微离心管中。gydF4y2Ba

白细胞分离:从含肝素真空管中取1ml全血，转入5ml聚苯乙烯圆底管中，加入12 μl 0.5 M EDTA。然后，在PBS中加入2%的FBS (1 ml)和50 μl的EasySep RBC Depletion spheres (EasySep RBC Depletion Reagent, 18170, STEMCELL Technologies)，以免疫磁耗尽红细胞。室温磁体孵育5分钟后，将含有白细胞的细胞悬浮液倒入新的5毫升聚苯乙烯管中。为了确保完全去除红细胞，重复进行红细胞消耗，并将含有白细胞的细胞悬浮液倒入新的15毫升聚丙烯管中。白细胞在300℃离心沉淀gydF4y2BaggydF4y2Ba在20°C下放置5分钟，然后在5毫升的0.04%牛血清白蛋白PBS中重新悬浮。重复这一步骤，白细胞被重新悬浮在2毫升0.04%牛血清白蛋白的PBS中。测定细胞活力和细胞密度，将7500个活白细胞转移到含有淋巴细胞悬液的微离心管中，总体积为50 μl 0.04% BSA在PBS中。gydF4y2Ba

免疫细胞化学、免疫组织化学gydF4y2Ba

分离的白细胞和淋巴细胞样本被固定在4%多聚甲醛PBS (0.2 mM和pH 7.4)中，并在细胞离心机中旋转(在300℃下旋转8分钟)gydF4y2BaggydF4y2Ba)放在涂有涂层的载玻片上。用10%正常驴血清PBS(含0.5% Triton X-100)和一抗(S100A8/9、Abcam、ab22506;IFITM1、Abcam、ab233545)在4℃下孵育过夜，然后与驴抗兔Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A32790)或抗小鼠Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31570)在室温下孵育1 h。用CD24 (Abcam, ab202073)在同一载玻片上室温染色1 h，然后用驴抗兔Alexa Fluor 647 (Invitrogen, A31573)染色。成像使用VS-120滑动扫描仪(Olympus)完成，高分辨率成像使用SP8光谱共聚焦显微镜(Leica)完成。图像处理在斐济完成(2.1.0版本)gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

scRNA-seq库的构建、对齐和质量控制gydF4y2Ba

共装载15,000个单细胞(包含等比例的白细胞和淋巴细胞)，使用10x Genomics NextGEM凝胶珠乳剂(3 '基因表达试剂盒，3.1版本)进行分割。所有样本均按照制造商的操作规程进行处理(PCR扩增步骤均为12×)。结果文库的质量控制(QC)和定量使用TapeStation D1000 ScreenTape试验(Agilent)。使用Illumina NovaSeq S2和SP 100周期双通道流细胞进行多轮测序，以确保每个样品每个细胞至少接收32,000个reads。测序读取使用CellRanger 3.1.0管道进行对齐gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba到标准的预先构建的GRCh38参考基因组。通过对齐QC的样本使用CellRanger aggr和样本间归一化聚合到单个数据集，以确保每个样本每个单元收到相同数量的映射读取。聚合非地塞米松治疗的COVID-19 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 12)和细菌性急性呼吸窘迫综合征(gydF4y2BangydF4y2Ba= 9)样本回收了1,872,659个细胞，每个细胞测序为38,410个归一化后读取。同样，聚集的COVID-19样本(gydF4y2BangydF4y2Ba= 9)或无(gydF4y2BangydF4y2Ba= 12)地塞米松恢复1,748,551个单细胞测序到每个细胞51,415个归一化后读取。聚集的健康样本共回收19,816个细胞，包括1,912个qc后中性粒细胞(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)。gydF4y2Ba

scRNA-seq计算分析和工作流程gydF4y2Ba

从聚合数据集中过滤的特征条形码HDF5矩阵被导入到R包Seurat(版本3.9和版本4)中，用于规范化、缩放、集成、多模态参考映射、Louvain聚类、降维、差分表达式分析和可视化gydF4y2Ba^62gydF4y2Ba．简而言之，转录复杂性异常的细胞(少于500个UMIs，超过25000个UMIs或超过25%的线粒体读码)被认为是伪产物，并从后续分析中删除。由于颗粒细胞RNA含量相对较低(由于RNA酶水平较高)，QC阈值由Xie等人提出。gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba．通过将单细胞图谱映射到最近发表的外周血单个核细胞单细胞联合RNA/CITE-seq多组学参考文献(Azimuth)，对细胞身份进行分类。gydF4y2Ba^63gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

中性粒细胞状态的注释gydF4y2Ba

因为Azimuth参考不包含可在查询数据集中自动注释中性粒细胞的粒细胞，所以通过查询已知标记(即CSF3R, S100A8, S100A9, MMP8, MMP9, ELANE和MPO)手动注释中性粒细胞集群。gydF4y2Ba^64gydF4y2Ba并使用R包SingleR进行了验证gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba．中性粒细胞状态的定义是基于两个重叠标准(1)scvelo推断的中性粒细胞成熟度和(2)通过基因表达和scenic推断的GRN签名与之前的人类和啮齿动物中性粒细胞scRNA-seq研究相一致进行分组的无监督(默认分辨率为Louvain)亚簇。未成熟的中性粒细胞定义为CD24gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba__arg1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaELANEgydF4y2Ba^+gydF4y2BaMPOgydF4y2Ba^+gydF4y2BaATF4gydF4y2Ba^{GRN-activegydF4y2Ba}JDP2gydF4y2Ba^{GRN-activegydF4y2Ba}中性粒细胞gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba}在基于scvelo的潜伏期伪排序中，这些细胞被重复分配为“根细胞”。干扰素gydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}中性粒细胞由优先的mRNA拼接(阳性速度)和ISGs的表达定义，如IFITM1/2、IFIT1/2/3、ISG15/20和IFI6/27/44/44LgydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba}．PGgydF4y2Ba^{活跃的gydF4y2Ba}通过PTGS2/COX2的优先剪接(以及前列腺素运输LST1的表达)来区分中性粒细胞。gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba并包括一个表达高水平IL-1β诱饵受体IL-1R2(参考文献)的子集。gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba)．最后,IL-7RgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba中性粒细胞(可能起源于胸腺的一个小而独特的子集)gydF4y2Ba^68gydF4y2Ba)表达了高水平的核糖体亚单位基因(例如，RPL5/7A/8/13/18/19/23/24/27/P0)，这与“核糖体”高度相似gydF4y2Ba^嗨gydF4y2Ba-特定的集群7 'gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

比较细胞比例的统计方法gydF4y2Ba

为了检验细胞组成是否因感染类型(COVID-19 vs细菌性ARDS)或治疗组(地塞米松vs非地塞米松)而改变，采用广义线性混合效应模型，其中感染类型和治疗组被认为是固定的，个体患者被认为是随机效应。使用' lme4 ' R包中的' glmer '函数进行拉普拉斯近似拟合(版本1.1-27.1)gydF4y2Ba^69gydF4y2Ba,gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用R包' car '(3.0-11版本)计算值。使用ggplot2包生成比较细胞类型组成的箱线图。由于t1采样的一部分患者在t2采集前从ICU出院(非随机或不可忽略的缺失数据)，我们将统计比较限制在一个时间点内的组间比较(例如，COVID-19 t1与细菌性ARDS t1或地塞米松治疗的t1与非地塞米松治疗的t1)，并没有估计t1和t2之间的时间差异。gydF4y2Ba

推断细胞通讯网络gydF4y2Ba

使用Connectome R工具包0.2.2版本重构了细胞-细胞间的差异相互作用网络。gydF4y2Ba^70gydF4y2Ba)和CellChat版本1.0.0(参考。gydF4y2Ba^71gydF4y2Ba)．简单地说，differalconnectome查询Seurat(版本3.9和版本4)R对象，包含根据感染类型和地塞米松状态集成的数据集，以定义节点和边缘，用于下游网络分析。使用CellChat中的compareInteractions函数计算交互总数和交互强度。差分边缘列表通过CircosDiff (R包' circlize '的包装器)和CellChat中的netVisual_chord_gene来过滤受体配体边缘并生成Circos图。gydF4y2Ba

一致性deg和扰动分数gydF4y2Ba

deg是那些平均logFC大于0.25(调整后)的gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，由Seurat(版本3.9和版本4)Wilcoxon秩和检验确定。使用constructConsensus函数生成共识堆叠条，显示累积的logfc(按个别样本贡献着色)gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba在患者中表现出可复制变化的基因(72小时比较为>3,7天比较为>2)。使用gProfiler的g:GOSt (gydF4y2BaPgydF4y2Ba值截止< 0.05)。一个细胞状态特定的“扰动分数”被计算出来，以反映反应的大小，通过将数量和共识deg的累积FC考虑在内。使用nebula(1.0.2版本)生成的密度图可视化摄动分数gydF4y2Ba^72gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

利用RNA速度构建细胞轨迹gydF4y2Ba

通过将CellRanger计数生成的BAMs与RNA速度命令行工具进行重组，对中性粒细胞轨迹进行分析gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba使用run10x命令和human (GRCh38)注释。将包含拼接计数和未拼接计数的输出织机文件进行组合，以比较COVID-19中的中性粒细胞与细菌性ARDS对照和未治疗的COVID-19患者的地塞米松治疗。对于这两种分析，使用SeuratWrappers版本0.2.0中的ReadVelocity函数将组合织机导入Seurat(版本3.9和版本4)，并使用SCTransform(版本0.3.2)进行规范化。gydF4y2Ba^73gydF4y2Ba使用SaveH5Seurat函数将其缩减并投影到UMAP上，并导出为H5文件。根据scVelo(0.2.1版本)工作流的建议，导入、过滤和规范化存储在H5文件中的计数gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba．利用随机和动力学模型估计RNA速度。因为这两个模型的结果相似，所以所有后续分析都使用随机模型作为默认值。存储在AnnData元数据中的计算被导出为CSV文件，用ggplot2(3.1.1版本)绘制描述速度推断潜伏期分布的内核密度线。gydF4y2Ba

基因调控网络与基因本体的丰富gydF4y2Ba

风景优美的gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba通过计算和修剪共表达模块来推断tf及其靶组之间的调控相互作用。简而言之，中性粒细胞从scvelo - re格兰德Seurat(版本3.9和版本4)对象中进行分组，并使用SCENIC的小插图(gydF4y2Bahttps://github.com/aertslab/SCENICgydF4y2Ba)使用hg19 RcisTarget参考。调节活动评分(在' 3.4_regulonAUC。Rds’，SCENIC工作流的输出)被添加到scVelo对象(使用CreateAssayObject函数)，以联合将轨迹和TF活动投射到相同的UMAP嵌入上。通过修改constructConsensus函数生成共识堆叠条，显示每个TF的AUCell分数的累计logFC(按个别样本贡献着色)gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba用于SCENIC试验。预测的作为中性粒细胞状态驱动因子的tf靶组(存储在' 2.6_regulons_asGeneSet.Rds '中)使用g:Profiler的功能富集分析进行绘制，使用iRegulon (Cytoscape插件)绘制与INF通路相交的基因gydF4y2Ba^74gydF4y2Ba．基因本体术语富集分析使用Seurat(版本3.9和版本4)deenrichment rplot函数进行，该函数是Ma 'ayan实验室的enrichment的包装器gydF4y2Ba^75gydF4y2Ba其中，使用Wilcoxon秩和检验计算deg，最多提供300个基因作为richr的输入。gydF4y2Ba

将scRNA-seq的发现与已发表的数据集进行比较gydF4y2Ba

检测地塞米松在t1和t2时是否抑制中性粒细胞基因(补充表gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba)预测COVID-19死亡率时，我们重新使用了参考文献中描述的方法。gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba并使用参考文献中生成的全血大体积RNA-seq数据集。gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba作为103个样本的验证队列(其中17个是致命的)。简单地说，103个样本中的每一个都使用Seurat(版本3.9和版本4)AddModuleScore()对t1和t2时地塞米松抑制中性粒细胞一致基因的聚合表达进行评分。将地塞米松抑制模块评分作为预测变量，28天死亡率作为响应变量，利用pROC的ROC()函数构建受试者工作特征(ROC)曲线。目的:推断重型和中度COVID-19患者的支气管肺泡中性粒细胞组成。gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba)以及细菌性肺炎和COVID-19(参考文献。gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba)、中性粒细胞(CSF3RgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba, S100A8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和S100A9gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)在BALF scRNA-seq数据集中捕获，使用相互最近邻锚定(findtransfer锚定)和在Seurat版本4中实现的身份传输(TransferData和AddMetaData)策略投影到我们的周边血液参考上。gydF4y2Ba^62gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

COVID中性粒细胞阿特拉斯gydF4y2Ba

为了方便直观地探索单单元数据集，一个门户网站(gydF4y2Bahttp://biernaskielab.ca/COVID_neutrophilgydF4y2Ba或gydF4y2Bahttp://biernaskielab.com/COVID_neutrophilgydF4y2Ba)是使用RShiny(版本1.1.0)、shinyLP(版本1.1.2)和shinythemes(版本1.1.2)包构建的。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

关于研究设计的进一步信息可在gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到本文。gydF4y2Ba