微生物物种的分子表征人类殖民回肠和结肠黏膜用16 s rDNA序列分析gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

目的:gydF4y2Ba

本研究的目的是描述细菌社区坚持回肠末端黏膜,近端和远端结肠人类消化道的。gydF4y2Ba

方法和结果:gydF4y2Ba捏样本回肠末端、近端和远端结肠被从一个健康的35年历史,和68年旧的主题与温和的憩室病。16 s rDNA基因放大使用PCR的循环次数低、克隆和测序。总共有361序列得到由70操作分类单位(OTU),计算范围为82·6%。20量百分之三的OTU常见回肠末端,近端结肠远端结肠,但14% OTU只发现回肠末端,和43%的人只有与近端或远端结肠。最常见的代表来自克隆gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba集团XIVa (24·7%),gydF4y2Ba拟杆菌门gydF4y2Ba(gydF4y2Ba噬细胞菌属所致Flavobacteria拟杆菌属gydF4y2Ba)集群(27·7%)。gydF4y2Ba

结论:gydF4y2Ba比较后肠的16 s rDNA克隆库在哺乳动物物种中确认的分布系统组无论主机物种相似。地理位置相关的组内差异较小或集群的有机体,是可能的。gydF4y2Ba

意义和影响:gydF4y2Ba这项研究提供了进一步的证据的分布人类后肠粘膜表面的细菌。数据为基准测试人类消化道的微生物组成。gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

人类的消化道由原地微生物群广泛殖民。数字是最低在胃里,很少有适应酸性环境,并保持低小肠由于相对快速交通和高胆汁酸浓度(gydF4y2Ba卡明斯和麦克法兰1991gydF4y2Ba;gydF4y2Ba1995弗罗林和树林gydF4y2Ba)。然而,微生物细胞的总数(域gydF4y2Ba细菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba古生菌gydF4y2Ba)可以达到10gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba在盲肠的总数是10倍体细胞在整个身体(gydF4y2Ba伯格1996年gydF4y2Ba;gydF4y2BaTannock 2000gydF4y2Ba)。总微生物细胞提升、横向、下行rectosigmoid结肠高虽然这个社区的构成变化取决于饮食和位置。例如,从近端到远端结肠,一些细菌的增长率和活动下降的环境变得枯竭外生非淀粉多糖和抗性淀粉(gydF4y2Ba卡明斯和麦克法兰1991gydF4y2Ba)。证据是积累,肠道细菌的组成和活动社区对宿主的健康产生重大影响,因为它影响营养、排便习惯,粘蛋白的生理障碍,和粘膜免疫系统的个体发生(gydF4y2Ba莫罗和Corthier 1988gydF4y2Ba;gydF4y2Ba冈田克也gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1994年gydF4y2Ba;gydF4y2BaHooper和戈登2001gydF4y2Ba;gydF4y2BaHoopergydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2002年gydF4y2Ba)。此外,肠道细菌群落的组成和活动可能会影响结直肠癌的发病机制(gydF4y2Ba范·明斯特和Nagengast 1993gydF4y2Ba;gydF4y2Ba卡多gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2001年gydF4y2Ba)和炎症性肠病(gydF4y2BaDalwadigydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2001年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

理解复杂的微生物群落进行了极大的增强分子生态技术的发展基于16 s rRNA的亚基(gydF4y2Ba速度1997gydF4y2Ba)。早期肠道微生物生态学工作取决于培养方法(gydF4y2Ba摩尔和Holdeman 1974gydF4y2Ba),但绝大多数仍unculturable通过已知的经典方法,这些方法不能反映真正的肠道细菌的多样性(gydF4y2Ba拉斯金gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1997年gydF4y2Ba)。一个16 s rDNA克隆一个图书馆gydF4y2Ba单gydF4y2Ba人类粪便样本显示广泛的多样性(gydF4y2BaSuaugydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1999年gydF4y2Ba)。只有24%的在这个单一的粪便样本序列都是由培养生物,和76%的序列分析属于未知的细菌物种。有待培养微观检测生物的数量可能会更高(gydF4y2Ba克劳斯和罗素1996gydF4y2Ba;gydF4y2Ba速度1997gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

粘膜gydF4y2BavsgydF4y2Ba肠道细菌的细胞腔的位置可能是重要的,正常的健康和病理。相信粘附肠细胞和粘液是结肠细菌最重要的属性之一他们开拓并增殖所必需的胃肠道内(gydF4y2BaAdlerberthgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1996年gydF4y2Ba)。然而,从主持人的角度来看,殖民位置相邻的细菌,或附着上皮细胞,或粘液,更有可能影响或受宿主免疫系统(gydF4y2Ba冈田克也gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1994年gydF4y2Ba;gydF4y2BaTannock 2000gydF4y2Ba;gydF4y2BaHoopergydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2002年gydF4y2Ba)。此外,地理非致病性细菌的粘附到上皮表面可能导致影响宿主抵抗病原菌的障碍(gydF4y2BaHooper和DiSpirito 1985gydF4y2Ba;gydF4y2BaTannock 2000gydF4y2Ba;gydF4y2BaHoopergydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2002年gydF4y2Ba)。由于丰富的氧气和其他血液承担应承担的营养,肠道上皮细胞的表面微环境是不同的腔,因此细菌种群的构成两个位置可能不是相同的(gydF4y2BaPrydegydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1999年gydF4y2Ba;gydF4y2BaZoetendalgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2002年gydF4y2Ba)。在这项研究中,我们进行了一个16 s rDNA基础分析回肠粘膜细菌,正常人体的近端和远端结肠。第一项研究是我们的知识描述粘膜细菌种群在不同网站的人类胃肠道在同一主题使用16 s rDNA序列分析。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

人类活组织检查集合gydF4y2Ba

夹活检样本收集在结肠镜检查的下行(左或远端)的一部分结肠癌的病人AB,一个68年老女温和乙状结肠结肠憩室病-乙状结肠憩室病是一个正常的发现在老Angloceltic受试者发生在50%以上(gydF4y2BaManousosgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1967年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba休斯1969gydF4y2Ba)-和回肠末端,近端结肠(右)和远端结肠(左)病人LC, 35年的旧女性发生癌症筛查和发现有一个正常的结肠。冒号和口服结肠灌洗清洁相关准备,PicoprepgydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba(Thornleigh Pharmatel Pty有限公司、澳大利亚)。没有主题,LC或AB,抗生素至少6个月。活检是立即洗在厌氧磷酸盐缓冲剂(0·1gydF4y2Ba米gydF4y2Ba磷酸钠),放入标签埃普多夫管,液氮快速冻结,储存在−80°C。gydF4y2Ba

总DNA提取gydF4y2Ba

存储活检被转移到液态氮,然后使用杵磨成粉。总DNA提取使用描述的方法gydF4y2Ba克劳斯gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(2001)gydF4y2Ba。总之,活检粉悬浮在0.5毫升TE缓冲(100米gydF4y2Ba米gydF4y2BaTris-HCl + 10米gydF4y2Ba米gydF4y2BaEDTA, pH值8·0),100gydF4y2BaμgydF4y2Bal 10% SDS和100gydF4y2BaμgydF4y2Ba蛋白酶K l(10毫克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})补充道。的混合是在55°C的环境与偶尔的混合150分钟,120年gydF4y2BaμgydF4y2Bal (5gydF4y2Ba米gydF4y2Ba氯化钠和65gydF4y2BaμgydF4y2Bal 10% CTAB (hexadecyltrimethylammonium溴化,σ,城堡山,澳大利亚)补充道,并在65°C的环境进一步10分钟。混合物和0·7毫升氯仿提取两次公/异戊醇(24:1),并与两卷乙醇沉淀。与70%乙醇洗后DNA小球,小球在50 resuspendedgydF4y2BaμgydF4y2Bal的蒸馏水。gydF4y2Ba

细菌16 s rDNA放大gydF4y2Ba

两套PCR引物(Genworks、阿德莱德、澳大利亚)附近的部分和用于生成完整的16 s rDNA序列。部分序列进行活检。附近还是完整的序列进行了AB降结肠活检。部分序列扩增子,包括九个变量的两个地区的16 s rDNA,gydF4y2BacagydF4y2Ba350个基点,并使用eubacterial引物由27个f (5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3′,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba职位8-27)和342 r (5′CTGCTGCSYCCCGTAG 3′,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba342 - 358年)。附近检测细菌16 s rDNA序列,其中包括所有九个变量rDNA的地区,gydF4y2BacagydF4y2Ba1500个基点,并由eubacterial引物27 f - 1492 r (5′TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3′,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba1492 - 1513年)(gydF4y2Ba莱恩1991gydF4y2Ba)。PCR反应混合物包含50 ng DNA, 1 UgydF4y2BaTaqgydF4y2BaDNA聚合酶(WI Promega,麦迪逊,美国),1×炽热gydF4y2BaTaqgydF4y2Ba反应缓冲区,2.5米gydF4y2Ba米gydF4y2BaMgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,400年gydF4y2BaμgydF4y2Ba米gydF4y2Ba每个核苷酸和6 pmole每个引物。PCR循环条件在94°C 2分钟一个周期,对5 s 60°C,和72°C 8年代;其次是20周期在94°C 2 s, 50°C 5和72°C 8年代;和一个周期为2 s 94°C, 50°C 5 s和72°C的8分钟。PCR反应与最后一个加热控制程序使用扩展为30分钟30°C。只有20周期放大被用来防止偏向于一个特定组(gydF4y2Ba王gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1996年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba阀盖gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2002年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

放大DNA的浓度决定densitometrically 0·8%琼脂糖凝胶。两部分的收益率(350个基点),附近全(1500个基点)序列PCR产品很低,两批PCR产品(100gydF4y2BaμgydF4y2Bal)汇集在一起,集中10×乙醇沉淀。简单地说,100年gydF4y2BaμgydF4y2Bal (PCR产品是混合10gydF4y2BaμgydF4y2Bal (3gydF4y2Ba米gydF4y2Ba醋酸钠(pH值4.6)和200年gydF4y2BaμgydF4y2Bal的乙醇。使离心后在室温下15分钟,70%乙醇和重新溶解的颗粒被20gydF4y2BaμgydF4y2Bal的蒸馏水。gydF4y2Ba

16 s rDNA克隆库的建设gydF4y2Ba

PCR产物被绑定到PCR 2.1威尼斯平底渔船gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba向量(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA),然后转化为能力gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细胞(一次机会gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba英杰公司)通过化学转换所描述的制造商。重组细胞种植在Luria Bertani应承担(磅)琼脂板上装有50gydF4y2BaμgydF4y2Ba克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}氨苄青霉素,X加应承担的地理(地理地理5溴4氯量3必经indolyl检测b d必经galactopyranoside)应承担和异丙基b thiogalactopyranoside应承担(IPTG)。一百年到150年白人殖民地从每个克隆库和生长在包含50磅肉汤gydF4y2BaμgydF4y2Ba克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}氨苄青霉素。gydF4y2Ba

质粒DNA快速提取的质粒DNA提取方法(gydF4y2BaSambrookgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1989年gydF4y2Ba)。一夜之间短暂,0.5毫升的文化混合0.5毫升的苯酚:氯仿(1:1)。混合后,混合物被离心分离800年12gydF4y2BaggydF4y2Ba5 s, 300gydF4y2BaμgydF4y2Bal的水相转移到一个干净的与300年埃普多夫管和混合gydF4y2BaμgydF4y2Ba异丙醇的l。存储在−20°C 5分钟后,质粒DNA被使离心沉淀800年12gydF4y2BaggydF4y2Ba十年代。球终于resuspended 50gydF4y2BaμgydF4y2Bal的蒸馏水。gydF4y2Ba

限制片段长度多态性(RFLP)分析gydF4y2Ba

克隆库最初的多样性研究利用RFLP分析和表达为一个特定操作的比例分类单位(OTU)。虽然有两个不同的长度PCR产品产生的实验中,RFLP数据库用于我们的实验是基于部分16 s rDNA序列覆盖变量地区V1和V2。因此,RFLP分析克隆库与附近的完整基因组序列gydF4y2BacagydF4y2Ba插入1500个基点,进行部分使用PCR引物序列27 342 f / r。详细,附近的一个35周期进行PCR反应检测完整序列16 s rDNA使用目标质粒检测引物(M13前进:5′GTAAAACGACGGCCAG 3′和M13相反:5′CAGGAAACAGCTATGAC 3′),然后细菌引物配对的产品进一步放大27 f - 342 r到生成最终的gydF4y2BacagydF4y2Ba350个基点细菌16 s rDNA。RFLP模式通过消化350 bp PCR产品与限制性内切酶的酶gydF4y2BaDdegydF4y2Ba我和gydF4y2Ba运算器gydF4y2Ba我(美国WI Promega,麦迪逊)和分析3·0%低熔点琼脂糖凝胶电泳(Promega)。通过比较每个殖民地的模式选择,OTU被确定基于个人RFLP模式,为进一步的DNA测序。gydF4y2Ba

DNA测序gydF4y2Ba

质粒插入从个人OTU通过使用M13正向和反向引物PCR反应,然后纯化使用Machery DNA纯化Nucleospin内格尔gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba工具包(综合科学,悉尼,澳大利亚)。部分序列的序列反应包含ABI大染料终结者测序工具(美国珀金埃尔默应承担的弗农山,IL)和底漆M13逆转。三组PCR引物,M13, M13反向引物907附近被用于非完整测序。所有反应都是在重复,如果有多个OTU被认为是相同的,通过一个自动化的ABI 373测序仪在澳大利亚基因组研究设施(昆士兰大学、圣卢西亚、澳大利亚)。gydF4y2Ba

系统发育分析gydF4y2Ba

两套部分(350个基点),附近的全部(1500个基点)rDNA序列被爆炸直接与基因库相比gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba搜索。序列有99%相似(< 1%)被指定为同一种生物多样性。唯一的序列与域gydF4y2Ba细菌gydF4y2Ba进行了进一步的系统发育分析,一些人类基因组序列也被检测到。所有使用CLUSTALW序列和他们的近亲是一致的gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba。使用TREECON进行了系统发育分析gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba系统发育分析包。相似性和DNADIST函数被用来分析连杆与木村和距离修正。根树产生距离矩阵,邻居加入项目。稳定的分支被引导检查。序列筛选可能与CHIMERA_CHECK嵌合体(gydF4y2BaMaidakgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1997年gydF4y2Ba)。嵌合序列被排除在进一步分析确认。gydF4y2Ba

加入核苷酸序列号码gydF4y2Ba

部分和附近满16 s rDNA分离序列用于系统发育分析沉积下的基因库的缩写adhumuc成年人粘膜前加入的数字,从AF499828 AF499911。系统发育分析中使用的参考菌株也从基因库数据库。gydF4y2Ba

生态统计学方法gydF4y2Ba

覆盖率的百分比多样性的克隆库计算公式[1−(gydF4y2BangydF4y2Ba/gydF4y2BaNgydF4y2Ba)/ 100,gydF4y2BangydF4y2Ba是分子物种的数量由一个克隆(单量克隆OTU)和gydF4y2BaNgydF4y2Ba序列的总数(gydF4y2Ba好1953年gydF4y2Ba)。不同的克隆库的组成和多样性是量化使用落指数方程(gydF4y2Ba路德维希和雷诺1988gydF4y2Ba)。落指数范围从0(最不同的)到1(最相似)。相关分析进行了比较偏的影响,附近的完整序列克隆的偏见。没有gydF4y2Ba事后gydF4y2Ba进行了分析,相关性高(gydF4y2BargydF4y2Ba> 0·95)。gydF4y2Ba

道德的考虑gydF4y2Ba

这项研究是板牙卫生服务研究伦理委员会的批准。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

比较部分和附近的完整序列的细菌16 s rDNA克隆库gydF4y2Ba

我们首先比较精密的部分序列筛选一个附近的完整序列的细菌多样性的屏幕,使用两种不同的插入长度来确定有一个克隆的偏见。的浓度PCR扩增子的长度都是相似的,但都需要集中达到一个适当的浓度对克隆的10倍。共有110个克隆从1500个基点和80年从350个基点16 s rDNA AB远端结肠(左结肠)克隆库都RFLP分析。gydF4y2Ba

细菌多样性的评估每个库是由策划独特的累积频率OTU克隆的数量的函数分析。中给出的结果gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba表明两个AB远端结肠库也有类似的整体多样性和序列长度没有影响分析(相关分析,gydF4y2BargydF4y2Ba= 0·98)。OTU显示的系统发育分析gydF4y2Ba拟杆菌门gydF4y2Ba,gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba集群XIVa (gydF4y2Ba柯林斯gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1994年gydF4y2Ba),gydF4y2Ba变形菌门gydF4y2Ba被主要细菌组确定从AB的克隆库(落索引0·69)。类似比例的复苏发生在每个大组部分,附近全部克隆库,这表明基于PCR检测16 s rDNA克隆技术的分析粘膜细菌稳定,重现性好。占主导地位的细菌群体的百分比从AB远端结肠-表中的两个克隆库结合,因为他们是如此相似,所示gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

比较16 s rDNA克隆从回肠末端黏膜细菌,近端结肠和远端结肠gydF4y2Ba

在前面的小节中,我们表明,分析部分16 s rDNA V1和V2覆盖区域显示人体粘膜细菌的多样性社区应承担的全部序列rDNA附近一样准确。因此,比较复杂的人类粘膜细菌社区gydF4y2BavsgydF4y2Ba肠道网站,三部分序列350 bp应承担的克隆库构造使用活检回肠末端的DNA,近端结肠和远端结肠健康的35年的老话题,LC (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

克隆库的组成由OTU相比,系统发育分析RFLP,然后确认与系统发育分析的序列。二十7 OTU回肠末端被确定,30从右边OTU结肠,41 OTU从左结肠。20量百分之三的OTU常见的三个克隆库,14% OTU独特的回肠末端,和43% OTU只发现在近端或远端结肠。似乎有一个内部一致近至远端梯度OTU数量的增加和共享OTU之间至少最遥远的网站,末端回肠和结肠远端(落索引0·38)。回肠克隆库出现接近的生物多样性的近端结肠克隆库(落索引0·57),进而接近远端结肠克隆库(落索引0·62)。gydF4y2Ba

主要细菌系统组和总数的百分比分析克隆从所有三个肠网站的信用证没有disssimilar整体(落指数0·38-0·62,gydF4y2Ba无花果3gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),并介绍了聚合形式gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。大多数物种都在gydF4y2Ba拟杆菌门(噬细胞菌属所致Flavobacteria量拟杆菌)gydF4y2Ba,gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba集群XIVaξ和十八,物种在这些细菌的主要群体呈现持续在所有三个克隆库。落指数比较部分序列的组成和多样性LC远端和AB型远端结肠克隆库是0·25。gydF4y2Ba

系统发育分析16 s rDNA序列gydF4y2Ba

拟杆菌门。gydF4y2Ba三个LC图书馆,共有80个克隆,包括26日从回肠末端克隆,克隆27日从右结肠和27从左结肠,被分配使用爆炸搜索的数据库为两个集群的基因库gydF4y2Ba拟杆菌门gydF4y2Ba。这占了39%的LC克隆。gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba显示这些克隆参考物种之间的关系gydF4y2Ba拟杆菌门gydF4y2Ba。gydF4y2Ba脆弱拟杆菌gydF4y2Ba集群包含了最多的克隆。共有69个克隆(88%)被确定为gydF4y2Bab . vulgatusgydF4y2Ba序列相似性> 98·8%。其余的三个克隆LC末端回肠和结肠左库被确定(> 99·1%的序列相似性)的无教养的人类粪便细菌adhufec 51 (gi / 6456097),这是最接近gydF4y2Bab . caccaegydF4y2Ba和三个从右结肠和左结肠克隆库可能属于一个新的物种接近(序列相似度96%)gydF4y2Bab . thetaiotamicrongydF4y2Ba。五个序列从LC左结肠和终端回肠库被放置在一个健壮的集群(引导价值的100%),没有在公共数据库中序列密切相关,与爆炸搜索显示他们接近gydF4y2Bab . distasonisgydF4y2Ba(序列散度5·1%)。gydF4y2Ba

序列的系统发育分布的两个AB左结肠库也所示gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba。总共27个克隆在下降gydF4y2Ba拟杆菌门gydF4y2Ba,其中26克隆属于gydF4y2Bab . fragilisgydF4y2Ba集群。系统发育分析显示,这些克隆用的92%gydF4y2Bab . vulgatusgydF4y2Ba(序列相似性> 98·6%)。两个克隆接近无教养的细菌HUCC30(序列相似性98·8%),以前隔绝人类结肠癌gydF4y2Bab . ovatusgydF4y2Ba(序列相似性94·6%)。只有一个序列在附近被发现gydF4y2Bab . distasonisgydF4y2Ba(序列相似性97·6%)。gydF4y2Ba

梭状芽胞杆菌(厚壁菌门)。gydF4y2Ba大多数克隆的图书馆gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba柯林斯gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1994年gydF4y2Ba)。有122 LC序列gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba,由41从LC回肠末端序列,41序列从LC右结肠,和40序列从LC左结肠图书馆。此外,还有18序列从AB部分16 s rDNA左结肠库和35序列从附近的AB应承担的全部序列16 s rDNA左结肠图书馆。所示gydF4y2Ba无花果4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,克隆序列的系统发育分布从LC库非常不同于AB库。集群XIVa (gydF4y2Ba球菌样的梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba)、集群XI (gydF4y2Babifermentans梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba)、集群十八(gydF4y2Baramosum梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba)和集群第九(gydF4y2Ba月形单胞菌属sputigenagydF4y2BaLC库)表示,而从AB序列库中主要是集群XIVa第九集群,集群IV (gydF4y2Baleptum梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba集群)和我(gydF4y2Baperfringens梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

总的来说,这是集群XIVa包含大多数序列从AB和LC库。大多数这些序列接近无教养的细菌发表在基因库。四个集群XIVa OTU从AB左结肠库指定为ABLCf20 ABLC21, ABLCf89丁酸和ABLC75隶属于生产出版的细菌gydF4y2BaBarcenillagydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(2000)gydF4y2Ba(丁酸盐生产T2量145 gi / 6899961;丁酸盐生产T1量815 gi / 12406799;丁酸盐生产A2 231应承担的gi / 13548352;和丁酸盐生产L1 83 gi / 12331176,分别为< 2%)序列散度(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba集群XIVa (gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba从LC回肠末端),19个克隆,克隆10从LC左结肠、14个克隆从LC右结肠和三个克隆的AB部分16 s rDNA克隆库有相同的序列相似(99·7%)无教养的细菌或然数量组24日近了gydF4y2Ba真细菌formicigeneransgydF4y2Ba。一个克隆的AB部分16 s rDNA克隆库,三个克隆AB附近的完整序列16 s rDNA克隆库和11个克隆从LC图书馆有相似的序列相似(> 98·6%)AF54无教养的细菌。六个克隆从三个LC图书馆是最接近人类的细菌无教养的66·25相似(98·8%)。7个克隆从LC图书馆序列最接近无教养的人类粪便细菌71·25(序列相似性97·7%)。三个集群XIVa LC对结肠克隆都是相同的gydF4y2Ba瘤胃球菌属gnavusgydF4y2Ba(序列相似性99·7%),一个已知的黏液溶解的细菌(gydF4y2Ba斯gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1985年gydF4y2Ba)。还有六个克隆、四个ABLCf 6和两个ABLCf 11日附近的gydF4y2Ba毛螺菌属pectinoschizagydF4y2Ba和gydF4y2Baxylanolyticum梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba分别使用序列散度5·4%。gydF4y2Ba

在集群XIVa除了大量的序列,许多LC序列也在下降gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba习集群和集群十八(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。20量两个克隆序列最相似(99·7%)gydF4y2Baramosum梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba集群十八和28个克隆的序列最相似(98·2%),无教养的细菌F17隔绝猪feaces (gi / 8347693),该系统属于gydF4y2Bamayombeii梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba习,位于集群。有两个LC克隆相同相似(99·2%)gydF4y2Ba韦永氏球菌属atypicagydF4y2Ba。gydF4y2Ba

其他六梭状芽胞杆菌序列确定从32 AB左结肠克隆库主要分配给集群四世,我和第九。四个克隆是一样的丁酸盐生产细菌A2量165相似(99·1%)接近gydF4y2BaFaecalibacterium prausnitziigydF4y2Ba在集群四世,而另一个两个克隆可能属于一个新的物种只有91·1%的序列相似性gydF4y2Ba瘤胃球菌属bromiigydF4y2Ba。其他22第四序列属于集群形成两个OTU分支。数据显示,爆炸的近亲是无教养的细菌CB25 (gi / 16549091)gydF4y2BaAnaerofilum pentosovorangydF4y2Ba相似(94·1%)。在集群和第九,两个AB克隆序列最相似(98·6%)gydF4y2Baperfringens梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba,两个克隆序列识别相似(99·2%)gydF4y2Ba韦永氏球菌属atypicagydF4y2Ba。gydF4y2Ba

变形菌门。gydF4y2Ba共有78个克隆主要由36 AB的完整基因组序列和37附近AB部分序列16 s rDNA左结肠克隆的gydF4y2Ba变形菌门gydF4y2Ba——只有五个LC克隆相关异质群体。在系统分析的基础上,gydF4y2Ba变形菌门gydF4y2Ba克隆分为三个细分(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。大多数克隆是在gydF4y2BaGammaproteobacteriagydF4y2Ba。二十5 AB的完整基因组序列和附近16 AB应承担的部分序列16 s rDNA克隆有相似的序列gydF4y2Ba志贺氏杆菌sonneigydF4y2Ba和gydF4y2Ba美国flexnerigydF4y2Ba只有0·6%和1·7%序列分别散度,从而占绝大多数gydF4y2Ba变形菌门gydF4y2Ba序列。AB克隆是近了gydF4y2Ba嗜血杆菌56gydF4y2Ba序列的散度4·2%和两个LC克隆被认同gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba(序列相似性99·0%)。隶属于三个序列gydF4y2BaStenotrophomonas maltophiliagydF4y2Ba(序列相似性98·6%),和一个序列确定无教养的Bihiii 13(序列相似性99·0%),这是与工业废水样品。gydF4y2Ba

一个克隆是相同的gydF4y2Ba纤毛菌属cholodniigydF4y2Ba(序列相似度100%)和六个克隆属于一个无教养的环境细菌D100使用(序列相似性98·8%)毗邻gydF4y2BaHerbaspirillum lemoigneigydF4y2Ba在gydF4y2BaBetaproteobacteriagydF4y2Ba。序列的两个OTU ABLC72 ABLC15,接近无教养的细菌S26 9和疾病预防控制中心组织印度河流域文明必经2 JHH 1448,分别但6·1的序列差异和8·3%,分别表明这两个克隆属于小说的种类。有一个LC OTU,这是相同的gydF4y2Ba伯克不过gydF4y2Ba(序列相似性99·4%)。gydF4y2Ba

三个克隆从350年英国石油公司应承担的克隆库和四个克隆从1500年英国石油公司应承担的克隆AB图书馆是最接近gydF4y2BaMethylobacteriumgydF4y2Basp,和三个350 bp AB应承担的克隆,一个1500 bp AB克隆是最接近gydF4y2BaSphingomonasgydF4y2Ba在gydF4y2BaAlphaproteobacteriagydF4y2Ba。gydF4y2Ba

其他细菌。gydF4y2Ba两个OTU从350年英国石油公司应承担的AB克隆库是最接近gydF4y2Ba链球菌引起的肺炎gydF4y2Ba(序列相似性98·8%)和两个OTU LC的回肠末端序列最接近gydF4y2Ba唾液链球菌。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

人类的消化道港口一个高度复杂和丰富的社区微观生物(gydF4y2BaTannock 2000gydF4y2Ba;gydF4y2BaHooper和戈登2001gydF4y2Ba)。我们在接触组件的微生物群从出生,但对他们的影响主机的正常生理和病理(gydF4y2BaHoopergydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2002年gydF4y2Ba)。这是最近展示了无菌的老鼠colonizd时gydF4y2Ba亚种gydF4y2Ba著名组件正常的老鼠和人类肠道微生物区系。全球殖民肠道转录反应观察DNA微阵列,并透露,这种共生的细菌调节相关基因的表达在几个重要的肠道功能包括营养吸收,粘膜屏障防御工事,异型生物质代谢、血管生成和产后肠成熟(gydF4y2BaHoopergydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2001年gydF4y2Ba)。这些肠道细菌反应将产生深远的影响在影响消化道疾病的发病机理。然而,在这些领域可以取得显著进展之前,基准测试的完整的微生物群在正常人体是必需的。gydF4y2Ba

我们的研究中两个主题在一个站点在消化道透露,是最具代表性的团体gydF4y2Ba拟杆菌门gydF4y2Ba和gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba集群XIVa (gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。这是对个人和来自其他研究似乎支持的证据(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。16 s rDNA克隆库gydF4y2Ba持有gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(2002)gydF4y2Ba采样结肠粘膜的三个主题,表明gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2BaXIVa集群最主要(46·3%)紧随其后gydF4y2Ba拟杆菌门gydF4y2Ba(gydF4y2Ba拟杆菌gydF4y2BaCFB)集群(26·4%)。类似的研究在一个45年的粪便量老个人(gydF4y2BaSuaugydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1999年gydF4y2Ba)透露,gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2BaXIVa集群(44%)是最具优势的,紧随其后的是gydF4y2Ba拟杆菌门gydF4y2Ba(30·9%)。gydF4y2BaSghirgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(2000)gydF4y2Ba使用北方污点分析证明gydF4y2Ba拟杆菌门gydF4y2Ba在粪便菌群不同个体之间的20 - 52%。gydF4y2Ba

的研究gydF4y2Ba持有gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(2002)gydF4y2Ba,目前的调查,也没有遇到任何bifidobacterial序列。双歧杆菌估计文化占10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba/ g粪便(gydF4y2Ba吉布森gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1995年gydF4y2Ba)。并不是所有序列都在完全相同的放大效率与给定组引物,这可能偏见克隆库。然而,分子的研究结果都是一致的,即使他们使用不同的引物组。此外,我们发现双歧杆菌在其他正常的受试者(未发表的PCR检测克隆数据)。双歧杆菌,相对容易的文化,可能高估了传统技术。他们曾被荧光检测gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂交,估计不超过人口总数的3%的细菌(gydF4y2Ba弗兰克斯gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1998年gydF4y2Ba)。另一方面,可想而知,随机PCR检测放大可能是罕见的微生物群的检测效率较低,因为少见序列扩增子可能淹没的扩增子序列更为普遍。这就是为什么PCR检测周期数量应保持尽可能低的最大化的恢复与随机克隆技术(OTUgydF4y2Ba阀盖gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2002年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在我们的研究中,克隆库是由三个不同的肠道网站。不可能得出结论的基础上,数据从一个个体差异三个克隆库是由于网站,而不是由于小样本大小。gydF4y2BaZoetendalgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(2002)gydF4y2Ba网站相比,结肠内的10个主题,没有检测和DGGE地理位置相关的差异。然而,发现在目前的系统调查和一个近端远端内部一致梯度OTU数量的增加和共享OTU之间至少最远的网站。gydF4y2Ba

在我们的研究中,我们得到361序列70独特OTU表示计算覆盖率为82%。这意味着额外的克隆序列的概率陷入没有观察到OTU为18% (gydF4y2Ba好1953年gydF4y2Ba)。报道了估计有多少生物多样性的示例使用克隆的方法。另一个估计是通过绘图的累积数量OTU克隆测序的数量的函数(gydF4y2Ba无花果1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。使用这个估计,渐近线代表100%的覆盖率,在个人,要么使用附近的列车全部或部分序列,生物多样性的很大一部分。这些估计是有用的,显示多少额外的信息是通过做更多的测序。例如,研究gydF4y2Ba莱塞gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(2002)gydF4y2Ba(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba从猪后肠)获得4720序列覆盖97·8%。从本质上说,作为一个接近渐近线,需要大量额外的序列相对较小的新信息。gydF4y2Ba

在我们的研究中,粘膜被捏样本在常规结肠镜检查检查的患者。口服结肠灌洗治疗结肠被用来准备考试。批评我们的研究可能是灌洗治疗,这是比较严重的,会破坏生物多样性的很大一部分存在于消化道的黏膜表面。这似乎并非如此。gydF4y2Ba持有gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(2002)gydF4y2Ba采样已故人的结肠粘膜没有进行灌洗。他们没有获得更大的多样性在克隆库比(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

我们获得的多样性相比使用附近的全长序列和通过使用350个基点片段(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。时的累积数量OTU策划反对克隆的数量的完整和附近的350个基点片段,没有任何显著差异OTU。这将表明,微生物多样性的一个适当的表示可以使用获得较短的片段。它曾被证明了基于部分序列的系统发育树具有相同的拓扑是基于完整的序列。而建立的组织是相同的,有一些差异在深分支门,但这不会影响视图获得的多样性(gydF4y2Ba车道gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1985年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba洛佩兹孔特雷拉斯应承担的gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2001年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

研究使用常规文化方法或荧光gydF4y2Ba原位gydF4y2Bahydridization显示,超过96%的结肠粘膜细菌厌氧生物,只有1 - 4%属于兼性需氧菌(gydF4y2BaPathmakanthangydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1999年gydF4y2Ba;gydF4y2Bavan der WaaijgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2002年gydF4y2Ba)。我们研究的结果是一致的,但确实证明了的重大国际米兰的个体差异的厌氧菌和兼性需氧菌分布和人口。主题LC活检样本,有一个高的比例gydF4y2Ba拟杆菌门gydF4y2Baspp。(38%)在所有三个克隆库和一些gydF4y2BaProtoebacteriagydF4y2Ba克隆,而个人AB怀有更少gydF4y2Ba拟杆菌门gydF4y2Ba但多gydF4y2BaγgydF4y2Ba量gydF4y2Ba变形菌门gydF4y2Ba。的gydF4y2Ba变形菌门gydF4y2Ba在AB降结肠克隆一个数量级大于其他肠道环境报道(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba),这意味着的平均百分比gydF4y2Ba变形菌门gydF4y2Ba克隆的话题,LC和AB型,在我们的研究中,也是一个数量级(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。他们包括细菌喜欢gydF4y2Ba伯克不过gydF4y2Ba,gydF4y2Ba纤毛菌属cholodniigydF4y2Ba,gydF4y2Bah . 56gydF4y2Ba,gydF4y2Ba志贺氏杆菌sonneigydF4y2Ba,gydF4y2Ba美国flexnerigydF4y2Ba和gydF4y2BaStenotrophomonas maltophiliagydF4y2Ba,所有这些可能会致病,在免疫损害人类(gydF4y2BaNikkarigydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2002年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba引起gydF4y2Ba等gydF4y2Ba。2002年gydF4y2Ba)和正常的人类宿主。因此,可能出现很多的存在gydF4y2Ba变形菌门gydF4y2Ba在AB,是病态的。她有轻微的乙状结肠结肠憩室病。憩室病中,发现是一个正常的老年白种人(gydF4y2BaManousosgydF4y2Ba等gydF4y2Ba。1967年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba休斯1969gydF4y2Ba),但其病因学是知之甚少。可能会有细菌的作用在其发病机理。gydF4y2Ba持有gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(2002)gydF4y2Ba也报道了gydF4y2BaBurkolderia不过gydF4y2Ba在他们的老年人。然而,它很可能的gydF4y2Ba变形菌门gydF4y2Ba是共生的,只有成为致病他们能否将黏液层。细菌群落在LC接近地理的报道粘膜细菌社区文化研究为基础,与物种的优势gydF4y2Ba拟杆菌门gydF4y2Ba。这包括频繁的克隆gydF4y2Bab . vulgatusgydF4y2Ba,gydF4y2Bab . caccaegydF4y2Ba,gydF4y2Bab . ovatusgydF4y2Ba,gydF4y2Ba亚种gydF4y2Ba和gydF4y2Bab . distasonisgydF4y2Ba(gydF4y2BaPoxtongydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1997年gydF4y2Ba;gydF4y2BaPathmakanthangydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1999年gydF4y2Ba)。然而,其他主要细菌的种群结构组织,特别是gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba,是相当不同的16 s rDNA克隆库的基础研究。因此,的成员gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba集群XIVa是最常代表克隆在LC,gydF4y2Ba持有gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(2002)gydF4y2Ba粘膜学习和研究单个粪便(gydF4y2BaSuaugydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1999年gydF4y2Ba)。此外,4%的序列从AB,从远端结肠,都接近丁酸产生细菌。这些生理上重要的物种更有可能被低估的传统文化(gydF4y2BaBarcenillagydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2000年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba持有gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2002年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

我们的研究和类似的研究之间的比较分析后肠生态系统显示非凡的代表类群之间的相似性(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。的gydF4y2Ba拟杆菌门gydF4y2Ba(CFB)和gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2BaXIVa组是在所有情况下主要的集群。这表明肠道生态系统之间的系统发育多样性高度相似。很可能致病状态将改变这种平衡,可能不会在总体布局方面的表型,但当然群体内部,或集群的生物。gydF4y2Ba

总之,我们构建了和分析了细菌社区居民的人类回肠末端黏膜,近端结肠和远端结肠通过使用16 s rDNA克隆库。与先前公布的数据,我们的数据显示,主要的系统组织类似哺乳动物的消化道,并主导gydF4y2Ba拟杆菌门gydF4y2Ba和gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2BaXIVa集群。本研究提出了一个重要的贡献的基准测试细菌组成人类消化道粘膜表面的。gydF4y2Ba

AcknowledementsgydF4y2Ba

我们感激地承认的技术帮助温迪·史密斯女士(Longpocket实验室),静夫人李栓(板牙IBD研究实验室)。新王博士的当前持有者雷金纳德弗格森在IBD研究奖学金。gydF4y2Ba

美国胃肠病协会工作提出了消化疾病周在旧金山。2002年5月胃肠病学;W938。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba